SỰ HIỆN DIỆN VÀ VAI TRÒ CỦA VI KHUẨN TÍCH LŨY POLYPHOSPHATE TRONG NƯỚC AO NUÔI CÁ TRA VÀ CHẤT THẢI TRẠI CHĂN NUÔI HEO Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN ĐỀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ

SỰ HIỆN DIỆN VÀ VAI TRÒ CỦA VI KHUẨN TÍCH LŨY
POLYPHOSPHATE TRONG NƯỚC AO NUÔI CÁ TRA VÀ CHẤT
THẢI TRẠI CHĂN NUÔI HEO Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

Nghiên cứu sinh thực hiện

LÊ QUANG KHÔI
Khóa: 2011 – 2015

Cần Thơ, 12/2012


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN ĐỀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ

SỰ HIỆN DIỆN VÀ VAI TRÒ CỦA VI KHUẨN TÍCH LŨY
POLYPHOSPHATE TRONG NƯỚC AO NUÔI CÁ TRA VÀ CHẤT
THẢI TRẠI CHĂN NUÔI HEO Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

Người hướng dẫn khoa học
PGS.TS. CAO NGỌC ĐIỆP

Nghiên cứu sinh thực hiện

LÊ QUANG KHÔI
Khóa: 2011 – 2015

Cần Thơ, 12/2012


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

MỤC LỤC
MỤC LỤC.................................................................................................................... i
DANH SÁCH HÌNH..................................................................................................iii
DANH SÁCH BẢNG.................................................................................................iv
TÓM LƯỢC................................................................................................................v
BẢNG CHÚ THÍCH..................................................................................................vi
Chương 1. ĐẶT VẤN ĐỀ...........................................................................................1
1. 1. Khái quát về tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước.....................................2
1. 1. 1 P và tác động của chúng đến chất lượng nước...........................................................2
1. 1. 2 Nguồn chất thải từ ao nuôi cá tra và trại chăn nuôi heo ở ĐBSCL.............................3
1. 1. 3 Loại bỏ P sinh học....................................................................................................5
1. 1. 4 Poly-P......................................................................................................................6
1. 1. 5 Chuyển hóa và điều hòa sự trao đổi chất trong PAOs................................................8
1. 1. 6 Tình hình nghiên cứu cấu trúc quần thể vi khuẩn poly-P trong hệ thống xử lý nước
thải....................................................................................................................................14
1. 1. 7 Tình hình nghiên cứu cấu trúc quần thể vi khuẩn poly-P trong các ao hồ tự nhiên...17
1. 1. 8 Nhóm vi khuẩn tích lũy poly-P khử nitơ (Denitrifying poly-P accumulating
organisms – DPAOs).........................................................................................................18

1.2 Phạm vi nghiên cứu chuyên đề...........................................................................19

1. 2. 1 Mục đích của chuyên đề.........................................................................................20
1. 2. 2 Yêu cầu chuyên đề.................................................................................................20

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................21
2 .1 Phương tiện nghiên cứu....................................................................................21
2. 1. 1 Thiết bị, dụng cụ....................................................................................................21
2. 1. 2 Nguyên vật liệu......................................................................................................22
2. 1. 3 Hóa chất.................................................................................................................22

2 .2 Phương pháp.....................................................................................................25
2 .2 .1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm............................................................25
2 .2 .2 Phương pháp lấy mẫu.............................................................................................25

i


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

2 .2. 3 Phương pháp phân lập vi khuẩn tích lũy Poly-P......................................................25
2 .2. 4 Xác định khả năng hình thành Poly-P nội bào.........................................................26
2. 2. 5 Gram staining.........................................................................................................27
2. 2. 6 Chụp kính hiển vi điện tử (electron microscopy)....................................................27
2 .2. 7 Nhận diện PAOs.....................................................................................................27

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................29
3. 1 Kết quả..............................................................................................................29
3. 1. 1 Phân lập và mô tả PAOs.........................................................................................29
3. 1. 2 Chụp SEM (Scanning electron microscopy)...........................................................31

3. 1. 3 Đặc điểm các dòng vi khuẩn đã phân lập................................................................31
3. 1. 4 Chụp TEM.............................................................................................................32
3. 1. 5 Định danh và phân tích sự phát sinh loài PAOs phân lập từ nước ao nuôi cá tra......33

3. 2 Thảo luận..........................................................................................................38
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.....................................................................41
4. 1 Kết luận............................................................................................................. 41
4. 2 Đề nghị..............................................................................................................41
Tài liỆu tham khẢo...................................................................................................43

ii


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

DANH SÁCH HÌNH
Hình 1: Cấu trúc chuỗi poly-P...................................................................................6
Hình 2: Ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử Burkholderia cepacia, các chấm đen
là hạt poly-P................................................................................................................. 6
Hình 3: Hiệu quả trích poly-P bằng nước lạnh, nước nóng và NaOH ở những
nồng độ khác nhau từ Chlorella vulgaris ((Eixler et al., 2005)................................8
Hình 4: Mô tả các đặc điểm sinh hóa chính trong quá trình EBPR. Sự chuyển đổi
kiểu trao đổi chất xảy ra dưới điều kiện kỵ khí và hiếu khí....................................9
Hình 5: Mối tương quan giữa tốc độ hấp thu phosphate và hàm lượng COD ngoại
bào.............................................................................................................................. 11
Hình 6: Sơ đồ mô tả sự đồng vận chuyển MeHPO4/H+ với nguồn năng lượng cần
cho các quá trình vận chuyển trong A. johnsonii 210A (van Veen et al., 1994). (1)
H+-ATPase, (2) kênh vận chuyển MeHPO4/H+, (3) kênh đồng vận chuyển

lysine/proton, (4) kênh vận chuyển thuận nghịch sodium/proton, (5) kênh đồng
vận chuyển proline/sodium, CM: màng tế bào, pro: proline, lys: lysine...............12
Hình 7: Ảnh chụp SEM với kích thước các dòng vi khuẩn phân lập. (a) Bacillus
sp CTT002L, (b) Bacillus megaterium BTT003L và (c) Rhodococcus
pyridinivorans...........................................................................................................31
Hình 8: Ảnh chụp TEM các dòng (a), (b) và (e) Burkholderia vietnamiensis
TVT003L, (c) Bacillus megaterium BTT003L, (d) Stenotrophomonas maltophilia
KGT005L, (f) Acinetobacter radioresistens TGT013L. Các hạt màu đen chỉ hạt
poly-P.........................................................................................................................32
Hình 9: Cây phát sinh loài dạng Maximum Likehood xây dựng trên trình tự 16S
rRNA của 21 dòng vi khuẩn phân lập từ mẫu ao nuôi cá tra................................36
Hình 10: Tỉ lệ các lớp trong các dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra 38

iii


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Các chất sử dụng và điều kiện ly trích poly-P (Eixler et al., 2005)............7
Bảng 2: Trình tự primer dùng nhận diện 16S rDNA vi khuẩn PAOs (Ivanov et al.,
2005)........................................................................................................................... 22
Bảng 3: Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn.........................................................29
Bảng 4: Kết quả kiểm hàm lượng poly-P nội bào...................................................30
Bảng 5: Tỷ lệ phần trăm về đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn phân lập31
Bảng 6: Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn trong nước ao nuôi ca tra..............33
Bảng 7: Hàm lượng poly-P nội bào các dòng vi khuẩn phân lập nước ao nuôi cá
tra............................................................................................................................... 34

