Một số đặc tính sinh hoá, miễn dịch và sinh học phân tử của các chủng Bacillus du và NT trong sản xuất các sinh phẩm
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (628.09 KB, 30 trang )
Bộ GIáO DụC V ĐO TạO Bộ Y Tế
VIệN Vệ SINH DịCH Tễ TRUNG ƯƠNG H NộI
LÊ THị LOAN
MộT Số ĐặC TíNH SINH HOá, MIễN DịCH V SINH HọC
PHÂN Tử CủA CáC CHủNG BACILLUS Du v NT TRONG SảN
XUấT các SINH PHẩM
Chuyên ngành: Vi Sinh học
M số: 1. 05. 12
TóM TắT LUậN áN TIếN Sĩ sinh HọC
H NộI - 2006
Công trình đợc hoàn thành tại :
- Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng.
Ngời hớng dẫn khoa học:
1. PGS. TS. LÊ VĂN HIệP
2. TS. PHAN LÊ THANH Hơng
Phản biện 1: PGS. TS. TRƯƠNG NAM HảI
Phản biện 2: PGS. TS. LÊ VĂN PHủNG
Phản biện 3: TS. PHạM HùNG VÂN
Luận án sẽ đợc bảo vệ trớc Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nớc họp
tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng Hà Nội.
vào hồi giờ ngày tháng năm 200.
Có thể tìm hiểu luận án tại th viện Quốc gia và th viện Viện Vệ sinh
Dịch tễ Trung ơng Hà Nội .
DANH MụC CÔNG TRìNH Có LIÊN QUAN ĐếN LUậN áN
1. Lê Thị Loan, Lê Văn Hiệp, Đặng Văn Phú( 2001), Bớc đầu tìm
hiểu tác động của các loại Oligo-alginat đến qúa trình sinh trởng
phát triển của Bacillus subtilis, tạp chí Y học dự phòng tập XI, số
4(50), trang 70-72.
2. Lê Thị Loan, Lê Văn Hiệp, Đặng Thị Thanh Hà, Vũ Kim
Quyên(2003) Nhận xét về sự hình thành bào tử của Bacillus
subtilis, tạp chí Y học dự phòng tập XIII, số 6(63), trang 97-99.
3. Lê Thị Loan, Lê Văn Hiệp, Nguyễn Thị Kim Chi (2004)Nghiên cứu
một số đặc tính sinh hóa của các chủng Bacillus subtilis dùng trong
sản xuất sinh phẩm, tạp chí Y học thực hành, số 478, trg. 357-361.
4. Lê Thị Loan, Lê Văn Hiệp, Dơng Hồng Quân, Nguyễn Tiến Minh,
Đinh Duy Kháng (2004) Cloning and sequencing of 16S ribosomal
RNA genes from two Bacillus sp. Strains used as an oral probiotic
product. (Kết qủa giải hai trình tự gen 16S ribosome của hai chủng
Du và NT đăng ký vào Ngân hàng gen quốc tế ( EMBL/
GENEBANK) đã đợc công bố, EMBL Nucleotide Sequence
Database, Số AJ842963. Bacillus sp. Du p[ gi: 52851158],
AJ842964. Bacillus sp. NTp[ gi: 52851159], tháng 9 năm 2004).
5. Lê Thị Loan, Lê Văn Hiệp, Dơng Hồng Quân, Nguyễn Tiến Minh,
Đinh Duy Kháng( 2005)Định loại các chủng vi khuẩn thuộc chi
Bacillus dùng trong sản xuất Biosubtyl bằng trình tự gen 16S rRNA
và đánh gía thành phần kháng nguyên giữa các chủng bằng Western
Blot, tạp chí Công nghệ Sinh học, tập 3, số 2, 2005, trang 201-206.
Mở ĐầU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Trong một thời gian dài trớc đây, ngời ta quen dùng kháng
sinh để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn và cũng đã mang lại hiệu quả to lớn.
Tuy nhiên, chúng cũng gây ra nhiều tác dụng phụ cho ngời sử dụng. Một
trong những tác dụng phụ gây hậu qủa nghiêm trọng là gây rối loạn hệ vi
sinh vật sẵn có trong đờng ruột dẫn đến rối loạn tiêu hóa. Theo thống kê
của báo sức khỏe thì tiêu chảy là nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tử vong
cho trẻ em ở các nớc đang phát triển và ớc tính hàng năm có tới 1.3 ngàn
triệu lợt trẻ em dới 5 tuổi bị tiêu chảy và 4 triệu trẻ em chết vì bệnh này.
