PROTEOMICS TRONG NGHIÊN cứu BIOMARKER

Proteomics trong nghiên cứu biomarker

I.

Mở đầu

II.

Tổng quan tài liệu

II.1

. Biomarker

II.1.1 Định nghĩa và nhu cầu của biomarker
II.1.2 Phương pháp nghiên cứu biomarker
II.1.3 Những thành quả của nghiên cứu biomarker
II.1.4 Những vấn đề cần hoàn chỉnh để ứng dụng biomarker
II.1.5 Khả năng nghiên cứu và lợi ích ứng dụng biomarker ở Việt Nam:
II.2

. Proteomic

2.2.1. Định nghĩa
2.2.2. Ý nghĩa của proteomics trong khoa học ngày nay
II.3
III.

Proteomic đối với nghiên cưứ biomarker
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

III.1

Vật liệu nghiên cưứ

III.2

Phương pháp nghiên cứu

III.2.1Tinh lọc protein các mẫu phẩm
III.2.2Phân tách và phân tích protein
III.2.3Kỹ thuật khối phổ
III.2.4Công nghệ cân bằng hạt
III.2.5Công nghệ ProteinChip SELDI
IV.

Quy trình thí ngiệm

IV.1

.Thu mẫu

IV.2

.Chuẩn bị mẫu

IV.3

.Điện di hai chiều

IV.4

.Phân tích bản gel điện di

IV.5

Cắt và thủy phân các spot

IV.6

Chứng thực các biomarker mới được phát hiện

V.

Kết quả

VI.

Khả năng nghiên cứu và ứng dụng ở Việt Nam
1


Proteomics trong nghiên cứu biomarker

PROTEOMICS TRONG NGHIÊN CỨU BIOMARKER
I.

Mở đầu
Biomarker là tập thể của một số gene hay protein tiêu biểu cho một trạng

thái thay đổi sinh học. Vì vậy vai trò của nghiên cưứ proteomics trong

biomarker là thiết yếu.. Tuy nhiên số lượng lớn các protein đặc biệt là bản
chất phức tạp của protein là một trở ngại lớn cho các nghiên cưứ biomarker.
Ý thức được tầm quan trọng đó của biomarker, viện Nghiên cứu Y tế Quốc
Gia Hoa Kỳ (NIH) đã lập một chương trình với ngân quỹ trên 100 triệu
dollar đặc trách giải quyết các vấn đề đẩy mạnh tiến bộ của proteomics. Mục
đích là thiết lập và tài trợ mạng lưới liên kết nhứng phòng thí nghiệm trên thế
giới nghiên cưứ và proteomics, đồng bộ hóa và hoàn chỉnh các kỹ thuật và
phương pháp của proteomics cho mạng lưới nghiên cứu này. Việc đồng bộ
hóa rất quan trọng về phương diện kỹ thuật vì trên thực tế, thường có những
khác biệt về số lượng các biomarker thu nhận từ các phòng thí nghiệm khác
nhau. Việc liên kết mạng lưới các phòng thí nghiệm nhằm tiến đến tạo dựng
một kho dữ kiện biomarker cho các loại bệnh lý và các đề tài sinh học.[2] .
II.
II.1

Tổng quan tài liệu
Biomarker. [3].

II.1.1 Định nghĩa và nhu cầu của biomarker:

Biomarker là những phân tử biểu hiện một dữ kiện sinh học.
Biomarker có thể đơn thuần là hóa chất, như glucose là dấu ấn của bệnh tiểu
đường, hoặc phân tử protein như các kháng thể (antibody) là dấu ấn của
bệnh nhiễm trùng, và gene hay DNA marker là dấu ấn cho các bệnh liên
quan đến di truyền. Với phát triển của những kỹ thuật tân sinh học có khả
năng nghiên cứu nhiều phân tử trên cùng một mẫu phẩm như microarray,
proteonomics, ngày nay biomarker thường là một nhóm gene hay protein
của dữ kiện sinh học.

2

Proteomics trong nghiên cứu biomarker

Về bệnh lý, khác với các yếu tố bệnh (pathogen agent) được mô tả
dưới dạng thức phân tử như gene hay vi khuẩn là những “nguyên nhân” gây
bệnh, biomarker chỉ là “biểu hiệu” (symbol) của bệnh. Những biểu hiện này
bao gồm tất cả mọi thay đổi của tế bào có liên quan đến bệnh lý. Như vậy,
biomarker bao gồm những phân tử gây bệnh và những phân tử được tạo ra
sau khi bệnh phát triển.
Biomarker còn được gọi một hiện tượng sinh học, những nghiên cứu
gần đây đã chứng minh tính hữu dụng của biomarker cho nhiều bộ môn sinh
học từ nghiên cứu đến ứng dụng. Các nhà nghiên cứu biomarker tin tưởng
rằng chữ ký sinh học chứa đựng những bí ẩn về bệnh lý, cho nên việc truy
tìm chữ ký sinh học sẽ giúp đạt được những kết quả có tầm ứng dụng hữu
hiệu và lớn lao trong y học. Những ứng dụng này gồm các phương pháp
chẩn đoán chính xác cho các bệnh phức tạp liên hệ đến nhiều gene (ung thư,
tiểu đường, tim mạch, thần kinh...), hoặc các bệnh miễn nhiễm, di truyền,
nhiễm trùng hay bệnh do yếu tố môi trường. Biomarker cũng có nhiều kỳ
vọng trong ứng dụng đo lường hiệu ứng của thuốc.
Vì những lý do trên, biomarker đã là một trong những nghiên cứu
trọng yếu của tân sinh học trong những năm qua, và đã có những kết quả
cho thấy tầm quan trọng của biomarker trong việc mang lại ứng dụng của
gene cho chẩn đoán bệnh lý cũng như rất nhiều khía cạnh y học, khoa học
khác. Những ứng dụng chẩn đoán của biomarker phác họa dưới đây cho
thấy tương quan lớn lao của biomarker trong rất nhiều ngành của bộ môn
sinh học. Thực khó có thể trình bày mọi khía cạnh của biomarker trong giới
hạn bài viết nàỵ
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu biomarker:
Như đã nêu trên, biomarker bao gồm rất nhiều dạng, từ hóa chất

cho đến gene và protein. Các phương pháp truy tìm biomarker chủ yếu dò
tìm các phân tử protein, vì protein là sản phẩm cuối cùng của gene và tác
động trực tiếp đến các hiện tượng sinh học. Lý do quan trọng hơn nữa là
3


