Phân lập và thiết kế vector ức chế biểu hiện gen mã hóa enzyme invertase (-fructofuranosidase) nhằm tăng trữ lượng sucrose ở cây mía

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
-------




LƢU THỊ CƢ



PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN
MÃ HÓA ENZYME INVERTASE (-FRUCTOFURANOSIDASE)
NHẰM TĂNG TRỮ LƢỢNG SUCROSE Ở CÂY MÍA






LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Thái Nguyên – 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
-------



LƢU THỊ CƢ



PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN
MÃ HÓA ENZYME INVERTASE (-FRUCTOFURANOSIDASE)
NHẰM TĂNG TRỮ LƢỢNG SUCROSE Ở CÂY MÍA


LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.70



NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ QUỲNH LIÊN

Thái Nguyên – 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa từng có ai công
bố trong bất kỳ một công trình nào khác.

Tác giả


Lưu Thị Cư

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Quỳnh
Liên, Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ
bảo, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện và hoàn thành
luận văn này.
Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Lê Trần Bình, TS.
Chu Hoàng Hà, KS. Đỗ Tiến Phát Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện
Công nghệ Sinh học, là những ngƣời đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt nhiều
kinh nghiệm quý báu và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn
thành luận văn. Trong thời gian thực tập nghiên cứu tôi cũng đã nhận đƣợc sự
hỗ trợ nhiệt tình và những ý kiến đóng góp bổ ích của các cô chú, các anh chị,
các bạn trong Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong khoa Sinh-
KTNN và khoa Sau đại học, trƣờng Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên đã hƣớng
dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi cũng vô cùng cảm ơn những tình cảm tốt đẹp của những ngƣời thân
trong gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã luôn dành cho tôi, động viên và tạo
mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu.
Thái Nguyên, ngày 25 tháng 09 năm 2009
Học viên

Lưu Thị Cư
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3
1.1. VAI TRÒ VÀ TẦM QUAN TRỌNG CỦA CÂY MÍA ................................ 3
1.1.1. Sơ lƣợc về cây mía ............................................................................................. 3
1.1.2. Tình hình sản xuất mía ở Việt Nam ................................................................ 4
1.2. SINH TỔNG HỢP SUCROSE ........................................................................... 5
1.3. VẬN CHUYỂN SUCROSE TRONG TẾ BÀO .............................................. 8
1.5. ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP RNAi (RNA
INTERFERENCE) .................................................................................... 10
1.5.1. Nguồn gốc RNAi .............................................................................................. 10
1.5.2. Cơ chế gây bất hoạt gen .................................................................................. 10
1.6. KỸ THUẬT GATEWAY
®
............................................................................... 12
1.7. NGHIÊN CỨU VỀ TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN Ở CÂY MÍA ........... 14
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 16
2.1. NGUYÊN LIỆU................................................................................................... 16
2.1.1. Nguyên liệu thực vật ........................................................................................ 16
2.1.2. Các chủng plasmid và enzyme ....................................................................... 16
2.1.3. Hóa chất khác .................................................................................................... 16
2.1.3. Các thiết bị máy móc ....................................................................................... 17
2.2. PHƢƠNG PHÁP ................................................................................................. 17
2.2.1. Thiết kế mồi....................................................................................................... 17
2.2.2. Tách RNA tổng số ............................................................................................ 18
2.2.3. RT-PCR .............................................................................................................. 18

2.2.4. Tách dòng và xác định trình tự gen ............................................................... 19
2.2.5. Thiết kế vector tái tổ hợp INV-RNAi ........................................................... 20
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2.2.6. Tái sinh mía thông qua mô sẹo ...................................................................... 21
2.2.7. Thử nghiệm chuyển gen gus-intron vào cây mía ....................................... 22
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: ...................................................................................... 2
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 24
3.1. THIẾT KẾ MỒI ................................................................................................... 24
3.2. TÁCH RNA TỔNG SỐ ...................................................................................... 25
3.3. NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE ............ 27
3.4. TÁCH DÒNG GEN VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN ............................. 28
3.4.1. Tạo plasmid tái tổ hợp INV-pENTR ............................................................ 28
3.4.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợp INV_pENTR vào tế bào khả biến
E.coli TOP 10 ............................................................................................ 28
3.4.3. Chọn lọc plasmide tái tổ hợp INV_pENTR bằng PCR ............................. 29
3.4.4. Kết quả xác định trình tự nucleotit ................................................................ 31
3.5. THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP INV-RNAi ........................................... 31
3.5.1. Tạo vector tái tổ hợp INV_RNAi bằng kỹ thuật Gateway ....................... 31
3.5.2. Biến nạp vector INV_RNAi vào tế bào khả biến E.coli ........................... 32
3.6. BIẾN NẠP VECTOR CHUYỂN GEN INV_RNAi VÀO CHỦNG
VI KHUẨN A.TUMEFACIENS CV58C1. .......................................... 34
3.7. TÁI SINH VÀ BƢỚC ĐẦU BIỂU HIỆN GEN GUS Ở MÍA ................... 35
3.7.1. Quy trình tái sinh mía thông qua mô sẹo ..................................................... 35
3.7.3. Chọn lọc mô sẹo và tái sinh cây chuyển gen ............................................... 37
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 42

