ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA, MIỄN DỊCH VÀ KHẢ NĂNG GÂY BỆNH TRÊN CÁ ĐIÊU HỒNG Oreochromis sp. CỦA HAI CHỦNG VI KHUẨN Streptococcus agalactiae CÓ DẠNG KHUẨN LẠC KHÁC NHAU
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (4.93 MB, 93 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA, MIỄN DỊCH VÀ KHẢ NĂNG GÂY
BỆNH TRÊN CÁ ĐIÊU HỒNG Oreochromis sp. CỦA HAI
CHỦNG VI KHUẨN Streptococcus agalactiae CÓ DẠNG
KHUẨN LẠC KHÁC NHAU
Sinh viên thực hiện: TRƯƠNG NGỌC ANH
TRẦN NGUYỄN KIM TUYẾN
Ngành: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
Chuyên ngành: NGƯ Y
Niên khóa: 2007 – 2011
Tháng 07/2011
ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA, MIỄN DỊCH VÀ KHẢ NĂNG GÂY BỆNH
TRÊN CÁ ĐIÊU HỒNG Oreochromis sp. CỦA HAI CHỦNG VI KHUẨN
Streptococcus agalactiae CÓ DẠNG KHUẨN LẠC KHÁC NHAU
Tác giả
TRƯƠNG NGỌC ANH
TRẦN NGUYỄN KIM TUYẾN
Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng
Kỹ sư ngành Nuôi Trồng Thủy Sản, chuyên ngành Ngư Y
Giáo viên hướng dẫn
TS. NGUYỄN HỮU THỊNH
Tháng 07 năm 2011
i
CẢM TẠ
Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy Sản và tất cả các thầy cô đã dùng hết tâm huyết của
mình để truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm và tạo điều kiện học tập tốt nhất cho chúng
tôi.
Xin gửi lời cảm ơn vô cùng sâu sắc đến thầy Nguyễn Hữu Thịnh đã tận tình
hướng dẫn và hỗ trợ chúng tôi hoàn thành tốt khóa luận này.
Cảm ơn các thầy và các bạn, các em phụ trách trại thực nghiệm Nuôi Trồng
Thủy Sản, chị Vũ Thị Ngọc, anh Đỗ Viết Phương, chị Truyện Nhã Định Huệ đã nhiệt
tình giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm để khóa luận có thể thực hiện thuận lợi.
Cha mẹ và gia đình đã động viên, giúp đỡ và hỗ trợ về tinh thần lẫn vật chất cho
con trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè, tập thể lớp DH07NY luôn khuyến khích, động
viên và chia sẻ với chúng tôi trong suốt thời gian qua.
Do kiến thức và kinh nghiệm hạn hẹp nên đề tài này sẽ không tránh khỏi sai sót,
rất mong nhận được sự góp ý và thông cảm của quý thầy cô và các bạn.
ii
TÓM TẮT
Đề tài “Đặc điểm sinh hóa, miễn dịch và khả năng gây bệnh trên cá điêu
hồng Oreochromis sp. của hai chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae có dạng
khuẩn lạc khác nhau” được tiến hành từ ngày 14/02/2011 đến ngày 11/07/2011 tại
trại thực nghiệm Khoa Thủy Sản và Phòng Thí Nghiệm Bệnh Học Thủy Sản, Khoa
Thủy Sản, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
Đề tài được thực hiện với mục đích:
-
Tìm hiểu khả năng gây bệnh của hai chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae
có dạng khuẩn lạc khác nhau trên cá điêu hồng Oreochromis sp.
-
Mô tả và so sánh các triệu chứng, bệnh tích, những biến đổi mô bệnh học trên
cá rô phi đỏ gây ra bởi hai chủng vi khuẩn.
-
Khả năng dung huyết và khả năng hình thành miễn dịch của hai chủng vi khuẩn
trên.
Thí nghiệm được bố trí gồm 3 nghiệm thức, gây nhiễm bằng phương pháp tiêm
vào xoang bụng:
• Nghiệm thức A: Sử dụng chủng vi khuẩn Streptoccocus agalactiae dạng 1
(chủng vi khuẩn cho khuẩn lạc lớn)
• Nghiệm thức B: Sử dụng chủng vi khuẩn Streptoccocus agalactiae dạng 2
(chủng vi khuẩn cho khuẩn lạc dạng pinpoint).
• Nghiệm thức C (nghiệm thức đối chứng): Không sử dụng vi khuẩn.
Trong 2 tuần tiến hành thí nghiệm, số lượng cá chết ở nghiệm thức A rất thấp
trong khi ở nghiệm thức B lại rất cao. Điều này khẳng định đôc lực của S. agalactiae
dạng 2 cao hơn S. agalactiae dạng 1.