Proteomics trong nghiên cứu biomarker

protein là thành phần sinh học phong phú nhất của tế bào so với mRNA
hay xa hơn nữa là gene. Một gene có thể có nhiều bản sao mRNA và chu
trình dịch mã (translation) và biến đổi sau dịch mã (post translational
modification) của những bản sao thường tạo ra nhiều protein hơn số bản
sao mRNA.
Theo ước lượng hiện nay, có khoảng từ 300.000 đến 500.000 protein
từ số lượng khoảng 30.000 gene của bộ gene người. Sự phong phú về dạng
thức và số lượng protein này sẽ là những dấu ấn làm nổi bật lên sự khác biệt
về hiện tượng sinh học của tế bào khi có thay đổi. Một số nhóm nghiên cứu
dùng các dữ kiện biểu hiện gene (gene expression profile) làm biomarker,
hoặc kết hợp protein và RNA, DNA để có độ chính xác cao hơn, nhưng
đương nhiên cũng sẽ phức tạp hơn. Gần đây, hiện tượng methyl hóa DNA
và RNAi cũng là đối tượng mới của nghiên cứu biomarker vì vai trò quan
trọng của chúng trong việc điều hành chức năng gene liên hệ đến bệnh lý.
Có thể nói về nguyên tắc, tìm kiếm biomarker đơn giản hơn nhiều so
với việc truy tìm các gene bệnh lý. Khác với các nghiên cứu gene và bệnh
lý, biomarker không đòi hỏi tìm hiểu cơ chế thường rất phức tạp của các mô
hình bệnh. Theo định nghĩa, biomarker là tất cả những thay đổi được tế bào
biểu hiện từ một trạng thái sinh học này so với trạng thái sinh học khác. Nói
về bệnh tật, thì biomarker là tất cả những protein thay đổi từ trạng thái bình
thường đến trạng thái bệnh lý. Cho nên, phương pháp chính xác định
biomarker dựa trên hai bước kỹ thuật là: ly trích protein và so sánh sự thay

đổi protein ở các mẫu phẩm.
Về thực dụng, việc tìm kiếm biomarker qua một số giai đoạn và có
những khó khăn chưa được giải quyết vì bản chất còn mới mẻ của môn
khoa học này. Các giai đoạn chính gồm:
- Tinh lọc protein của các mẫu phẩm: Nhiều nghiên cứu biomarker
cần tinh lọc các mẫu phẩm để làm giàu (enrich) nồng độ protein liên hệ đến
biomarker. Việc tinh lọc nhằm mục đích loại bỏ các protein có nồng độ cao
4


Proteomics trong nghiên cứu biomarker

và thường không có vai trò quan trọng về bệnh lý như serum albumin ở
máu, các protein tạo thình của tế bào như actin, tubulin. Việc thanh lọc
protein có thể thực hiện bằng nhiều phương pháp sinh hóa như sắc ký, hoặc
dùng kháng thể đơn dòng để loại những protein. Việc làm giàu protein có
tầm quan trọng về kỹ thuật, nghiên cứu từ các tiến trình sinh học của tế bào
và về bệnh lý cho thấy các protein có vai trò chức năng (functional proteins)
thường biểu hiện ở nồng độ rất thấp, nM so với mM, của những protein cấu
trúc (structural proteins) hay vận chuyển (carier proteins).
- Các phương pháp ly trích và phân tích protein: Có nhiều phương
pháp ly trích protein được áp dụng để khởi công truy tìm biomarker. Các
phương pháp này đều nhằm phân lập các protein sai biệt giữa hai trường
hợp sinh học. Sắc ký cột (chromatography column), và điện di protein hai
chiều (2 D protein gel electrophoresis) là hai phương pháp thông dụng.
Phương pháp sắc ký cột loại các ion axit hay kiềm để ly trích các protein
dựa theo đặc tính axit và kiềm; hoặc dựa vào độ ưa nước (hydrophyllic) hay
kỵ nước (hydrophobic). Phương pháp điện di protein hai chiều có thể giúp
so sánh sự khác biệt protein dựa trên trọng lượng phân tử (molecular
weight) và điện tích (charges) của các protein. Cả hai phương pháp sắc ký

cột và điện di đều có trở ngại là số lượng protein được phân tích rất giới
hạn. Điện di hai chiều chỉ có thể phân tích được khoảng từ 2.000 đến 10.000
protein trên một điện di đồ; chúng ta biết đó là một con số rất nhỏ so với
tổng số protein có thể từ 300.000 đến 500.000 phân tử trong tế bào.
Trong các nghiên cứu hậu genome, ngành proteomics cộng với kỹ
thuật khối phổ (mass spectrometry) đã tạo những bước tiến đột phá cho bộ
môn nghiên cứu biomarker. Kỹ thuật này còn được gọi là Mass-spect
/Proteonomic-based Approach. Trong kỹ thuật này, protein được ion hóa để
tách ra khỏi các phức hợp mẫu phẩm, và sau đó các phân tử protein sẽ được
phá tan thành các mảnh nhỏ và trải trên một biểu đồ gồm những đoạn
peptide xếp theo tỷ số trọng lượng và điện tích. Các protein trên biểu đồ
5


