XÁC ĐỊNH LD50 CỦA VI KHUẨN Streptococcus agalactiae TRÊN CÁ RÔ PHI ĐỎ (Oreochromis sp.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NGÂM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH LD 50 CỦA VI KHUẨN Streptococcus agalactiae
TRÊN CÁ RÔ PHI ĐỎ (Oreochromis sp.)
BẰNG PHƯƠNG PHÁP NGÂM

Họ và tên sinh viên: TRẦN MINH MẪN
Ngành: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
Chuyên ngành: NGƯ Y
Niên khóa: 2007 – 2011

Tháng 07/2011


XÁC ĐỊNH LD 50 CỦA VI KHUẨN Streptococcus agalactiae TRÊN CÁ RÔ
PHI ĐỎ (Oreochromis sp.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NGÂM

Tác giả

TRẦN MINH MẪN

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư ngành
Nuôi Trồng Thủy Sản chuyên ngành Ngư Y

Giáo viên hướng dẫn
TS. NGUYỄN HỮU THỊNH

Tháng 7 năm 2011

i


CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cảm tạ:
Cha mẹ và gia đình luôn ở bên cạnh, động viên và hỗ trợ cả về tinh thần lẫn vật chất
cho tôi trong suốt quá trình học tập.
Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
Ban chủ nhiệm Khoa Thủy Sản cùng tất cả quý thầy cô đã tận tâm truyền đạt những
kiến thức quý báo và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình
học tập.
Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến thầy Nguyễn Hữu Thịnh, Vũ Thị
Ngọc, Đỗ Viết Phương và Truyện Nhã Định Huệ đã hướng dẫn tôi hoàn thành
tốt Luận văn này với tất cả trách nhiệm và lòng nhiệt thành.
Xin gửi lời cảm ơn đến tất cả bạn bè và tập thể lớp Ngư y K33 đã luôn ở bên tôi, chia
sẻ và động viên tôi trong suốt thời gian qua.
Chúng tôi rất mong nhận được sự thông cảm và đóng góp ý kiến của quý thầy, cô và
các bạn đọc.

ii


TÓM TẮT
Đề tài nghiên cứu “Xác định liều gây chết 50% (LD 50 ) của vi khuẩn
Streptococcus agalactiae trên cá rô phi đỏ (Oreochromis sp.) bằng phương pháp
ngâm” được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bệnh Học Thủy Sản và Trại Thực Nghiệm
Thủy Sản trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng
03/2011 đến tháng 07/2011. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên.
Kết quả thu được sau 14 ngày thí nghiệm, vi khuẩn phân lập từ cá bệnh là vi
khuẩn Streptococcus agalactiae. Tỷ lệ cá chết tích lũy và liều LD 50 trong thí nghiệm:

− Tỷ lệ cá chết tích lũy ở các mật độ vi khuẩn: 0 CFU/mL, 1,9 x 103 CFU/mL,
1,9 x 104 CFU/mL, 1,9 x 105 CFU/mL, 1,9 x 106 CFU/mL và 1,9 x 107
CFU/mL theo thứ tự lần lượt là 3,3%, 13,3%, 13,3%, 20,0%, 40,0% và 60,0%.
− Mật độ vi khuẩn gây chết 50% cá thí nghiệm (LD 50 )
+ Theo Reed – Muench (1938) là 5,4 x 106 CFU/mL.
+ Theo phương trình hồi quy tuyến tính là 8,6 x 106 CFU/mL.
+ Theo phương pháp phân tích probit là 8,3 x 106 CFU/mL

iii


MỤC LỤC
Đề Mục

Trang

Trang tựa

i

Cảm tạ

ii

Tóm tắt

iii

Mục lục

iv

Danh sách các chữ viết tắt

vii

Danh sách các hình

viii

Danh sách các bảng

ix

Danh sách các biểu đồ

x

CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU

1

1.1. Đặt Vấn Đề

1

1.2. Mục Tiêu Đề Tài

3

1.3. Nội Dung Đề Tài

3

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4

2.1. Đặc Điểm Sinh Học Của Cá Rô Phi

4

2.1.1. Phân loại

4

2.1.2. Nguồn gốc và phân bố

4

2.1.3. Đặc điểm hình thái

5

2.1.4. Điều kiện môi trường

5

2.1.4.1. Nhiệt độ

5

2.1.4.2. Oxy hòa tan (DO)

5

2.1.4.3. Độ mặn

6

2.1.4.4. pH và amonia (NH 3 – N)

6

2.1.5. Đặc điểm dinh dưỡng

6

2.1.6. Đặc điểm sinh trưởng – sinh sản

6

2.1.6.1. sinh trưởng

6

2.1.6.2. Sinh sản

6

2.2. Bệnh Do Vi Khuẩn Streptococcus agalactiae Trên Cá Rô Phi

7

2.2.1. Tác nhân gây bệnh

7
iv


2.2.2. Triệu chứng và bệnh tích

8

2.2.3. Đặc điểm dịch tể học

9

2.2.4. Chẩn đoán bệnh

10

2.2.5. Phòng và trị bệnh

10

2.3. Các Phương Pháp Gây Cảm Nhiễm Nhân Tạo Cho Cá

11

2.3.1. Phương pháp tiêm

11

2.3.2. Phương pháp ngâm

11

2.3.3. Phương pháp nuôi chung

11

2.3.4. Phương pháp đường tiêu hóa

11

2.4. Sơ Lược Về LD 50

11

2.4.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến LD 50

12

2.4.2. Tìm hiểu về LD 50 của vi khuẩn Streptococcus agalactiae trên cá rô phi

12

CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

13

3.1. Thời Gian Và Địa Điểm Nghiên Cứu

13

3.2. Vật Liệu Nghiên Cứu

13

3.2.1. Dụng cụ

13

3.2.2. Hóa chất và môi trường

13

3.2.2.1. Hóa chất

13

3.2.2.2. Môi trường

13

3.2.3. Đối tượng thí nghiệm

14

3.2.3.1. Cá thí nghiệm

14

3.2.3.2. Vi khuẩn

14

3.3. Phương Pháp Nghiên Cứu Chung

14

3.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm

15

3.3.1.1. Bố trí hệ thống thí nghiệm

15

3.3.1.2. Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn

17

3.3.1.3. Phương pháp pha loãng vi khuẩn

17

3.3.1.4. Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn trong bình huyền phù gốc

