Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM


Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưn
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
----------------------

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN SSIV MÃ HÓA ENZYME
STARCH SYNTHASE TĂNG CƯỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT

Chuyên ngành:
Mã số:

Sinh học thực nghiệm
60420114

Học viện:
Hướng dẫn khoa học:

Nguyễn Mậu Hưng
TS. Phạm Bích Ngọc

Hà Nội - 2016

LỜI CAM ĐOAN


Luận văn Thạc
sỹ

Nguyễn Mậu
Hưng
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan Luận văn này hoàn toàn được hoàn thiện bằng qua trình
nghiên c ứu khoa học của bản thân dưới sự hướng dẫn trực tiếp của TS . Phạm Bích Ngọc
cùng v ới cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học. Các số liệu hin
̀ h
ảnh, kết quả được trin
̀ h bày, trong luận văn này là trung thực, không sao chép bất cứ tài liệu,
công trình nghiên cứu của người khác mà không chỉ rõ nguồn tham khảo. Tôi xin chịu
trách nhiệm về lời cam đoan của mình trước hội đồng khoa hoc.

Hà Nội, tháng 1 năm 2016
Học viên

Nguyễn Mậu Hưng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN

3


Luận văn Thạc
sỹ

Nguyễn Mậu
Hưng
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến những người đã hướng dẫn,

giúp đỡ tận tình để tôi hoàn thành luận văn này:
TS. Phạm Bích Ngọc, Phó trưởng phòng Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Công nghệ
Sinh học, đã hướng dẫn và hỗ trợ tận tình, truyền đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý báu
trong suốt quá trin
̀ h thực hiện đề tài.
PGS.TS. Chu Hoàng Hà - Viện trưởng Viện công nghệ sinh học, Viện trưởng Viện Công
nghệ sinh học đã chỉ bảo tận tình về chuyên môn, luôn theo sát thi nghiệm của tôi để có
những lời khuyên bổ ích và kịp thời.
ThS. Lê Thu Ngọc, CN. Nguyễn Khắc Hưng, CN. Phạm Thanh Tùng đã giúp đỡ tôi trong
suốt thời gian làm luận văn.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô giáo tại Cơ sở đào tạo Viện Sinh thái
và Tài nguyên sinh vật đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian học tập
vừa qua.
Bằng tin
̀ h cảm chân thành, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đin
̀ h và bạn bè đã luôn ở
bên, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này.
Hà Nội, tháng 1 năm 2016
Học viên

Nguyễn Mậu Hưng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN



4


Luận văn Thạc
sỹ

Nguyễn Mậu
Hưng
MỤC LỤC

MỞ ĐẦU
..............................................................................................................................................
....... 11
1.
Đặt vấn đề
...................................................................................................................................... . 11
2.
Mục đích nghiên cứu
....................................................................................................................... 12
3.
Nội dung nghiên cứu
....................................................................................................................... 12

4.
Ý nghĩa khoa học
............................................................................................................................ . 13
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI
LIỆU...................................................................................................... 14
1.1. Tổng quan về tinh bột và sinh tổng hợp tnh bột
............................................................................. 14
1.1.1. Giới thiệu về tnh bột
....................................................................................................................... 14
1.1.2. Cấu trúc của tinh
bột....................................................................................................................... . 15
1.1.3. SỰ THỦY PHÂN TINH BỘT
........................................................................................................ 16
1.1.4. HÌNH DẠNG TINH BỘT
............................................................................................................... 17
1.1.5. Các loại hạt tinh bột hay gặp
........................................................................................................... 17
1.1.6. Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột và các gen liên quan
........................................................................ 18
1.1.7. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải biến quá trình trao đổi tnh
bột...................... 21
1.2.

Cây sắn và tnh hình sản xuất cây sắn trên thế giới và Việt Nam
.................................................... 22

1.3.

Rễ tơ và ứng dụng nuôi cấy rễ tơ trong sản xuất protein tái tổ
hợp............................................ 26

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –

ĐHTN

5


Luận văn Thạc
sỹ
1.4

Nguyễn Mậu
Hưng

Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes – phương pháp tạo rễ tơ ở tế bào thực
vật .................28
1.5

Cơ chế chuyển các gen vùng T-DNA vào tế bào thực vật
............................................................... 29

1.6
Nuôi cấy sinh khối rễ
tơ.................................................................................................................. . 30
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU...................................................................... 32
2.1. Vật liệu , hóa chất và thiết bị
........................................................................................................... 32
2.1.1 Thực vật
......................................................................................................................................... .

32
2.1.2 Chủng khuẩn, vector và cặp mồi sử dụng
..................................................................................... 32
2.1.3 Hóa chất
......................................................................................................................................... .
33
2.1.4. Thiết bị
........................................................................................................................................... .
33
2.2. Phương pháp nghiên cứu
................................................................................................................. 34
2.2.