Xuất phát từ các vấn đề nêu trên, xu hớng ngày nay của thế giới là tập
trung nghiên cứu những chế phẩm sinh học có gía trị trị liệu cao, không
gây độc, hạn chế tác dụng phụ và không ảnh hởng đến cân bằng hệ vi sinh
vật có ích trong đờng ruột. Phơng pháp dùng vi sinh vật sống đờng
uống để điều trị các bệnh đờng ruột là một thành công lớn của nền y học
thế giới. Đã có nhiều sản phẩm probiotic ra đời đợc làm từ Bacillus- là
một loại vi sinh vật đợc sử dụng nhiều nhất trong các chế phấm sinh học
dùng trong y học, nông nghiệp và thủy sản. Trên thị trờng Việt Nam cũng
đã thấy xuất hiện nhiều chế phẩm sinh học có sử dụng Bacillus. Từ trên 20
năm nay, Viện Vắcxin và các chế phẩm sinh học đã sản xuất và lu hành
trên thị trờng nhiều loại sản phẩm mang dấu ấn của Bacillus, một trong
những sản phẩm quan trọng đợc nhiều ngời a chuộng và sử dụng nhất
là Biosubtyl. Thành phần chính của Biosubtyl là chủng Bacillus subtilis.
Tuy đã ra đời nhiều năm song Biosubtyl chỉ mới đợc chú trọng về mặt
ứng dụng mà ch
a có một nghiên cứu nào mang tính chất hệ thống về các
tính chất sinh hóa, miễn dịch và sinh học phân tử của các chủng Bacillus
subtilis nhất là đối với những chủng phân lập đợc. Vì vậy đề tài đợc thực
hiện với mong muốn khẳng định tính chất thuần chủng của các chủng
Bacillus subtilis đang sử dụng trong sản xuất để góp phần nâng cao chất
lợng sản phẩm và tiến tới tiêu chuẩn hóa Biosubtyl thành một mặt hàng có
thể xuất khẩu đợc.
2. Mục đích nghiên cứu:
2.1. Xác định
một số đặc tính sinh hoá, miễn dịch và sinh học phân tử
của hai chủng Bacillus Du và NT dùng trong sản xuất.
2.2. Đề xuất các điều kiện nuôi cấy tối u để thu đợc hiệu suất sinh
khối cao nhất.
3. Những đóng góp mới và giá trị thực tiễn của luận án
Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu đầy đủ về các đặc tính sinh lý,
sinh hóa, di truyền và miễn dịch của các chủng vi khuẩn dùng trong sản
xuất chế phẩm Probiotic tại Việt Nam.
4. Cấu trúc của luận án
Luận án gồm 150 trang, 4 chơng, có 17 bảng, 42 hình, cấu trúc từng
phần nh sau: Mở đầu 2 trang, chơng 1: Tổng quan tài liệu 43 trang,
chơng 2: Đối tợng-vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 15 trang,
chơng 3: Kết quả nghiên cứu 45 trang, chơng 4: bàn luận 10 trang, kết
luận 2 trang, kiến nghị 1 trang, danh mục các công trình có liên quan
đến luận án 1 trang, phần tài liệu tham khảo 12 trang gồm 113 tài liệu
trong đó tiếng Việt 24, tiếng Anh 89 và cuối cùng là phần phụ lục 21
trang.
Chơng 1 : TổNG QUAN TI LIệU
1.1. Đặc điểm sinh học của Bacillus:
1.4.1. Hình thể và tính chất sinh vật hoá học:
Bảng 1.2. So sánh các loài của Bacillus
Đặc điểm
B. subtilis B. pumilus B. cereus
B. cereus
var
thuringiensis
B. cereus var
mycoides
B. cereus var
anthracis
hình que
đờng kính
Chiều dài m
Gram
Bào tử
Chuyển động
Catalaza
Phát triển kỵ khí
Axit từ: glucoza
arabinose
xylose
manitol
Thủy phân tinh bột
Sử dụng citrate
KhửNO
3
ra NO
2
Phân hủy: cazein
tyrozin
0.7- 0.8
2.0 3.0
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
0.6 - 0.7
2.0 3.0
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
-
+
-
1.0 - 1.2
3 5
+
+
-
a
+
+
-
-
-
-
+
+
+
+
1.0 - 1.2
3 5
+
+
a
a
+
+
+
-
-
-
+
+
+
+
1.0 - 1.2
3 5
+
+
-
-
+
+
+
-
-
-
+
a
+
+
1.0 - 1.2
3 5
+
+
-
-
+
+
+
-
-
-
+
b
+
+
% giống với các đặc điểm: + : 85- 100%; a : 50- 84%; b : 15- 49%; - : 0-
14% [36 ], [38].