17

3.3.1.5. Gây bệnh thực nghiệm

18

3.3.1.6. Chăm sóc và quản lý thí nghiệm

19

3.3.2. Phương pháp kiểm tra triệu chứng và bênh tích

19

v


3.3.2.1. Kiểm tra triệu chứng và bệnh tích ngoài

19

3.3.2.2. Kiểm tra bệnh tích trong

19

3.3.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn từ cá bệnh

19

3.3.4. Phương pháp cấy thuần vi khuẩn

20

3.3.5. Phương pháp phết mẫu mô nhuộm gram

20

3.3.6. Phương pháp định danh vi khuẩn

20

3.3.6.1. Định danh sơ bộ vi khuẩn

20

3.3.6.2. Định danh vi khuẩn bằng bộ test API 20 Strep

23

3.3.7. Mô bệnh học

24

3.4. Các Chỉ Tiêu Môi Trường

25

3.5. Phương Pháp Xác Định LD 50

25

3.6. Phương Pháp Xử Lý Số Liệu

26

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

27

4.1. Các Chỉ Tiêu Môi Trường

27

4.2. Kết Quả Gây Nhiễm Bằng Vi Khuẩn S. agalactiae

28

4.2.1. Kết quả kiểm tra ký sinh trùng

28

4.2.2. Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn từ mẫu cá bệnh

28

4.2.2.1. Đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn

28

4.2.2.2. Kết quả phân lập vi khuẩn

28

4.2.2.3. Kết quả định danh sơ bộ

29

4.2.2.4. Kết quả định danh bằng bộ test API 20 Strep

30

4.2.3. Kết quả phân lập vi khuẩn trên cá còn sống sau 14 ngày gây nhiễm

31

4.2.4. Triệu chứng và bệnh tích

31

4.2.5. Kết quả mô bệnh học

36

4.2.6. Tỷ lệ cá chết

38

4.2.7. Kết quả LD 50

40

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

44

5.1. Kết Luận

44

5.2. Đề Nghị

44

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BHIA

Brain Heart Infusion Agar

BHIB

Brain Heart Infusion Broth

CFU

Colony Forming Unit

cm

centimeter

ctv

cộng tác viên

DO

Dissolve Oxygen

FAO

Food and Agriculture Organization

g

gram

kg

kilogram

LD 50

Lethal Dose 50 %

M

Mean

mg

milligram

mL

milliliter

mm

millimeter

o

degree Celsius

pd

proportionate distance

SE

Standard Error

THBA

Todd Hewitt Broth Agar

TSA

Trypticase Soy Agar

vk

vi khuẩn

µm

micrometer

C

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình

Trang

Hình 2.1: Vi khuẩn Streptococcus agalactiae

7

Hình 3.1: Hệ thống bể composite bố trí thí nghiệm

16

Hình 3.2: Phương pháp pha loãng vi khuẩn

17

Hình 3.3: Ba đường mổ trên cá

20

Hình 3.4: Bốn đường mổ não cá

20

Hình 3.5: Các bước nhuộm gram (Hồ Thị Trường Thy, 2009)

22

Hình 3.6: Thử nghiệm catalase (Hồ Thị Trường Thy, 2009)

22

Hình 3.7: Thử nghiệm oxidase (Hồ Thị Trường Thy, 2009)

23

Hình 4.1: Khuẩn lạc vi khuẩn S. agalactiae phân lập từ cá bệnh

28

Hình 4.2: Catalase âm tính

29

Hình 4.3: Oxidase âm tính

29

Hình 4.4: Kết quả định danh S. agalactiae bằng bộ test API 20 Strep

30

Hình 4.5: Vi khuẩn S. agalactiae trong mẫu A, phết gan và B, nhuộm gram

31

Hình 4.6: Bệch tích ngoài của cá lờ đờ và cá mới chết

33

Hình 4.7: Bệch tích trong của cá lờ đờ và cá mới chết

34

Hình 4.8: Bệch tích trong của cá lờ đờ và cá mới chết

35

Hình 4.9: Mô gan cá khỏe (H&E, X10, X100)

36

Hình 4.10: Mô gan cá bệnh (H&E, X10, X100)

36

Hình 4.11: Mô thận cá khỏe (H&E, X10, X100)

37

Hình 4.12: Mô thận cá bệnh (H&E, X10, X100)

37

Hình 4.13: Mô lách cá khỏe (H&E, X10, X100)

38

Hình 4.14: Mô lách cá bệnh (H&E, X10, X100)

38

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng

Trang

Bảng 2.1: Phân biệt cá đực và cá cái ở cá rô phi

5

Bảng 2.2: Kết quả LD 50 của một số tác giả

8

Bảng 3.1: Mật độ vi khuẩn S. agalactiae gây nhiễm trên cá rô phi đỏ

18

Bảng 3.2: Thuốc thử và cách đọc kết quả các phản ứng sinh hóa trong API 20 Strep 24
Bảng 4.1: Bảng theo dõi các chỉ tiêu môi trường nước