Cá bệnh do vi khuẩn S. agalactiae có các triệu chứng bệnh tích gần giống nhau
như lờ đờ, kém linh hoạt; gan sung huyết, gan, thận, lách sưng, hoại tử, hoặc xuất
huyết, não xuất huyết,... Mô ở gan, thận, lách có nhiều khác biệt so với mô cá khỏe ở
nghiệm thức đối chứng như cấu trúc mô hư hại, các tế bào máu tập trung thành từng
vùng, xuất hiện trung tâm đại thực bào sắc tố,…
iii
S. agalactiae dạng 1 có khả năng dung huyết nhưng rất yếu, còn S. agalactiae
dạng 2 không có khả năng dung huyết.
S. agalactiae dạng 1 chỉ ngưng kết với huyết thanh của cá còn sống sau khi gây
bệnh bằng S. agalactiae dạng 1. Tương tự đối với S. agalactiae dạng 2. Hiện tượng
ngưng kết chéo giữa hai chủng vi khuẩn với hai dạng huyết thanh và với huyết thanh
của cá ở nghiệm thức đối chứng đều không xảy ra.
iv
MỤC LỤC
TRANG TỰA ................................................................................................................ i
CẢM TẠ ......................................................................................................................... ii
TÓM TẮT...................................................................................................................... iii
DANH SÁCH CÁC BẢNG ........................................................................................ viii
DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ.......................................................................................ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH ..............................................................................................x
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... xii
Chương 1: MỞ ĐẦU .....................................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề ..................................................................................................................1
1.2 Mục tiêu đề tài ...........................................................................................................2
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..........................................................................3
2.1 Sơ lược về bệnh do Streptococcus agalactiae...........................................................3
2.1.1 Lịch sử và một số nghiên cứu về bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra ..........3
2.1.2 Vi khuẩn Streptococcus agalactiae ........................................................................4
2.2 Phản ứng ngưng kết huyết thanh .............................................................................11
2.3 Mô bệnh học ............................................................................................................11
2.3.1 Khái niệm .............................................................................................................11
2.3.2 Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................12
Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................13
3.1 Thời gian và địa điểm ..............................................................................................13
3.2 Vật liệu và dụng cụ ..................................................................................................13
3.2.1 Dụng cụ và trang thiết bị ......................................................................................13
v
3.2.2 Hóa chất và môi trường ........................................................................................13
3.2.3 Đối tượng nghiên cứu ...........................................................................................14
3.2.4 Hệ thống bể thí nghiệm ........................................................................................14
3.3 Phương pháp nghiên cứu .........................................................................................14
3.3.1 Bố trí thí nghiệm ...................................................................................................15
3.3.2 Phương pháp nghiên cứu chung ...........................................................................16
3.3.3 Phương pháp kiểm tra kí sinh trùng .....................................................................17
3.3.4 Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn ...............................................................................17
3.3.5 Phương pháp pha loãng huyền phù vi khuẩn .......................................................17
3.3.6 Xác định mật độ vi khuẩn .....................................................................................18
3.3.7 Gây bệnh bằng phương pháp tiêm ........................................................................19
3.3.8 Phương pháp giải phẫu cá ....................................................................................19
3.3.9 Phương pháp cấy phân lập vi khuẩn .....................................................................21