Bảng 8: Các dòng vi khuẩn tích lũy Polyphosphate phân lập từ nước ao nuôi cá
tra............................................................................................................................... 35
Bảng 9: Mối quan hệ phát sinh loài của các dòng vi khuẩn phân lập dựa trên
trình tự tương đồng 16S rRNA................................................................................37

iv


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

TÓM LƯỢC
Vi khuẩn tích lũy polyphosphate (polyphosphate accumulating organisms - PAOs) là
nhóm vi khuẩn có vai trò quan trọng trong xử lý nước thải bằng con đường sinh học.
Chúng tích lũy lượng lớn polyphosphate nội bào, góp phần vào quá trình loại bỏ
phospho hòa tan trong nước.
Áp dụng phương pháp phân lập truyền thống và kỹ thuật sinh học phân tử thông qua các
phương pháp thể hiện trong các tài liệu nghiên cứu trước đây cho thấy PAOs có sự đa
dạng về thành phần trong nước ao nuôi cá tra. Kết quả có 439 dòng phân lập từ 196 mẫu
chất thải từ ao cá tra và trại chăn nuôi heo. Trong đó có 191 dòng phân lập từ 70 mẫu
nước ao nuôi cá tra và 248 dòng phân lập từ 126 mẫu chất thải trại chăn nuôi heo. Kết
quả kiểm tra hàm lượng polyphosphate nội bào của từng dòng phân lập cho thấy hàm
lượng polyphosphate dao động từ 2 mg/l đến 148,1 mg/l sau 6 ngày nuôi vi khuẩn trong
môi trường. Khả năng tích lũy polyphosphate dao động lớn và tùy thuộc vào từng dòng
vi khuẩn. Có 398/439 dòng vi khuẩn phân lập có khả năng tích lũy polyphosphate với
hàm lượng từ 2 – 19,5 mg/l (chiếm 90,66%). Chỉ có 45/439 dòng vi khuẩn phân lập có
hàm lượng polyphosphate tích lũy nội bào từ 19.6 – 148,1 mg/l (trong đó có 29/439
dòng tích lũy từ 20 – 50 mg/l, 11/439 dòng có hàm lượng từ 50 – 100 mg/l và 5 dòng
tích lũy từ 100 – 148,1 mg/l).

Dựa trên trình tự của 16S rRNA, 21 dòng trên 191 dòng phân lập từ nước ao nuôi cá
tra nằm trong bốn lớp Bacilli, Actinobacteria, Beta-proteobacteria, Gammaproteobacteria. Các dòng có quan hệ gần gũi với giống Bacillus chiếm tỉ lệ cao
(52.4%) trong các dòng phân lập, nhưng dòng có khả năng tích lũy poly-P cao là
Burkholderia vietnamiensis TVT003L trong lớp Beta-proteobacteria, Acinetobacter
radioresistens

TGT013L

trong

lớp

Gamma-proteobacteria

và

Arthrobacter

protophomiae VLT002L trong lớp class Actinobacteria. Kết hợp chụp TEM xác định
phosphate tồn trữ trong tế bào dạng hạt polyphosphate.
Từ khóa: Vi khuẩn tích lũy poly-P, polyphosphate, loại bỏ phosphate, ao cá tra,
Bacilli, Actinobacteria.

v


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

BẢNG CHÚ THÍCH
ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long
DPAOs: Denitrifying polyphosphate accumulating organisms (vi khuẩn tích lũy poly-P khử nitơ)
EBPR: Enhanced biological phosphorus removal (Tăng cường sự loại bỏ P bằng sinh học)
GAOs: glycogen accumulating organisms (vi khuẩn tích lũy glycogen)
N: Nitơ
P: Phospho
PAOs: Polyphosphate accumulating organisms (vi khuẩn tích lũy poly-P)
PHAs: Polyhydroxyalkanoates
Poly-P: Polyphosphate
SEM: Scanning electron microscopy (Kính hiển vi điện tử quét)
TEM: Transmission electron microscopy (kính hiển vi điện tử truyền quét)
VFAs: Volatile fatty acids (acid béo dễ bay hơi)
AGH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo ở tỉnh An Giang
AGT: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở tỉnh An Giang
BLH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo ở tỉnh Bạc Liêu
BTH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo ở tỉnh Bến Tre
BTT: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở tỉnh Bến Tre
CMH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo ở tỉnh Cà Mau
CTH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo ở tỉnh Cần Thơ
CTT: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở tỉnh Cần Thơ
DTH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo ở tỉnh Đồng Tháp
DTT: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở tỉnh Đồng Tháp
HGH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo ở tỉnh Hậu Giang
HGT: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở tỉnh Hậu Giang
KGH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo ở tỉnh Kiên Giang
KGT: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở tỉnh Kiên Giang
LAH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo ở tỉnh Long An
STH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo ở tỉnh Sóc Trăng
STT: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở tỉnh Sóc Trăng

TGH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo ở tỉnh Tiền Giang
TGT: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở tỉnh Tiền Giang
TVH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo ở tỉnh Trà Vinh
TVT: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở tỉnh Trà Vinh
VLH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo ở tỉnh Vĩnh Long
vi


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

vii


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

CHƯƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Phú dưỡng hóa (eutrophication) là vấn đề nghiêm trọng về môi trường (Qin 2002). Mặc
dù sự phát triển quá mức của tảo gây ra hiện tượng phú dưỡng hóa, không chỉ dẫn đến
hậu quả là nước bị ô nhiễm nặng mà còn đưa đến vấn đề là phải xử lý ô nhiễm về môi
trường xung quanh và ảnh hưởng của chúng đến sức khỏe con người. Nhiều nghiên cứu
tập trung xem xét các yếu tố hóa học và vật lý như ánh sáng (Swale 1964), nhiệt độ của
nước (Robarts và Zohary 1987), thủy động lực học (You et al., 2007), độ đục của nước
và thành phần các chất dinh dưỡng (Painting et al., 2007) gây ra sự phát triển quá mức
của tảo xanh lục (Blue-green algae). Trong các yếu tố trên, thành phần dinh dưỡng được
xem là chỉ tiêu chủ yếu dẫn đến sự phú dưỡng hóa, đặc biệt là phospho (P) được xem là
yếu tố giới hạn cho sự phát triển của tảo và là thành phần chủ yếu gây sự phú dưỡng hóa

cho các ao hồ.
Sự hấp thu và giải phóng P hòa tan dạng phosphate phụ thuộc vào các yếu tố nhạy cảm
trong các phản ứng oxy hóa khử dưới điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Trong điều kiện
hiếu khí P sẽ được hấp thu và giải phóng trở lại trong điều kiện kỵ khí dưới sự hiện
diện của Fe3+/Fe2+ (Zhou et al., 2005). Trước đây, quá trình hấp thu P hòa tan được xem
như là quá trình loại bỏ bằng con đường hóa học (Peng et al., 2007). Tuy nhiên, nhiều
bằng chứng cho thấy quá trình sinh học đóng vai trò quan trọng (Gächter et al. 1988).
Bên cạnh xử lý P hòa tan bằng con đường hóa học, nhiều vi sinh vật có khả năng hấp
thu lượng lớn phosphate và tồn trữ chúng dạng poly-P nội bào. Nhiều nghiên cứu cũng
cho rằng cả hai quá trình hóa học và sinh học đều có vai trò quan trọng trong quá trình
hấp thu và giải phóng phosphate (Khoshmanesh et al., 1999). Tác động của vi khuẩn
trong quá trình hấp thu và giải phóng phosphate có thể thông qua con đường trực tiếp
như: sự phân hủy các hợp chất hữu cơ, tích tụ và phóng thích phosphate hoặc gián tiếp
thông qua quá trình khoáng hóa (Davelaar 1993). Chính vì vậy, vi khuẩn tích lũy polyP được xem xét và sử dụng trong quá trình loại bỏ các thành phần dinh dưỡng trong
các hệ thống xử lý nước thải (Mino et al., 1998), bên cạnh đó, chúng cũng hiện diện
trong các ao hồ trong tự nhiên (Davelaar 1993).
Vi khuẩn hấp thu P hòa tan đặc biệt là nhóm vi khuẩn tích lũy poly-P (PAOs) là nhóm
vi khuẩn có vai trò quan trọng trong xử lý nước thải bằng con đường sinh học. Chúng
tích lũy lượng lớn poly-P nội bào, góp phần vào quá trình loại bỏ P trong nước. Cách
1