27

Bảng 4.2: Phân lập vi khuẩn S. agalactiae từ cá bệnh

29

Bảng 4.3: Kết quả định danh bằng bộ test API 20 Strep

30

Bảng 4.4: Kết quả phân lập vi khuẩn trên cá còn sống sau 14 ngày gây nhiễm

31

Bảng 4.5: Tỷ lệ cá chết tích lũy ở các nghiệm thức

39

Bảng 4.6: Tỷ lệ sống và chết của cá thí nghiệm trong mỗi nồng độ pha loãng

41

ix


DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ

Trang

Biểu đồ 3.1: Các bước thực hiện thí nghiệm

15

Biểu đồ 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm

16

Biểu đồ 4.1: Tần suất xuất hiện bệnh tích ngoài tích lũy của cá lờ đờ và cá mới chết 32
Biểu đồ 4.2: Tần suất xuất hiện bệnh tích trong tích lũy của cá lờ đờ và cá mới chết 34
Biểu đồ 4.3: Tỷ lệ cá chết của các nghiệm thức trong 14 ngày gây nhiễm

39

Biểu đồ 4.4: Đồ thị tương quan giữa tỷ lệ cá chết tích lũy và mật độ vi khuẩn

41

Biểu đồ 4.5: Đồ thị tương quan giữa phần trăm cá chết và mật độ vi khuẩn

42

x


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt Vấn Đề
Cá rô phi là loài cá được nuôi phổ biến thứ hai trên thế giới, chỉ sau loài cá chép
(Fitzsimmons K. và Gonznlez P., 2005). Sản lượng cá rô phi nuôi không ngừng tăng
lên và ngày càng đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện nguồn cung cấp dinh
dưỡng cho người thu nhập thấp. Nghề nuôi cá rô phi cũng cho là một sinh kế tốt nhất
cho nông dân thoát khỏi đói nghèo. Trong tương lai, cá rô phi sẽ là sản phẩm thay thế
cho các loài cá thịt trắng khai thác từ tự nhiên đang ngày càng cạn kiệt (WFC, 2003).
Theo FAO (1996), Châu Á là nơi nuôi nhiều cá rô phi nhất trên thế giới, trong đó vùng
Đông Á và Đông Nam Á thực sự đã là quê hương thứ hai của cá rô phi (Nguồn:
). Trong giai đoạn 5 năm từ 2003 – 2007, sản lượng cá nuôi tăng đến
60%, từ 1,58 triệu tấn lên 2,51 triệu tấn. Theo báo cáo sơ bộ của FAO (2011), sản
lượng cá rô phi nuôi năm 2009 đã vượt qua 3 triệu tấn (Nguồn:
). Năm 2010 đạt 3,7 triệu tấn. Trung Quốc có sản lượng nhiều
nhất thế giới, chiếm khoảng 32% tổng sản lượng toàn cầu và giảm 13% so với năm
2009 (Nguồn: ).
Hội nghị Quốc tế về Kỹ thuật và Thương mại cá rô phi đã được tổ chức vào
ngày 28 – 30/5/2001 (Kuala Lumpur, Malaysia) đã nhận định cá rô phi là một đối
tượng có khả năng phát triển rất lớn và là sản phẩm có nhu cầu rất cao trong những
năm tới trên nhiều thị trường thế giới như Mỹ, Nhật Bản và một phần ở Châu Âu. Trên

cơ sở dự báo về khả năng sản xuất và nhu cầu thị trường thế giới trong những năm tới,
Tổng Cục Thủy Sản đã xác định đây là đối tượng nuôi cần được chú ý phát triển mạnh
để đưa mặt hàng cá rô phi nhanh chóng có sản lượng hàng hóa lớn và trở thành một
trong những sản phẩm có giá trị xuất khẩu cao. Năm 2002 – 2003, đưa khoảng 13.000
– 15.000 ha (khoảng 3% diện tích nuôi nước ngọt) mặt nước của khu vực đồng bằng
sông Cửu Long vào nuôi cá rô phi, chủ yếu là cá rô phi đỏ để tiêu thụ trong nước. Năm
1


2010, sản lượng cá rô phi đỏ là 120.000 – 150.000 tấn và trở thành đối tượng nuôi
nước ngọt phổ biển đứng thứ hai ở đồng bằng sông Cửu Long và cả nước nói chung
(Thông tin KHCN & Kinh tế thủy sản, số 12/2007. Nguồn: Fistenet, 22/1/2008).
Tại Việt Nam, hằng năm khoảng 5.000 – 7.000 tấn cá rô phi được tiêu thụ nội
địa. Rô phi là một trong những loài cá nuôi kinh tế nhất và là loài có sức đề kháng cao
hơn so với các loài khác. Tuy nhiên, với mô hình nuôi ngày càng thâm canh và phát
triển bè nuôi quá nhiều trong cùng nguồn nước sẽ dễ làm phát sinh dịch bệnh. Bệnh ở
cá rô phi gồm, bệnh do vi khuẩn, virus, nấm và ký sinh trùng. Ở Việt Nam bệnh
thường xảy ra trên cá rô phi là vi khuẩn Streptococcus agalactiae. Theo Đinh Thị
Thủy và ctv (2005), từ năm 2003 – 2004 chủng vi khuẩn phân lập được từ cá bệnh có
tần suất cao nhất ở một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long như An Giang, Tiền Giang
và Vĩnh Long là chủng vi khuẩn Streptococcus chiếm 95 – 100 %. Bệnh thường xuất
hiện ở cá từ 1 – 5 tháng tuổi, không gặp ở cá nhỏ hơn 1 tháng tuổi. Tỷ lệ xuất hiện cao
nhất vào mùa khô (tháng 1 – 4) và kéo dài đến tháng 6 – 7 trong mùa mưa. Bệnh do
chủng vi khuẩn Streptococcus cũng xảy ra ở một số tỉnh đồng bằng sông Hồng như Hà
Nội, Quảng Ninh, Hải Phòng, Hải Dương, Bắc Giang, gây tỷ lệ chết cao nhất có thể
lên đến 100% (Nguyễn Viết Khuê và ctv., 2009).
Bệnh do vi khuẩn Streptococcus sp. là nguyên nhân gây nên thiệt hại lớn ở cá
rô phi nói riêng và cá nước ngọt nói chung, làm ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế của
ngành nuôi trồng thuỷ sản thế giới. Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu mô tả triệu
chứng và bệnh tích của cá rô phi bị bệnh do Streptococcus agalactiae như nghiên cứu

của Al – Harbi (1996), Evans và ctv (2002), Amal và ctv (2008), ... Tuy nhiên, việc
xác định liều gây chết 50% là cơ sở để cho các nghiên cứu khác về sử dụng thuốc và
hóa chất trong phòng trị bệnh là rất quan trọng và là vấn đề cần được giải quyết cấp
bách.
Trước nhu cầu thực tiễn đó được sự phân công của Khoa Thủy Sản Trường Đại
Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh và Bộ Môn Bệnh Học Thủy Sản chúng tôi
tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xác định LD 50 của vi khuẩn Streptococcus agalactiae
trên cá rô phi đỏ (Oreochromis sp.) bằng phương pháp ngâm”.