Phương pháp thu thập mẫu, phân lập, xác định trình tự gen SSIV
............................................. 34
2.2.1. Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140
........................................................................ 34

2.2.2. Phản ứng RT-PCR
.......................................................................................................................... . 34

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN



6


Luận văn Thạc

sỹ

Nguyễn Mậu
Hưng

2.2.3. Tách dòng sản phẩm bằng vector pENTR™/D-TOPO
................................................................... 36
2.2.4. Kiểm tra các khuẩn lạc bằng phương pháp PCR từ khuẩn
lạc......................................................... 37
2.2.5. Tách chiết plasmid
.......................................................................................................................... . 38
2.2.6. Xác định trình tự và so sánh trình tự gen thu được với các trình tự tương ứng trên
GenBank. ....... 39
2.2.7. Thiết kế vector pK7GWIWG2(II) mang đoạn gen SSIV bằng kỹ thuật Gateway.
.................... 39
2.2.8. Phương pháp chuyển gen tạo rễ tơ ở khoai lang nhờ vi khuẩn Agrobacterium
rhizogenes ...... 42
2.2.9. Phương pháp đánh giá mô chuyển gen trên môi trường chọn lọc
............................................... 43
2.2.10. Phương pháp xử lí số liệu
.............................................................................................................. 43
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO
LUẬN............................................................................................. 44
3.1. Phân lập, giải trình tự gen SSIV mã hóa cho enzyme Starch Synthase ở
sắn.................................. 44
3.1.1. Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140.
....................................................................... 44
3.1.2. Thiết kế mồi đặc hiệu nhân gen SSIV của sắn và tổng hợp
cDNA............................................. 44
3.1.3. Phân lập, tách dòng, giải trình tự gen SSIV của sắn

.................................................................... 45
3.2. Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D/SSIV và tạo chủng vi khuẩn
Agrobacterium
rhizogenes tương ứng
................................................................................................................................ . 46
3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D/SSIV bằng kỹ thuật Gateway
............................. 46
3.2.2. Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium mang cấu trúc vector chuyển gen đã thiết kế
......................... 47
3.3. Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ khoai lang mang gen SSIV
............................................................... 48
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –

ĐHTN

7


Luận văn Thạc
sỹ

Nguyễn Mậu
Hưng

3.5. Phân tích các dòng rễ tơ khoai lang chuyển gen SSIV bằng kỹ thuật PCR
..................................... 50
3.6. Phân tích cây chuyển gen SSIV bằng kỹ thuật RT-PCR
............................................................. 51

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

........................................................................................................................ . 55
KẾT LUẬN:
............................................................................................................................................... .
55
ĐỀ
NGHỊ:.........................................................................................................................................
........... 55
Tài Liệu Tham Khảo
................................................................................................................................. . 56
Phụ Lục:
.................................................................................................................................................
.......

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN



8


Luận văn Thạc
sỹ

Nguyễn Mậu
Hưng
DANH MỤC HÌNH

Hình 1. Cấu trúc phân tử của amylopectin và amylose ..................................15
Hình 2. Quá trình sinh tổng hợp tinh bột và các enzyme liên quan................19

Hình 3. Cây Sắn ..............................................................................................23
Hình 4. Sản lượng sắn theo châu lục, năm 2006-2011Error! Bookmark not defined.
Hình 5. Tỷ lệ sản lượng sắn các nước trên thế giới, 2012Error!

Bookmark not defined.

Hình 6. Vector pK7GWG2D...........................................................................40
Hình 7. RNA tổng số tách chiết từ củ giống sắn KM140 ...............................44
Hình 8. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen SSIV từ cDNA sắn45
Hình 9. Colony-PCR chọn lọc các dòng khuẩn mang vector pENTR/SSIV.. 46
Hình 10. Kết quả colony-PCR sử dụng mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F/R và kiểm tra sản phẩm cắt
plasmid pK7WG2D/SSIV bằng EcoRI. .........................................47
Hình 11. Kết quả điện di colony-PCR các dòng khuẩn lạc .........................48
Hình 12. Hình ảnh các mảnh lá và thân mẫu khoai lang in vitro trên môi trường đồng
nuôi cấy sau 2 ngày lây nhiễm A.rhizogenes ............................49
Hình 13. Hình ảnh các mảnh lá và thân mẫu khoai lang in vitro bắt đầu ra rễ trên môi
trường chọn lọc sau khi chuyển gen 30 ngày ...................................49
Hình 14. Kết quả tách chiết DNA tổng số một số rễ tơ ..................................50
Hình 15. Sản phẩm PCR nhân gen SSIV từ DNA tổng số tách chiết từ một số dòng rễ tơ
chuyển gen và không chuyển gen ..................................................51
Hình 16. Điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR xác định hoạt động của gen actin trong
các dòng rễ tơ chuyển gen M: thang chuẩn DNA 1kb; 1 - 15: sản phẩm RT-PCR các cây
chuyển gen.................................................................52

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN



7

Luận văn Thạc
sỹ

Nguyễn Mậu
Hưng

Hình 17. Điện di đồ kiểm tra sản phẩm RT-PCR xác định hoạt động của gen
.........................................................................................................................52

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Diện tích, năng suất và sản lượng sắn của thế giới từ năm 2000-2012
......................................................................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 2. Trình tự các cặp mồi sử dụng ............................................................ 32
Bảng 3. Kích thước các phân đoạn thu được khi cắt plasmid tái tổ hợp
pK7GWG2D/SSIV bằng EcoRI ...................................................................... 41
Bảng 4: Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ mang cấu trúc gen tăng cường tổng hợp tinh bột
SSIV ở cây khoai lang ....................................................................... 53