Proteomics trong nghiên cứu biomarker

được so sánh với dữ kiện protein đã được thiết lập từ proteomics và từ đó
loại (type) và cấu trúc (structure) của protein sẽ được xác định chính xác.
Việc so sánh biểu đồ của protein từ mẫu bệnh lý và protein từ mẫu không
mang bệnh sẽ cần một hệ thống điện toán chuyên trách (như Correlogic
Systems, Inc. được dùng ở NIH) để nhận diện một số protein có khả năng là
biomarker của bệnh. Các mẫu phẩm có thể là máu, tế bào, mô (tissues),
hoặc dịch bài tiết từ các tuyến. Với khả năng của máy khối phổ hiện nay,
các thí nghiệm biomarker có thể xác định hàng ngàn protein từ một lượng
nhỏ mẫu như một giọt máu. Việc xác định giá trị của các biomarker này se
đòi hỏi một chương trình nghiên cứu lâm sàng và thống kê qui mô.
2.1.3. Những thành quả của nghiên cứu biomarker:
Vì những giá trị khoa học của biomarker, việc nghiên cứu đề tài này
đã được triển khai ở nhiều trung tâm nghiên cứu sinh học và y khoa ở nhiều
quốc gia. Về kỹ nghệ, những hãng chuyên về chẩn đoán như Roche, Chiron,

Abbott cũng có những phương hướng rộng lớn đi về nghiên cứu biomarker;
ngoài ra các hãng công nghệ sinh học chuyên về biomarker như Ciphergene
Biosystem, Pathway Diagnostics, Thirdwave, Digene đang trên đà phát
triển. Đặc biệt với những nhóm đại kỹ nghệ dược khoa như Pfizer, Novartis,
Bristol Meyers, biomarker đang được sử dụng chung với các thí nghiệm
thiết yếu như độc tính (toxicology), dược tính (pharmacology) trong qui
trình thẩm định giá trị lâm sàng của dược phẩm.
Từ các công trình nghiên cứu biomarker ở nhiều trung tâm nghiên
cứu, đã có những thành quả hứa hẹn những ứng dụng rất tốt đẹp của
biomarker cho việc chẩn đoán bệnh và trị liệụ. Việc ứng dụng biomarker để
hoàn chỉnh hoặc thay thế các thử nghiệm thường quy sẽ chỉ còn là vấn đề
thời gian. Những biomarker này nhằm giúp tiên đoán sớm và chính xác các
trường hợp bệnh lý từ ung thư đến tim mạch và biến dưỡng; biomarker còn
có giá trị tiên đoán hiệu ứng của thuốc để giúp các chuyên gia y tế lấy quyết
định đúng đắn nhất cho việc điều trị bệnh nhân. Đi xa hơn nữa, biomarker
6


Proteomics trong nghiên cứu biomarker

có tiềm năng trong ứng dụng liệu pháp trị liệu cá nhân (personalized
medicine).
Hiện có rất nhiều biomarker được tìm thấy từ chương trình nghiên
cứu ở các trung tâm cũng như các hãng dược phẩm trên thế giới. Kết quả từ
Viện nghiên cứu Y tế Hoa Kỳ (NIH) đã thu thập được 14 protein có khả
năng dùng làm biomarker cho bệnh ung thư vú (breast cancer) từ các phân
tích khối phổ với mẫu sữa lấy từ vú bệnh nhân. Trong các nhóm được thử
nghiệm, độ chính xác của các biomarker này rất cao so với việc dùng các
gene BRCA (BRCA là gene của bệnh ung thư vú di truyền được tìm thấy
trong phả hệ ung thu vú; tuy nhiên gen này chỉ có tỉ lệ thấp từ 2-5% của

bệnh này khi dùng chẩn đoán ở quần chúng); một số protein biomarker khác
cũng đã được khám phá từ nghiên cứu các bệnh ung thư tiền liệt tuyến
(prostate), ung thư phổi (lung), ung thư bàng quang (bladder), và ung thư
buồng trứng (ovarian); về tim mạch đã có một số biomarker protein được đề
cử là liên hệ đến bệnh nghẽn động mạch (arterosclerosis). Như nhiều kết
qủa từ những trung tâm nghiên cứu khác, các biomarker này của NIH được
khám phá từ một số mẫu thử giới hạn, nên còn là đối tượng cho các thử
nghiệm thống kê và lâm sàng rộng lớn để thẩm định mức tương quan
(frequency) trong quần chúng.
2.1.4.Những vấn đề cần hoàn chỉnh để ứng dụng biomarker
Như chúng ta đã biết, biomarker là tập thể của một số gene hay
protein tiêu biểu cho một trạng thái thay đổi sinh học. Như đã nêu trên, nền
tảng của nghiên cứu Biomarker dựa trên các protein, vì thế vai trò của
nghiên cứu proteomics là thiết yếu. Tuy nhiên số lượng lớn lao (dự đoán
khoảng từ 300.000 đến 500.000 protein), và đặc biệt là bản chất phức tạp
của protein là một trở ngại lớn cho các nghiên cứu biomarker. Ý thức được
những trở ngại này và tầm quan trọng của biomarker, Viện Nghiên cứu Y tế
Quốc gia Hoa Kỳ (NIH) đã lập một chương trình với ngân quỹ khoảng trên
100 triệu dollar đặc trách giải quyết các vấn đề và đẩy mạnh tiến bộ của
7