2


1.2. Mục Tiêu Đề Tài
Xác định liều gây chết 50% cá rô phi đỏ thí nghiệm khi cho gây nhiễm với vi
khuẩn Streptococcus agalactiae bằng phương pháp ngâm. Đây là cơ sở cho việc tiến
hành các nghiên cứu về gây bệnh thực nghiệm trên cá rô phi đỏ cho nhiều mục đích
khác nhau.
1.3. Nội Dung Đề Tài
Đề tài được tiến hành với nội dung chính sau:
− Xác định liều gây chết 50% cá rô phi đỏ thí nghiệm khi cho gây nhiễm với
Streptococcus agalactiae bằng phương pháp ngâm.
− Mô tả triệu chứng bệnh tích của cá rô phi đỏ khi bị bệnh do S. agalactiae.
− Mô tả những biến đổi mô bệnh học của cá rô phi đỏ bị bệnh do S. agalactiae.

3


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Đặc Điểm Sinh Học Của Cá Rô Phi

2.1.1. Phân loại
Bộ: Perciformes
Họ: Cichlidae
Giống: Oreochromis
Loài: Oreochromis sp. (Trewavas, 1983).
Tên tiếng Anh: Red tilapia.
Tên Việt Nam: cá rô phi đỏ, cá điêu hồng, cá diêu hồng.
2.1.2. Nguồn gốc và phân bố
Nguồn gốc cá rô phi đỏ là do đột biến gen, có 3 dòng nguyên gốc đều được
mang tên là Oreochromis sp. (Popma và Masser, 1999).
Dòng thứ 1 sản xuất ở Đài Loan vào cuối những năm 1960, lai tạo giữa cá cái
O. mossambicus đột biến có màu đỏ cam với cá đực O. niloticus bình thường, được
gọi là cá rô phi đỏ Đài Loan.
Dòng thứ 2 được phát triển ở Florida vào những năm 1970, lai tạo giữa cá cái
O. urolepis hornorum bình thường với cá đực O. mossambicus có màu đỏ cam.
Dòng thứ 3 phát triển ở Israel, lai tạo giữa cá cái O. niloticus đột biến có màu
hồng với cá đực O. aureus hoang dã.
Tất cả ba dòng gốc đã được lai với cá rô phi đỏ có nguồn gốc khác nhau không
được báo cáo hoặc với các loài Oreochromis hoang dã.
Cá rô phi đỏ được nhập vào nước ta năm 1985 từ các nước: Đài Loan, Thái
Lan, Singapore, Israel... Chúng được nuôi phổ biến ở miền Nam Việt Nam, tập trung
nuôi nhiều ở đồng bằng sông Cửu Long (Nguồn: ).

4


2.1.3. Đặc điểm hình thái
Toàn thân cá rô phi đỏ phủ vẩy, có màu sáng hồng. Vẩy trên thân có màu đậm,
màu vàng nhạt hoặc đỏ hồng, cũng có thể gặp những cá thể màu vàng, màu hồng xen
lẫn những đám vẩy màu đen nhạt (Nguồn: ).

Phân biệt cá đực, cá cái (Trần Văn Vỹ, 1999) được thể hiện ở bảng 2.1.
Bảng 2.1: Phân biệt cá đực và cá cái ở cá rô phi
Đặc điểm phân biệt

Cá đực

Đầu

To và nhô cao

Màu sắc (Sau 4 – 5 tháng,

Mép vây lưng và vây

Màu nhạt hơn hoặc không

đến tuổi phát dục)

đuôi rực rỡ

thay đổi màu sắc

Lỗ niệu sinh dục

hai lỗ: phía trước là lỗ

ba lỗ: phía trước là lỗ hậu

(Cá rô phi còn nhỏ,

hậu môn và phía sau là

môn, phía sau là lỗ niệu và lỗ

cỡ 6 – 7 cm)

lỗ niệu sinh dục

sinh dục ở giữa

Cá cái
Nhỏ, hàm dưới trề do ngậm
trứng và con

2.1.4. Điều kiện môi trường sống
2.1.4.1. Nhiệt độ
Nhiệt độ cần thiết cho sự phát triển của cá rô phi từ 20 – 32 oC, thích hợp nhất
là 25 – 32 oC. Ngưỡng nhiệt độ của cá rô phi từ 8 – 42 oC, cá bắt đầu chết rét khi nhiệt
độ nước xuống thấp dưới 5,5oC và bắt đầu chết nóng ở 42oC. Nhiệt độ càng thấp ngoài
ngưỡng thích hợp thì cá càng giảm ăn, ức chế sự tăng trưởng và rủi ro nhiễm bệnh
(Nguồn: ).
2.1.4.2. Oxy hòa tan (DO)
Cá rô phi có thể sống được trong ao, đìa có màu nước đậm, mật độ tảo dày, có
hàm lượng chất hữu cơ cao, thiếu oxy trong nhiều giờ. Ngưỡng oxy của cá rô phi ở
mức thấp tới 0,4 mg/L (Ngô Trọng Lư và Thái Bá Hổ, 2005). Cá rô phi phát triển tốt
khi DO từ 3 – 8 mg/L (Phạm Văn Trang và Nguyễn Trung Thành, 2004). Nếu hàm
lượng oxy hòa tan trong nước nằm ngoài ngưỡng trên trong một thời gian dài, sức để
kháng bệnh của cá sẽ giảm và chậm lớn.