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN



8


Luận văn Thạc

sỹ

Nguyễn Mậu
Hưng

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU STT

KÝ HIỆU

CHỮ VIẾT TẮT
1

A.tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

2

DNA

Acid Deoxiribonucleic

3

BA

6-benzyl adenine

4

bp

Base pair

5

cDNA

Complementary DNA

6

E.coli

Escherichia coli

7

EDTA

Ethylene Diamine Tetra acetic Acid

8

Etal

Đồng tác giả

9

EtBr

Ethidium Bromid

10

GFP

Green Fluorescent Protein

11

HSPs

Heat shock proteins

12

Hyg

Hygromycine resistant

13

LB

14

M

Thang Marker chuẩn

15

mRNA

RNA thông tin

16

MT

Môi trường

17

MS

Luria Bertani

Murashige and Skoog, 1962

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN



9

Luận văn Thạc
sỹ

Nguyễn Mậu
Hưng

18

MT-sHSP

Mitochondrial small Heat shock protein

19

MUG

4-methyl-umBelliferyl-β -D-glucoronide

20

µl

Micro litte

21

µM

Micromolar

22

NAA

23

PCR

24

RT-PCR

1-Naphthaleneacetic acid
Polymerase Chain Reacton
Reverse transcripton polymerase chain
reacton

25

RAPD

Random Amplified Polymorphic DNA

26

SOD

Superoxide dismutase

27

SSIV

Starch synthase IV

28

T-DNA

Transfer-DNA

29

TAE

Tris-acetate –EDTA

30

Ti-plasmid

Tumor-Inducing Plasmid

31

TP

32

Vir

33

WT

Transit peptide
Virulence
Dòng không chuyển gen

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN

10




Luận văn Thạc
sỹ

Nguyễn Mậu
Hưng
MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Tinh bột là nguồn carbohydrate dự trữ chính của cây trồng, là hợp chất cao phân tử
có hàm lượng lớn trong tự nhiên và có ý nghĩa quan trọng đối với đời sống nhân loại. Tinh
bột là chất rắn không hoà tan, có cấu trúc dạng polymer được tạo ra các monomer là
glucose. Tùy thuộc vào dạng liên kết của các phân tử glucose mà tạo thành dạng mạch
thẳng amylose, hoặc dạng mạch nhánh amylopectn. Tinh bột được tích lũy chủ yếu ở

cơ quan củ của thực vật: củ sắn, củ khoai tây, củ khoai lang, củ rong giềng …
Tinh bột có vai trò quan trọng trong đời sống, đây là nguồn cung cấp cacbonhydrat hay
năng lượng chính cho con người. Ngoài ra, tnh bột còn được ứng dụng rộng rãi trong
công nghiệp như thực phẩm, dược. Trung bình trên thế giới sử dụng tới 60 triệu tấn tnh
bột hàng năm bao gồm bột mỳ, bột ngô, bột khoai tây, bột gạo, bột sắn, bột khoai lang.
Hầu hết tnh bột được sử dụng cho các ngành công nghiệp chế biến như: sử dụng làm chất
nền cho quá trình lên men của vi sinh vật (chủ yếu cho sản xuất mỳ chính), công nghiệp
dệt vải sợi, công nghiệp giấy và nhiều ngành công nghiệp khác.
Hàm lượng tnh bột, kích thước hạt tnh bột và hàm lượng amylose là những tính
chất quan trọng của tnh bột có ảnh hưởng nhiều đến các

sản phẩm trong các

ngành công nghiệp thực phẩm (mì sợi, bánh bì và bánh cookies) và phi thực phẩm
(dệt, giấy, và dược phẩm). Các tính chất này quyết định độ nở của bột mì và tnh
bột lúa mì, đó là các chỉ số quan trọng liên quan đến các sản phẩm thực phẩm giàu tnh
bột như mì sợi và mì ăn liền (McCormick et al., 1991; Konik et al., 1993; Sasaki & Matsu ki
1998; Dennett et al., 2009; Salman et al., 2009). Đặc tính tnh bột chịu ảnh hưởng của gen
cũng như môi trường tăng trưởng (Rharrabti et al., 2001; Kindred et al., 2008; Weightman
et al., 2008). Sự hiểu biến đổi của tính chất tnh bột được quyết định bởi hai yếu tố là
giống và điều kiện môi trường xung quanh. Cùng một điều kiện, tính chất tnh bột có thể
thay đổi ở các giống khác nhau. Tương tự,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN

11

Luận văn Thạc
sỹ

Nguyễn Mậu
Hưng

cùng một giống trồng ở môi trường khác nhau tính chất tnh bột cũng thay đổi, từ đó
sẽ gây khó khăn cho các nhà dinh dưỡng và nhà chế biến thực phẩm trong việc dự
đoán thành phần hóa học và quá trình chế biến.