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

đây vài thập niên, từ khi các kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để nhận dạng
nhóm vi sinh vật này cho thấy chúng có sự phong phú cao trong các hệ thống xử lý
nước thải. Khoảng 6 năm trở lại đây, nhiều nghiên cứu về vi sinh vật học và sinh lý sinh thái học đã có những bước phát triển nhảy vọt. Một lớn thông tin về bộ gen được
khám phá dựa vào các kỹ thuật giải trình tự DNA. Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên

cứu sự hiện diện và vai trò của vi khuẩn trong quá trình hấp thu P hòa tan trong nước ở
các ao - hồ, đặc biệt là trong các ao nuôi cá tra công nghiệp và các ao sinh học tiếp
nhận nước thải từ hệ thống xử lý chất thải chăn nuôi heo (biogaz).
Trong chuyên đề này sẽ tập trung tìm hiểu về quá trình trao đổi chất, cấu trúc quần thể
và sự phân bố về mặt sinh thái của nhóm vi khuẩn tích lũy poly-P trong các hệ thống
xử lý nước thải và trong các ao - hồ trong tự nhiên, nhằm mục đích tổng hợp các thông
tin nghiên cứu trên thế giới và trình bày một cách tổng quan về một số đặc tính sinh
học của nhóm vi khuẩn quan trọng này. Thông qua đó đề ra các phương pháp phân lập
và nhận diện vi khuẩn tích lũy poly-P.
1. 1. Khái quát về tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1. 1. 1 P và tác động của chúng đến chất lượng nước
Phospho được xác định như là yếu tố dinh dưỡng thiết yếu cho sự sống. P là thành
phần cấu tạo nên các hợp chất quan trọng của sự sống như: các phân tử di truyền
DNA, RNA; các phân tử cấu trúc như protein, lipid; các phân tử dự trữ năng lượng cho
tế bào như ATP, poly-P…Tuy nhiên, mặc dù P vừa là một yếu tố kiểm soát sự tăng
trưởng và phát triển của sinh vật nhưng chúng cũng là nhân tố chủ yếu gây ra hiện
tượng phú dưỡng hóa. Ở hàm lượng vượt mức cho phép, P kích thích mạnh mẽ khả năng
tăng sinh khối của thủy sinh vật như tảo, tảo lam…Bowman et al., (2007), chỉ ra rằng,
một lượng nhỏ P trong nước 0.1 mg/l và duy trì thời gian dài sẽ gây sự phát triển mạnh
mẽ của tảo. Sự biểu hiện có thể nhận biết rõ của hiện tượng này là sự bùng nổ của tảo, sự
giảm hàm lượng oxy hòa tan kéo theo nước ô nhiễm nặng, cá chết, các thực vật – động vật
thủy sinh dần dần bị tiêu diệt. Trong một vài trường hợp, có sự xuất hiện của tảo độc như
Microsystis. Sự quá dư thừa lượng dinh dưỡng trong nước làm gia tăng sự hoạt động các
vi sinh vật có hại như Pfisteria. Điều này sẽ tác động đến nền kinh tế thông qua ảnh
hưởng của chúng đến nghề nuôi cá thương mại, du lịch sinh thái và có thể ảnh hưởng đến
sức khỏe con người.
2


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

1. 1. 2 Nguồn chất thải từ ao nuôi cá tra và trại chăn nuôi heo ở ĐBSCL
Nguồn chất thải chủ yếu chứa lượng lớn P là phân động vật. Chúng tồn tại 3 dạng: P hữu
cơ (P liên kết trong các hợp chất hữu cơ), orthophosphate (PO 43-) và poly-P. Hầu hết các
P hữu cơ và poly-P có thể chuyển hóa thành PO43- thông qua quá trình sinh học. Ở
ĐBSCL nguồn thải chứa P từ phân chủ yếu từ các ao nuôi cá tra và trại chăn nuôi heo
công nghiệp.
Đối với nuôi cá tra công nghiệp
Ở các nơi có nguồn thải N và P cao như khu vực nuôi cá tra công nghiệp tập trung ở
ĐBSCL. Tổng N và P thải ra từ các ao nuôi cá tra khoảng 31,6 tấn N và 9,8 tấn P năm
2007 và 50,4 tấn N và 15,7 P tấn năm 2008 (De Silva et al., 2010). Nếu tất cả chúng
thải trực tiếp ra các con sông ở ĐBSCL thì gây cơ gây ô nhiễm nặng. Tuy nhiên,
không phải tất cả chúng đều thải ra các con sông ở ĐBSCL, một phần chất thải sử
dụng cho nông nghiệp và một phần chúng tích tụ trong bùn đáy ao hoặc được hấp thu
bởi các vi sinh vật trong ao. Phan et al., (2009) quan sát sự tích lũy thành phần dinh
dưỡng trong ao cho thấy rằng, khoảng 51% P được tích lũy trong bùn đáy ao. Điều này
cho thấy rằng vai trò quan trọng của các vi sinh vật trong quá trình tích tụ P hòa tan
trong nước nuôi cá tra.
Theo Lê Bảo Ngọc (2004), bình quân sản xuất 1kg cá Tra sẽ thải ra môi trường 23,2g
N và 8,6g P. Khi cho ăn, cá chỉ hấp thu được chỉ khoảng 17% năng lượng trong thức
ăn và phần còn lại (83%) sẽ thải ra và hòa lẫn trong môi trường nước trở thành các
chất hữu cơ phân hủy.
Theo Huỳnh Trường Giang et al., (2008) nước ao nuôi cá Tra thâm canh ở An Giang
vào mùa khô có TSS từ 3,5-122,7mg/l, TAN từ 0,053-2,513mg/l, PO 43- từ 0,0041,973mg/l, NO2- từ 0,001-1,359mg/l, NO3- từ 0,122-18mg/l; trong mùa mưa TSS từ
18,5-188mg/l, TAN từ 0,11-4,062mg/l, PO43- từ 0,003-2,28mg/l, NO2- từ 0,0341,359mg/l, NO3- từ 0,194-8,743mg/l.
Thay nước ao nuôi là việc làm rất cần thiết trong quá trình nuôi cá Tra. Số lần thay
nước trong sáu tháng bình quân là 30-40 lần và có thể lên đến 90 lần (Lê Anh Tuấn,
2008). Lượng nước nầy hầu như 100% được thải trực tiếp ra sông, rạch mà không qua