5

2.1.4.3. Độ mặn
Cá rô phi là loài rộng muối, có khả năng sống được trong môi trường nước
sông, suối, đập tràn, hồ ao nước ngọt, nước lợ và nước mặn có độ mặn từ 0 – 40 o/ oo .
Trong môi trường nước lợ (độ mặn 10 – 25 o/ oo ) cá tăng trưởng nhanh, mình dày, thịt
thơm ngon (Nguồn: ).
2.1.4.4. pH và ammonia (NH 3 -N)
Theo Bùi Đoàn Dũng (2003), giới hạn dưới của pH gây chết cá xấp xỉ bằng 4
và giới hạn trên là 11, khoảng pH thích hợp nhất đối với cá rô phi là 6,5 – 8,5. Bên
cạnh đó, khi pH thấp sẽ hòa tan một số kim loại nặng và làm tăng tính độc của khí
H 2 S, gây độc cho cá nuôi. Ngược lại, khi pH cao làm tăng tính độc của khí NH 3 và sẽ
gây ức chế hoạt động một số thủy sinh vật làm thức ăn.
Cá rô phi giống bắt đầu bỏ ăn khi ammonia là 0,08 mg/L, cá bắt đầu chết khi
hàm lượng ammonia lớn hơn 0,2 mg/L (Popma và Maser, 1999).
2.1.5. Đặc điểm dinh dưỡng
Khi còn nhỏ, cá rô phi ăn sinh vật phù du (tảo và động vật nhỏ) là chủ yếu. Cá
20 ngày tuổi, kích thước 17 – 19 mm sẽ chuyển dần sang ăn nhiều loại thức ăn khác
nhau như cá trưởng thành. Cá trưởng thành ăn mùn bã hữu cơ lẫn tảo lắng ở đáy ao, ăn
ấu trùng, côn trùng, thực vật thủy sinh. Tuy nhiên, trong nuôi công nghiệp, cá cũng ăn
các loại thức ăn chế biến từ cá tạp, cua, ghẹ, ốc, bột cá khô, cám mịn, bã đậu nành, bã
đậu phộng, đặc biệt chúng có thể ăn thức ăn viên, đây là một đặc điểm thuận lợi cho
nghề nuôi cá.
2.1.6. Đặc điểm sinh trưởng – sinh sản
2.1.6.1. Sinh trưởng
Cá rô phi là loài cá dễ nuôi. Cá đực lớn nhanh hơn cá cái 2 – 5 lần, sau 4 – 5
tháng nuôi có thể đạt trọng lượng 0,4 – 0,6 kg/con. Cá rô phi là loài ăn tạp và có khả
năng bắt mồi lớn nên có tốc độ tăng trưởng nhanh trong điều kiện nuôi bình thường
().
2.1.6.2. Sinh sản

Trong điều kiện ao nuôi cá rô phi thành thục sinh dục vào tháng thứ 3, 4 khi cá
có trọng lượng 100 – 150 g/con (cá cái). Trong điều kiện khí hậu ấm áp cá có thể đẻ
quanh năm (10 – 11 lứa ở các tỉnh phía Nam và 5 – 7 lứa ở các tỉnh phía Bắc).
6


Phân biệt cá đực và cá cái khi cá lớn cỡ 6 – 7 cm (xem mục 2.1.3).
Khi thành thục cá bắt cặp và tự đào tổ ở đáy ao để đẻ trứng, đường kính tổ là 20
– 30 cm. Cá cái đẻ trứng vào tổ và cá đực tưới tinh dịch lên trứng để thụ tinh. Sau khi
trứng thụ tinh cá cái sẽ ngậm trứng vào miệng để ấp. Cá cái ngậm cá con trong miệng
cho đến khi cá tiêu hết noãn hoàng và tự kiếm được thức ăn bên ngoài. Sau 4 – 5 ngày,
cá con tách khỏi cá mẹ, cá mẹ lại chuẩn bị cho chu kỳ sinh sản mới. Thời gian giữa hai
lứa đẻ tùy thuộc vào tuổi cá, nhiệt độ, dinh dưỡng, … Trung bình cá đẻ từ 1000 – 2000
trứng/lần (Trần Văn Vỹ, 1999).
2.2. Bệnh Do Vi Khuẩn Streptococcus agalactiae trên Cá Rô Phi
2.2.1. Tác nhân gây bệnh
Giống Streptococcus thuộc họ Streptococcaceae, bộ Lactobacillales, lớp Bacilli,
ngành Firmicutes là một giống lớn có dạng hình cầu hoặc hình ovan, đường kính nhỏ
hơn 2 μm. Đây là vi khuẩn gram dương, không di động, oxidase âm tính, catalase âm
tính (Hosting, 2008). Theo Bùi Quang Tề (2006), vi khuẩn Streptococcus sp. lên men
trong môi trường glucose, nhu cầu phát triển phức tạp. Thành phần guanin và cytozin
trong ADN là 34 – 46 mol%, sinh trưởng tốt trên môi trường Trypticase soy agar
(TSA) có thêm 0,5% glucose, môi trường Brain heart infusion agar (BHIA), môi
trường Todd hewitt broth agar (THBA), môi trường thạch máu ngựa (Horse blood
agar). Nuôi cấy vi khuẩn ở 20 – 30 oC, sau 24 – 48 giờ hình thành khuẩn lạc tròn nhỏ
trên môi trường, đường kính 0,5 – 1,0 mm, màu trắng sữa, lồi, trơn nhẵn.