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

AS Acetosyringone
A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens
BAP 6-Benzyl Amino Purine (Benzyladeninpurin)
bp Cặp base
cDNA Complementary DNA = DNA bổ sung đƣợc tổng hợp bằng
khuôn mRNA
cs Cộng sự
DEPC Diethyl pyrocarbonat
DNA Deoxyribonucleic Acid
dNTP deoxynucleosit triphotphat (deoxynucleoside triphosphate)
EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid
EtBr đEtBrEthiium bromide
E.coli Escherichia coli
gus β-glucuronidase
IBA Indole-3-Butyric Acid
kb kilo base
LB Luria and Bertani
MS Môi trƣờng nuôi cấy theo Murashige và Skoog
NAA Naphthalene Acetic Acid
OD Giá trị mật độ quang (optical density)
PCR Polymerase Chaine Reaction = Phản ứng chuỗi Polymerase
RNA Ribonucleic Acid
RNase Ribonuclease
RT-PCR Reverse Transcriptase-PCR
SDS Sodium dodecylsulfat
TAE Tris-acetate-EDTA
Taq Thermus aquaticus DNA (polymerase)
2,4D 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên bảng
Trang
Bảng 2.1. Các plasmid sử dụng trong thí nghiệm ................................................. 16
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR một bƣớc................................... 18
Bảng 2.3. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR ............................................................ 19
Bảng 2.4. Các môi trƣờng tái sinh cây mía ............................................................. 21
Bảng 3.1. Trình tự và các thông số cần thiết của cặp mồi 3’INV và
5’INV .......................................................................................................... 25
Bảng 3.2. Mã số các trình tự đoạn gen Invertase ở mía trên ngân hàng
gen NCBI ................................................................................................... 25
Bảng 3.3. Khả năng tạo mô sẹo và tái sinh ở giống mía ROC10 in vitro
trên các môi trƣờng thử nghiệm M1 - M4. .......................................... 36

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
DANH MỤC CÁC HÌNH

Tên hình
Trang
Hình 1.1: Chu trình sinh tổng hợp sucrose với sự tham gia của các
enzyme chính ............................................................................................... 6
Hình 1.2. Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi................................................................ 11
Hình 1.3. Sơ đồ mô tả kỹ thuật Gateway ................................................................ 13
Hình 3.1. Kết quả điện di RNA tổng số tách từ lá và bẹ thân non của 2
giống mía ROC1 và ROC10 trên gel agarose 1% ............................... 26
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 0,8% ................ 27
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid với cặp mồi M13
(For/Rev) nhằm kiểm tra sự có mặt của đoạn Invertase trong
vector pENTR/D ....................................................................................... 30
Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự đoạn gen Invertase phân lập đƣợc

với trình tự Invertase trong ngân hàng gen có mã số
AY302083 .................................................................................................. 31
Hình 3.5. Mô hình cấu trúc chuyển gen INV_RNAi ........................................... 32
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid INV_RNAi tổ hợp với
HindIII và XbaI ......................................................................................... 34
Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR plasmid INV-RNAi trong
A.tumefaciens với cặp mồi đặc hiệu 5’INV và 3’INV ....................... 35
Hình 3.8. Quy trình tái sinh mía ROC10 in vitro từ mô sẹo ................................ 37
Hình 3.9. Biến nạp gen gus-intron vào cây mía ROC10 in vitro thông
qua trung gian A.tumefaciens ................................................................. 39


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1

MỞ ĐẦU

Đƣờng là một nhu cầu cần thiết trong đời sống con ngƣời. Theo thống
kê, nhu cầu tiêu thụ đƣờng trên thế giới trung bình tính theo đầu ngƣời là 35
kg/1 ngƣời/1 năm. Tại Việt Nam, năm 1994 là 8 kg/1 ngƣời/1 năm, hiện nay
là 15 kg/1 ngƣời/1 năm và dự kiến nhu cầu về đƣờng còn tiếp tục tăng nữa.
Tại các nƣớc nhiệt đới và cận nhiệt đới nhƣ Việt Nam, 75% sản lƣợng
đƣờng đƣợc sản xuất từ cây mía. Mía là một trong số ít loài thực vật tích trữ
chủ yếu đƣờng sucrose (α-D-glucopyranosyl-1, 2-D-fructofuranose), nguồn
nguyên liệu ban đầu để sản xuất đƣờng. Do đó, ở Việt Nam mía trở thành
một cây công nghiệp trọng yếu và là cây xóa đói giảm nghèo của chính phủ.
Tuy nhiên, các giống mía của Việt Nam có năng suất đƣờng chỉ đạt mức
trung bình của thế giới. Việc nhập các giống mía cao sản của thế giới kết
hợp với phƣơng pháp lai tạo truyền thống chƣa thực sự có hiệu quả trong
việc tạo giống mía có hàm lƣợng đƣờng cao lại phù hợp với điều kiện thổ