Các nghiên cứu về chọn lọc các

giống cho hàm lượng tốt đã và đang được đẩy mạnh nghiên cứu. Tuy nhiên, hầu hết
chỉ dừng lại ở mức độ chọn lọc giống cho chất lượng tnh bột tốt và ổn định. Các nghiên
cứu sâu hơn về hoạt động của gen liên quan đến các giống tại Việt Nam đang còn ít
và chưa cụ thể. Xuất phát từ thực tiễn đó, cùng với sự phát triển công nghệ và các nghiên
cứu lâu năm của Phòng Công nghệ tế bào thực vật, nhóm nghiên cứu tiến hành tập trung
đánh giá cụ thể hoạt động của gen Starch Synthase IV. Đây là một trong
5 gen quyết định lớn đến sinh tổng hợp và cấu trúc của tnh bột. Để có được Starch
Synthase IV cũng như đánh giá gen này chúng tôi ti ến hành: “Nghiên cứu phân lập và
thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng
hợp tinh bột”.
2. Mục đích nghiên cứu
Mục tiêu tổng quát: Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa
enzyme starch synthase, đồng thời bước đầu đánh giá hoạt động của gen này đến khả
năng tăng cường sinh tổng hợp tinh bột ở các dòng rễ tơ khoai lang.
Mục têu cụ thể:
-

Phân lập và thiết kế vector mang gen SSIV phục vụ cho mục đich chuyển

gen vào cây khoai lang.
-

Tối ưu hóa được quy trình chuyển gen thông qua Agrobacterium rhizogenes và tạo

được các dòng rễ tơ.
-

Bước đầu đánh giá khả năng hoạt động của gen trong các dòng rễ tơ khoai lang ở mức

độ phiên mã
3. Nội dung nghiên cứu
-

Nghiên cứu phân lập gen SSIV từ giống sắn KM140.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN

12




Luận văn Thạc
sỹ
-

Nguyễn Mậu
Hưng

Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D mang gen SSIV bằng kỹ

thuật Gateway.
-

Tạo

chủng

Agrobacterium

rhizogenes

mang

cấu

trúc

vector

pK7WG2D/SSIV.
-

Tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen và đánh giá hoạt động của gen SSIV

trong các dòng rễ tơ khoai lang ở mức độ phiên mã.

4. Ý nghĩa khoa học
Làm cơ sở cho việc đánh giá hoạt động của các gen chức năng liên quan đến sinh tổng
hợp tinh bột ở các cây lương thực tại Việt Nam.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN

13




Luận văn Thạc
sỹ

Nguyễn Mậu
Hưng
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về tinh bột và sinh tổng hợp tinh bột
1.1.1. Giới thiệu về tinh bột
Tinh bột là một glucan không tan, được cấu thành từ hai chuỗi polymer (amylopectin
và amylase) được cấu thành từ các tiểu phần là glucose. Ở thực vật bậc cao, tinh bột được
tổng hợp trong plastid (thể lạp) của cả tế bào quang hợp và không quang hợp. Là
carbohydrate dự trữ chủ yếu, tinh bột đóng vai trò quan trọng trong suốt chu kỳ sống của
thực vật. Trong lá, một phần nhỏ carbon đồng hóa thông qua quang hợp được giữ lại
trong các lục lạp ở dạng tinh bột chứ không được chuyển đổi thành sucrose để vận
chuyển đến các bộ phận khác. Dạng tinh bột tạm thời này sẽ được phân hủy vào ban đêm
để cung cấp cơ chất cho quá trình hô hấp ở lá và tiếp tục tổng hợp sucrose cho việc phát
triển khác của cây(McMaugh et al. 2014) . Tinh bột, công thức hóa học: (C6H10O5)n) là

một polysacarit carbohydrate chứa hỗn hợp amyloza và amylopectin, tỷ lệ phần trăm
amilose và amilopectn thay đổi tùy thuộc vào từng loại tinh bột, tỷ lệ này thường từ 20:80
đến 30:70. Tinh bột có nguồn gốc từ các loại cây khác nhau có tính chất vật lí và thành
phần hóa học khác nhau. Chúng đều là các polymer carbohydrat phức tạp của glucose
(công thức phân tử là C6H12O6). Tinh bột được thực vật tạo ra trong tự nhiên trong các quả,
củ như: ngũ cốc. Tinh bột, cùng với protein và chất béo là một thành phần quan trọng bậc
nhất trong chế độ dinh dưỡng của loài người cũng như nhiều loài động vật khác. Ngoài sử
dụng làm thực phẩm ra, tinh bột còn được dùng trong công nghiệp sản xuất giấy,
rượu, băng bó xương. Tinh bột được tách ra từ hạt như ngô và lúa mì, từ rễ và củ như sắn,
khoai tây, dong là những loại tinh bột chính dùng trong công nghiệp (Evans et al. 2000).
Tinh bột lưu trữ được tái sử dụng để hỗ trợ giai đoạn phát triển khác của cây. Các
bộ phận thu hoạch của cây trồng chủ lực của loài người phần lớn là cơ quan lưu trữ tinh bột
ở thực vật. Có thể kể đến nhóm hạt ngũ cốc (gạo, ngô, lúa mì, lúa mạch, lúa miến…) là nhóm
quan trọng nhất, tiếp theo là các loại củ than

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN

14




Luận văn Thạc
sỹ

Nguyễn Mậu
Hưng

(khoai tây, khoai lang, khoai mỡ) và rễ củ (sắn, khoai môn), và hạt cây họ đậu. Hầu hết tinh

bột của cây trồng đều dùng trực tiếp làm thực phẩm hoặc thức ăn cho chăn nuôi. Tuy nhiên
nhu cầu dùng tinh bột cho công nghiệp đang ngày một tăng lên. Đặc biệt tnh bột đang là
nguồn vật liệu chủ yếu cho thế hệ nguyên liệu sinh học đầu tên do đặc tính dễ lên men.