Hình 2.1: Vi khuẩn Streptococcus agalactiae
(Nguồn: )
7

Một số nghiên cứu liều LD 50 của Streptococcus agalactiae trên cá rô phi được
tổng hợp trong bảng 2.1.
Bảng 2.2: Kết quả LD 50 của một số tác giả.
Tác giả

Trọng

Phương pháp

lượng (g)
63,2

Tiêm xoang bụng

Mật độ vk

Nhiệt

LD50

(CFU/mL)

độ (oC) (CFU/mL)

104 - 108*

28 - 30

1,8 x 106

Cá gây nhiễm: Oreochromis niloticus x O. aureus
50

Tiêm xoang bụng

104 - 108*

28 - 30

3,5 x 105

104 - 108*

28 - 30

9,2 x 107

104 - 108*

28 - 30

2 x 107

104 - 108*

28 - 30

2,8 x 105

102 - 108

32

1,9 x103,3

104 - 108

29 - 30

3 x 107

Cá gây nhiễm: O. niloticus x O. mossambicus
Al - Harbi, 1996

66,1

Tiêm xoang bụng

Cá gây nhiễm: O. niloticus
97,7

Tiêm xoang bụng

Cá gây nhiễm: O. aureus
83,5

Tiêm xoang bụng

Cá gây nhiễm: O. mossambicus
30

Evans và ctv.,
2002
Amal và ctv.,
2008

Tiêm xoang bụng

Cá gây nhiễm: O. niloticus
85 - 100

Tiêm xoang bụng

Cá gây nhiễm: O. niloticus
Ghi chú: 104 – 108* CFU/mL = 1,2 x 104 – 1,2 x 108 CFU/mL

2.2.2. Triệu chứng và bệnh tích
 Triệu chứng:
Vi khuẩn Streptococcus sp. có khuynh hướng tấn công vào hệ thần kinh trung
ương của cá rô phi nên cá bệnh sẽ có biểu hiện thần kinh như bơi lội hỗn loạn và mất
định hướng, bơi xoáy hoặc uống cong cơ thể hình chữ C. Cá giảm hoặc bỏ ăn.
(Nguồn: ).
 Bệnh tích ngoài:
Theo Hosting (2008), những tổn thương mắt có thể gặp như lồi mắt hai bên
hoặc một bên có khi mắt xẹp xuống lõm vào trong, mắt mờ đục và có thể xuất huyết.
Cá rô phi bị bệnh nhưng có trường hợp không bị tổn thương về mắt. Xuất huyết ở da
8

thường được nhìn thấy ở quanh miệng cá hoặc ở các gốc vây. Đôi khi cũng có thể
quan sát thấy những vùng da hơi đỏ xung quanh hậu môn hoặc lỗ sinh dục. Cá bệnh có
thể bị viêm ở vị trí đối xứng hai bên hàm dưới hoặc có thể viêm loét đến 2/3 cơ thể từ
vây đuôi đến vây ngực. Bệnh nặng, bụng cá trương to, tích dịch xoang bụng và đi kèm
với dấu hiệu hậu môn bị lồi. Dịch màu vàng có thể thấy chảy ra từ hậu môn của cá.
Tuy nhiên không phải cá bệnh nào cũng có những bệnh tích nói trên.
 Bệnh tích trong:
Theo Hosting (2008), cá bệnh thường bỏ ăn và nhìn chung không có sự hiện
diện thức ăn trong dạ dày hoặc ruột, dấu hiệu là túi mật rất to, đó là đặc trưng của hoạt
động tiêu hoá bị ngưng trệ trong cơ thể. Bệnh nặng, vi khuẩn Streptococcus sp. nhanh
chóng đi đến hệ tuần hoàn và lan tỏa đến tất cả các cơ quan nội tạng. Những dấu hiệu
lâm sàng chính liên quan đến sự nhiễm trùng máu là sự xuất huyết ở gan, thận, lách,
ống ruột, não. Gan, lách sưng đôi khi mềm nhũn và thận sưng. Một số trường hợp cơ
quan nội tạng viêm dính vào nhau và dính vào thành xoang bụng. Ngoài ra khi cá bị
nhiễm bệnh nặng, bệnh còn kết hợp với những vi khuẩn cơ hội khác gây bệnh cho cá
có sẵn trong môi trường như vi khuẩn Aeromonas sp. ở nước ngọt hay vi khuẩn Vibrio
sp. ở nước lợ.
2.2.3. Đặc điểm dịch tễ học
Dịch bệnh nguy hiểm thường xảy ra ở cá rô phi (Oreochromis sp.) nuôi thâm
canh, cao nhất vào mùa khô (tháng 1 – 4) và kéo dài đến các tháng trong mùa mưa (từ
tháng 7 – 10) (Đinh Thị Thủy và ctv., 2005).
Bệnh do vi khuẩn Streptococcus sp. thường xảy ra khi điều kiện sống của cá
không thích hợp như nhiệt độ nước tăng cao ngoài ngưỡng thích hợp 20 – 32 oC, oxy
hòa tan trong nước thấp dưới mức 3 mg/L hoặc cá nuôi với mật độ cao trong thời gian
dài. Bệnh có thể xảy ra ở mọi giai đoạn phát triển của cá rô phi nhưng cá trên 100 g
mẫn cảm với bệnh hơn cá nhỏ (Hosting, 2008).
Bệnh ở giai đoạn cấp tính thường xảy ra vào mùa nóng khi nhiệt độ nước cao
và tỷ lệ chết có thể lên tới 100% trong khoảng từ 2 – 3 tuần. Bệnh mãn tính khi nhiệt
độ thấp hơn, tỷ lệ chết thấp hơn và chết kéo dài (Hosting, 2008).