nhƣỡng khí hậu của nƣớc ta. Chọn tạo giống mía có hàm lƣợng đƣờng cao
bằng công nghệ sinh học có tiềm năng giảm giá thành đƣờng mà không cần
tăng diện tích trồng mía và thúc đẩy sự phát triển nền công nghiệp mía
đƣờng tại Việt Nam.
Sinh tổng hợp sucrose là một quá trình phức hợp, trong đó enzyme
Invertase đƣợc xem nhƣ là một chiếc chìa khóa điều chỉnh sự tích lũy lƣợng
sucrose trong cây mía. Nó có vai trò phân hủy sucrose trong tế bào. Vì vậy,
muốn tăng trữ lƣợng sucrose trong cây mía thì phải ức chế đƣợc sự biểu hiện
của gen mã hóa Invertase. Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi (RNA-interference)
hiện nay đã trở thành một biện pháp công nghệ hữu hiệu có thể ức chế hoàn
toàn biểu hiện của gen ở động vật, thực vật và cả vi sinh vật [31]. Ở thực vật,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2
RNAi có thể đƣợc thực hiện bằng cách chuyển gen có cấu trúc biểu hiện sự
phiên mã cao RNA sense, anti-sense hoặc RNA kẹp tóc bổ sung chính nó mà
chứa trình tự tƣơng đồng với gen đích.
Với mục tiêu nghiên cứu chọn tạo giống mía có hàm lƣợng đƣờng cao,
chúng tôi chọn đề tài “Phân lập và thiết kế vector ức chế biểu hiện gen mã
hóa enzyme Invertase (β-fructofuranosidase) nhằm tăng trữ lượng sucrose
ở cây mía”.
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU:
Ức chế biểu hiện của Invertase dạng hòa tan nhằm tăng trữ lƣợng
sucrose ở cây mía.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:
1. Phân lập đoạn gen mã hóa cho enzyme Invertase ở cây mía in vitro
ROC1
2. Thiết kế đƣợc vector ức chế biểu hiện gen mã hóa Invertase (β-
fructofuranosidase) ở cây mía.
3. Nghiên cứu hệ thống tái sinh ở cây mía phục vụ cho mục đích chuyển

gen tiếp theo.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3
Chƣơng 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. VAI TRÕ VÀ TẦM QUAN TRỌNG CỦA CÂY MÍA
1.1.1. Sơ lƣợc về cây mía
Mía (Saccharum L.) thuộc chi mía (Saccharum), họ hòa thảo
(Poaceae), bộ lúa (Poales), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae). Chúng là
những cây có thân to, mập, chia đốt cao từ 2 - 6 m. Các loại thực vật trong chi
này đa số là các loại cỏ sống lâu năm bao gồm khoảng 6 - 37 loài tùy theo hệ
thống phân loại, sống chủ yếu ở khu vực nhiệt đới và ôn đới trên thế giới [2].
Cây mía chứa hàm lƣợng đƣờng rất cao chiếm khoảng 46% khối lƣợng khô,
trong đó sucrose chiếm tới 80%. Chính vì thế, mía trở thành một trong những
cây công nghiệp quan trọng của ngành công nghiệp sản xuất đƣờng. Ngoài ra,
cây mía còn chứa các chất đạm (protein), chất bột (carbohydrate), chất béo
(lipid), các chất khoáng và các vitamin… vì thế mía còn có tác dụng thanh
nhiệt, giải khát, trợ giúp tiêu hóa, cung cấp năng lƣợng và các chất dinh
dƣỡng cần thiết cho cơ thể. Theo Đông y, mía là "vị thuốc" dùng để chữa một
số bệnh nhƣ ho khan, đại tiện táo, tiểu tiện bất lợi, đau dạ dày, an thai…
Mía còn là loại cây có tác dụng bảo vệ đất rất tốt, đặc biệt là chống xói
mòn đất cho các vùng đồi trung du. Hơn nữa, mía là cây rễ chùm và phát triển
mạnh trong tầng đất từ 0 - 60 cm (1 ha mía tốt có thể cho 13 - 15 tấn rễ sau
thu hoạch), đây là nguồn chất hữu cơ quý làm tăng độ phì của đất. Phần bã
mía chứa nhiều cellulose có thể dùng làm nguyên liệu đốt lò, hoặc làm bột
giấy, bìa các tông, ép thành ván dùng trong kiến trúc... Sản phẩm cặn bã còn
lại sau khi chế biến đƣờng (bùn lọc) có thể sử dụng để sản xuất nhựa, xêrin,

làm sơn, xi đánh giầy... phế phẩm còn lại dùng làm phân bón rất tốt. Trong
tƣơng lai bã mía còn có thể nguồn nguyên liệu làm bột giấy, làm sợi thay thế

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
4
các loại cây rừng bị giảm đi. Khi mà nguồn nhiên liệu lỏng ngày càng cạn kiệt
nhƣ hiện nay, một số nƣớc phát triển trên thế giới nhƣ Mỹ, Brazil, Ấn Độ…
đã bắt đầu sử dụng nhiên liệu sinh học từ cây mía để bổ sung và thay thế. Nhƣ
vậy, cây mía có vai trò rất quan trọng trong đời sống kinh tế của con ngƣời.
1.1.2. Tình hình sản xuất mía ở Việt Nam
Hiện nay có khoảng 200 quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới trồng
và sản xuất mía đƣờng, sản lƣợng trung bình đạt khoảng 13.246 triệu tấn (gấp
6 lần so với củ cải đƣờng). Ở Việt Nam, mía là cây trồng chủ đạo trong ngành
công nghiệp đƣờng của cả nƣớc. Dự kiến niên vụ 2009-2010 diện tích mía
nguyên liệu cả nƣớc sẽ vào khoảng 290.000 ha, tăng 19.400 ha so với vụ
trƣớc, trong đó diện tích vùng mía nguyên liệu tập trung của các nhà máy là
221.816 ha với năng suất mía bình quân đạt 55 tấn/ha và sản lƣợng đạt 16
triệu tấn. Cây mía góp phần xóa đói giảm nghèo ở vùng trung du, miền núi ở
nhiều tỉnh nƣớc ta nhƣ: Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Phú Yên, Bình
Định, Quảng Ngãi [3]... Nhà nƣớc đã hỗ trợ một phần đầu tƣ phát triển cơ sở
hạ tầng giao thông, thủy lợi cho vùng trồng mía tập trung, nghiên cứu chuyển
giao khoa học kỹ thuật và công nghệ nhằm nâng cao năng suất, chất lƣợng,
hiệu quả sản xuất mía đƣờng [1].
Quá trình đô thị hóa, công nghiệp hóa ngày một gia tăng cùng với sự
biến đổi môi trƣờng khí hậu nên diện tích đất trồng trọt có xu hƣớng ngày một
thu hẹp. Hơn nữa, ở nƣớc ta hiện nay có tới trên 60% các giống mía là những
giống cũ nhƣ: ROC1, ROC10, F156, F127… hoặc các dạng lai ghép nội chi
phức tạp. Các giống này có đặc điểm dễ canh tác, thích nghi rộng với nhiều
vùng sinh thái của Việt Nam, nhƣng trữ lƣợng đƣờng rất thấp. Còn lại các
giống mía nhập nội tuy có trữ lƣợng đƣờng cao song không phù hợp với khí