1.7. Di truyền học và sinh học phân tử
1.7.1. Vectụ taùo doứng
Đây là các plasmit nằm ngoài nhiễm sắc thể có kích thớc nhỏ và chứa
gen chọn lọc đợc sử dụng để tạo dòng các đoạn ADN. Chúng đợc phát
hiện đầu tiên ở vi khuẩn, sau đó không ngừng đợc cải tiến với nhiều đặc
tính quý: (1) Plasmit thế hệ thứ nhất nh ColE1, pSC101 nguồn gốc tự
nhiên có rất ít các đặc tính cần thiết; (2) Plasmit thế hệ thứ hai nh pBR322
đợc thiết kế nhân tạo trên cơ sở tập trung các tính trạng quý của plasmit tự
nhiên và đợc sử dụng để biến nạp gen quan tâm vào E. coli nhằm tạo
dòng và nhân lên với lợng lớn. Chúng thờng chứa vùng sao chép trong E.
coli, chỉ thị chọn lọc vi khuẩn và vùng MCS. Plasmit pBR322 và các thế hệ
vectơ biểu hiện có nguồn gốc từ pBR322 khá bền, tồn tại trong tế bào chủ
qua nhiều thế hệ nuôi cấy ngay trong điều kiện không có kháng sinh chọn
lọc. Tuy nhiên, trong một vài trờng hợp, plasmit có thể không bền vững
khi protein tái tổ hợp có hoạt tính độc ảnh hởng đến sinh trởng của tế
bào chủ; (3) Plasmit thế hệ thứ ba: nh pUC, pSP, pBluescript có kích th-
ớc nên sao chép rất nhanh trong tế bào vi khuẩn. Để tách dòng gen mã hoá
16S ribosome và gen mã hoá -amylase của các chủng vi khuẩn thuộc chi
Bacillus, chúng tôi sử dụng plasmit pCR 2.1 của hãng Invitrogen làm
vector tách dòng. Đây là một trong các plasmit có hiệu quả tạo dòng rất
cao.
1.7.2. Gen 16S ARN ribosome và ứng dụng
Gen 16S ARN ribosome lần đầu tiên đã đợc xác định ở E. coli với 1520
bp [48].Và ngay sau đó ngời ta đã sử dụng gen này để nghiên cứu nguồn
gốc phát sinh chủng loại ở các vi sinh vật procaryot nh Euglena gracilis
[116], nghiên cứu sự khác biệt giữa các giống tảo đỏ (Rhodophyta), tảo
lam (Anacystis nidulans) và các vi khuẩn Escherichia coli, Bacillus subtilis
[35].
Chơng 2.
Vật liệu v phơng pháp nghiên cứu
2.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị máy móc
2.1.1.Vật liệu
2.1.1.1. Chủng giống
- Trực khuẩn B. subtilis Trần Văn Du do bác sĩ Trần Văn Du phân lập
từ Pháp trao cho bác sĩ Phạm Ngọc Thạch nghiên cứu năm 1952, từ năm
1983 Viện Vacxin sử dụng sản xuất Biosubtyl đến nay, đợc phòng Kiểm
định Viện vacxin ĐàLạt đông khô ngày 19/1/1999.
- Trực khuẩn B.subtilis NT nhập từ Banladesh dới tên B. subtilis
đợc phòng Kiểm định Viện vacxin ĐàLạt đông khô ngày 15/9/2000.
-Trực khuẩn B.subtilis ATCC 6633 nhập từ Viện Americal Type
Culture Collection, đợc phòng Kiểm định Viện vacxin ĐàLạt đông khô
ngày 20/3/2001.
- Escherichia coli tên DH5, mua từ hãng Invitrogen ( Mỹ).
2.1.1.2. Các nguyên liệu khác:
(1) Cặp mồi để khuếch đại gen 16S ARN ribosome có trình tự theo
công bố của Green D.H. và cs [56]. Cặp mồi có trình tự:
B16Sp1: AGAGTTTGATCATGGCTCA
B16Sp2: AAGGAGGTGATCCAGCC
(2) Cặp mồi để khuếch đại gen mã hóa amylase và của vi khuẩn
B.subtilis:
BsAmyP10 5-AAGCGGAAGAATGAAGTAAGAGGG
BsAmyM30 5-GGATAAAGCACAGCTACAGACCTGG
Cặp mồi để khuếch đại gen mã hóa amylase của vi khuẩn B. subtilis
đợc chúng tôi thiết kế dựa trên các trình tự gen này đã đợc công bố trong
Ngân hàng Gen quốc tế số đăng ký K00563 [111]. Các cặp mồi đợc tổng
hợp nhờ Hãng Invitrogen (Mỹ).
2.2. Phơng pháp nghiên cứu
A. Phần nghiên cứu sinh hóa
2.2.1. Phơng pháp nuôi cấy vi khuẩn để quan sát hình thái tế bào:
2.2.2. Tính chất sinh hóa: Tính lên men các loại đờng, tính nhạy cảm với
kháng sinh.
2.2.3. Hoạt tính men của vi khuẩn
2.2.3.1. Khảo sát thời gian sinh hoạt tính men amylase và protease của
các chủng nghiên cứu
2.2.3.2. Khảo sát hoạt tính men amylase và protease trong sinh phẩm
Biosubtyl (Biosubtyl DL loạt 16,17,18,19; Biosubtyl NT loạt
19,20,22,25).
2.2.5. ảnh hởng nồng độ oligo- alginat lên qúa trình sinh trởng-
phát triển của Bacillus:
Xử lý thống kê bằng phơng pháp so sánh số liệu từng cặp ( T test).