3.3.10 Phương pháp cấy thuần ......................................................................................21
3.3.11 Phương pháp định danh vi khuẩn .......................................................................21
3.3.12 Thử nghiệm ngưng kết huyết thanh....................................................................23
3.3.13 Mô học ................................................................................................................23
3.3.14 Phương pháp theo dõi cá sau khi gây nhiễm ......................................................24
3.4 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu ..................................................................24
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................25
4.1 Một số chỉ tiêu chất lượng nước trong quá trình thí nghiệm ...................................25
4.2 Kết quả thí nghiệm ..................................................................................................26
4.2.1 Kết quả kiểm tra sức khỏe cá trước khi thí nghiệm..............................................26
4.2.2 Mật độ vi khuẩn gây nhiễm ..................................................................................27
4.2.3 Triệu chứng và bệnh tích ......................................................................................28
vi
4.2.4 Kết quả phân lập vi khuẩn trên cá chết ................................................................33
4.2.5 Phân lập vi khuẩn từ cá còn sống sau 14 ngày gây nhiễm ...................................34
4.2.6 Kết quả định danh .................................................................................................34
4.2.7 Số lượng và tỷ lệ cá chết theo ngày ......................................................................41
4.2.8 Thử nghiệm khả năng ngưng kết huyết thanh ......................................................46
4.2.9 Mô bệnh học .........................................................................................................47
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................55
5.1 Kết luận....................................................................................................................55
5.2 Đề nghị ....................................................................................................................55
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................56
PHỤ LỤC .....................................................................................................................59
vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Các đặc điểm sinh hóa của S. agalactiae phân lập bởi nhiều tác giả
Bảng 2.2: Các đặc điểm sinh hóa thông thường của S. agalactiae từ một số tác giả
Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm gây bệnh thực nghiệm trên cá rô phi đỏ
Bảng 4.1: Một số chỉ tiêu chất lượng nước trước thí nghiệm
Bảng 4.2: Một số chỉ tiêu chất lượng nước trong quá trình thí nghiệm
Bảng 4.3: Mật độ vi khuẩn gây nhiễm ở các nghiệm thức
Bảng 4.4: Kết quả cấy phân lập vi khuẩn từ gan, thận, lách, não của cá sau thí nghiệm ở
các nghiệm thức
Bảng 4.5: Kết quả định danh sơ bộ
Bảng 4.6: Kết quả test kit API 20 Strep
Bảng 4.7: Tỷ lệ cá chết ở mỗi mật độ của nghiệm thức A sau 14 ngày thí nghiệm
Bảng 4.8: Tỷ lệ cá chết ở mỗi mật độ của nghiệm thức B sau 14 ngày thí nghiệm
Bảng 4.9: Kết quả thử nghiệm ngưng kết huyết thanh
viii
DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ cá chết tích lũy của nghiệm thức A so với nghiệm thức đối chứng
Biểu đồ 4.2: Tỷ lệ cá chết tích lũy của nghiệm thức B so với nghiệm thức đối chứng
ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1: Khuẩn lạc dạng pinpoint không dung huyết của S. agalactiae trên môi
trường thạch máu
Hình 2.2: Khuẩn lạc dạng pinpoint dung huyết beta của S. agalactiae trên môi trường
thạch máu
Hình 3.1: Phương pháp pha loãng
Hình 3.2: Cân cá trước khi tiêm
Hình 3.3: Thao tác tiêm vi khuẩn vào xoang bụng cá
Hình 3.4: Ba đường cắt mổ xoang bụng
Hình 3.5: Bốn đường cắt mổ sọ não cá
Hình 3.6: Kết quả phản ứng ngưng kết huyết thanh
Hình 4.1: Cá bệnh ở nghiệm thức A bị xuất huyết toàn thân và xơ vây
Hình 4.2: Cá bệnh ở nghiệm thức A có lách sưng to và gan sung huyết
Hình 4.3: Cá bệnh ở nghiệm thức A bị sưng hậu môn
Hình 4.4: Cá bệnh ở nghiệm thức A bị xuất huyết não
Hình 4.5: Cá bệnh ở nghiệm thức B bơi nghiêng
Hình 4.6: Cá bệnh ở nghiệm thức B bơi sát nền đáy và thân cong hình chữ C
Hình 4.7: Cá bệnh ở nghiệm thức B bị lồi và xuất huyết cả hai mắt
Hình 4.8: Cá bệnh ở nghiệm thức B bị lồi và đục một hoặc cả hai mắt
Hình 4.9: Cá bệnh ở nghiệm thức B bị xuất huyết não rất nặng
Hình 4.10: Cá bệnh ở nghiệm thức B có gan sưng to và sung huyết, lách sưng to
Hình 4.11: Khuẩn lạc của S. agalactiae dạng 1 và dạng 2 sau 48 giờ