hậu Việt Nam nên năng suất thấp. Chính vì thế, Quyết định số 26/2007/QĐ-

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
5
TTg của Phó thủ tƣớng Nguyễn Sinh Hùng “Quy hoạch phát triển mía đƣờng
đến năm 2010 và định hƣớng đến năm 2020” đƣợc phê duyệt đã đƣa quan
điểm rõ ràng là: đồng thời với việc nhập khẩu giống mía có năng suất, trữ
đƣờng cao đƣợc đánh giá tốt phù hợp với Việt Nam thì phải xây dựng hệ
thống viện nghiên cứu và các trung tâm giống mía đủ điều kiện trang thiết bị
và năng lực cán bộ để chủ động sản xuất giống tốt, có năng suất, trữ lƣợng
đƣờng cao của Việt Nam, đáp ứng yêu cầu sản xuất [1].
1.2. SINH TỔNG HỢP SUCROSE
Trong lục lạp của mía có enzyme photphoenolpyruvat
-
cacboxilase hoạt
động rất mạnh. Sản phẩm đầu tiên của quang hợp ở mía là các axit
oxaloaxetic, malic, aspartic đều gồm có bốn nguyên tử cacbon trong phân tử,
do đó mía đƣợc gọi là thực vật C
4
[5]. Chu trình C
4
(hay cơ chế Hatch-Slack)
là cơ chế có sự chuyên hoá trong việc thực hiện chức năng quang hợp của
cây C
4
: một loại lục lạp chuyên trách cố định CO
2
, còn một loại lục lạp
chuyên khử CO
2

thành các chất hữu cơ cho cây. Vì vậy mà hoạt động quang
hợp của cây C
4
có hiệu quả hơn các nhóm thực vật khác và thƣờng cho năng
suất sinh học rất cao.
Sucrose là một disaccharide của glucose (α-D-glucopyranoside) và
fructose (β-D-fructofuranosyl), có công thức phân tử C
12
H
22
O
11
. Đây là sản
phẩm chính của quá trình quang hợp, có vai trò bổ sung năng lƣợng cho quá
trình sinh trƣởng phát triển của thực vật cũng nhƣ các sinh vật sống khác.
Trong cơ thể động vật, sucrose là nguyên liệu tổng hợp glucogen, khi thừa
sẽ chuyển sang dạng mỡ dự trữ. Sucrose tích lũy phần lớn ở các mô của thực
vật, giúp cho thực vật có khả năng thích nghi tốt hơn với các điều kiện bất
lợi của môi trƣờng nhƣ: hạn, lạnh, mặn và cƣờng độ ánh sáng mạnh... [7, 12,
17, 23, 26, 30]. Nó đƣợc tích trữ chủ yếu ở cây mía, củ cải đƣờng và có ở

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
6
trong nhiều loại cây khác nhƣ dứa, chuối, mơ, mận, dƣa hấu, táo, cà rốt…
đây là nguồn nguyên liệu tự nhiên, rất dễ trồng với số lƣợng lớn và giá rẻ.
Sucrose rất dễ hòa tan trong nƣớc, khi bị thủy phân tạo thành glucose và
fructose.
Sinh tổng hợp sucrose là một chu trình phức tạp diễn ra ở cytosol (tế
bào chất) trong lá của cây trồng với sự tham gia của nhiều enzyme khác nhau,
trong đó một số enzyme chính (key enzyme) có ảnh hƣởng lớn tới lƣợng

sucrose đƣợc tổng hợp. Các enzyme này xúc tác cho các dạng phản ứng:
(1) Tổng hợp sucrose nhƣ sucrose 6-phosphatephosphatase (SPS) hoặc
sucrosesynthase (SS)
(2) Thủy phân sucrose nhƣ β-fructofuranosidase (Invertase)
(3) Vận chuyển các hexose tới tế bào chất và chuyển hóa lại thành sucrose
nhƣ pyrophosphate fructose 6-phosphat 1 phosphostransferase (PFP) [6].