3


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

xử lý. Đây là mối đe dọa lớn đến chất lượng nước mặt cho sinh hoạt và tăng nguy cơ
lây lan bệnh trong nuôi trồng thủy sản.
Để có 100 tấn cá phi lê phải có 300 tấn cá nguyên liệu, tức phải cần 480 tấn thức ăn
thủy sản (tính theo hệ số chuyển hóa thức ăn bình quân 1,6). Như vậy, nếu vùng
ĐBSCL đạt chỉ tiêu 1 triệu tấn cá phi lê xuất khẩu thì phải đưa vào nguồn nước 4,8
triệu tấn thức ăn - tức cùng lúc phải làm sao có đến 26 triệu ha mặt nước để tự xử lý ô
nhiễm do 2,1 triệu tấn chất thải hữu cơ phát sinh.
Đối với các ao nuôi công nghiệp, chất thải trong ao có thể chứa đến 45% Nitrogen và
22% là các chất hữu cơ khác...Nguồn chất thải này lan truyền nhanh ra bên ngoài gây
nguy cơ ô nhiễm còn khiến dịch bệnh thủy sản phát sinh trong môi trường nước.
Đối với chăn nuôi heo
Số liệu thống kê cho thấy hoạt động chăn nuôi có khuynh hướng gia tăng từ năm 1990
đến năm 2002 về số lượng đầu heo và sản lượng thịt heo hơi xuất chuồng.
Hiện nay, do sự gia tăng nhanh về dân số và mức sống, nhu cầu về các sản phẩm chăn
nuôi (thịt, trứng, sữa) sẽ ngày càng gia tăng. Việc tăng nhanh số trại chăn nuôi là điều
tất nhiên, nhất là những trại nuôi có quy mô lớn. Đối với chăn nuôi heo, năm 2001 cả
nước có khoảng 22 triệu con heo, sản xuất 1,5 triệu tấn thịt hơi. Hàng năm tổng đàn
heo cả nước tăng khoảng 1% (Nguyễn Đăng Vang, 2002).
Ô nhiễm môi trường nước do nước thải chăn nuôi có thể gây ra hiện tượng phú dưỡng
đối với nước mặt. Do đó, các vi khuẩn phân hủy rong tảo cũng phát triển, sử dụng oxy
trong nước và khi chết đi tạo mùi vị khó chịu cho nước. Sự phú dưỡng cũng gắn liền
với sự phát triển của một loài sinh vật có hại mang tên Pfiesteria piscicida có khả năng

giết chết cá hàng loạt và gây bệnh cho người.
Tóm lược: P là yếu tố dinh dưỡng chính nhưng cũng là yếu tố kiểm soát chất lượng
nước. Ở hàm lượng P hòa tan vừa đủ thì cần thiết cho sự phát triển của thủy sinh vật,
tuy nhiên hàm lượng P vượt giới hạn cho phép sẽ phá vỡ sự cân bằng sinh thái thủy
sinh vật và ảnh hưởng đến môi trường sống. Ở các ao hồ, đặc biệt là các ao nuôi cá tra
và nước thải chăn nuôi heo có hàm lượng P cao dạng phosphate không những là vấn đề
nghiêm trọng có liên quan trực tiếp đến ô nhiễm môi trường nước xung quanh mà còn
tác động gián tiếp đến nghề nuôi cá trong khu vực.
4


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

1. 1. 3 Loại bỏ P sinh học
Loại bỏ P hòa tan có ý nghĩa vô cùng quan trọng. Hiện nay, một số biện pháp có thể
loại bỏ P được sử dụng là biện pháp hóa học và sinh học. Ba biện pháp được áp dụng
như lắng tụ P bằng quá trình bổ sung các kim loại như muối natri hoặc kẽm, loại bỏ P
bằng màng thấm lọc, tích tụ P trong tế bào vi sinh vật.
Quá trình loại bỏ P hòa tan bằng sinh học tùy thuộc vào hàm lượng P hòa tan và hiệu
quả của quá trình tách bùn. Sinh khối có thể chứa một lượng P 1.5 đến 2.5% (w/w)
trên chất rắn dễ bay hơi. Trong quá trình làm tăng cường sự loại bỏ P hòa tan, thì sinh
khối có thể chứa đến 6 đến 8%, một lượng P vượt quá mức nhu cầu thiết yếu của tế
bào. P tích lũy trong tế bào sẽ được loại bỏ bằng quá trình lắng tụ sinh học.
Quá trình loại bỏ P bằng con đường sinh học tùy thuộc vào sự tăng cường khả năng
của vi sinh vật hấp thu lượng phosphate tự do trong môi trường vào tế bào. Do đó, quá
trình này thường cho là quá trình làm tăng cường sự loại bỏ P sinh học (Enhanced
biological phosphorus removal – EBPR). EBPR được ứng dụng trong hầu hết các hệ
thống xử lý nước thải. Mặc dù EBPR cho thấy loại bỏ P hiệu quả, nhưng đôi lúc hoạt

động này bị gián đoạn. Nhiều nghiên cứu trong 50 năm qua đã góp phần giải thích
hiện tượng này. Tuy còn vài khía cạnh chưa được làm sáng tỏ, nhưng các nghiên cứu
cũng đã mang lại nhiều sự hiểu biết quan trọng về con đường trao đổi chất và được áp
dụng vào thực tiễn. Về mặt cơ bản, con đường trao đổi chất kỵ khí - hiếu khí và xác
định vi sinh vật có vai trò cho EBPR là rất quan trọng. Về mặt thực tiễn, sự áp dụng
đồng thời 2 quá trình: loại bỏ N và P với nồng độ oxy hòa tan thấp thì rất có ý nghĩa,
sẽ làm giảm đáng kể chi phí xử lý. Phương pháp xử lý bằng sinh học có thể làm giảm
nồng độ P trong nước xuống dưới 0.5 mg/l.
Trải qua nhiều năm nghiên cứu và áp dụng thực tế, các hệ thống xử lý nước thải đã
ứng dụng các đặc tính sinh lý của một vài nhóm vi khuẩn để loại bỏ P hòa tan, các vi
khuẩn này hấp thu lượng lớn phosphate hơn nhu cầu cần thiết cho quá trình trao đổi
chất và tồn trữ dạng poly-P nội bào. Nhóm vi sinh vật này được gọi là vi khuẩn tích
lũy poly-P (poly-P accumulating organisms – PAOs) (Mino et al., 1998) hay còn được
gọi với tên khác là Candidatus accumulibacter hay accumulibacter phosphatis (He et
al., 2011 and McMahon, 2011).