Proteomics trong nghiên cứu biomarker

proteomics. Mục đích của chương trình này là: Thiết lập và tài trợ mạng
lưới liên kết những phòng thí nghiệm trên thế giới nghiên cứu về
proteomics; Đồng bộ hóa và hoàn chỉnh các kỹ thuật và phương pháp của
proteomics cho mạng lưới nghiên cứu này. Việc đồng bộ hóa rất quan trọng
về phương diện kỹ thuật vì trên thực tế, thường có những khác biệt về số
lượng các biomarker thu nhận được từ những phòng thí nghiệm khác nhau

dù cho cùng một loại bệnh. Thu thập từ các tài liệu nghiên cứu, hiện có
khỏang gần 1.500 biomarker proteins liên hệ đến ung thư và đương nhiên là
việc tiêu chẩn hóa các protein này thật cần thiết để chọn lọc những protein
có gía trị ứng dụng. Những yếu tố kỹ thuật bao gồm thuốc thử, các kháng
thể, peptide; quản lý mẫu phẩm, và đặc biệt là phương pháp ly trích và phân
tích các protein. Việc liên kết mạng lưới các phòng thí nghiệm nhằm tiến
đến tạo dựng một kho dữ kiện (consortium) biomarker cho các loại bệnh lý
và các đề tài sinh học.
Các nhà nghiên cứu tiên liệu rằng kho dữ kiện biomarker sẽ đóng
vai trò trọng yếu trong chẩn đoán và điều trị bệnh trong một tương lai gần.
Quan trọng hơn nữa, họ cũng tin tưởng rằng khi kết hợp các ngành nghiên
cứu gồm tin sinh học (bioinformatics), genomics, y học thực chứng
(evidence based medicine), biomaker sẽ giúp tạo được những mô hình phân
tử tế bào về bệnh lý có khả năng khảo sát được bằng những thí nghiệm cụ
thể từ các biomarker proteins. Và đây chính là đường hướng biomarker có
khả năng đưa đến việc xác định các gene có vai trò chủ yếu liên hệ đến bệnh
lý phức tạp do nhiều gene, thay vì chỉ được coi như những biểu hiện. Từ đó,
vai trò của gene cho chẩn đoán và trị liệu sẽ được khẳng định rõ ràng như
cộng đồng y học và xã hội đã luôn mong đợi.
Về ứng dụng, có thể nói gía trị của biomarker trong chẩn đoán và
trị liệu đã được xác định trên bình diện khoa học. Tuy nhiên thực tế sẽ đòi
hỏi những thử nghiệm lâm sàng chi tiết và cũng có thể dài hạn, trước khi
triển khai thành sản phẩm có gía trị trong cộng đồng xã hội. Ngòai ra, để sử
8


Proteomics trong nghiên cứu biomarker

dụng hữu hiệu những biomarker sẽ cần huấn luyện có hệ thống các thông
tin khoa học về biomarker đến các giới chưc y tế gồm bác sĩ và các chuyên

viên thử nghiệm.
2.1.5.Khả năng nghiên cứu và lợi ích ứng dụng biomarker ở Việt Nam:
Trong các nghiên cứu tân sinh học, biomarker có tính khả thi và ứng
dụng rất cao trong môi trường nghiên cứu ở Việt Nam hiện nay. Tính khả thi
cao vì như đã nói ở trên, biomarker không đòi hỏi các bước nghiên cứu
nhiều thử thách như trong truy tìm gene liên hệ đến bệnh lý, hay như việc
tạo những sản phẩm protein trị liệu, vaccine thường đòi hỏi kỹ thuật cao,
công phu và tốn kém. Trang bị chính của nghiên cứu biomarker là máy khối
phổ (mass spectrometry) cộng với khả năng sử dụng những chương trình
điện toán về proteonomics. Đương nhiên, cả hai kỹ thuật này cần được đảm
trách bởi các chuyên viên. Ngoài ra, cũng như những khoa học khác, người
đảm trách chương trình là những khoa học gia có khả năng suy luận cao về
các chủ đề sinh học để phân tích dữ kiện thu được từ nghiên cứu biomarker.
Trên thực tế, Việt Nam có những lợi điểm so với các trung tâm
nghiên cứu ở các nước tân tiến. Những lợi điểm này bao gồm số lượng mẫu
phẩm dồi dào và cho nhiều loại bệnh; đây là những yếu tố cần thiết cho
thống kê để thu đựơc những biomarker có độ chính xác cao qua việc xác
định cũng như loại trừ các protein trong nhóm biomarker. Ngoài ra, Việt
Nam cũng dồi dào dữ kiện lâm sàng có vai trò quan trọng trong việc đánh
giá khả năng ứng dụng các biomarker trong trị liệu. Nhưng điểm quan yếu
nhất là giá trị đặc thù của biomarker liên hệ đến chủng tộc; có nhiều dữ kiện
lâm sàng cũng như kinh nghiệm dân gian cho biết tần số cao của những
bệnh xảy ra ở người Việt khi so sánh với các chủng tộc khác. Việc xác định
các “dấu ấn” sinh học của chủng tộc Việt Nam hứa hẹn cac ứng dụng thiết
thực mang lại những dịch vụ y tế hữu hiệu, có phẩm chất cao cho quần
chu’ng. Các dấu ấn này cũng sẽ là chủ đề quan trọng cho những nghiên cứu
y học từ nguyên do bệnh lý cho đến tác động môi trường, cũng như dược
9

Proteomics trong nghiên cứu biomarker

học trong việc tìm kiếm hay thẩm định tính trị liệu của các dược phẩm ở
Việt Nam.
II.2