Hình 1.1: Chu trình sinh tổng hợp sucrose với sự tham gia của các
enzyme chính
SUCROSE 6’-P
FRUCTOSE
GLUCOSE 6-P
ATP
FRUCTOSE 1.6-P2
GLUCOSE 1-P
UDP-GLUCOSE
UTP
SUCROSE
FRUCTOSE 6-P
GLUCOSE
ADP
UDP
UDP
ADP
ATP PPi
Pi
Pi
Invertase
SPS
SS

Pi
PFP

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
7
Thay đổi hoạt tính các enzyme này thƣờng dẫn tới những biến đổi lớn
trong lƣợng sucrose tích lũy trong tế bào thực vật [6, 10, 11, 15, 31, 35]. Các
enzyme liên quan tới chu trình sinh tổng hợp sucrose ở thực vật đã đƣợc
nghiên cứu trên nhiều đối tƣợng gồm cả thực vật hai lá mầm và một lá mầm
[10, 15, 31]. Trong đó, SPS (sucrose 6-phosphatephosphatase) đƣợc coi là
enzyme chính của chu trình sinh tổng hợp sucrose ở thực vật, nó xúc tác quá
trình hình thành sucrose 6-phosphate, cơ chất cho phản ứng tổng hợp các
phân tử sucrose [7, 16]. SPS là enzyme có hoạt tính tỉ lệ thuận với sucrose
trong các mô dự trữ của khoai tây, ngô, cải bó xôi [30]. Ở ngô, hoạt tính SPS
tỉ lệ thuận với tốc độ tổng hợp và vận chuyển sucrose [16]. Cây cà chua
chuyển gen tăng cƣờng biểu hiện SPS thì lƣợng sucrose tăng còn lƣợng tinh
bột giảm trong quá trình quang hợp [33]. Tƣơng tự, cây bông mang gen SPS
của rau bi-na (spinacia oleracea) cũng có tốc độ tổng hợp sucrose cao hơn so
với đối chứng [13]. Ngƣợc lại, khi làm bất hoạt SPS, các dòng cây khoai tây
chuyển gen sẽ giảm trữ lƣợng sucrose [10]. Gen mã hóa cho SPS đã đƣợc
phân lập từ nhiều loài thực vật khác nhau và cho tới nay ngân hàng gen NCBI
đã có thông tin về vài trăm trình tự SPS của các loài thực vật hai lá mầm nhƣ
khoai tây, thuốc lá, rau bi-na, củ cải đƣờng; cây một lá mầm nhƣ lúa, ngô, mía
và cả tảo lam [9, 10, 13, 14, 21, 27, 31, 33]. Liên quan chặt chẽ với SPS trong
chu trình sinh tổng hợp sucrose là enzyme thủy phân sucrose - Invertase (β-
fructofuranosidase). Khi hoạt tính của Invertase cao thì lƣợng đƣờng tích lũy
trong các mô tế bào giảm và ngƣợc lại. Hoạt tính của enzyme pyrophosphate
fructose 6-phosphotransferase (PFP) cũng tỉ lệ nghịch với lƣợng sucrose trong
tế bào thực vật [11]. PFP xúc tác chuyển hóa fructose 6-phosphate thành
fructose 1,6-biphosphate. Do vậy, nếu hoạt tính của PFP giảm, lƣợng cơ chất

cho phản ứng tổng hợp sucrose sẽ tăng, dẫn tới lƣợng sucrose cũng tăng
tƣơng ứng. Ảnh hƣởng này đã đƣợc chứng minh trên các dòng mía có mang

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
8
cấu trúc antisense làm bất hoạt PFP. Lƣợng sucrose trên các cây mía chuyển
gen còn non tăng khoảng 50%. Tuy nhiên, khi phân tích trên các cây trƣởng
thành, tổng lƣợng sucrose tăng, nhƣng chƣa đáng kể so với đối chứng [11].
Những nghiên cứu trên đã chứng tỏ đƣợc vai trò quan trọng của các enzyme
SPS, PFP, Invetase trong việc tổng hợp và tích lũy sucrose ở thực vật.
1.3. VẬN CHUYỂN SUCROSE TRONG TẾ BÀO
Theo thuyết vận chuyển đƣờng (hay thuyết Turgeon), đƣờng sucrose
đƣợc tổng hợp ở tế bào chất của các tế bào thịt lá trong quang hợp sẽ đƣợc
vận chuyển ra không bào, sau đó nhờ hệ thống cấu trúc liên kết giữa các tế
bào (sợi liên bào và cầu sinh chất hay plasmodesmata) nó sẽ đƣợc chuyển từ
tế bào này sang tế bào khác và nhờ ống dẫn phloem mà sucrose đi tới khắp
các cơ quan của thực vật bằng con đƣờng khuyếch tán. Các phân tử nhỏ
sucrose trong ống dẫn phloem sẽ đƣợc polyme hóa thành những phân tử
đƣờng lớn và phức tạp hơn, lúc này các phân tử đƣờng đƣợc đẩy ra xa khỏi lá
đến những phần khác của cây, nơi mà nó đƣợc sử dụng hay tích trữ lại, và do
kích thƣớc của nó quá lớn nên nó không thể chuyển ngƣợc trở về lá. Chính cơ
chế khuếch tán này đã tạo nên sự vận chuyển liên tục sucrose từ các cơ quan
quang hợp (source tissue) tới các cơ quan dự trữ (sink tissue). Bên cạnh đó,
sucrose còn đƣợc vận chuyển và tích trữ tại không bào làm nguyên liệu cho
chu trình sinh tổng hợp tinh bột. Ngoài lƣợng sucrose đƣợc vận chuyển liên
tục, một phần sucrose sẽ đƣợc phân hủy nhằm cung cấp năng lƣợng cho quá
trình sinh trƣởng và phát triển, đồng thời tái tạo các cơ chất khác.
1.4. ENZYME INVERTASE (β-FRUCTOFURANOSIDASE)
Invertase (β-fructofuranosidase) đƣợc mã hóa bởi 5 - 10 đồng phân tùy
thuộc từng loài thực vật khác nhau. Cây mô hình Arabidopsis thaliana có 5

đồng phân Invertase, trong khi ở cà chua hiện nay đã phân lập đƣợc 8 đồng
phân. Hiện nay, trên ngân hàng gen đã có trình tự EST (Expressed Sequenced