5


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Tóm lược: Bên cạnh sự loại bỏ P hòa tan trong nước bằng con đường hóa học, thì biện
pháp sinh học trở nên phổ biến và ngày càng được ứng dụng bởi vì các đặc tính hữu
dụng của chúng là: dễ ứng dụng, hiệu quả về mặt kinh tế và thân thiện với môi trường
sống. Quá trình tích tụ và hòa tan P bằng con đường sinh học, đặc biệt là thông qua vi
khuẩn, có vai trò quan trọng trong sự điều chỉnh hàm lượng P hòa tan trong nước.
Chúng giải phóng P từ bùn đáy ao vào các tầng nước thông qua quá trình phân rã các
hợp chất hữu cơ hoặc các hợp chất vô cơ chứa P (poly-P), bên cạnh đó, P cũng có thể

tích tụ trở lại bùn thông qua quá trình lắng tụ sinh học, kết quả là có thể loại bỏ P hòa
tan trong nước (Wang et al., 2005).
1. 1. 4 Poly-P

Hình 1: Cấu trúc chuỗi poly-P
Poly-P là polymer đầu tiên được xác định bởi Wiame (1947) như là một trong những
thành phần hạt quan trọng được tích lũy trong nội bào. Chúng có khả năng bắt màu khi
nhuộm và được mô tả từ năm 1900 (Wiame, 1947). Ngày nay, poly-P được nhận biết
như là biopolymer hiện diện hầu hết trong các sinh vật: vi khuẩn, nấm, thực vật và
động vật (Dawes và Senior, 1973). Poly-P là chuỗi thẳng bao gồm gốc phosphate nối
với nhau bằng cầu nối giàu năng lượng phosphoalhydride và chiều dài từ 3 tới 1000
gốc phosphate (Kulaev, 1979) (hình 1)

Hình 2: Ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử Burkholderia cepacia, các chấm đen
là hạt poly-P
6


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Poly-P hiện diện trong nội bào dưới dạng hạt màu đen với kích thước và số lượng khác
nhau khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử (hình 2). Dưới điều kiện thích hợp, poly-P có
thể tích lũy trong nội bào chiếm khoảng 10 – 20% trọng lượng khô của tế bào và vượt
mức nhu cầu cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của vi khuẩn, điều này chứng
minh sự hấp thu phosphate ngoại bào và tích lũy chúng dạng poly-P nội bào biểu hiện
vai trò trao đổi chất đặc biệt không chỉ là nguồn phosphate tồn trữ cho nhu cầu của tế
bào (Pick et al., 1990). Các nghiên cứu mô tả các đặc tính vật lý và hóa học của chuỗi
poly-P cũng như vai trò của chúng trong quá trình tiến hóa (Kortstee et al., 1994). Nhiều

nghiên cứu xác định sự diện hiện và ước lượng hàm lượng poly-P nội bào dựa vào số
lượng và kích thước các hạt poly-P thông qua hình ảnh chụp TEM (Boswell et al., 2001;
Eixler et al., 2005).
Trong một số điều kiện đặc biệt như môi trường nghèo dinh dưỡng, vi sinh vật tích lũy
phosphate và đồng hóa thành poly-P như là nguồn năng lượng để duy trì sự sống.
Thường hạt poly-P định vị vùng ngoại vi gần màng tế bào chất và chúng dễ dàng hòa
tan trong môi trường kiềm (Buzoleva et al., 2005). Eixler et al., (2005) sử dụng nhiều
phương pháp khác nhau để ly tích hạt poly-P nội bào của Chlorella vulgaris và
Synechocystic sp. (Bảng 2).
Bảng 1: Các chất sử dụng và điều kiện ly trích poly-P (Eixler et al., 2005)
Số nghiệm
thức
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13

Nước lạnh
Nước lạnh
Nước nóng
Nước nóng

0.2 M NaOH
0.2 M NaOH

Thời gian
ly trích
24 giờ
24 giờ
20 phút
20 phút
20 phút
6 giờ

0.2 M NaOH
1 M NaOH
1 M NaOH
1 M HCl
2 M HCl
4 M NaCl
2 M NaNO3

36 giờ
20 phút
6 giờ
20 phút
20 phút
20 phút
20 phút

Dung môi

7

Nhiệt độ ủ
Điều kiện khác
(0C)
20
Lắc siêu sóng 5 phút
20
100
Bể nước nóng
100
ủ trong nồi áp suất
20
20
20
20
20
100
20
20
20


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Kết quả cho thấy rằng NaOH và nước nóng thích hợp để ly tích poly-P mà không ảnh
hưởng đến sự thủy phân poly-P (Hình 3).
- e-SRP: Soluble reactive

phosphorus
- polyP: polyphosphate
- Cold water: nước lạnh
- Hot water: nước nóng

Hình 3: Hiệu quả trích poly-P bằng nước lạnh, nước nóng và NaOH ở những
nồng độ khác nhau từ Chlorella vulgaris ((Eixler et al., 2005).
Sau khi ly tích poly-P, dịch ly tích được lọc qua giấy lọc vi khuẩn có đường kính lổ lọc
0.45µm để loại bỏ xác tế bào và dịch lọc chứa poly-P dạng hòa tan. Kết quả cũng cho
thấy rằng, trong dịch lọc bên cạnh poly-P cũng còn có một phần phosphate tự do
(Eixler et al., 2005). Hiện nay, chưa có phương pháp định lượng hàm lượng poly-P mà
chỉ có thể xác định hàm lượng poly-P thông qua hàm lượng phosphate sau khi thủy
phân poly-P. Poly-P dễ dàng thủy phân trong dung dịch axit 1 M HCl ở nhiệt độ 100 0C
(Buzoleva et al., 2005).
Tóm lược: Poly-P được xem là nguồn P và là nguồn năng lượng nội bào cần thiết cho hoạt
động của PAOs. Chúng là các hạt bắt màu khi nhuộm, có thể hòa tan trong môi trường kiềm
mà không bị thủy phân. Chính vì vậy, có thể sử dụng định tính bằng chụp TEM
(Tranmission electron microscopy) và định lượng thông qua ly trích chúng bằng NaOH.
1. 1. 5 Chuyển hóa và điều hòa sự trao đổi chất trong PAOs
1. 1. 5. 1 Trao đổi chất với nguồn carbon là acetate
Acetate là nguồn carbon được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu về quá trình EBPR.
Trong E. coli acetate được vận chuyển qua kênh đồng vận chuyển acetate xuyên màng
(ActP) (Gimenez et al., 2003). Gen actP đã được xác định hiện diện trong bộ gen của
Accumulibacter. Acetate được chuyển xuyên màng thông qua kênh ActP cùng với sự
chênh lệch gradient nồng độ H+ hoặc Na+ (hình 5). Tương tự như ActP của E. coli, sự

8


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

hấp thu acetate của vi khuẩn Accumulibacter bị ức chế bởi thể vận chuyển proton
carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP).
Vài dạng trao đổi chất được nghiên cứu để mô tả sự biến đổi sinh hóa các nguồn carbon
trong quá trình trao đổi chất. Khi nghiên cứu với acetate như là nguồn carbon duy nhất,
quá trình trao đổi chất được trình bày trong hình 4
Quá trình EBPR được biết đến như sự biến đổi theo chu
trình của các chất tích lũy nội bào như poly-P, PHAs và
glycogen. Trong điều kiện kỵ khí, poly-P nội bào bị thủy
phân tạo năng lượng ATP cho quá trình hấp thu các chất
hữu cơ như các axid béo mạch ngắn và thông qua quá
trình đó phosphate phóng thích ra môi trường. VFAs được
chuyển hóa thành PHAs. Ngược lại, dưới điều kiện hiếu
khí, PHAs bị oxy hóa và P được hấp thu vào trong tế bào
trở lại và đồng hóa thành poly-P. Song song với quá trình
này thì glycogen được tái tổng hợp và tế bào sẽ tăng
trưởng và phát triển (Hình 4)
Hình 4: Mô tả các đặc điểm sinh hóa chính trong quá trình EBPR. Sự chuyển đổi
kiểu trao đổi chất xảy ra dưới điều kiện kỵ khí và hiếu khí.
1. 1. 5. 2 Trao đổi chất với nguồn carbon khác
Dạng trao đổi chất trên được nghiên cứu chủ yếu dựa trên các hệ thống bùn hoạt tính
nhân tạo với acetate là nguồn carbon duy nhất. Tuy nhiên, trong hệ thống bùn hoạt tính
trong tự nhiên, bên cạnh acetate thì còn có nhiều hợp chất carbon mạch ngắn khác. Sự
trao đổi chất kết hợp giữa các nguồn carbon khác nhau thì chưa được nghiên cứu
nhiều. Có báo cáo cho rằng, khi thí nghiệm với glucose là nguồn carbon duy nhất thì
quá trình EBPR sẽ thất bại. Tuy nhiên, dạng trao đổi sinh hóa cho quá trình EBPR với
glucose cũng được báo cáo và cho rằng khi bổ sung glucose sẽ có tác dụng hỗ trợ cho
sự ổn định quá trình EBPR. Đầu tiên glucose sẽ được chuyển hóa thành acid lactic bởi

vi khuẩn lên men lactic. Chúng có vai trò đồng hóa glucose dưới điều kiện kỵ khí và
tạo ra acid lactic và cuối cùng là tồn trữ glycogen. Một số giống có khả năng sử dụng
amino acid như là nguồn hoạt chất.