Bệnh lây lan theo chiều ngang từ cá bệnh sang cá khỏe (cá khoẻ ăn cá bệnh, ăn
thịt lẫn nhau, do vết thương trên da...) và từ môi trường nước vào cá.
9


Ở Thái Lan, cá rô phi bệnh do vi khuẩn Streptococcus sp. có tỷ lệ chết lên tới
40 – 60%.
2.2.4. Chẩn đoán bệnh
Chẩn đoán sơ bộ tại ao nuôi dựa vào triệu chứng bệnh tích. Để chẩn đoán bệnh
chính xác, tiến hành phết kính mẫu gan, thận, lách, não nhuộm gram rồi quan sát dưới
kính hiển vi. Nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn bằng test API 20 Strep, sử
dụng kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR).
Môi trường phân lập: sử dụng môi trường thạch máu (Horse bood agar) kiểm
tra khả năng dung huyết của vi khuẩn, môi trường BHIA, môi trường THBA. Nuôi cấy
vi khuẩn ở 20 – 30 oC, sau 24 – 48 giờ hình thành khuẩn lạc nhỏ trên môi trường,
đường kính 0,5 – 1,0 mm, màu trắng sữa, hình tròn, lồi, trơn nhẵn (Bùi Quang Tề,
2006).
2.2.5. Phòng và trị bệnh
Áp dụng phương pháp phòng bệnh tổng hợp cho cá, đặc biệt là vào mùa bệnh.
Giảm các nhân tố dẫn đến stress cho cá như nuôi mật độ cao trong thời gian dài, thiếu
oxy và nhiệt độ nước tăng cao. Đây là những nhân tố tạo điều kiện thuận lợi để mầm
bệnh phát triển. Vì vậy, ta cần nâng cao sức đề kháng của cá nuôi bằng chế độ dinh
dưỡng hợp lý và bổ sung vitamin C vào thức ăn trong mùa bệnh.
Điều trị bệnh ở cá rô phi do vi khuẩn Streptococcus sp. gây ra bằng kháng sinh
như erythromycin hoặc ciprofloxacin, enrofloxacin liều 25 – 50 mg/kg cá/ngày cho ăn
4 – 7 ngày (Nguồn: ). Kháng sinh chỉ có thể điều trị bệnh ở
giai đoạn sớm của bệnh. Tuy nhiên, trong hầu hết các trường hợp cho cá ăn kháng sinh
không hiệu quả bởi cá bị nhiễm bệnh sẽ chán ăn, giảm ăn. Việc sử dụng kháng sinh
cần được chú ý vì sử dụng kháng sinh liên tục với liều lượng cao dần sẽ gây ra hiện
tượng kháng thuốc của vi khuẩn và ảnh hưởng đến dư lượng kháng sinh tồn dư trong

thịt cá.
Hiện nay tại Việt Nam chưa có vacxin thương mại có hiệu quả để phòng bệnh
do vi khuẩn Streptococcus sp. gây ra. Tuy nhiên, trong tương lai gần thì việc phòng
bệnh bằng vacxin sẽ là phương án tối ưu làm giảm thiệt hại về kinh tế do bệnh gây ra.

10


2.3. Các Phương Pháp Gây Cảm Nhiễm Nhân Tạo Cho Cá
Để gây cảm nhiễm nhân tạo trên cá, thường có các phương pháp sau đây:
phương pháp tiêm, phương pháp ngâm, phương pháp nuôi chung và phương pháp gây
bệnh qua đường tiêu hóa.
2.3.1. Phương pháp tiêm
Theo Nguyễn Hữu Thịnh (2009), phương pháp tiêm là phương pháp gây bệnh
bằng cách đưa trực tiếp vi khuẩn vào cơ thể cá qua đường tiêm. Thông thường, tiêm vi
khuẩn vào xoang bụng hoặc cơ lưng. Phương pháp này làm cho cá bệnh nhanh do vi
khuẩn xâm nhập trực tiếp vào máu. Đây là phương pháp gây bệnh phổ biến nhất.
2.3.2. Phương pháp ngâm
Theo Nguyễn Hữu Thịnh (2009), phương pháp ngâm là phương pháp gây bệnh
bằng cách cho vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể cá thông qua mang, mũi, đường bên.
Phương này tiến hành bằng cách ngâm cá trong một thể tích nước cố định có pha vi
khuẩn, gây bệnh trong một khoảng thời gian nhất định. Đây là phương pháp gây bệnh
phổ biến thứ hai.
2.3.3. Phương pháp nuôi chung
Là phương pháp gây bệnh bằng cách nuôi chung cá thí nghiệm với cá đã nhiễm
bệnh từ trước. Vi khuẩn lây nhiễm theo chiều ngang thông qua tiếp xúc cá bệnh và cá
khỏe; môi trường nước vào cơ thể cá khỏe. Hiện nay phương pháp này vẫn chưa được
sử dụng nhiều trong thí nghiệm.
2.3.4. Phương pháp đường tiêu hóa
Là phương pháp bằng cách cho vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể cá thí nghiệm

qua đường tiêu hóa. Theo phương pháp này, vi khuẩn sẽ được trộn với thức ăn rồi đưa
vào ống tiêu hóa của cá bằng đụng cụ chuyên biệt. Phương pháp này vẫn ít được sử
dụng phổ biến trong gây bệnh thực nghiệm.
2.4. Sơ Lược Về LD 50
LD 50 (Lethal Dose 50%) là lượng thuốc gây chết 50% số cá thể thí nghiệm, đơn
vị là mg hoạt chất/kg trọng lượng cơ thể. Độ độc càng cao thì trị số LD 50 càng nhỏ.
Người ta thường chia LD 50 thành ba nhóm:
- Loại thuốc có độ độc mạnh khi LD 50 < 100 mg/kg thể trọng.
- Loại thuốc có độ độc trung bình khi LD 50 = 100 – 300 mg/kg thể trọng.
11