. Proteomics

2.2.1. Định nghĩa
Macr Wilkins là người đầu tiên đưa ra khái niệm proteome (hệ protein ) là
bổ trợ của genome. Nếu proteome được coi là tập hợp các protein được mã
hóa và biểu hiện bởi genome, trong đó genome bao hàm toàn bộ các gen
trong cơ thể thì genomic là khoa học nghiên cứu genome còn proteomics là
khoa học nghiên cứu về proteome. Proteomics được coi là môn khoa học mới
nghiên cứu sản phẩm của genome hay chính là tập hợp các protein được biểu
hiện trong tế bào, mô hoặc cơ thể trong những dièu kiẹn và thời gian xác
dịnh.
Proteomics bao gồm những nghiên cứu có tính hệ thống nhằm cung cấp
những kiến thức tổng quan về cấu trúc, chức năng của protein và vai trò của
chúng trong điều hòa hoạt động của các hệ sinh học.Những cải tiến về trang
thiết bị và phương pháp hiện nay đã cho phép mở rộng phạm vu nghiên cứu
từ phân tích hóa sinh các protein đơn lẻ đến việc nhận dạng và xác định
những phức hợp protein. Cũng chính vì vậy, proteomics đang trở thành một
trong những bộ môn quan trọng nhất của khoa học sự sống và công nghệ sinh
học.[1] .
2.2.2. Ý nghĩa của proteomics trong khoa học ngày nay
Sự tồn tại của các ORF (opne reading frame - tạm dịch là khoảng đọc mở
hay khoảng đọc còn bỏ ngõ) trong dữ liệu bộ gene không đơn giản ngụ ý đó
là sự tồn tại của một gene mang chức năng. Bất chấp những tiến bộ của công
cụ hổ trợ là bioinformatics, người ta vẫn không thể dễ dàng chỉ định một

cách chính xác chức năng của một gene từ dữ liệu genome. Ở đây, một vài ý
kiến đưa ra cho rằng chúng ta có thể so sánh trình tự genome của một sinh
vật này với một sinh vật khác (giống sư so sánh trình tự prortein) để tìm ra
chức năng của một gene dựa trên một gene đã biết. Thực nghiệm đã cho thấy,
10


Proteomics trong nghiên cứu biomarker

mặc dầu khuynh hướng này cũng có những thành công nhất định nhưng nhìn
chung thì tỷ lệ thành công rất thấp. Đặc biệt với các trường hợp các sinh vật
có bộ gene nhỏ, hoặc với các gene có độ tương đồng thấp hay thậm chí
không có sự tương đồng với bất kỳ gene nào thì phương pháp so sánh sự
tương đồng lại hoàn toàn không dùng được vì nó có thể sai toàn bộ. Chẳng
hạn với bộ gen của Mycoplasma genitalium, tính toán gần đây cho thấy, lỗi
sai phạm ít nhất là 8% trong số 340 gene đã được ghi chú (gene ghi chú được
hiểu là gene đã được xác định về trình tự, vị trí nhưng về chức năng thì có thể
chưa biết). Do vây, suy luận rộng ra cho trường hợp của bộ gene người thì
với lỗi sai phạm đó, người ta đã có thể hình dung hậu quả như thế nào. Do
vậy, việc thẩm tra các sản phẩm của gene được xem là bước đầu tiên quan
trọng trong việc "ghi chú bộ gene". Ở đây nổi lên một vai trò độc đáo của các
phương pháp proteomics, đó là người ta không thể "nhìn" trên trình tự DNA
để phán đoán, nghiên cứu sự hiệu chỉnh protein sau phiên mã, quá trình tạo
các đãng isoform của protein. Rõ ràng chỉ có các phương pháp proteomics
mới cho phép nhà nghiên cứu làm được công việc này.
Hơn thế nữa, điều cần thiết là người ta phải xác định mối tương quan giữa
mức độ mRNA và mức độ biểu hiện protein vì giữa hai yếu tố này, có thể có
mà cũng có thể không có mối tương quan nào. Một vấn đề nữa mà thông tin
trình tự gene không thể nào cung cấp cho nhà nghiên cứu đó là sự định vị của
sản phẩm gene (tức là vị trí mà protein sẽ thể hiện chức năng trong tế bào).

Một vấn đề nữa mà thông tin trình tự gene không thể nào cung cấp cho nhà
nghiên cứu đó là sự định vị của sản phẩm gene (tức là vị trí mà protein sẽ thể
hiện chức năng trong tế bào). Mở rộng vấn đề, rõ ràng, các cơ chế điều hòa
chức năng protein thông qua sự phân giải (proteolysis), sự tái chế (recycling)
hay sự cô lập (sequestration) trong tế bào không thể được "nhìn thấy" nếu chỉ
căn cứ tren thông tin của bộ gene. Cuối cùng, sự tương tác protein-protein và
các thành phần cắu trúc nên tế bào (các cơ quan tử) chỉ có thể được xác định
ở mức độ protein.Về mặt phương pháp luận thì Proteomics dựa trên các
11