9


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Các dạng trao đổi chất sinh hóa hiện nay vẫn chưa giải thích hết các thông tin nhận
được từ các sự quan sát cho quá trình EBPR như sự đồng hóa hoạt chất dưới điều kiện
kỵ khí cùng với sự thủy phân poly-P và sự chuyển hóa glycogen tới PHA, EBPR cũng
có thể hoạt động với nguồn carbon là glucose nhưng không có sự tích lũy PHAs. Điều
này thể hiện thiếu các cơ sở để giải thích một cách hoàn toàn và đầy đủ về quá trình
EBPR, cũng như thiếu các nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của quần thể vi khuẩn
này. Có lẽ các dạng trao đổi chất này chỉ có thể giải thích một cách thích đáng khi
nghiên cứu quá trình trao đổi chất dưới điều kiện nuôi cấy thuần các dòng vi khuẩn
phân lập được với các dạng khác nhau của PAOs để xác định lại các quá trình trao đổi
chất được tìm thấy trong các hệ thống có sự tăng cường loại bỏ phosphate.
1. 1. 5. 3 Ảnh hưởng của tỉ lệ giữa hàm lượng carbon và
phosphate trên khả năng đồng hóa và dị hóa poly-P
Tính hữu dụng của nguồn carbon là yếu tố cơ bản cho quá trình EBPR bởi vì vi khuẩn
tích lũy poly-P sử dụng nguồn carbon đặc biệt (như acetate) cho quá trình sinh tổng
hợp. Tỉ lệ COD (biểu thị qua hàm lượng carbon) và P (mg/mg) trên 40 thì thích hợp để
xử lý phosphate hòa tan và quá trình EBPR được duy trì ổn định (Randall et al., 1992).
Dạng hợp chất carbon cũng là yếu tố quan trọng, tỉ lệ các hợp chất hữu cơ mạch ngắn
(như acetate, propionate, succinate,…) phải chiếm tỉ lệ cao trong hàm lượng COD, hoặc
hàm lượng COD có thể dễ dàng bị phân hủy nhanh chóng thành VFAs bởi các vi khuẩn

khác. Tỉ lệ VFAs và P khoảng 14 hoặc COD dễ phân hủy và P là 16 trong nước thải
được xem là thành phần lý tưởng cho vi khuẩn tích lũy poly-P hoạt động và nhận được
hàm lượng thấp phosphate hòa tan (Barnard và Abraham, 2006). Bên cạnh đó, một vài
nghiên cứu cho rằng tỉ lệ COD và P cao sẽ mang lại các điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn
tích lũy glycogen, vì vậy dẫn đến quá trình EBPR không hiệu quả (Liu et al., 1997). Để
hạn chế sự phát triển của GAOs, Schuler và Jenkins (2003) đề nghị tỉ lệ COD (acetate)
và P khoảng 10 sẽ hạn chế sự giới hạn về nguồn carbon và P cho quá trình hoạt động
của vi khuẩn và nhận được hàm lượng thấp phosphate hòa tan sau khi xử lý.
Panswad et al., (2007) nghiên cứu tỉ lệ giữa P và COD và đánh giá hàm lượng P nội
bào trong vi khuẩn tích lũy poly-P, cho rằng khi tỉ lệ giữa P và COD tăng từ 0.02, 0.04
và 0.16 thì hàm lượng P trong bùn hoạt tính ở điều kiện hiếu khí tăng từ 0.053 tới
0.084 và 0.205 mg P/mg VSS).
10


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Soejima et al., (2008) nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng acetate trên quá trình xử
lý đồng thời P và N. Ở thời gian đầu của quá trình xử lý hiếu khí, sự bổ sung acetate
(COD) sẽ ngăn cản quá trình hấp thu phosphate bởi PAOs. Tốc độ hấp thu phosphate
có liên quan trực tiếp đến sự hiện diện và hàm lượng carbon ngoại bào. Tốc độ hấp thu
phosphate giảm đột ngột khi hàm lượng COD dao động 0 – 20 mg/l và giải phóng
phosphate ra khỏi tế bào khi hàm lượng COD cao hơn 40 mg/l. Điểm cân bằng giữa
hấp thu và giải phóng phosphate khi hàm lượng COD là 10 mg/l (Hình 6).

Hình 5: Mối tương quan giữa tốc độ hấp thu phosphate và hàm
lượng COD ngoại bào
Trong quá trình đồng xử lý P và N, sự bổ sung nguồn carbon nhằm hạn chế sự hấp thu

nhanh chóng phosphate của vi khuẩn tích lũy polyphosate trong môi trường, để cung
cấp phosphate cho hoạt động của vi khuẩn vừa có khả năng loại bỏ N và P, và vì vậy
có thể xử lý đồng thời chúng. Hàm lượng COD từ 50 – 100 mg/l ở thời điểm đầu của
quá trình hiếu khí sẽ hạn chế sự hấp thu phosphate và có thể nhận được sự loại bỏ
đồng thời P và N khi xử lý bằng vi khuẩn DPAOs.
Nghiên cứu này cũng phù hợp với You et al., (2004) khi nghiên cứu ảnh hưởng của
hàm COD trên khả năng hấp thu và giải phóng phosphate trong điều kiện hiếu khí và
thiếu oxy của vi khuẩn DPAOs và PAOs cho thấy rằng khi hàm lượng COD cao chúng
sẽ phòng thích phosphate ra khỏi tế bào.

11


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

1. 1. 5. 4 Ảnh hưởng pH và Mg2+ trên quá trình đồng hóa và dị
hóa poly-P và acetate
Sự vận chuyển điện tử thông qua chuỗi dẫn truyền điện tử định vị trên màng tế bào
chất của vi khuẩn có nhiệm vụ giải phóng proton ra khỏi tế bào. Sự chênh lệch hàm
lượng proton trong và ngoài màng tế bào tạo ra sự khác biệt lượng proton và điện tích
xuyên màng được gọi là lực vận chuyển điện tử (Neidhardt et al., 1990). Năng lượng
vận chuyển điện tử xuyên màng được vi khuẩn sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau
như tổng hợp ATP thông qua bơm proton (ATPase) và vận chuyển hoạt chất vào trong
tế bào theo sự chênh lệch gradient nồng độ. van Veen et al., (1994) chứng minh rằng
Acinetobacter johnsinii 210A có khả năng dự trữ năng lượng cần thiết cho quá trình
trao đổi chất từ các hạt poly-P tích lũy.