2.2.6. Khảo sát ảnh hởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến sự
hình thành bào tử các chủng Du và NT trên môi trờng thạch dinh
dỡng pH = 7,2, và trên môi trờng thạch Edwards.
B. Phần nghiên cứu sinh học phân tử
2.2.7. Nuôi cấy và lu giữ các chủng vi khuẩn
2.2.8. Tách chiết và tinh sạch ADN plasmit, ADN genom
2.2.8.1. Tách chiết ADN plasmit của vi khuẩn E. coli
2.2.8.2. Quy trình tách chiết ADN plasmit của E. coli:
2.2.8.3. Tách chiết ADN Genom từ vi khuẩn thuộc chi Bacillus
2.2.9. Phản ứng tổng hợp chuỗi polymeraza
2.2.10. Phản ứng cắt ADN với enzym hạn chế
2.2.11. Điện di :Điện di ADN trên gel agaroza; điện di protein trên gel
polyacrylamit
2.2.12. Ghép nối các đoạn ADN
2.2.13. Chuẩn bị tế bào khả biến: Chuẩn bị tế bào khả biến E. coli để
biến nạp bằng sốc nhiệt.
2.2.14. Biến nạp ADN plasmit vào tế bào vi khuẩn: Biến nạp ADN
plasmit vào tế bào E. coli bằng sốc nhiệt
2.2.15. Xác định trình tự nucleotit của gen
Xử lý số liệu bằng phần mềm vi tính chuyên dụng
C. Phần nghiên cứu miễn dịch
2.2.16. Kỹ thuật Western blot
2.2.17. Kỹ thuật gây miễn dịch sản xuất kháng thể
Chơng 3. Kết quả
3.1. Hình thái tế bào và tính chất nuôi cấy
Bảng 3.1. Một số đặc tính nuôi cấy của 3 chủng Bacillus
Chủng
VK
Hình thái tế
bào
Kích thớc
(àm)
Hình thái
khuẩn lạc
Tính chất
nuôi cấy
Du
Trực khuẩn
Gram+, hai đầu
vuông, xếp
chuỗi dài
0.8-1 x 3.5-
4.5
dạng R, lồi ở
giữa, bám
chặt trên mặt
thạch
tạo váng
dày, môi
trờng
trong
NT
Trực khuẩn
Gram+, hai đầu
vuông, không
0.6-1 x 1.5
- 3.1
dạng R, lồi ở
giữa, bò lan
tạo váng
mỏng môi
trờng hơi
xếp thành chuỗi trong
ATCC
6633
Trực khuẩn
Gram+,
hai đầu vuông,
ít xếp thành
chuỗi
0.8-1 x 2.5
-3.2
dạng R,ở
giữa tâm có
nhiều tia
tạo váng
mỏng môi
trờng rất
trong
3.2. Tính chất sinh hóa:
Cả ba chủng vi khuẩn Du, NT và ATCC 6633 đều có tính di động và không
sinh hơi.
Bảng 3.2. Khả năng lên men đờng
Chủng Glu Sac Man Mal Mann Lac Rha Ara
Du + ++ + ++ + - - +
NT + ++ - ++ + - - -
ATCC6633 ++ ++ - - - - - -
3.3. Độ nhạy cảm với kháng sinh
Bảng 3.3: Độ nhạy cảm với kháng sinh
Đờng kính vòng vô khuẩn (mm)
Chủng
Tên kháng sinh
B. Du B. NT B.ATCC
6633
Netilmicin 35 29 25
Erythromycin 33 30 28
Vancomycin 27 24 26
Streptomycin 23 23 22
Tetracycline 34 34 34
Rifampicin 35 31 25
Cefaclor 39 34 40
Cephalexin 31 26 31
Amikacin 33 28 27
Bactrim 45 43 34
Cefepin 10 10 32
Azithromycin 30 26 23
Ampicillin - 26 28
Nitrofurantoin 31 44 28
Penicillin - 28 30
Gentamicin 32 31 27
Ciprofloxacin 36 36 31
Norfloxacin 31 33 29
3.4. Hoạt tính men: Cả ba chủng Du, , NT và ATCC 6633 đều có hoạt
tính men amylase, protease.