Hình 4.12: Hình dạng vi khuẩn của S. agalactiae dạng 1 và S. agalactiae dạng 2
Hình 4.13: Hai chủng vi khuẩn không phát triển lan rộng khỏi vết cấy
Hình 4.14: Phản ứng catalase và oxidase âm tính của vi khuẩn S. agalactiae dạng 1
Hình 4.15: Phản ứng catalase và oxidase âm tính của vi khuẩn S. agalactiae dạng 2
Hình 4.16: Khuẩn lạc S. agalactiae dạng 1 dung huyết rất yếu trên môi trường thạch
máu cừu
x
Hình 4.17: Khuẩn lạc S. agalactiae dạng 2 không dung huyết trên môi trường thạch
máu cừu
Hình 4.18: Kết quả định danh bằng kit API 20 Strep của vi khuẩn S. agalactiae dạng 1
Hình 4.19: Kết quả định danh bằng kit API 20 Strep của vi khuẩn S. agalactiae dạng 2
Hình 4.20: Mô gan cá khỏe ở nghiệm thức đối chứng
Hình 4.21: Mô gan cá bệnh ở nghiệm thức A
Hình 4.22: Mô gan cá bệnh ở nghiệm thức B
Hình 4.23: Mô thận cá khỏe ở nghiệm thức đối chứng
Hình 4.24: Mô thận cá bệnh ở nghiệm thức A
Hình 4.25: Mô thận cá bệnh ở nghiệm thức B
Hình 4.26: Mô lách cá khỏe ở nghiệm thức đối chứng
Hình 4.27: Mô lách cá bệnh ở nghiệm thức A
Hình 4.28: Mô lách cá bệnh ở nghiệm thức B
xi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ctv
Cộng tác viên
DO
Dissolved oxygen
BHIA
Brain Heart Infusion Agar
BHIB
Brain Heart Infusion Broth
SBA
Sheep Blood Agar
OD
Optical density
pd
Proportionate distance
CFU
Conoly forming unit
g
Gam
xii
Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Cá rô phi là một trong những đối tượng nuôi kinh tế, chất lượng thịt ngon và
thơm nên rất được người tiêu dùng trong nước và thế giới ưa chuộng. Để đáp ứng cho
nhu cầu đó, nghề nuôi cá rô phi cũng ngày càng được mở rộng và phát triển.Tuy cá rô
phi là loài dễ thích nghi, sức đề kháng cao, nhưng với mô hình nuôi thâm canh, dịch
bệnh trên cá rô phi vẫn xuất hiện thường xuyên trong vụ nuôi. Bệnh do Streptococcus
là nguyên nhân gây nên thiệt hại rất lớn, làm ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế của
ngành nuôi trồng thủy sản thế giới. Ước tính thiệt hại do Streptococcus hằng năm
khoảng 150 triệu USD (Shoemaker và Klesius, 1997). Từ năm 2000 đến năm 2009,
Brian và ctv đã định danh hơn 1.000 chủng vi khuẩn phân lập từ cá rô phi thu được ở
74 vùng và 14 nước và thấy rằng hơn ½ số vi khuẩn đó thuộc giống Streptococcus.
Streptoccocus iniae và Streptoccocus agalactiae là 2 nguyên nhân gây bệnh
quan trọng trong các bệnh do Streptococcus gây ra trên cá nuôi. Trong khi bệnh trên cá
gây ra bởi S. iniae được báo cáo trên nhiều loài cá biển nuôi thì bệnh do S. agalactiae
lại phổ biến hơn trên cá rô phi, là một loài cá nước ngọt.
Bệnh do S. agalactiae đã được báo cáo trên cá rô phi nuôi ở Việt Nam. Đối với
cá rô phi đỏ nuôi bè ở đồng bằng Sông Cửu Long, thiệt hại cho nghề nuôi chủ yếu là
do S. agalactiae. Trong một đợt kiểm tra mẫu bệnh cá rô phi đỏ ở Đồng Tháp vào
tháng 05/2011, phòng thí nghiệm Bệnh học thủy sản – Khoa thủy sản trường Đại học
Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã phân lập được hai chủng S. agalactiae. Hai
chủng này tạo khuẩn lạc có sự phát triển và hình dạng khác nhau trên môi trường nuôi
cấy. Kiểm tra các đặc điểm sinh hóa và khả năng gây bệnh trên cá rô phi đỏ của các
chủng vi khuẩn khác nhau này là công việc rất cần thiết. Công việc này nhằm tìm hiểu
sự khác biệt về đặc điểm sinh học và khả năng gây bệnh của vi khuẩn S. agalactiae.
1
Từ nhận định trên và được sự phân công, cho phép của khoa Thủy Sản – trường
Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài
“Đặc điểm sinh hóa, miễn dịch và khả năng gây bệnh trên cá điêu hồng Oreochromis
sp. của hai chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae có dạng khuẩn lạc khác nhau”.
1.2 Mục tiêu đề tài
-
Tìm hiểu khả năng gây bệnh của hai chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae
có dạng khuẩn lạc khác nhau trên cá điêu hồng Oreochromis sp.
-
Mô tả các triệu chứng, bệnh tích, biến đổi mô bệnh học của cá bệnh sau thí
nghiệm.
-
Tìm hiểu khả năng dung huyết và khả năng hình thành miễn dịch của cá rô phi
đỏ đối với hai chủng vi khuẩn trên.
2
Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược về bệnh do Streptococcus agalactiae
2.1.1 Lịch sử và một số nghiên cứu về bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra
Bệnh do liên cầu khuẩn được báo cáo lần đầu tiên năm 1966 bởi Robinson và
Mayer trên cá nước ngọt Notemignus crysoleucas. Sau đó, Eldar và ctv (1995) xác
định được hai loài S. shiloi (S. iniae) và S. diffiicile (S. agalactiae) là tác nhân gây
bệnh trên cá rô phi lai và cá hồi vân ở Israel năm 1984. Đến năm 1997, Vandamme và
ctv. đã chứng minh được S. difficile thuộc nhóm B, type Ib Streptococcus, rất khó phân
biệt với S. agalactiae, do hai loài có trình tự đoạn gen 16S - 23S giống nhau đến
97,7% và trình tự 16S giống nhau 100%. Vì vậy, trong hai nghiên cứu của Brain với
ctv năm 2001 và Yoshiaki với ctv năm 2005 đã định danh lại S. difficile chính là S.
agalactiae.