Cấu trúc phân tử amylopectin

Cấu trúc phân tử amylose

Hình 1. Cấu trúc phân tử của amylopectin và amylose
1.1.2. Cấu trúc của tinh bột
Tinh bột được cấu tạo bởi 2 loại polysaccharid được gọi là amylose và
amylopectin.
Amylose: phân tử amylose là một chuỗi hiện nay được biết đến hàng nghìn đơn
vị β-D-glucose nối với nhau theo dây nối (1→ 4). Quan niệm trước đây cho rằng chỉ có từ
200-400 đơn vị vì do quá trình chiết xuất và phân tích, mạch bị đứt. Phân tử amylose đa số là
các chuỗi thẳng rất ít phân nhánh.
6 7
Amylopectin: amylopectin có phân tử lượng lớn hơn khoảng 10 -10 gồm
5000-50.000 đơn vị glucose và phân nhánh nhiều. Các đơn vị α-D-glucose trong mạch cũng
nối với nhau theo dây nối (1→ 4) còn chỗ phân nhánh thì theo dây nối (1→ 6). Để xét mức
độ phân nhánh, người ta methyl hóa toàn bộ các nhóm OH của amylopectn rồi sau đó
thủy phân và suy ra từ lượng 2, 3 dimethylglucose. Lượng 2, 3, 4, 6 tetramethylglucose
ứng với những đơn vị tận cùng của mạch còn lượng 2, 3, 6 trimethylglucose ứng với những
đơn vị glucose trong mạch (Evans et al. 2000).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN

15

Luận văn Thạc
sỹ

Nguyễn Mậu
Hưng

Ngoài ra còn có thể xác định lượng glucose cuối mạch dựa vào tính khử của
amylopectin không methyl hóa. Chú ý rằng ở đây là glucose ở cuối mạch có OH bán acetal tự
do. Mạch bên trong (mạch giữa 2 điểm phân nhánh) của amylopectin có khoảng 5-9 đơn vị
glucose, những mạch bên ngoài có từ 10-18 đơn vị. Trong các loại tinh bột, trung bình tỉ lệ
amylose là 25% còn amylopectin là 75%. Tuy nhiên người ta cũng tạo ra được những chủng
có nhiều amylose, ví dụ ngô, có tinh bột chứa 75% amylose.
Amylose cho với thuốc thử iod màu xanh đậm có cực đại phổ hấp thu khoảng
660nm, còn amylopectin thì có màu tím đỏ và cực đại hấp thụ khoảng
540nm. Màu tạo thành giữa tinh bột và iod được giải thích do sự hấp phụ. Người ta cho rằng
iod bị hấp phụ vào phía trong hình xoắn ốc. Ứng với một vòng xoắn ốc thì có 1 phân tử iod.
Những phân tử chưa đủ 6 đơn vị glucose thì không phản ứng với iod(Mason-Gamer, Weil,
and Kellogg 1998).
1.1.3. SỰ THỦY PHÂN TINH BỘT
Khi thủy phân tinh bột bằng acid thì sản phẩm cuối cùng là glucose
C6H12O6 (C6H10O5)n + nH2O -> (1+n) (C6H12O6)
Sự thủy phân qua các chặng: dextrin, erythrodextrin, achrodextrin, maltose,
glucose. Amylose dễ bị thủy phân hơn amylopectin vì dây nối (1-> 4) dễ bị cắt hơn là dây
nối (1-> 6).
Thủy phân bằng enzym
Enzym amylase. Có 2 loại chính: a-amylase và β-amylase. Enzym a phổ biến trong
cây, nhiều nhất là các hạt ngũ cốc nẩy mầm, ngoài ra còn có trong nấm mốc, nước bọt,

dịch tụy. a-amylase chịu được nhiệt độ đến 70o, ở nhiệt độ này thì các enzym khác mất hoạt
tính. Enzymβ-amylase có trong khoai lang, đậu nành và một số hạt ngũ cốc, chịu được nhiệt
độ đến 50onhưng chịu được môi trường acid cao hơn so với enzym a (pH = 3,3). Trong thực
tế người ta dựa vào ảnh hưởng khác nhau đó về độ pH và nhiệt độ để tách 2 loại enzym trên.
a) Enzym β cắt xen kẽ những dây nối α-(1->4)-glucosid của amylose để
tạo thành các đường maltose, kết quả thu được là 100% đường maltose. Đối với

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN

16




Luận văn Thạc
sỹ

Nguyễn Mậu
Hưng

amylopectin thì b-amylase chỉ cắt được các dây nối (1->4), khi gặp mạch nhánh thì dừng lại,
kết quả tạo thành maltose và dextrin, lượng maltose chỉ đạt từ 5060%.
b) Enzym α cắt một cách ngẫu nhiên vào dây nối (1->4). Đối với amylose thì sản
phẩm cuối cùng khoảng 90% là maltose ngoài ra có một ít là glucose. Đối với
amylopectin thì α-amylase cũng chỉ tác động đến dây nối (1->4) mà không

cắt được

dây nối(1->6) vì thực tế người ta tm thấy các phân tử isomaltose (= 6-O-α-D-glucopyranosyl-D-glucopyranose) trong dịch thủy phân. Enzym α-amylase tiếp tục cắt được