Bảng 3.4. Hoạt tính enzym protease của các chủng qua thời gian nuôi
cấy (t
o
= 37
o
C)
Độ pha loãng enzym
Thời
gian
nuôi
cấy
(giờ)
Số đơn vị enzym hoạt
động
1/10 1/100 1/1000 1/10.000
Du NT 6633
D
u
N
T
66
33
D
u
N
T
66
33
D
u
N
T
66
33
D
u
N
T
66
33
24 0 0 0 - - - - - - - - - - - -
48 10 0 0 + - - - - - - - - - - -
72 100 10 10 + + + + - - - - - - - -
96 1000 100 100 + + + + + + + - - - - -
120 100 0 10 + - + + - - - - - - - -
144 10 0 0 + - - - - - - - - - - -
(+): Lỏng hoàn toàn (-): Đông đặc
0
200
400
600
800
1000
1200
24 48 72 96 120 144
T
hời gian nuôi cấy(giờ)
Đơn vị enzym
Du
NT
6633
Hình 3.10. Thời gian nuôi cấy và hoạt tính enzym protease của các
chủng Bacillus
Bảng 3.5. Hoạt tính enzym amylase của các chủng qua thời gian nuôi
cấy ( t
o
=37
o
C)
Độ pha loãng enzym Thời
gian
nuôi
cấy
(giờ)
Số đơn vị
enzym hoạt
động
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64
D
u
N
T
6
6
3
3
D
u
N
T
6
6
3
3
D
u
N
T
6
6
3
3
D
u
N
T
6
6
3
3
D
u
N
T
6
6
3
3
D
u
N
T
6
6
3
3
D
u
N
T
6
6
3
3
24 8 4 8 + + + ++++-+ - - -
48 8 8 16 + + + ++++++ - - -
72 16 16 32 + + + +++++++++- - + - - -
96 32 32 16 + + + +++++++++++- - - -
120 4 4 4 + + + +++ - - -
144 2 2 2 + + + - - -
(+) : Mất màu hoàn toàn (-) : Không mất màu
0
5
10
15
20
25
30
35
24 48 72 96 120 144
Thời gian nuôi cấy (giờ)
Đơn vị enzym
Du
NT
6 6 3 3
Hình 3.11. Thời gian nuôi cấy và hoạt tính enzym amylase của các
chủng Bacillus
Bảng 3.6. Hoạt tính enzym protease trong Biosubtyl
Độ pha loãng enzym
Thời
gian
nuôi
cấy
(giờ)
Số đơn vị
enzym hoạt
động
1/10 1/100 1/1000 1/10000 1/100000 1/1000000
Du NT
D
u
N
T
D
u
N
T
D
u
N
T
D
u
NT Du NT Du NT
24 100 10 + + + + - - - - - - - -
48 1000 100 + + + + + - - - - - - -
Bảng 3.7. Hoạt tính enzym amylase trong Biosubtyl
Độ pha loãng enzym
Thời
gian
nuôi
cấy
(giờ)
Số đơn vị
enzym
hoạt động
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64
Du NT
D
u
N
T
D
u
N
T
D
u
NT Du NT Du NT Du NT
24 2 8 + + - + - + - - - - - -
48 4 16 + + + + - + - + - - - -
3.5. ảnh hởng của Oligo-alginat lên tốc độ nhân sinh khối của
Bacillus.
0
10
20
30
40
0 5 10 15 20 25 30
Thụứi gian nuoõi caỏy (giụ
ứ
)
SLVK x 10
9
/ ml
6900
4700
2900
ẹoỏi chửựng
Hình 3.18. Sự tạo thành sinh khối nuôi cấy chủng Du theo trọng lợng
phân tử oligo-alginat
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 5 10 15 20 25 30
Thụứi gian nuoõi caỏy (giụ
ứ
)
SLVK x 10
9
/ ml
6900
4700
2900
ẹoỏi chửựng
Hình 3.19. Sự tạo thành sinh khối nuôi cấy chủng NT theo trọng lợng
phân tử oligo-alginat
3.6. ảnh hởng của thời gian và nhiệt độ nuôi cấy đến sự hình thành
bào tử Bacillus trên môi trờng thạch dinh dỡng pH = 7,2.
Bảng 3.10. Sự tạo thành bào tử của chủng Du và chủng NT theo thời
gian và nhiệt độ nuôi cấy khác nhau trên môi trờng thạch dinh dỡng
pH = 7,2
TGNC
(giờ)
24 48 72 96
LTN
NĐNC
(
0
C)
Số lợng
bào tử x
10
8
/ ml hỗn
dịch
Số lợng
bào tử x
10
8
/ ml hỗn
dịch
Số lợng
bào tử x
10
8
/ ml hỗn
dịch
Số lợng
bào tử x
10
8
/ ml hỗn
dịch
Du NT Du NT Du NT Du NT
1
2
3
32
0
C
-
-
-
-
-
-
25
34
32
27
35
36
51
63
60
55
64
58
23
28
22
25
30
23
GTTB - - 30,3 32,6 58 59 24,3 26
1
2
3
37
0
C
-
-
-
-
-
-
-
-
-
10
15
18
24
28
30
58
62
67
27
31
35
46
44
38
GTTB - - - 14,3 27,3 62,3 31 42,6
3.7. ảnh hởng của thời gian và nhiệt độ nuôi cấy đến sự hình thành
bào tử Bacillus trên môi trờng thạch Edwards.
Bảng 3.11. Sự tạo thành bào tử của chủng Du và chủng NT theo thời
gian và nhiệt độ nuôi cấy trên môi trờng thạch Edwards.