S. agalactiae có phổ ký chủ rộng, gây bệnh cho người, gia súc và cá. Đôi khi,
chúng còn ảnh hưởng đến các loài động vật khác, chẳng hạn như chó, mèo, cá sấu,
ếch, hải cẩu hoặc cá heo.(Theo www.moredun.org.uk)
Hầu hết các chủng GBS đều dung huyết beta (β – haemolysis) trên môi trường
thạch máu nhưng một số chủng phân lập trên người, cừu và cá không dung huyết
(Kawamura và ctv., 2005; Sheehan và ctv., 2009). Tỷ lệ các dạng mầm bệnh
streptoccocal chính ở vùng Châu Á – Thái Bình Dương là: S. agalactiae dung huyết
beta chiếm 26%, S. agalactiae không dung huyết chiếm 56%, còn lại là S. iniae chiếm
18%. Các chủng S. agalactiae hiện diện theo từng vùng địa lý riêng biệt. Ở Châu Á, S.
agalactiae không dung huyết được tìm thấy ở Trung Quốc, Indonesia, Việt Nam và
Philippin. Ở Châu Mỹ Latin, chúng được tìm thấy ở Ecuador, Honduras, Mexico và
gần đây nhất là ở Brazil (năm 2001); S. agalactiae dung huyết beta chiếm ưu thế ở
Thái Lan, Malaysia và Singapore; S. iniae thường được tìm thấy cùng với S.
agalactiae dung huyết beta hoặc S. agalactiae không dung huyết ở Trung Quốc,
3
Ecuador, Honduras, Indonesia, Philippin và Thái Lan. Chỉ riêng ở Philippin và Việt
Nam, cả S. agalactiae dung huyết beta, S. agalactiae không dung huyết và S. iniae
hiện diện trong cùng một quốc gia.
Vaccine từ S. agalactiae không dung huyết chỉ có khả năng bảo hộ miễn dịch
cho cá đối với S. agalactiae không dung huyết , nhưng không thể bảo vệ cá khỏi S.
agalactiae dung huyết beta, và ngược lại. (Theo www.thefishsite.com, 2009)
Trên cá rô phi, S. agalactiaae không dung huyết gây bệnh ở mọi giai đoạn,
trong khi S. agalactiae dung huyết beta chủ yếu gây bệnh ở cá cỡ lớn. S. agalactiae đã
trở thành một tác nhân gây bệnh quan trọng trên cá rô phi ở Châu Á và Châu Mỹ
(Klesius và ctv, 2005). Đó là tác nhân gây bệnh cho tỷ lệ chết cao trên cá rô phi của
Thái Lan trong những năm gần đây (Tân và ctv, 2007. Trích bởi Hồ Thành Tâm,
2010). Theo Maisak và ctv (2008), trên 60 cá rô phi mắc bệnh từ các vùng khác nhau
của Thái Lan, có đến 53 cá bị nhiễm S. agalactiae (88%) và chỉ có 7 cá bị nhiễm S.
iniae (12%). ( />2.1.2 Vi khuẩn Streptococcus agalactiae
2.1.2.1 Phân dạng
Lớp: Bacilli
Bộ: Lactobacillales
Họ: Streptococcaceae
Giống: Streptococcus (Rosenbach, 1884)
Loài: Streptococcus agalactiae (Lehmann và Neumann, 1896)
2.1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
S. agalactiae thuộc nhóm B (Group B Streptococcus – GBS), gram dương, tế
bào hình cầu hoặc hình trứng, tồn tại độc lập, kết cặp hoặc dạng chuỗi, không di động,
không sinh bào tử, cho kết quả phản ứng oxidase và catalase âm tính. Đường kính
khuẩn cầu từ 0,6 - 1,0 micromet (Duremdez và ctv., 2004; Yuasa và ctv., 2008).
S. agalactiae sinh trưởng tốt trên môi trường dinh dưỡng như TSA, BA và
BHIA (Ali và ctv, 2010). Sau 24 - 48 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp từ 25 – 28oC vi
khuẩn tạo thành khuẩn lạc nhỏ, màu trắng đục, tròn, ít hoặc không có lớp màng nhầy
và hơi lồi, một số chủng tạo khuẩn lạc lớn, màu trắng trong, hơi lồi, nhầy. Lớp màng
nhầy đó là mucopolysaccharide. Lớp màng nhầy càng dày thì độc lực của vi khuẩn
4
càng cao. Tuy nhiên, rất khó duy trì chủng có độc lực cao được lâu, vì qua nhiều lần
cấy chuyền độc lực sẽ giảm dần, thu được khuẩn lạc màu trắng đục, nhỏ, không có tính
nhầy như những chủng thông thường. Vì vậy muốn giữ độc lực của nó ta cấy một lần
rồi bảo quản lạnh để phục hồi (Nguyễn Hữu Thịnh, 2010).