những dextrin mà enzym b để lại để tạo thành các dextrin phân tử bé hơn. Như vậy αamylase tác dụng lên tinh bột thì sản phẩm thu được chủ yếu là maltose rồi đến glucose
và dextrin phân tử bé. Tinh bột nguồn gốc khác nhau, enzym nguồn gốc khác nhau thì khả
năng thủy phân cũng khác nhau.
1.1.4. HÌNH DẠNG TINH BỘT
Tinh bột tồn tại trong cây dưới dạng hạt có hình dạng và kích thước khác nhau, đây
là một đặc điểm giúp ích cho việc kiểm nghiệm một dược liệu chứa tinh bột. Tùy theo loài
cây và tùy theo độ trưởng thành của cây mà hình dáng và kích thước thay đổi. Về hình dáng
thì có thể hình cầu, hình trứng, hình nhiều góc ... kích thước có thể từ 1-100mm đường
kính. Soi kính hiển vi thường thấy hạt tnh bột cấu tạo bởi nhiều lớp đồng tâm sắp xếp
chung quanh một điểm gọi là rốn hạt. Các lớp này tạo nên là do hạt tinh bột lớn dần bằng
cách tăng thêm các lớp ở phía ngoài. Các lớp này khác nhau ở chỉ số chiết quang và hàm
lượng nước. Có tác giả cho rằng các lớp khác nhau đó là do những lớp được tăng thêm về ban
đêm và những lớp tăng thêm về ban ngày nên không hoàn toàn giống nhau.
1.1.5. Các loại hạt tinh bột hay gặp
Hạt hình trứng và hình thận: Tinh bột khoai tây chế từ củ cây khoai tây
- Solanum tuberosumL. , thuộc họ Cà - Solanaceae. Hạt tinh bột hình trứng, rốn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN

17




Luận văn Thạc
sỹ

Nguyễn Mậu
Hưng

hạt ở đầu hẹp, các vân đồng tâm dễ nhận. Thỉnh thoảng có hạt kép 2 hoặc 3.
Kích thước trung bình 50mm nhưng có hạt lớn đến 80-100mm.
Tinh bột hoàng tinh chế từ củ cây dong - Maranta arundinacea L. , thuộc họ
dong - Marantaceae, (đừng nhầm với cây hoàng tinh - Polygonatum sp.). Hạt hình trứng
kích thước 30-60mm.
Tinh bột sen, chế từ hạt cây sen - Nelumbo nucifera Gaertn., họ Sen Nelumbonaceae. Hạt tinh bột hình trứng hay hình thận, rốn hạt hình vạch kích thước hạt từ
3-25mm.
Tinh bột sắn (= khoai mì) chế từ cây sắn (= khoai mì) - Manihot esculenta
Crantz; họ Thầu Dầu- Euphorbiaceae. Hạt hình cầu phần lớn một đầu bị lẹm và hơi lõm
trông như cái chuông. Rốn hạt hình sao, kích thước 3-35mm.
Tinh bột đậu, chế từ hạt của nhiều loại đậu - Phaseolus spp.; họ Đậu - Fabaceae.
Hạt hình trứng hay hình thận. Rốn hạt dài và phân nhánh, kích thước trung bình 35mm.
Tinh bột hoài sơn, chế từ củ của cây củ mài - Dioscorea persimilis Prain và Burkill,
họ Củ nâu - Dioscoreaceae. Hạt hình trứng hay hình thận. Rốn hạt dài, kích thước trung
bình 40mm.
Hạt hình đĩa hay hình thấu kính dẹt: Tinh bột mì chế từ hạt của cây lúa mì Triticum vulgareL., họ Lúa - Poaceae, kích thước hạt lớn đến 30mm, hạt bé
6-7mm. Tùy theo vị trí nhìn mà thấy hình tròn hoặc hình thấu kính lồi 2 mặt. Rốn hạt là 1
điểm ở giữa hạt, không rõ.
Hạt hình nhiều góc: Tinh bột gạo chế từ hạt cây lúa - Oriza sativa L., họ Lúa Poaceae. Hạt nhiều góc, nhỏ, kích thước từ 4-6mm, thường được kết thành đám. Rốn hạt
không rõ.
Tinh bột ngô (= bắp), chế từ hạt cây ngô - Zea mays L. ; họ Lúa - Poaceae.
Hạt nhiều góc, rốn hạt ở giữa rất rõ, kích thước 15-30mm.
1.1.6. Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột và các gen liên quan
Quá trình tổng hợp tnh bột α-1,4 glucan bao gồm ba bước quan trọng xảy ra trong
lục lạp và thể vô sắc: i) cung cấp glucose-6-phosphate (Glc-6-P) vào

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN

18




Luận văn Thạc
sỹ

Nguyễn Mậu
Hưng

trong các thể lạp, ii) tổng hợp ADP-glucose (ADPG) từ Glc-1-P, và iii) tổng hợp tinh bột từ
ADPG (Zeeman, Kossmann, and Smith 2010). Nói một cách ngắn gọn, bước đầu tiên không
thể thiếu được là sự tổng hợp ADPG từ Glc-1-P và ATP được xúc tác bởi ADP-glucose
pyrophosphorylase (AGPase). Một khi được hoạt hóa, starch synthase (SS) chuyển ADPG
tới đầu không khử của α-1,4 glucan để tạo thành các sợi α-1,4 glucan. Tiếp theo, các sợi α1,4 glucan được dùng như là các cơ chất cho các enzyme phân nhánh của tinh bột (BE hoặc
Q- enzyme) tạo ra các liên kết sợi α-1,6 là amylopectin. Cuối cùng amylopectn được tnh thể
hóa tạo thành tinh bột dưới tác động của các enzyme phân rã (DPE), phosphorylase (Penzyme)

và

glucanotransferase

(D-enzyme).