- Loại thuốc ít độc khi LD 50 > 300 mg/kg thể trọng.
Trong gây bệnh thực nghiệm trên cá bằng vi khuẩn, LD 50 được hiểu là lượng vi
khuẩn cần thiết để gây chết 50% số cá thí nghiệm, được tính bằng CFU/mL.
2.4.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến LD 50
Mỗi loại thuốc khác nhau thì có trị số LD 50 khác nhau. Liều LD 50 giữa các sinh
vật, giới tính, độ tuổi, giống loài khác nhau cũng khác nhau.
Liều LD 50 của thuốc đối với cơ thể còn phụ thuộc vào cách thức xâm nhập của
thuốc vào cơ thể. Cùng một loại thuốc điều trị cùng một cơ thể thì đường xâm nhập
của thuốc vào cơ thể cũng quyết định đến tác dụng của thuốc. Thuốc xâm nhập qua
miệng vào đường ruột tác động có thể khác xâm nhập qua da. Vì vậy, liều LD 50 qua da
cũng khác liều LD 50 qua miệng.
2.4.2. Tìm hiểu về LD 50 của vi khuẩn S. agalactiae trên cá rô phi
Theo AL - Harbi (1996), kết quả LD 50 (tính theo Reed – Muench) khi gây cảm
nhiễm trên hai loài cá rô phi lai (O. niloticus x O. aureus có trọng lượng 50 g/con và
O. niloticus x O. mossambicus có trọng lượng 66,1 g/con) với vi khuẩn S. agalactiae ở
các mật độ từ 1,2 x 104 – 1,2 x 108 CFU/mL bằng phương pháp tiêm, sau 12 ngày thí
nghiệm lần lượt là 1,8 x 106 CFU/mL và 3,5 x 105 CFU/mL.
Theo Evans và ctv (2002), kết quả LD 50 (tính theo Reed – Muench) khi gây

cảm nhiễm cá rô phi (O. niloticus 30 g/con) với vi khuẩn S. agalactiae ở các mật độ từ
102 – 108 CFU/mL bằng phương pháp tiêm, sau 7 ngày thí nghiệm là 1,9 x103,3
CFU/mL.

12


Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời Gian Và Địa Điểm Nghiên Cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 03/2011 đến tháng 07/2011. Địa điểm thực hiện
tại phòng thí nghiệm Bệnh Học Thủy Sản và Trại thực nghiệm Thủy Sản trường Đại
học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vật Liệu Nghiên Cứu
3.2.1. Dụng cụ
Đĩa pettri, đèn cồn, que cấy thẳng, que cấy vòng, ống nghiệm, lam, lamen,
pipette, micropipette, đầu tuýp, ống đong, cốc thủy tinh, bình tam giác, giấy bạc, bông
không thấm nước và bộ giải phẫu.
Tủ sấy, tủ hấp, tủ vi sinh, tủ ủ, kính hiển vi, máy vortex, máy lắc, cân điện tử.
Bể composite, xô, ống siphon, vợt, máy sục khí, máy bơm nước, nhiệt kế, găng
tay, và một số dụng cụ đo pH, oxy hòa tan, ammonia trong nước.
3.2.2. Hóa chất và môi trường
3.2.2.1. Hóa chất
Hóa chất dùng nhuộm gram: thuốc nhuộm tím crystal violet, dung dịch lugol,
cồn 95% và safranin.
Hóa chất cố định mẫu mô: phosphate buffered formaline 10%.
Hóa chất thử phản ứng catalase: H 2 O 2 3 – 10 %, dung dịch đệm phosphate.
Hóa chất thử phản ứng oxidase: đĩa giấy có tẩm hóa chất N,N,N,N –
tetramethyl – 1,4 – p – phenylenediamine dihydrochlorid 1%, Ascorbic acid 0,2%.
Nước cất, dầu soi kính, nước muối sinh lý tiệt trùng, cồn 70o, cồn 100o, thuốc

gây mê Ethylene glycol monophenyl ether.
3.2.2.2. Môi trường
Môi trường Brain heart infusion agar (BHIA) dùng để nuôi cấy vi khuẩn.
Môi trường Brain heart infusion broth (BHIB) dùng để tăng sinh vi khuẩn.
13


Môi trường BHIA bổ sung 5% (v:v) máu cừu.
3.2.3. Đối tượng thí nghiệm
3.2.3.1. Cá thí nghiệm
Cá rô phi đỏ (Oreochromis sp.) cỡ 3 – 4 g/con được mua ở trại sản xuất giống ở
tỉnh Vĩnh Long về ương cho đến khi đạt trọng lượng phù hợp với yêu cầu của nghiên
cứu tại Trại Thực Nhiệm Thủy Sản trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí
Minh. Cá được ương trong bể xi măng, ngày cho ăn 2 lần bằng thức ăn cho cá rô phi
của công ty Cargill đến khi thỏa mãn. Cá chuyển vào bể thí nghiệm phải khỏe mạnh,
linh hoạt, màu sắc tươi sáng và được kiểm tra tình trạng nhiễm ký sinh trùng và tình
trạng nhiễm khuẩn trong gan, thận, lách.
3.2.3.2. Vi khuẩn
Vi khuẩn S. agalactiae được phân lập từ cá rô phi (O. niloticus) ở Biên Hòa –
Đồng Nai năm 2011. Giống được bảo quản ở tủ đông –80oC tại phòng thí nghiệm
Bệnh Học Thủy Sản, khoa Thủy Sản, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí
Minh.
3.3. Phương Pháp Nghiên Cứu Chung
Từ vi khuẩn Streptococcus agalactiae trong giống gốc đem tăng sinh trong môi
trường BHIB. Sau đó pha loãng vi khuẩn trong bình tăng sinh thành các mật độ thích
hợp rồi gây bệnh trên cá bằng phương pháp ngâm. Sau khi gây bệnh xong tiến hành
mổ khám, tái phân lập vi khuẩn và ghi nhận triệu chứng bệnh tích để xác định đúng là
mầm bệnh gây nhiễm trong thí nghiệm. Qua tỷ lệ chết xác định liều LD 50 .
Quá trình thực hiện thí nghiệm được mô tả theo biểu đồ 3.1.

14