Hình 2.1: Khuẩn lạc dạng pinpoint không dung huyết của S. agalactiae trên môi
trường thạch máu
(Nguồn: />
Hình 2.2: Khuẩn lạc dạng pinpoint, dung huyết beta của S. agalactiae trên môi trường
thạch máu
(Nguồn: />
5
S. agalactiae dung huyết beta phát triển tốt ở 37oC và chủ yếu gây bệnh trên cá
giống.
S. agalactiae không dung huyết trên môi trường thạch máu phát triển yếu ở
37oC và đa phần gây bệnh trên cá thương phẩm (Nguyễn Hữu Thịnh, 2010).
Vi khuẩn S. agalactiae dung huyết beta khi lấy làm vaccine ngừa bệnh cho cá
rô phi thì cá chỉ miễn dịch và không mắc bệnh trở lại với S. agalactiae dung huyết beta
nhưng đáng chú ý là nó lại không tạo ra miễn dịch để chống lại S. agalactiae không
dung huyết và ngược lại (Nguyễn Hữu Thịnh, 2010).
Kết quả một số phản ứng sinh hóa của vi khuẩn S. agalactiae:
6
Bảng 2.1: Các đặc điểm sinh hóa của S. agalactiae phân lập bởi nhiều tác giả
(Duremdez và ctv,2004)
Dung huyết β
Test
Không dung huyết
Duremdez và
Eldar
Baya
ctv
và ctv
và ctv
và ctv
và Meyer
(1994) (1990)
(1973)
(1966)
(2004)
Wikinson Robinson
OF test
-/-
+/+
-/-
-/-
c
Haemolysis
β
γ
γ
Γ
γ
Catalase
-
-
+
-
c
Oxidase
-
-
-
-
c
Acetoin production
+
+
+
C
c
Hippurate
+
-
c
+
c
Esculin
-
-
c
C
c
Tinh bột
-
-
-
-
-
Pyrrolidonylarylamidase
-
-
c
C
c
α-Galactosidase
-
-
c
C
c
β-Glucorinase
-
-
c
C
c
β-Galactosidase
-
-
c
C
c
Alkaline phosphatase
+
+
c
C
c
Leucine arylamidase
+
+
c
C
c
Arginine dihydrolase
+
+
+
C
c
Mannitol
-
-
-
C
c
10o C
-
-
-(15oC)
C
c
37o C
+
-
+(30oC)
C
c
45o C
-
-
-(40oC)
-
c
Phát triển ở pH 9.6
-
+
c
C
c
Phát triển ở:
Phát triển trong môi trường có chứa:
4.0% NaCl
+
c
c
+
-
6.5% NaCl
-
-
-(6.0%)
-
-
10% dịch mật
-
c
c
-
-
7
40% dịch mật
-
-
c
-
-
Ghi chú: (+): Dương tính; (-): Âm tính; β: Dung huyết β; γ: Không dung huyết; c:
Chưa được báo cáo.
Bảng 2.2: Các đặc điểm sinh hóa thông thường của S. agalactiae từ một số tác giả (Ali
và ctv, 2010)
Ali và ctv
Duremdez, và
Salvador và
Yuasa và
(2010),
ctv (2004)
ctv (2005)
ctv(2008)
Malaysia
Kuwait
Brazil
Thái Lan
+, hình cầu
+, hình cầu
+, hình cầu
+, hình cầu
Hemolysis
β
β
Γ
β
Catalase
-
-
-
-
Oxidase
-
-
-
-
Esculin
-
-
-
-
Sorbitol
-
-
-
-
Lactose
-
-
-
-
Trehalose
+
+
+
+
-
-
-
Test
Nhuộm gram
Phát triển trong môi
trường bổ sung 6.5%
không được
NaCl
báo cáo
Ghi chú: (+): Dương tính, (-): Âm tính; β: Dung huyết β; γ: Không dung huyết.
2.1.2.3 Triệu chứng, bệnh tích của cá bị bệnh Streptococcus agalactiae
Ali và ctv (2011) đã tiến hành gây bệnh thực nghiệm cho cá giống cá rô phi đỏ
bằng S. agalactiae và kết luận rằng: S. agalactiae phân lập từ cá rô phi nhiễm bệnh tự
nhiên có thể gây bệnh lại trên cá giống của cá rô phi đỏ thí nghiệm thông qua phương
pháp tiêm vào xoang bụng và phương pháp ngâm. Dấu hiệu bệnh tích, các biểu hiện
chung và dấu hiệu mô học tương tự như mô tả từ cá bệnh tự nhiên.