Ngoài

ra,

UDP-glucose:

protein

glucosyltransferase hoặc amylogenin (38 hoặc 45 kDa) cũng được dự đoán tham gia vào bước
đầu tiên trong quá trình tổng hợp tinh bột (Zeeman, Kossmann, and Smith 2010), (Egli et al.
2010).

Hình 2. Quá trình sinh tổng hợp tinh bột và các enzyme liên quan
Các starch synthase (SS) của thực vật bậc cao mã hóa bởi 5 nhóm gen ký hiệu là GBSS
(granule-bound starch synthase), SSI, SSII, SSIII, và SSIV. GBSS gắn chặt với hạt tinh bột và
chịu trách nhiệm tổng họp amylose. Các biến thể khác nhau của SS (thường gọi là SS hòa
tan) tạo ra các chuỗi amylopectin (1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN

19




Luận văn Thạc
sỹ

Nguyễn Mậu
Hưng

dạng tnh bột đã polyme hóa) có thể tan hoặc trong các plastic hoặc một phần hòa tan
một phần gắn với hạt tinh bột. Số liệu di truyền và sinh hóa chỉ ra rằng mỗi biến thể enzyme
SS có các cấu thành khác nhau và vai trò nhất định trong tổng hợp amylopectin. Phân tích

việc phân phối chiều dài chuỗi amylopectin trong các cây đột biến và cây chuyển gen mất các
biến thể enzyme SS đặc trưng đã dẫn tới kết luận rằng nhóm SSI, SSII, và SSIII đóng vai trò
trong việc kéo dài các chuỗi ngắn, trung bình và dài tương ứng.
Việc phân nhánh của amylopectin xảy ra đồng thời với quá trình kéo dài chuỗi. Quá
trình phân nhánh được xúc tác bởi enzyme phân nhánh (BE). Enzyme này cắt chuỗi αl,4-glucan sẵn có và chuyển đoạn cắt mang 6 đơn vị glucose hoặc nhiều hơn tới vi trí C6 của
gốc glucosyl ở chuỗi glucan khác. BE của thực vật bậc cao bao gồm hai nhóm I và II. Nhóm
I vận chuyển các chuỗi dài hơn. Phân tích di truyền chỉ ra rằng hai nhóm BE có vai trò đặc
biệt trong tổng hợp amylopectin.
Bên cạnh SS và BE còn có các enzyme khác nhau tham gia vào quá trình sinh tổng hợp
tinh bột. Các enzyme khừ phân nhánh - (debranching enzymes, DBE) làm mất các điểm
phân nhánh và quan trọng trong việc quyết định cấu trúc của amylopectn. Thực vật có hai
loại DBE— isoamylase (ISA) và limitdextrinase (LDA, hay còn gọi là pullulanase). Hai loại này
khác nhau bởi trình tự amino acid và cơ chất. ISA có 3 nhóm - ISA1, ISA2, và ISA3. ISA1 và
ISA2 liên quan chặt với tổng hợp amylopectin. Vai trò cơ bản của LDA và ISA3 là phân hủy
tinh bột. ISA1 hoạt động mạnh nhất khi cơ chất là các chuỗi glucan tương đối dài như là các
amylopectn bị hòa tan, trong khi đấy LDA và ISA3 có hoạt tính cao với các chuỗi glucan ngắn
như β-limit dextrins. ISA2 dường như không có hoạt tính xúc tác mà tác dụng điều tiết hoặc
ổn định ISA1 chứ không tham gia trực tiếp vào quá trình hủy phân nhánh. Trong các cây đột
biến hoặc chuyển gen thiếu hụt ISA1, tnh bột dạng hạt bị giảm, thậm chí không có và thay
thế một phần bởi các glucan tan trong nước. Hiện tượng này quan sát được ở một số
thực vật, ví dụ như ở nội nhũ non của ngũ cốc, lá Arabidopsis và củ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN