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
9
Tags) của enzyme Invertase phân lập từ một số giống mía [35]. Invertase
trung tính (có trong tế bào chất) đã đƣợc tinh sạch từ thân mía trƣởng thành.
Tuy nhiên trình tự gen mã hóa cho dạng enzyme này vẫn chƣa đƣợc công bố
trên GenBank.
Invertase có mặt ở hầu hết các mô thực vật tích trữ đƣờng và tồn tại ở
nhiều dạng khác nhau: dạng hoà tan (soluble acid Invertase) có nhiều trong
không bào (dịch tế bào); dạng liên kết với màng (cell wall Invertase) có trong
thành tế bào; dạng độc lập (neutral Invertase) có chủ yếu trong hạt. Nó là một
enzyme xúc tác quá trình thủy phân sucrose trong không bào thành hai đƣờng
đơn là glucose (Aldohexose) và fructose (Ketohexose) [6].
Vì thế, mức độ biểu hiện của nó có nhiều ảnh hƣởng lên sự sinh trƣởng
phát triển của thực vật [6]. Cụ thể, khi Invertase có hoạt tính cao nó sẽ làm
giảm một lƣợng sucrose đáng kể trong thân cây mía. Nghiên cứu cho thấy
những dòng mía có sản lƣợng đƣờng cao thƣờng là các dòng có hoạt tính
Invertase thấp và ngƣợc lại [35]. Tƣơng tự, một số dòng cà chua ngọt có tích
lũy nhiều đƣờng là do hoạt tính của Invertase thấp. Invertase có hoạt tính cao
trong không bào của tế bào thuốc lá và đậu tƣơng cũng đã làm giảm lƣợng
sucrose trong các cơ quan này [6]. Bất hoạt Invertase làm tăng tỉ lệ tích trữ
sucrose trong cây cà chua chuyển gen ở lá và quả, đồng thời cũng làm thay
đổi tỉ lệ đƣờng đơn (hexose) trong các dòng cây này [18, 24]. Lá của các dòng
khoai tây biểu hiện gen mã hóa Invertase phân lập từ nấm men tích trữ chủ
yếu glucose và fructose hơn là sucrose. Hơn nữa, những dòng này hình thành
ít củ và nhỏ hơn các dòng đối chứng, nhƣng chứa nhiều đƣờng hơn là tinh
bột. Điều này chứng tỏ rằng Invertase có liên quan chặt chẽ tới hàm lƣợng và
vận chuyển của sucrose ở thực vật.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
10
Nhƣ vậy, Invertase đƣợc xem nhƣ là một chiếc chìa khoá điều chỉnh sự
tích lũy sucrose dự trữ trong thực vật. Do đó, ức chế biểu hiện của Invertase
có thể tăng tích lũy sucrose trong cây mía.
1.5. ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP RNAi (RNA
INTERFERENCE)
1.5.1. Nguồn gốc RNAi
RNAi là một cơ chế căn bản để kiểm soát chuỗi thông tin di truyền hay
cách vô hiệu hoá hoạt động của các gen xác định do hai nhà khoa học Andrew
Z. Fire và Craig C. Mello khám phá ra và công bố trên tạp chí Nature vào
ngày 19/12/1998 [4]. Andrew Fire và Craig Mello đã nghiên cứu cơ chế điều
khiển biểu hiện gen ở giun tròn (Caenorhabditis elegans) và cho rằng khi
mRNA “chiều dịch mã” và “chiều đối mã” gặp nhau thì chúng sẽ kết hợp lại
thành những mRNA sợi kép. Hai ông đã kiểm chứng lại giả thuyết của mình
bằng cách tiêm các phân tử mRNA sợi kép chứa các mật mã di truyền quy
định nhiều protein khác của giun tròn. Kết quả đều thu đƣợc protein đƣợc mã
hóa bởi các gen đó không đƣợc tổng hợp. Qua đó Fire và Mello đã rút ra đƣợc
kết luận rằng có thể RNA dạng chuỗi kép đã làm các gen bị bất hoạt. Công
trình đƣợc công bố và đƣợc trao giải Nobel Y học năm 2006.
1.5.2. Cơ chế gây bất hoạt gen
RNAi (RNA interference) đƣợc coi nhƣ một phƣơng thức miễn dịch tự
nhiên giúp sinh vật chống lại sự xâm nhập của virus RNA bằng cách phân
huỷ các trình tự nucleotide tƣơng đồng của chúng [8]. Nó làm trung gian
kháng lại cả acid nucleic ngoại bào và nội bào, cũng nhƣ điều khiển sự biểu
hiện gen mã hóa protein. Nó đƣợc thực hiện khi có sự xuất hiện của phân tử
RNA mạch kép trong cơ thể sinh vật gây nên ức chế sự biểu hiện gen của một
loại trình tự đặc hiệu.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
11