TGNC
(giờ)
24 48 72 96
LTN
NĐNC
(
0
C)
Số lợng
bào tử x
10
8
/ ml hỗn
dịch
Số lợng
bào tử x 10
8
/
ml hỗn dịch
Số lợng
bào tử x 10
8
/
ml hỗn dịch
Số lợng
bào tử x
10
8
/ ml hỗn
dịch
Du NT Du NT Du NT Du NT
1 32
0
C 59 65 140 152 271 272 78 81
2
3
81
79
84
82
177
172
176
185
274
266
284
270
89
82
83
76
GTTB 73 77 163 171 270 275,3 83 80
1
2
3
37
0
C
64
55
58
57
68
62
125
96
91
132
110
87
33
31
35
74
62
41
14
17
11
22
15
14
GTTB 59 62,3 104 109,6 33 59 14 17
3.8. Khuếch đại, tạo dòng và xác định trình tự gen 16S ARN ribosome
của các chủng Du, NT và chủng chuẩn quốc tế ATCC6633
ADN tổng số đợc tách chiết từ vi khuẩn sau đó sử dụng 100 ng ADN làm
khuôn để khuếch đại gen 16S ARN ribosome bằng kỹ thuật PCR với cặp
mồi nh đã mô tả trong phần vật liệu và phơng pháp nghiên cứu. Kết quả
khuếch đại gen 16S ARN ribosome từ các mẫu ADN tách từ hai chủng sản
xuất Du, NT và một chủng chuẩn quốc tế ATCC6633 với cặp mồi 16Sp1,
16Sp2 đợc nêu ở hình 3.20.
Hình 3.20. Khuếch đại gen 16S ARN ribosome của các chủng Du,
NT và ATCC6633 bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi B16Sp1, B16Sp2.
Theo lý thuyết, sản phẩm PCR có độ dài 1544 cặp bazơ. M: Chỉ thị phân
tử (ADN
cắt bằng Hind III và EcoR I). 1: Sản phẩm PCR từ chủng Du;
2: Sản phẩm PCR từ chủng NT; 3: Sản phẩm PCR từ chủng ATCC6633.
Hình 3.21. Điện di gel agarose 1% để chọn lọc các plasmid có kích thớc
lớn hơn plasmid gốc (có khả năng là plasmid tái tổ hợp mang gen 16S
ARN ribosome của các chủng Du, NT và ATCC6633). K: Đối chứng
(plasmid gốc pCR2.1). 1-6: Plasmid tách từ các khuẩn lạc E. coli biến nạp
1 2 3 4 5 6 K 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
M 1 2 3
kb
21,2
5,1
2,00
1,37
sản phẩm gắn vector pCR2.1 + sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S
ribosome của chủng Du. 7-11: Plasmid tách từ các khuẩn lạc E. coli biến
nạp sản phẩm gắn vector pCR2.1 + sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S
ribosome của chủng NT. 12-16: Plasmid tách từ các khuẩn lạc E. coli biến
nạp sản phẩm gắn vector pCR2.1 + sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S
ribosome của chủng ATCC6633.
Hình 3.22. Điện di gel agarose 1% để kiểm tra sản phẩm cắt các plasmid
với EcoRI để chọn các plasmid tái tổ hợp có khả năng mang gen 16S ARN
ribosome của các chủng Du, NT và ATCC6633. Sản phẩm cắt đợc điện di
gel agarose 1%. M: Chỉ thị phân tử (ADN lamda cắt bằng EcoRI và
HindIII). 1, 8, 12: Sản phẩm PCR trớc khi gắn vào vector tách dòng. 2, 7,
11: Sản phẩm PCR sau khi xử lý với EcoRI. 3, 4: Plasmid tái tổ hợp mang
gen 16S ARN ribosome của chủng Du sau khi xử lý với EcoRI. 5, 6:
Plasmid tái tổ hợp mang gen 16S ARN ribosome của chủng NT sau khi xử
lý với EcoRI. 9, 10: Plasmid tái tổ hợp mang gen 16S ARN ribosome của