8
2.1.2.4 Triệu chứng
Cá bệnh có triệu chứng chung khá điển hình trên nhiều loài với những biểu hiện
bất thường như lờ đờ, hoạt động bơi lội bất thường và mất định hướng, xoay tròn, cong
thân, cá bệnh tập trung thành từng cụm ở nền đáy, thường kém ăn hay bỏ ăn (Ali và
ctv, 2011).
2.1.2.5 Bệnh tích
2.1.2.5.1 Bệnh tích bên ngoài
Một số biểu hiện tương đối đặc trưng là mắt mờ đục, lồi một bên, hai bên hoặc
lõm vào, có thể thấy ổ mủ ở hàm dưới, gốc vây, ổ mủ vỡ ra thành loét, xuất huyết điểm
ở da, da vùng miệng, gốc vây.
Một số còn bị đỏ, lồi lỗ hậu môn và lỗ sinh dục.
2.1.2.5.2 Bệnh tích bên trong
Tương tự như bệnh nhiễm trùng do Aeromonas spp. di động, Edwarsiella spp.,
bệnh thường gây xuất huyết, hoại tử gan, lách, thận thành những đốm màu nhạt ở cá rô
phi (Bùi Quang Tề, 2006).
Gan sưng, thận và lách có hiện tượng sung huyết, tích dịch xoang bụng
(Duremdez và ctv., 2004; trích bởi Springer, 2007).
Lách sưng, mô lách mềm nhũn, sung huyết, bóng hơi phình to, não mềm, thận
sung huyết, tắc mạch máu (Ali và ctv, 2011).
Trướng bụng, dạ dày và ruột trống rỗng hoặc tích dịch hơi vàng (Springer,
2007)
Viêm phúc mạc nên viêm dính nội quan với nhau và viêm dính thành bụng, có
hiện tượng xuất huyết não (Nguyễn Hữu Thịnh, 2010).
2.1.2.6 Dịch tễ của bệnh
Bệnh thường xảy ra trên cá cỡ lớn.
Tỷ lệ cá chết rất cao ở những thời gian nhiệt độ nước cao trong năm, tập trung
vào các tháng cuối mùa hè và đầu mùa thu. Ở những thời điểm khác trong năm cá chết
rải rác. Khi nhiệt độ nước xuống thấp vào những tháng mùa đông ở các nước ôn đới
thì không thấy xuất hiện bệnh.
Bệnh xảy ra do cá bị stress trong thời gian dài, bởi một số nguyên nhân do nhiệt
độ nước tăng cao (30,5 – 32oC), DO thấp, mật độ nuôi dày.
9
Bệnh lây lan theo chiều ngang do hiện tượng ăn nhau, khi cá bị trầy xướt trên
da tạo điều kiện cho vi khuẩn từ môi trường nước xâm nhập trực tiếp vào cơ thể cá,
hay vi khuẩn xâm nhập qua niêm mạc (khứu giác). Bệnh truyền từ cá thể này sang cá
thể khác, từ cá chết sang cá hấp hối và cá khỏe. Bệnh xảy ra cấp tính tỷ lệ chết cao, lên
đến trên 50% trong 2 – 3 tuần. Bệnh bộc phát vài lần, sau đó trở nên mãn tính, cá chết
kéo dài trong nhiều tuần.
2.1.2 7 Phương pháp chẩn đoán bệnh
Tại ao nuôi: Dựa vào các triệu chứng, bệnh tích để chẩn đoán sơ bộ.
Trong phòng thí nghiệm: Tiến hành làm mẫu soi tươi, phết kính gan, thận, lách
não. Phân lập vi khuẩn bằng một số môi trường cơ bản như TSA, NA, BHIA. Sử dụng
môi trường thạch máu kiểm tra khả năng dung huyết của vi khuẩn. Định danh vi khuẩn
bằng các phản ứng sinh hóa (phương pháp truyền thống), dùng bộ kit API 20 Strep, sử
dụng kỹ thuật PCR,…Tuy nhiên trong thực tế, các kết quả thu được từ các phản ứng
sinh hóa cũng như các test kit đôi lúc không trùng lắp với nhau do nhiều nguyên nhân.
Vì vậy, cần kết hợp các phương pháp để có kết quả định danh chính xác nhất.