20

Luận văn Thạc
sỹ

Nguyễn Mậu
Hưng

khoai tây. Trong Arabidopsis và khoai tây việc mất hoạt tính ISA2 có ảnh hưởng giống như
mất hoạt tính của ISA1 (McMaugh et al. 2014). Đột biến thiếu hoạt tính DBE (tức là đột biến
đồng thời 4 gen: isal, isa2, isa3, Ida) không phát hiện được các hạt tinh bột. Kết quả này hoàn
toàn đồng nhất với ý kiến cho rằng hoạt tính DBE là cần thiết cho việc sinh tổng hợp tinh
bột. Tuy nhiên các phân tích sâu hơn về sinh hóa và di truyền chỉ ra rằng việc mất hoàn
toàn tnh bột trong đột biến này là kết quả của việc thay đổi và mất các glucan được
phân nhánh nhờ các enzyme phân hủy tnh bột chứ không phải việc mất hoạt tính DBE
(Watebled et al. 2008). Mặc dù có những phát hiện mới trong việc xác định các enzyme tổng
hợp amylopectin synthesis, những vẫn chưa thể có những hiểu biết một cách chính xác cấu
trúc SS và BE nào được tạo ra, làm thể nào DBE có thể khử phân nhánh một cách chọn lọc,
hoạt động nào của 3 enzyme này được phối hợp như thế nào để tạo thành một phân tử
amylopectin có khả năng tử hình thành hạt tnh bột. Để giải quyết vấn đề này đòi hỏi phát
triển về kỹ thuật trong phương pháp phân tích và phân tử.
Thành phần amylose của tinh bột được tổng hợp bởi GBSS. Các cây đột biến và
chuyển gen thiếu enzyme này là cẩn thiết đế tạo ra cây không có amylose. Các hạt
tnh bột không có amylose vẫn có hình thái bình thường, điều đó chứng tỏ rằng amylopectin
là cần thiết cho việc hình thành hạt. GBSS khác các biến thể khác nhau của enzyme SS ở
chỗ vị trí đặc biệt đối với các hạt và kiểu phản ứng. Không giống các biến the synthase của
tinh bột, GBSS chuyển các gốc glucosyl từ thực vật bậc cao.
1.1.7. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải biến quá trình
trao đổi tinh bột.
Cho đến nay những cố gắng nhàm tăng khả năng tích lũy tnh bột tập trung vào
việc tăng hoạt tính ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) trong cây. Đây là enyme cung
cấp cơ chất cho SS. Một loạt đột biến của gene AGPase Escherichia coli (glgC16) mã hóa

cho các dạng điều khiển khác nhau của enzyme này đã được dùng để biểu hiện mạnh
trong cây. Khi glgC16 được biểu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN

21




Luận văn Thạc
sỹ

Nguyễn Mậu
Hưng

hiện ở plastid của cây khoai tây chuyển gen, một vài dòng đã có khả năng tích luỹ tinh bột
cao hơn dòng không chuyển gen là 60%. Tuy nhiên với các cây khác như sắn, ngô và các
loài khác việc tăng tinh bột không đạt được mức như vậy. Vì thế việc biến đổi một mình
AGPase có thể không có đạt được kết quả mong muốn tăng tinh bột trong các cơ quan dự
trữ. Ngoài ra, có một số bằng chứng về việc tăng nguồn cung cấp ATP cho các plastid có thể
kích thích việc tạo ra ADP-glucose và dẫn đến việc tăng tốc độ sinh tổng hợp tnh bột.
Biểu hiện mạnh yếu tố dẫn truyền adenylate ở vỏ plastd của Arabidopsis trong khoai tây làm
tăng ADP-glucose lên 2 lần và hàm lượng tnh bột tăng lên từ 16-36% so với đối chứng. Khi
kìm hãm adenylate kinase của plastc (enzyme chuyển hóa hai chiều 2 phân từ ADP thành
ATP và AMP) làm ADP-glucose tăng lên 10 lần và tinh bột tăng lên gấp đôi trong củ khoai tây
cả ở trong nhà kính và ngoài đồng ruộng (Ballicora, Iglesias, and Preiss 2003)
Tăng khả năng phân hủy tinh bột lại có tác dụng đối với cây trồng cung cấp nguyên
liệu sản xuất ethanol. Biểu hiện α-amylase chịu nhiệt trong cây ngô đã được ứng dụng để tạo

ra cây tự chế biến, giảm giá thành biến đổi từ tinh bột sang ethanol. Amylase được biểu
hiện trong gian bào nên không tham gia vào sinh tổng hợp tinh bột hay dự trữ vì thế việc
có mặt của nó không ảnh hưởng đến việc tích tụ tnh bột trong quá trình phát triển của cây.
Khi hạt xay ra được làm nóng trong nước để dính hóa tinh bột thì amylase chịu nhiệt sẽ bắt
đầu chuyển đổi tnh bột thành dạng có thể lên men (Zeeman, Kossmann, and Smith
2010).
1.2. Cây sắn và tình hình sản xuất cây sắn trên thế giới và Việt Nam
Sắn (Manihot esculenta Crantz) là cây lương thực hàng năm. Củ sắn có tỷ lệ chất khô 38 40%, tinh bột 16 - 32%, giàu vitamin C, calcium, vitamin B và các chất khoáng, nghèo chất
béo, muối khoáng, vitamin và nghèo đạm.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN

22




Luận văn Thạc
sỹ

Nguyễn Mậu
Hưng

Hình 3. Cây Sắn
Cây sắn hiện được trồng trên 100 nước có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc ba
châu lục: châu Á, châu Phi và châu Mỹ La tinh (Hình 3). Sắn được trồng chủ yếu ở các hộ
nông dân nhỏ. Sắn được sử dụng với nhiều mục đích đa dạng tùy vùng khác nhau trên thế
giới. Ở Châu Á và Châu Mỹ Latnh, củ sắn cung cấp nguyên liệu thô cho chế biến thức ăn cho
gia súc và làm tnh bột ở quy mô nhỏ và lớn. Hiện nay, mặc dù được trồng bởi các hộ nông

dân nhỏ, tại các vùng đất khó trồng trọt nhất, các sản phẩm từ sắn đang được chuyển đổi
nhanh chóng từ sản phẩm mang tính truyền thống thành mặt hàng có tính thương mại. Ở
Đông Nam Á, hầu hết sắn thu hoạch được bán cho các mục đích công nghiệp trong nước và
xuất khẩu (Hoàng Kim và Phạm Văn Biên (1996).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –
ĐHTN

23