chủng ATCC sau khi xử lý với EcoRI.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
2,00-
1,37-
Kb
ID Du_16S ARN ribosome
SQ 1544 BP; 394 A; 349 C; 477 G; 324 T;
AGAGTTTGAT CATGGCTCAG GATGAACGCT GGCGGCCTGC CTAATACATG CAAGTCGAGC
GAATGGATTG AGAGCTTGCT CTCAAGAAGT TAGCGGCGGA CGGGTGAGTA ACACGTGGGT
AACCTGCCCA TAAGACTGGG ATAACTCCGG GAAACCGGGG CTAATACCGG ATAACATTTT
GAACTGCATG GTTCGAAATT GAAAGGCGGC TTCGGCTGTC ACTTATGGAT GGACCCGCGT
CGCATTAGCT AGTTGGTGAG GTAACGGCTC ACCAAGGCAA CGATGCGTAG CCGACCTGAG
AGGGTGATCG GCCACACTGG GACTGAGACA CGGCCCAGAC TCCTACGGGA GGCAGCAGTA
GGGAATCTTC CGCAATGGAC GAAAGTCTGA CGGAGCAACG CCGCGTGAGT GATGAAGGCT
TTCGGGTCGT AAAACTCTGT TGTTAGGGAA GAACAAGTGC TAGTTGAATA AGCTGGCACC
TTGACGGTAC CTAACCAGAA AGCCACGGCT AACTACGTGC CAGCAGCCGC GGTAATACGT
AGGTGGCAAG CGTTATCCGG AATTATTGGG CGTAAAGCGC GCGCAGGTGG TTTCTTAAGT
CTGATGTGAA AGCCCACGGC TCAACCGTGG AGGGTCATTG GAAACTGGGA GACTTGAGTG
CAGAAGAGGA AAGTGGAATT CCATGTGTAG CGGTGAAATG CGTAGAGATA TGGAGGAACA
CCAGTGGCGA AGGCGACTTT CTGGTCTGTA ACTGACACTG AGGCGCGAAA GCGTGGGGAG
CAAACAGGAT TAGATACCCT GGTAGTCCAC GCCGTAAACG ATGAGTGCTA AGTGTTAGAG
GGTTTCCGCC CTTTAGTGCT GAAGTTAACG CATTAAGCAC TCCGCCTGGG GAGTACGGCC
GCAAGGCTGA AACTCAAAGG AATTGACGGG GGCCCGCACA AGCGGTGGAG CATGTGGTTT
AATTCGAAGC AACGCGAAGA ACCTTACCAG GTCTTGACAT CCTCTGAAAA CCCTAGAGAT
AGGGCTTCTC CTTCGGGAGC AGAGTGACAG GTGGTGCATG GTTGTCGTCA GCTCGTGTCG
TGAGATGTTG GGTTAAGTCC CGCAACGAGC GCAACCCTTG ATCTTAGTTG CCATCATTAA
GTTGGGCACT CTAAGGTGAC TGCCGGTGAC AAACCGGAGG AAGGTGGGGA TGACGTCAAA
TCATCATGCC CCTTATGACC TGGGCTACAC ACGTGCTACA ATGGACGGTA CAAAGAGCTG
CAAGACCGCG AGGTGGAGCT AATCTCATAA AACCGTTCTC AGTTCGGATT GTAGGCTGCA
ACTCGCCTAC ATGAAGCTGG AATCGCTAGT AATCGCGGAT CAGCATGCCG CGGTGAATAC
GTTCCCGGGC CTTGTACACA CCGCCCGTCA CACCACGAGA GTTTGTAACA CCCGAAGTCG
GTGGGGTAAC CTTTTTGGAG CCAGCCGCCT AAGGTGGGAC AGATGATTGG GGTGAAGTCG
TAACAAGGTA GCCGTATCGG AAGGTGCGGG TGGATCACCT CCTT
/
/H×nh 3.23. Tr×nh tù gen 16S ARN ribosome cña chñng Du. Gen 16S
ARN ribosome cña chñng Du do chóng t«i gi¶i m∙ cã chiÒu dµi 1544
cÆp baz¬ (bp) víi 394 A, 349 C, 477 G vµ 324 T.
ID NT_16S ARN ribosome
SQ 1540 BP; 382 A; 361 C; 486 G; 311 T;
AGAGTTTGAT CATGGCTCAG GACGAACGCT GGCGGCCTGC CTAATACATG CAAGTCGAGC
GGACAGAAGG GAGCTTGCTC CCGGATGTTA GCGGCGGACG GGTGAGTAAC ACGTGGGTAA
CCTGCCTGTA AGACTGGGAT AACTCCGGGA AACCGGAGCT AATACCGGAT AGTTCCTTGA
ACCGCATGGT TCAAGGATGA AAGACGGTTT CGGCTGTCAC TTACAGATGG ACCCGCGGCG
CATTAGCTAG TTGGTGGGGT AATGGCTCAC CAAGGCGACG ATGCGTAGCC GACCTGAGAG
GGTGATCGGC CACACTGGGA CTGAGACACG GCCCAGACTC CTACGGGAGG CAGCAGTAGG
GAATCTTCCG CAATGGACGA AAGTCTGACG GAGCAACGCC GCGTGAGTGA TGAAGGTTTT
CGGATCGTAA AGCTCTGTTG TTAGGGAAGA ACAAGTGCGA GAGTAACTGC TCGCACCTTG
ACGGTACCTA ACCAGAAAGC CACGGCTAAC TACGTGCCAG CAGCCGCGGT AATACGTAGG