Hình 1.2. Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi

Hình 1.2 cho thấy, Cơ chế RNAi đƣợc bắt đầu bằng việc phân cắt phân
tử RNA chuỗi kép (dsRNA) bởi enzyme Dicer - một trong những enzyme thuộc
họ RNase III, tạo thành các phân tử RNA ức chế nhỏ (siRNA) có kích thƣớc
khoảng 21 - 26 nucleotide [4]. Các siRNA này đƣợc giải xoắn và một mạch
gắn kết với một phức hợp protein một cách chọn lọc gọi là phức hợp cảm ứng
sự bất hoạt RNA (RISC – RNA Induced Silencing Complex). Argonaute
(protein Argonaute) trong RISC có chứa RNase-H hoạt động nhƣ một
endonuclease sẽ tách siRNA thành những chuỗi RNA đơn, trong đó chỉ có một
chuỗi đơn RNA có đầu 5
’
có lực bắt cặp base (base pairing) nhỏ nhất đƣợc
chọn để tiếp tục đi vào phức hệ RISC. Sau đó, RISC sẽ thu nhận các phân tử
phiên mã mRNA nội sinh của tế bào có trình tự tƣơng đồng với trình tự của
chuỗi siRNA đang có mặt trong phức hệ bằng cách bắt cặp với các base theo

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
12
nguyên tắc bổ sung. Khi đã đƣợc nhận diện các mRNA nhanh chóng bị cắt đứt
ở khoảng giữa của chuỗi xoắn kép siRNA-mRNA và bị tiêu hủy bởi các RNA
nuclease (Helicase) có trong RISC. Sợi RNA bị phân cắt, tiếp tục hình thành
các siRNA. Quá trình tiếp diễn liên tục nhƣ vậy sẽ phân hủy các bản mã sao
hình thành, kết quả là ức chế biểu hiện của gen mong muốn [4].
Cơ chế can thiệp RNAi đem lại những ứng dụng vô cùng to lớn và
đang là công cụ nghiên cứu hữu ích trong nhiều ngành sinh học, nông
nghiệp và y dƣợc học. Nó đƣợc biết đến nhƣ một kỹ thuật sinh học hiện đại

có hiệu quả trong việc chuyển gen phòng chống bệnh do virus, vi khuẩn, hay
làm tăng cƣờng, ức chế một tính trạng mong muốn nào đó ở sinh vật.
Phƣơng pháp này đã đƣợc ứng dụng thành công để thay đổi thành phần chất
béo trong dầu, loại caffein trong cà phê, tăng hàm lƣợng lysine trong ngô
hoặc loại các chất gây dị ứng ở táo và cà chua [19, 20, 25]. RNAi là một
hƣớng mới cho phép các nhà khoa học nghiên cứu những ứng dụng trong
các liệu pháp trị bệnh cho con ngƣời trong tƣơng lai cũng nhƣ phân tích
chức năng hệ gen cây trồng v.v...
1.6. KỸ THUẬT GATEWAY
Kỹ thuật Gateway (Invitrogen) là một kỹ thuật dòng hóa phổ biến, nó
mang lại hiệu quả cao và nhanh chóng khi phân tích chức năng, biểu hiện
protein và dòng hóa đoạn DNA. Kỹ thuật này cho phép chuyển đoạn DNA
giữa các vector tách dòng khác nhau mà vẫn duy trì định hƣớng chính và cấu
trúc đọc, thay thế việc sử dụng các enzyme giới hạn và các enzyme nối hiệu
quả trong thời gian ngắn. Kỹ thuật này có hiệu quả cao (90%) đối với việc
tách dòng có định hƣớng của các sản phẩm PCR. Hơn nữa các phản ứng đơn
giản, dễ thực hiện, nhanh, mạnh và tự động. Đây là kỹ thuật hữu ích cho
những đặc tính tái tổ hợp đặc hiệu vị trí của vi khuẩn lambda, giúp cho phản

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
13
ứng tái tổ hợp lambda (Lambda reconstruction: LR) xảy ra một cách hiệu quả
và gắn các đoạn trình tự DNA vào nhiều hệ thống vector.


Hình 1.3. Sơ đồ mô tả kỹ thuật Gateway
- Kỹ thuật Gateway đƣợc thực hiện bởi hai bƣớc chính:
+ Tạo dòng tiếp nhận “entry clone” bằng cách chèn gen biểu hiện
(expression gene) vào vector tiếp nhận (pENTR/D).
+ Tạo dòng biểu hiện (expression clone) bằng cách tái tổ hợp giữa

“entry clone” với một vector đích (destination vector) mà có chứa các trình tự
attR1 và attR2 và marker có khả năng kháng chọn lọc ccdB.
Trên hình 1.3 cho thấy dòng vector nhận có các điểm tái tổ hợp attL1
và attL2 sẽ phản ứng với các điểm tái tổ hợp trên vector đích attR1 và attR2
để tạo ra một cấu trúc mới attB1 và attB2. Mặt khác, đoạn gen quan tâm đƣợc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
14
gắn vào trên vector nhận sẽ trao đổi chéo với đoạn ccdB trên vector đích vì
thế thu đƣợc trên dòng biểu hiện có cấu trúc của đoạn gen mong muốn.
1.7. NGHIÊN CỨU VỀ TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN Ở CÂY MÍA
Tái sinh cây đƣợc xem là mấu chốt quan trọng, quyết định sự thành công
của các thí nghiệm chuyển gen. Hiện nay, hệ thống chuyển gen ở thực vật
thông qua A.tumefaciens đã mang lại những thành tựu lớn trong thời gian
ngắn có thể tạo ra các giống cây trồng có những đặc tính tốt mong muốn. Ở
mía đã chuyển gen thành công với hai phƣơng pháp là súng bắn gen và thông
qua vi khuẩn A.tumefaciens, trong đó chuyển gen thông qua A.tumefaciens là
hiệu quả hơn hẳn.
Snyman và cs (2006) đã tái sinh và chuyển gen thành công ở cây mía
bằng phƣơng pháp súng bắn gen từ mô sẹo [29]. Mô sẹo tạo ra bằng cách đặt
những lát cắt nhỏ dày 1 - 2 mm ở phần đỉnh ngọn của cây mía lên môi trƣờng
cảm ứng tạo mô sẹo là (MS + 30 g/l sucrose + 0,5 g/l casein + 0,6 mg/l 2,4D
+5 g/l agar), pH = 5,8 trong điều kiện tối, ở 28
o
C. Trƣớc 4 giờ chuyển gen
bằng kỹ thuật súng bắn gen, các mô sẹo đƣợc đặt lên môi trƣờng có bổ sung
thêm 0,2 M Sorbitol; 0,2 M manitol. Sau chuyển gen các mô sẹo đƣợc đồng
nuôi cấy ở trong tối, 3 ngày. Tiếp theo mô sẹo đƣợc chuyển sang môi trƣờng
chọn lọc và thu đƣợc cây chuyển gen hoàn chỉnh với các môi trƣờng có bổ
sung 45 mg/l geneticin.