Proteomics trong nghiên cứu biomarker

phương pháp có hiệu suất cao để phân tách và phân tích protein trong hệ
thống sống. Việc sử dụng các phương pháp này sẽ cung cấp tất cả các thông
tin toàn diện về đặc tính sinh hóa của protein trong hệ thống sống như sự
biểu hiện, sự hiệu chỉnh sau phiên mã, sự tương tác.
Lĩnh vực Proteomics hiện đang phát triển mạnh mẽ ở nhiều quốc gia. Nó,
cùng với genomics, đang nằm ở vị trí dẫu đầu trong các chương trình nghiên
cứu khoa học ứng dụng, khoa học cơ bản, y-dược học và các ngành liên
quan. Năm 2001, một tổ hợp quốc tế bao gồm các nhà khoa học, kinh tế,
chính trị đạ hình thành Tổ chức Proteome của Người (HUPO-Human
Proteome Organization). Mục đích chính của HUPO là khám phá ra tất cả
các phân tử protein của người; lập bản đồ vị trí các protein trong tế bào, mô,
cơ quan; xác lập tất cả các tương tác protein-protein; nâng cấp các cơ sở dữ
liệu thông tin quan trọng; dò tìm các phân tử marker protein quan trọng để
nhận diện bệnh. Ngược lại với HUGO (Human Genome Organization),
HUPO không đưa ra thời điểm nhất định sẽ hoàn tất dự án, vì với HPG, con
số nucleotide kiến tạo bộ gene người là xác định, còn con số protein người
biến thiên tuỳ thuộc điều kiện sống, điều kiện bình thường hay bệnh lý.

Mặc dù chúng ta vừa có các nhìn lướt qua về proteoin nhưng các câu
hỏi: Proteome hay proteomics nghĩa là gì? Phương pháp luận cơ bản
proteomics là gì? Thành tựu quan trọng mà ngành này sẽ mang lại cho nhân
loại là gì? Các phương pháp để nghiên cứu proteomics ở hiện tại và tương lai
là gì. Thật sự, không một ai trả lời được trọn vẹn các câu hỏi trên, đơn giản là
vì phương pháp luận và kỹ thuật áp dụng phát triển theo từng ngày, khiến
người ta khó lòng bắt kịp. Trung bình cứ hai năm một lần, các hãng cung cấp
trang thiết bị dành cho nghiên cứu proteomics phải nâng cấp tất cả các thế hệ
máy móc mà họ hiện bán để đáp ứng nhu cầu của nhà nghiên cứu, ngược lại
các nhà khoa học cũng phải thay đổi phương pháp tiếp cận, thay đổi máy
móc để đẩy nhanh tốc độ nghiên cứu nếu không muốn bị tụt hậu. Tuỳ thuộc
mục đích nghiên cứu khác nhau là các công ty, trường, viện nghiên sẽ trang
12


Proteomics trong nghiên cứu biomarker

bị các dòng máy móc, trang thiết bị khác nhau (cơ bản khác nhau về giá cả,
hiệu xuất).
Có một điều cần chú ý là, không như những ngành nghiên cứu khác
cũng hình thành và phát triển ở thời kỳ hậu genome (ví dụ transcriptome,
nghiên cứa mRNA) vốn có đối tượng nghiên cứu hạn chế, proteomics ngược
lại là một ngành nghiên cứu không có biên giới, không giới hạn đối tượng,
hướng nghiên cứu.
2.3. Proteomics đối với nghiên cứu biomarker.
Protein là thành phần sinh học phong phú nhất của tế bào so với mRNA
hay xa hơn nữa là gen. Một số nhóm nghiên cứu dung các dữ kiện biểu hiện
gen làm biomarker, hoặc kết hợp protein và RNA, DNA để có độ chính xác
cao hơn, nhưng sẽ phức tạp hơn.Gần đây, sự methyl hóa DNA và RNA là đối
tượng mới của nghiên cứu biomarker.

Về nguyên tắc thì tìm kiếm biomarker đơn giản hơn nhiều so với truy tìm
các gen bệnh lý. Vì biomarker có cả những thay đổi được tế bào biểu hiện từ
một trạng thái sinh học này so với trạng thái sinh học khác. Phương pháp
chính xác định biomarker dựa trên hai bước ký thuật : phân tách protein và so
sánh sự thay đổi protein ở các mẫu phẩm.
III.
III.1

Vật liệu – Phương phap nghiên cứu
.Vật liệu nghiên cứu
Các dịch cơ thể con người, đặc biệt là huyết tương máu, huyết thanh.

3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Tinh lọc protein của các mẫu phẩm
Có nhiều phương pháp để phân tách protein, phát hiện biomarker:
+ Phương pháp sắc ký cột loại các ion acid hay kiểm để phân tách các
protein dựa theo đặc tính acid,kiềm, dựa vào độ ưa nước hay kỵ nước
+ Phương pháp điện di protein hai chiều so sánh sự khác biệt protein
dựa trên trọng lượng phân tử và điện tích của các protein
3.2.2. Phân tách và phân tích protein
13


Proteomics trong nghiên cứu biomarker

Số lượng protein được phân tích rất giới hạn: điện di hai chiều phân tích
được 2.000-10.000 protein trên một điện di đồ (so với tổng số protein có thể
300.000-500.000 phân tử trong tế bào).Phương pháp xác định duy nhất ngày
nay cung cấp thông tin một cách phổ biến về các biến đổi cấu trúc protein
đặc trưng mà không cần biết trước về sự biến đổi đó. MS tìm hiểu các nhóm