Hình 6: Sơ đồ mô tả sự đồng vận chuyển MeHPO4/H+ với nguồn năng lượng cần cho

các quá trình vận chuyển trong A. johnsonii 210A (van Veen et al., 1994). (1) H+ATPase, (2) kênh vận chuyển MeHPO4/H+, (3) kênh đồng vận chuyển lysine/proton,
(4) kênh vận chuyển thuận nghịch sodium/proton, (5) kênh đồng vận chuyển
proline/sodium, CM: màng tế bào, pro: proline, lys: lysine.
Khi tế bào cần lượng lớn phosphate cho tăng trưởng, sẽ có lượng lớn phosphate phóng
thích ra khỏi tế bào từ sự phân hủy poly-P. Song song đó, lượng lớn ATP nội bào được
tạo ra và làm gia tăng điện thế xuyên màng. Hệ thống đồng vận chuyển ion kim loại và
phosphate (MeHPO4) thông bơm MeHPO4/H+ ra khỏi tế bào, tạo lực dịch chuyển proton
cần thiết cho quá trình vận chuyển H+-ATPase, Na+/H+ và Lys/H+ (Hình 7). pH cao sẽ
làm gia tăng giải phóng phosphate trong điều kiện kỵ khí vì sử dụng lực vận chuyển
proton để tổng hợp ATP ở màng tế bào. Bên cạnh đó, ion Mg 2+ kích thích PAOs hấp thu
12


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

lượng lớn phosphate thông qua hệ thống MgHPO4/H+ dưới điều kiện hiếu khí và ức chế
giải phóng phosphate trong điều kiện kỵ khí. Sự tích lũy poly-P xảy ra cùng với sự hấp
thu và tích lũy ion K+ và Mg2+ trong tế bào. Sự phóng thích phosphate cũng xảy ra cùng
với sự phóng thích ion K+ và Mg2+ ra khỏi tế bào (Wu et al., 2006).
Năng lượng cho quá trình hấp thu hoạt chất đã được xem như là yếu tố điều hòa cơ
bản cho quá trình hấp thu nguồn carbon bởi vi khuẩn PAOs và GAOs (Liu et al., 1997;
Smolders et al., 1994). Nghiên cứu cho thấy rằng, trong điều kiện môi trường kiềm, vi
khuẩn cần nhiều năng lượng hơn để hấp thu hoạt chất. Chính vì vậy, sự gia tăng pH sẽ
tạo điều kiện thuận lợi cho PAOs hơn GAOs. Các nghiên cứu cho thấy rằng điều kiện
pH cao ức chế sự phát triển của GAOs hơn là ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất
của PAOs. Liu et al., (1996) nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên quá trình chuyển hóa
acetate cho thấy rằng, khi pH ban đầu trong môi trường khoảng 5 - 6.5 sự hấp thu
acetate và phóng thích phosphate sẽ tăng cùng với sự gia tăng pH theo, khi pH trong

khoảng 6.5 - 8 sự hấp thu acetate cân bằng nhưng tốc độ giải phóng phosphate vẫn
tăng. Khi pH trên 8.0 thì hấp thu acetate và giải phóng phosphate bắt đầu giảm. Filipe
et al., (2001) chứng minh rằng sự tăng trưởng và phát triển của PAOs, quá trình loại bỏ
phosphate, phân hủy PHAs trong điều kiện hiếu khí chịu ảnh hưởng bởi pH. Khi pH
thấp ảnh hưởng lên quá trình trao đổi chất của PAOs, tốc độ hấp thu phosphate chỉ
khoảng 37% ở pH 7.5, bên cạnh đó tốc độ phân hủy PHAs và sự tăng trưởng của PAOs
giảm đáng kể. pH giảm xuống 6.5 khả năng loại bỏ phosphate trong môi trường giảm
theo. Khi pH tăng trên 7 sẽ không có ảnh hưởng bất lợi lên PAOs, chính vì thế mang
lại sự ổn định trong quá trình EBPR. Trong điều kiện kỵ khí, sự gia tăng pH không
ảnh hưởng tới khả năng hấp thu acetate của tế bào là do PAOs có thêm nguồn năng
lượng dự trữ dưới dạng poly-P, sự thủy phân poly-P cung cấp thêm nguồn năng lượng
ATP cần thiết khi pH trong môi trường gia tăng.
Tóm lược: Kiểu trao đổi chất của PAOs đã được nghiên cứu và mô trả như là tiến
trình sinh hóa. Trong điều kiện kỵ khí, poly-P nội bào bị thủy phân tạo năng lượng
ATP cho quá trình hấp thu các chất hữu cơ như các axid béo mạch ngắn (short chain
fatty acids – SCFAs) hay các acid hữu cơ dễ bay hơi (Volatile fatty acids – VFAs) như
acetate và thông qua quá trình đó P phóng thích ra môi trường. VFAs được chuyển hóa
thành polyhydroxyalkanoates (PHAs), một loại polymer có năng lượng khử cao hơn
13


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

VFAs. Năng lượng sử dụng cho quá trình chuyển hóa này được cung cấp từ sự phân
hủy glycogen nội bào hoặc từ chu trình tricarboxylic acid (TCA). PHAs được xem là
nguồn carbon và là nguồn năng lượng cho sự tăng trưởng và phát triển của PAOs.
Ngược lại, dưới điều kiện kỵ khí, PHAs bị oxy hóa tạo năng lượng cung cấp hấp thu P
trở lại vào trong tế bào trở lại và đồng hóa thành poly-P. Song song với quá trình này

thì glycogen được tái tổng hợp và tế bào sẽ tăng trưởng và phát triển. Vì vậy, quá trình
EBPR được biết đến như sự biến đổi theo chu trình của các chất tích lũy nội bào như
poly-P, PHA và glycogen. Với đặc điểm trao đổi chất này, có thể sử dụng cấy luân
phiên giữa hai môi trường có bổ sung nguồn carbon và không bổ sung nguồn carbon
mà PAOs vẫn có thể phát triển bình thường, để có thể chọn lọc ban đầu trong quá trình
phân lập. Bên cạnh đó, sự hấp thu nguồn carbon, sự phóng thích hoặc tích lũy poly-P
phụ thuộc vào nhiều yếu tố và nồng độ các hoạt chất khác nhau như COD, Mg 2+, K+,
pH. Chính vì vậy, khi tuyển chọn các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P để ứng dụng vào
thực tiển, thì các điều kiện này là rất cần thiết để tạo môi trường tuyển chọn phù hợp
với các đặc tính và yếu tố trao đổi chất của PAOs, cũng như phù hợp với thành phần và
tính chất của nước ao nuôi cá tra.
1. 1. 6 Tình hình nghiên cứu cấu trúc quần thể vi khuẩn poly-P trong hệ thống xử
lý nước thải
Trải qua nhiều thập niên ứng dụng quá trình EBPR để xử lý nước thải, mặc dù chúng
thể hiện tính hiệu quả về mặt kinh tế và thân thiện với môi trường, nhưng đôi lúc quá
trình này biểu lộ tính không ổn định và quá trình loại bỏ P khỏi nước thải đôi khi thất
bại (Neethling et al., 2005). Chính vì thế tìm hiểu rõ poly-P được tích lũy bởi nhóm vi
sinh vật nào, chúng tích lũy để làm gì và tích lũy như thế nào có vai trò quan trọng để
cung cấp cơ sở cho thiết kế, vận hành và khắc phục các sự cố không mong muốn xảy
ra trong các hệ thống xử lý nước thải.
Từ nghiên cứu phân lập đầu tiên của Fuhs và Chen (1975) cho rằng các loài vi khuẩn
thuộc giống Acinetobacter được xác định như là PAOs. Vào những năm 1980, nhiều
báo cáo cũng cho rằng sự đa dạng loài trong giống Acinetobacter trong bùn hoạt tính
của các hệ thống xử lý (Stephenson, 1987). Sau đó, Acinetobacter được xem là nhóm
vi khuẩn có vai trò chính trong quá trình EBPR (Auling et al., 1991; Carr et al., 2001;
Ohtake et al., 1985; Tandoi et al., 1998; Bark et al., 1992; Boswell et al., 2001; Sidat et
14