Manickavasagam và cs (2004) tái sinh và chuyển gen thành công ở mía
thông qua A.tumefaciens từ các mô phân sinh của chồi bằng con đƣờng tạo đa
chồi với hiệu quả thu đƣợc là 49,6% cây chuyển gen [22]. Lây nhiễm
A.tumefaciens vào các mô non đã bị làm thƣơng của mía trong 10 phút. Sau
đó thấm khô trên giấy thấm và đặt lên môi trƣờng MS trong 3 ngày. Các mô
đƣợc diệt khuẩn bằng nƣớc cất khử trùng có bổ sung 500 mg/l cefotaxime.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
15
Ông tạo đƣợc các cây chuyển gen trên các môi trƣờng chọn lọc tái sinh có bổ
sung 5 mg/l ppt.
Santosa và cs (2004) chuyển gen thành công vào mô sẹo của mía thông
qua A.tumefaciens GV2260. Kết quả kiểm tra các cây sau chọn lọc thấy rằng
có khoảng 85 - 100% cây sống sót có mang gen chuyển [34]. Mô sẹo đƣợc tạo
từ đoạn thân non trên môi trƣờng [4,3 g/l MS + 30 g/l sucrose + 0,5 g/l NZ-
amine + 0,3 ml vitamin (0,1 g / 75 ml hydrochloride thiamine; 0,05 g / 75 ml
biotin; 1 g / 75 ml pyrodoxine hydrochlorid; 0,25 g / 75 ml myo-inositol) + 3
mg/l 2,4D + 100 ml nƣớc dừa + 8 g/l agar, pH = 5,8] trong điều kiện tối, 1
tháng. Trƣớc 7 giờ biến nạp với A.tumefaciens bổ sung thêm 75 μl chất chống
ôxyhóa vào dịch khuẩn. A.tumefaciens đƣợc hòa tan với môi trƣờng cảm ứng
tạo chồi có bổ sung 5 ml chất chống ôxyhóa với OD
578
= 0,2 và đƣợc lây
nhiễm với các mảnh mô sẹo nhỏ (2 - 3 mm) trong 5 - 10 phút. Diệt khuẩn và
chuyển mô sẹo lên môi trƣờng có bổ sung 500 mg/l cefotaxime ở 28
o
C, lắc
60 vòng/2 ngày. Cây chuyển gen đƣợc tạo thành với các môi trƣờng chọn lọc
có bổ sung 500 mg/l cefotaxime và 100 mg/l kanamycin.
Zhangsun và cs (2007) tái sinh và chuyển gen ở mía từ mô sẹo thông qua

A.tumefaciens (OD
600
=0,2; 0,4; 0,6) trong thời gian 10 - 20 phút với kháng
sinh chọn lọc 500 mg/l carbenicillin và 1 mg/l ppt [28].
Nhƣ vậy, các tác giả đã tái sinh và chuyển gen thành công chủ yếu từ mô
sẹo và thông qua vi khuẩn A.tumefaciens. Để thành công việc chuyển gen vào
thực vật nói chung cũng nhƣ ở mía thì nhất thiết phải có một hệ thống tái sinh
hoàn chỉnh và một quy trình chuyển gen hoạt động hiệu quả. Trong thí
nghiệm này chúng tôi đã thử nghiệm và cải biến hệ thống tái sinh và quy trình
chuyển gen của các nghiên cứu thành công về mía ở trên.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
16
Chƣơng 2

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Nguyên liệu thực vật
Chúng tôi sử dụng giống mía ROC1 và ROC10 in vitro đang đƣợc giữ
tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa
học và Công nghệ Việt Nam.
2.1.2. Các chủng plasmid và enzyme

Bảng 2.1. Các plasmid sử dụng trong thí nghiệm
Plasmid
Kích thƣớc
(bp)
Kháng sinh chọn lọc Nguồn cung cấp
pENTR

TM
/D-
TOPO
2580 Kanamycin Invitrogen (Mỹ)
pK7GWIWG2(II)

12904
Spectinomycine,
streptomycine
Trƣờng Đại học
Ghent (Bỉ)

- Các chủng vi khuẩn: E.coli One Shot TOP 10 và A.tumefaciens chủng
CV58C1 mang plasmid pGV2260
- Các enzyme giới hạn: HindIII , XbaI của hãng New England Biolabs
- Các enzyme T
4
ligase, T
4
kinase do hãng Fermentas cung cấp
2.1.3. Hóa chất khác
- Cặp mồi 3
’
INV/5
’
INV nhân đoạn gen mã hóa enzyme Invertase và
cặp mồi M13for/rev kiểm tra sự có mặt của gen Invertase trong vector tách