protein, xác định rõ ràng và đầy đủ chức năng của nóBiến đổi nào trong
chuỗi gene và quá trình biến đổi sau dịch mã sẽ được phản ánh trong cả khối
protein.
3.2.3. Kỹ thuật khối phổ (Mass Spectrometry)
Phương thức khối phổ từ dưới lên ,Các mảnh peptit thành phần được
phát hiện thông qua MS.Dễ dàng hơn: ion hóa hiệu quả,nhạy, và chính xác
Tăng sự phức tạp của mẫu, vật liệu đưa từ ngoài vào, một phần lớn chuỗi
protein chưa phân tích nên có thể không phát hiện các biến đổi của chuỗi
protein. Kỹ thuật khối phổ (Mass Spectrometry)Phương thức khối phổ từ
dưới lên. Xét nghiệm các protein tự nhiên, làm điểm chỉ peptit
Phần lớn các phát hiện marker ung thư mới làm sau khi ứng dụng công nghệ
SELDI, vốn là phương thức biến đổi từ trên xuống dưới .Việc xác định các
protein tương đồng là khó khăn khi phân tích đồng thời lượng lớn các
protein .Xu thế gần đây: tập trung loại 6 protein huyết tương có hàm lượng
cao nhất (85% tổng khối lượng) .
Hầu hết các protein marker được phát hiện qua SELDI đều là các mảnh
peptit trong khu vực m/z thấp .Mang tính chất số lượng, chưa tính đến sự bất
hoạt protein .Cách duy nhất để thu được lượng chuỗi protein đầy đủ là giải
mã khối lượng của protein hoàn chỉnh. Kỹ thuật khối phổ (Mass
Spectrometry).Sử dụng thư viện hạt nền tảng của các phối thể dạng peptide
tổ hợp .
3.2.4. Công nghệ cân bằng hạt.
Pha loãng các protein có nồng độ cao và cố định các protein nồng độ
thấp .Các phương pháp cố định và khử muối thường mất mát protein và gặp
14


Proteomics trong nghiên cứu biomarker

vấn đề về khả năng tái sinh. Kết hợp công nghệ cân bằng hạt và SELDI

(surface-enhanced laser desorption/ionization-tăng cường hiệu ứng laze phân
tách/ ion hóa bề mặt). Các chuỗi ProteinChip được phát triển để sử dụng
trong quá trình phát hiện BioMarker trên các mẫu của người. Gồm bản in
màu (chất bảo lưu) và khối phổ.
3.2.5. Công nghệ ProteinChip SELDI.
Ưu điểm: tính sắc phổ bề mặt giúp tách chiết hạt dựa trên cơ chế lọc
mạnh mẽ, nhanh chóng, đòi hỏi số lượng rất thấp các mẫu
IV. Quy trình thí nghiệm
4.1. Thu mẫu
Thu mẫu huyết thanh, nước tiểu, dịch tế bào tại các bệnh viện.
Huyết thanh hay huyết tương là mẫu phẩm dễ lấy nhất, nguồn mẫu
thường xuyên,nhưng có độ đa dạng cao các protein, cản trở phát hiện
biomarker (nồng độ thấp ).
Nứơc tiểu có nồng độ protein thấp hơn nhưng nhiều muối và ure gây
khó khăn khi phân tích, protein cần thiết dễ bị mất khi phân tích.
4.2.Chuẩn bị mẫu
Làm giàu protein cần thiết. Sắc kí: tách từng nhóm nhỏ các protein có
chung đặc tính nào đó. Kháng thể đơn dòng: cung cấp các nhân tố chọn lọc
giống nhau về cấu trúc tinh sạch ái lực của kháng nguyên, cho phép khôi
phục kháng nguyên từ hỗn hợp thô, loại bỏ các chất bẩn đặc trưng từ giai
đoạn chuẩn bị. Phân lập bằng công nghệ cân bằng hạt: cho thấy kết quả phân
tích có số đỉnh cao nhất lớn gấp 2-3 lần hoặc hơn so với mẫu cơ bản
Phương pháp lọc liên tiếp 4 bước và 3 bước .Tăng số lượng mẫu .Chuẩn bị
mẫu .Lọc liên tiếp 4 bước và 3 bước.Đều thực hiện các bước ban đầu giống
nhau. Chỉ khác nhau về số lần lọc và thành phần đệm lọc.
Huyết thanh: lọc liên tiếp 3 bước số các đỉnh nhọn được xác định cao
hơntrên tất cả các chuỗi hóa học .

15

Proteomics trong nghiên cứu biomarker

Nước tiểu: phương pháp 3 bước cho ra chất lượng quang phổ cao hơn ở
tất cả các bước phân lập .Dịch lọc TUC (2.2M thiourea, 7.7M urea, 4.4%
CHAPS) của lọc liên tiếp 3 bước có thể sử dụng trực tiếp cho quá trình điện
di 2 chiều. Lọc liên tiếp 4 bước và 3 bước. Tăng số lượng mẫu khiến cố định
được nhiều protein thực thể hơn, đặc biệt là trong phạm vi khối lượng nhỏ.
Chuẩn bị mẫu:
Kĩ thuật điện di: hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trường tác động
vào các phân tử tích điện và kích thước lỗ của thể nền .Dựa trên các đặc điểm
vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện tích.Kết hợp
điện di theo khối lượng phân tử và điểm đẳng điện tạo nên kỹ thuật điện di 2
chiều
4.3. Điện di hai chiều
Nhiệm vụ chính:
Xác định tất cả các spot protein trên mỗi bản gel .Tìm các spot giống
nhau, khác biệt trên các bản gel với nhau.Tìm các spot có trên bản gel này
mà không có trên bản gel khác. Các spot protein biểu hiện tăng, giảm ở các
bản gel khác nhau .Bản gel điện di được quét vào thiết bị phân tích tự động
và được xử lí bằng phần mềm có sẵn
4.4. Phân tích bản gel điện di
Các spot khác biệt ở các bản gel khi so sánh với nhau sẽ được cắt
riêng khỏi bản gel điện di
4.5. Cắt và thuỷ phân các spot
Tiến hành: Tẩy màu thuốc nhuộm.Thủy phân thành các oligopeptid,
chuẩn bị cho việc phân tích khối phổ.Tất cả được tiến hành tự động trên hệ
thống thiết bị chuyên dụng. Hệ thống Xcise (Shimadzu). Phân tích khối phổ
tự động với chế độ MALDI-TOF MS. Số liệu thu được được đối chiếu với cơ
sở dữ liệu NCBI (Trung tâm Thông tin CNSH Quốc gia Hoa Kì) nhờ phần

mềm MASCOT để nhận dạng protein. Máy khối phổ hiện đại có thể xác định
hàng ngàn protein từ.Xác định các spot protein trên phân tích khối phổ
16