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

al., 1999), nhiều nghiên cứu về các kiểu trao đổi chất phản ánh các đặc tính trao đổi
chất của PAOs tập trung vào nhóm vi khuẩn này (Wentzel et al., 1986; Wentzel, 1991).
Trong các loài thuộc giống Acinetobacter, A. Johnsonii cho thấy có khả năng tích lũy
lượng lớn poly-P và được xem là loài vi khuẩn kiểu mẫu cho nghiên cứu về quá trình
trao đổi năng lượng, các enzyme chuyển hóa poly-P và quá trình vận chuyển các hoạt
chất qua màng tế bào (van Veen et al., 1994). Những năm gần đây, các kỹ thuật sinh
học phân tử được sử dụng để mô tả cấu trúc quần thể của PAOs dựa trên mối quan hệ
phát sinh loài. Áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong việc xác định quần thể của
PAOs cho thấy vi khuẩn trong bùn hoạt tính của các hệ thống xử lý nước thải rất đa
dạng bao gồm các lớp Proteobacteria (α, β và ɣ), Gram positive với hàm lượng G+C
cao (Actinobacteria), Planctomycetes và Bacteroides (Crocetti et al., 2000; Ahn et al.,
2007; Bond et al., 1995; Bond et al., 1999; Kong et al., 2005; Liu et al., 2001; Gloess
et al., 2008; Tamaki et al., 2005). Bên cạnh đó, thường có sự khác nhau về thành phần
các nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế trong các hệ thống xử lý khác nhau. Sự thể hiện thành
phần và tính chất của từng loại nước thải mà có sự khác biệt trong thành phần của
PAOs (Beer et al., 2006; Wong et al., 2005; Crocetti et al., 2000). Trong lớp
Actinobacteria các vi khuẩn được xem là PAOs như Arthrobacter sp. (Shoda et al.,
1980), Mycobacterium sp. (McMahon et al., 2002), Gordonia sp. (Beer et al., 2006).
Nguyen et al., (2011) sử dụng kỹ thuật dò mẫu gen kết hợp khuếch đại và giải trình tự
đoạn 16S rRNA bằng cặp mồi (27F và 1492R) của nhóm vi khuẩn Actinobacteria
trong các hệ thống EBPR phát hiện giống Tetrasphaera thuộc họ Intrasporangiaceae
chiếm khoảng 30% trên tổng số vi khuẩn quan sát và có các kiểu hình khác nhau. Khả
năng hấp thu orthophosphate và hình thành poly-P xảy ra ở hầu hết các dòng
Tetrasphaera. Khả năng hấp thu orthophosphate dưới điều kiện hiếu khí chỉ xảy ra khi
chúng hấp thu nguồn carbon dưới điều kiện kỵ khí. Nguồn carbon rất đa dạng như
amino axít, glucose và acetate. Chúng có hình dạng rất khác nhau như hình que ngắn,
que chia nhánh, hình cầu, hình sợi.

Ivanov et al., (2005) phân tích vi khuẩn loại bỏ phosphate dựa trên khuếch đại và giải
trình tự 16S rRNA bằng cặp mồi 27F và 1492R cho thấy Stenotrophomonas
maltophilia LMG 10989 có khả năng loại bỏ phosphate cao vừa là giảm hàm lượng Fe
với tỉ lệ 0.17 g P/g Fe2+.
15


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Hesselmann et al., (1999) đặt tên nhóm vi sinh vật tích lũy Poly-P là Candidatus
accumulibacter phosphatis hay accumulibacter. Chúng được xem là nhóm có liên quan
trực tiếp đến Rhodocyclus. Các nghiên cứu sau đó cũng chứng tỏ Accumulibacter rất
phổ biến (Oehmen et al., 2007). Trong một số nơi Accumulibacter chiếm khoảng 90%
trong bùn hoạt tính có khả năng loại bỏ phosphate cao. Sau đó, một số nghiên cứu
cũng cho biết, không chỉ có Accumulibacter chứa hạt Poly-P (poly-P) và một vài nhóm
vi khuẩn khác cũng có như Actinobacter (Wong et al., 2005). Tuy nhiên, Actinobacter
không thể hấp thu các axit béo dễ bay hơi (volatile fatty acids - VFAs). Hấp thu VFAs
là đặc tính chính được quan sát trong nhiều tiến trình EBPR. Điều này cho thấy, vai trò
quan trọng của nhiều vi sinh vật khác nhau trong quá trình EBPR.
Nakamura et al. (1991, 1995) phân lập Micrococcus strain NM-1. Chúng tích lũy PolyP trong điều kiện hiếu khí và sử dụng chúng như là năng lượng để hấp thu nguồn
carbon trong điều kiện kỵ khí như glucose và casamino axít, không phải là acetate.
Ubukata và Takii (1994) cũng phân lập dòng vi khuẩn tương tự và chứng minh rằng
các vi khuẩn này chỉ thể hiện sự đồng hóa nguồn carbon (PHAs) và tích lũy poly-P vào
trong tế bào khi có sự luân phiên quá trình kỵ khí –hiếu khí. Tuy nhiên, chúng không
phải là một trong các vi khuẩn nổi trội trong tiến trình EBPR vì chúng không chuyển
hóa acetate tới PHAs dưới điều kiện kỵ khí. Gần đây, việc áp dụng các kỹ thuật sinh học
phân tử như FISH (Fluorescence in situ hydridization) (Wagner et al., 1994 ; Kampfer et
al., 1996 ; Liu, 1995) cho thấy có ít nhất ba nhóm vi khuẩn có vai trò quan trọng trong

quá trình EBPR với hình dạng khác nhau.
Auling et al., (1991) sử dụng phương pháp DAP để phân tích quần thể vi sinh vật tích
lũy poly-P trong hệ thống xử lý nước thải. Bên cạnh Acinetobacter còn có Pseudomonas
sp. và Xanthobacter sp. cũng góp phần quan trọng trong quá trình EBPR.
Sidat et al., (1999) phân lập các vi khuẩn tích lũy Poly-P trong bùn hoạt tính cho thấy
có sự đa dạng trong thành phần các chủng vi khuẩn phân lập có khả năng tích lũy
Poly-P. Bên cạnh hai giống Pseudomonas spp. (chiếm 58% trên tổng số vi khuẩn phân
lập được) và Staphylococcus spp. (chiếm 40%), còn có một số giống cũng có khả năng
tích lũy lượng lớn Poly-P như Acinetobacter calcoaceticus, Enterobacter spp.,
Aeromonas spp., Moraxella spp., Bacillus cereus. Trong đó, Enterobacter spp. và
Pseudomonas spp. tích lũy Poly-P nhiều nhất (> 5.3 x 10-12 mg/tế bào).
16