2.1.2.8 Phương pháp phòng và trị bệnh
2.1.2.8.1 Phương pháp phòng bệnh
Áp dụng phương pháp phòng bệnh chung cho cá, đặc biệt là trước và trong mùa
dịch. Nên giảm mật độ nuôi, tránh cho ăn thừa, bổ sung các chất tăng cường miễn dịch
vào thức ăn, thường xuyên vệ sinh bể nuôi, hạn chế đến mức tối đa các hoạt động phân
cỡ, chuyển đàn trong thời gian dịch bệnh thường xảy ra, vớt cá có dấu hiệu bệnh, cá
chết ra khỏi ao nhằm tránh lây lan bệnh…
Sử dụng vaccine là biện pháp phòng bệnh tốt nhất hiện nay. Evans và ctv
(2004) đã phát triển vaccine bất hoạt của S. agalactiae có bổ sung sản phẩm ngoại bào
ECPs (Extracellular products) cho hiệu quả bảo hộ tốt với phương pháp tiêm qua
xoang bụng một lần và phương pháp ngâm. Trọng lượng cá rô phi thích hợp cho cấp
vaccine theo cả hai phương pháp trên là 30g. Phương pháp tiêm cho hiệu quả bảo hộ
tốt hơn so với phương pháp ngâm, việc hình thành miễn dịch khi đưa vaccine vào cơ
thể cá bằng phương pháp tiêm cho hiệu quả cao gấp 2 lần so với phương pháp ngâm.
Đồng thời, nhóm nghiên cứu còn cho rằng, không có sự bảo hộ miễn dịch chéo của
vaccine có nguồn gốc từ S. iniae chống lại S. agalactiae và ngược lại. Theo Sheehan
10
và cộng tác viên (2009), vaccine cho cá rô phi với chủng S. agalactiae không dung
huyết không thể bảo vệ cá khi gây nhiễm với chủng S. agalactiae dung huyết beta và
ngược lại.
2.1.2.8.2 Trị bệnh
Sử dụng các dạng kháng sinh phổ rộng hay kháng sinh diệt khuẩn gram dương
như erythromycin, oxytetracyclin, doxycyclin,… để trị bệnh. Dùng phương pháp trộn
kháng sinh vào thức ăn như dùng erythromycin, ciprofloxacin, enrofloxacin liều 25 –
50 mg/kg cá/ngày, sử dụng liên tục trong 4 – 7 ngày.
Tuy nhiên việc dùng kháng sinh cần thận trọng và tuân theo các nguyên tắc sử
dụng kháng sinh. Nhiều người nuôi cho biết, kháng sinh chỉ có tác dụng trong thời
gian dùng thuốc, khi ngưng kháng sinh, tỉ lệ chết tăng cao trở lại, buộc người nuôi phải
dùng trong thời gian dài làm tăng nguy cơ kháng kháng sinh, giảm giá trị thịt cá và
tăng chi phí sản xuất. Vì vậy nếu đã quyết định dùng kháng sinh, chỉ nên dùng trong
giai đoạn sớm của bệnh khi cá còn ăn.
2.2 Phản ứng ngưng kết huyết thanh
Phản ứng này được dùng phổ biến để phát hiện kháng nguyên khi đã có sẵn
kháng thể đặc hiệu hoặc để phát hiện kháng thể khi đã có sẵn kháng nguyên hòa tan
đặc hiệu.
Khi cho kháng thể đặc hiệu phản ứng với kháng nguyên sẽ xuất hiện hiện tượng
ngưng kết có thể nhìn thấy bằng mắt thường dùng để định tính và bán định lượng
kháng thể trong huyết thanh.
Đầu tiên cho kháng nguyên hữu hình vào dãy ống nghiệm có độ pha loãng
kháng thể tăng dần (Ví dụ: Ống 1: 1/2, ống 2: 1/4, ống 3: 1/8,…). Hiệu giá kháng thể
là độ pha loãng cao nhất mà vẫn xảy ra ngưng kết. Chẳng hạn ở ống thứ 3 có độ pha
loãng lớn nhất mà vẫn quan sát thấy ngưng kết thì ta nói hiệu giá của kháng huyết
thanh là 1/8.
2.3 Mô bệnh học
2.3.1 Khái niệm
Mô bệnh học là khoa học nghiên cứu các tổn thương ở các tế bào và mô. Ngoài
ra còn so sánh đối chiếu các tổn thương với những biểu hiện lâm sàng.
11
Qua đó, tìm hiểu mối quan hệ mật thiết giữa biến đổi hình thái và các rối loạn
chức năng để chẩn đoán nguyên nhân.
2.3.2 Phương pháp nghiên cứu
Cố định mẫu Xử lý mẫu Đúc khối Cắt lát Nhuộm màu Đọc kết
quả Hiểu được sự thay đổi bất thường của các tổ chức mô bệnh trên động vật thủy
sản do các tác nhân như ký sinh trùng, vi khuẩn và virus. (ThS. Lưu Thị Thanh Trúc,
2009)
12