Proteomics trong nghiên cứu biomarker

một lượng nhỏ mẫu như một giọt máu trong các thí nghiệm biomarker
Xác định giá trị các biomarker đòi hỏi một chương trình nghiên cứu lâm sàng
và thống kê qui mô.Xác định các spot protein trên phân tích khối phổ.
Đây là phương diện khó khăn nhất trong chẩn đoán biomarker .
Phương thức xác định miễn dịch :Được sử dụng nhiều khi mới bắt đầu
cần chứng thực các biomarker mới .Dễ dàng sử dụng trong lọc tốc độ cao,
quy mô lớn, các nghiên cứu để xác thực các biomarker đã được phát hiện
trong chẩn đoán proteomic. Không thể phát hiện được các protein bị biến đổi
cấu trúc mà có vai trò (ví dụ như các chất chỉ thị ung thư). Chứng thực các
dữ liệu bắt nguồn từ chẩn đoán proteomics về sự biến đổi cấu trúc protein có
thể rất dễ dàng được thực hiện khi sử dụng Mass Spectrometry.
4.6. Chứng thực các biomarkers mới được phát hiện
Những thành quả được triển khai ở nhiều trung tâm nghiên cứu sinh
học và y khoa ở nhiều quốc gia .Những hãng chuyên về chẩn đoán (Roche,
Chiron, Abbott) có những phương hướng rộng lớn đi về nghiên cứu
biomarker
Các hãng công nghệ sinh học chuyên về biomarker như Ciphergene
Biosystem, Pathway Diagnostics, Thirdwave, Digene đang trên đà phát triển
Các nhóm đại kỹ nghệ dược khoa như Pfizer, Novartis, Bristol Meyers,
biomarker đang được sử dụng chung với các thí nghiệm thiết yếu như độc
tính, dược tính trong qui trình thẩm định giá trị lâm sàng của dược phẩm.
V. Kết quả
Những thành quả hứa hẹn những ứng dụng rất tốt đẹp của biomarker

cho việc chẩn đoán bệnh và trị liệu. Có giá trị tiên đoán hiệu ứng của thuốc
Tiên đoán sớm và chính xác các trường hợp bệnh lý từ ung thư đến tim mạch
và biến dưỡng Biomarker có tiềm năng trong ứng dụng liệu pháp trị liệu cá
nhân .Những

vấn

đề

cần

hoàn

chỉnh

để

ứng

dụng

biomarker

Sự phát triển của ngành proteomics là nền tảng nghiên cứu biomarker. Viện
Nghiên cứu Y tế Quốc gia Hoa Kỳ đã lập một chương trình (với ngân quỹ
17


Proteomics trong nghiên cứu biomarker

khoảng trên 100 triệu dollar) giải quyết các vấn đề và đẩy mạnh tiến bộ của
proteomics.
Về phương diện kỹ thuật: việc đồng bộ hóa rất quan trọng vì thực tế
có những khác biệt về số lượng các biomarker thu nhận được từ những phòng
thí nghiệm khác nhau ở cùng một loại bệnh
Về ứng dụng:
Đòi hỏi những thử nghiệm chi tiết (lâm sàng cũng như dài hạn), trước khi
triển khai thành sản phẩm có gía trị trong cộng đồng xã hội
Đào tạo có hệ thống các thông tin khoa học về biomarker đến các giới chức y
tế

(bác

sĩ

và

các

chuyên

viên

thử

nghiệm).

Kết

quả

Biomarker có tính khả thi và ứng dụng rất cao trong môi trường nghiên cứu ở
Việt Nam hiện nay.Tính khả thi cao: Không đòi hỏi các bước nghiên cứu
nhiều thử thách như trong truy tìm gene liên hệ đến bệnh lý
Không đòi hỏi kĩ thuật cao, công phu tốn kém như tạo những sản phẩm
protein trị liệu, vaccine.
Thử thách:
Trang bị chính: máy khối phổ và những chương trình điện toán về
proteonomics, giá thành cao. Cả hai kỹ thuật này cần được đảm trách bởi các
chuyên viên. Đảm trách phải là những nhà khoa học khả năng suy luận cao
về sinh học để phân tích dữ kiện thu được từ nghiên cứu biomarker.
VI. Khả năng nghiên cứu và ứng dụng ở Việt Nam
Hiện nay, ở Việt Nam đã có nghiên cứu biomarker. Thực tế, Việt Nam
có những lợi điểm so với các trung tâm nghiên cứu ở các nước tân tiến.
Số lượng mẫu phẩm dồi dào và cho nhiều loại bệnh. Dồi dào dữ kiện lâm
sàng để đánh giá khả năng ứng dụng các biomarker trong trị liệu
Quan trọng nhất là giá trị đặc thù của biomarker liên hệ đến chủng tộc
Nhiều dữ kiện lâm sàng cũng như kinh nghiệm dân gian cho biết tần số cao
của những bệnh xảy ra ở người Việt khi so sánh với các chủng tộc khác
Xác định các biomarker của chủng tộc Việt Nam hứa hẹn các ứng dụng thiết
18


Proteomics trong nghiên cứu biomarker

thực trong y tế, có phẩm chất cao cho quần chúng. Khả năng nghiên cứu
và ứng dụng ở Việt Nam .
Tài liệu tham khảo
1. Proteomics – Phan Văn Chi
2. />3. />

19