TGGCAAGCGT TGTCCGGAAT TATTGGGCGT AAAGGGCTTG CAGGCGGTTT CTTAAGTCTG
ATGTGAAAGC CCCCGGCTCA ACCGGGGAGG GTCATTGGAA ACTGGGAAAC TTGAGTGCAG
AAGAGGAGAG TGGAATTCCA CGTGTAGCGG TGAAATGCGT AGAGATGTGG AGGAACACCA
GTGGCGAAGG CGACTCTCTG GTCTGTAACT GACGCTGAGG AGCGAAAGCG TGGGGAGCGA
ACAGGATTAG ATACCCTGGT AGTCCACGCC GTAAACGATG AGTGCTAAGT GTTAGGGGGT
TTCCGCCCCT TAGTGCTGCA GCTAACGCAT TAAGCACTCC GCCTGGGGAG TACGGTCGCA
AGACTGAAAC TCAAAGGAAT TGACGGGGGC CCGCACAAGC GGTGGAGCAT GTGGTTTAAT
TCGAAGCAAC GCGAAGAACC TTACCAGGTC TTGACATCCT CTGACAACCC TAGAGATAGG
GCTTTCCCTT CGGGGACAGA GTGACAGGTG GTGCATGGTT GTCGTCAGCT CGTGTCGTGA
GATGTTGGGT TAAGTCCCGC AACGAGCGCA ACCCTTGATC TTAGTTGCCA GCATTCAGTT
GGGCACTCTA AGGTGACTGC CGGTGACAAA CCGGAGGAAG GTGGGGATGA CGTCAAATCA
TCATGCCCCT TATGACCTGG GCTACACACG TGCTACAATG GACAGAACAA AGGGCTGCAA
GACCGCAAGG TTTAGCCAAT CCATAAATCT GTTCTCAGTT CGGATCGCAG TCTGCAACTC
GACTGCGTGA AGCTGGAATC GCTAGTAATC GCGGATCAGC ATGCCGCGGT GAATACGTTC
CCGGGCCTTG TACACACCGC CCGTCACACC ACGAGAGTTT GCAACACCCG AAGTCGGTGA
GGTAACCTTT ATGGAGCCAG CCGCCGAAGG TGGGGCAGAT GATTGGGGTG AAGTCGTAAC
AAGGTAGCCG TATCGGAAGG TGCGGCTGGA TCACCTCCTT
Hình 3.24. Trình tự gen 16S ARN ribosome của chủng NT. Gen 16S
ARN ribosome của chủng NT do chúng tôi giải m có chiều dài 1540
cặp bazơ (bp) với 382 A, 361 C, 486 G và 311 T.
ID ATCC6633 16S ARN ribosome .
SQ 1542 BP; 383 A; 362 C; 488 G; 309 T;
AGAGTTTGAT CATGGCTCAG GACGAACGCT GGCGGCGTGC CTAATACATG CAAGTCGAGC
GGACAGATGG GAGCTTGCTC CCTGATGTTA GCGGCGGACG GGTGAGTAAC ACGTGGGTAA
CCTGCCTGTA AGACTGGGAT AACTCCGGGA AACCGGGGCT AATACCGGAT GGTTGTTTGA
ACCGCATGGT TCAAACATAA AAGGTGGCTT CGGCTACCAC TTACAGATGG ACCCGCGGCG
CATTAGCTAG TTGGTGAGGT AACGGCTCAC CAAGGCGACG ATGCGTAGCC GACCTGAGAG
GGTGATCGGC CACACTGGGA CTGAGACACG GCCCAGACTC CTACGGGAGG CAGCAGTAGG
GAATCTTCCG CAATGGACGA AAGTCTGACG GAGCAACGCC GCGTGAGTGA TGAAGGTTTT
CGGATCGTAA AGCTCTGTTG TTAGGGAAGA ACAAGTACCG TTCGAATAGG GCGGTACCTT
GACGGTACCT AACCAGAAAG CCACGGCTAA CTACGTGCCA GCAGCCGCGG TAATACGTAG
GTGGCAAGCG TTGTCCGGAA TTATTGGGCG TAAAGGGCTC GCAGGCGGTT TCTTAAGTCT
GATGTGAAAG CCCCCGGCTC AACCGGGGAG GGTCATTGGA AACTGGGGAA CTTGAGTGCA
GAAGAGGAGA GTGGAATTCC ACGTGTAGCG GTGAAATGCG TAGAGATGTG GAGGAACACC
AGTGGCGAAG GCGACTCTCT GGTCTGTAAC TGACGCTGAG GAGCGAAAGC GTGGGGAGCG
AACAGGATTA GATACCCTGG TAGTCCACGC CGTAAACGAT GAGTGCTAAG TGTTAGGGGG
TTTCCGCCCC TTAGTGCTGC AGCTAACGCA TTAAGCACTC CGCCTGGGGA GTACGGTCGC
AAGACTGAAA CTCAAAGGAA TTGACGGGGG CCCGCACAAG CGGTGGAGCA TGTGGTTTAA
TTCGAAGCAA CGCGAAGAAC CTTACCAGGT CTTGACATCC TCTGACAATC CTAGAGATAG
GACGTCCCCT TCGGGGGCAG AGTGACAGGT GGTGCATGGT TGTCGTCAGC TCGTGTCGTG
AGATGTTGGG TTAAGTCCCG CAACGAGCGC AACCCTTGAT CTTAGTTGCC AGCATTCAGT
TGGGCACTCT AAGGTGACTG CCGGTGACAA ACCGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAATC
ATCATGCCCC TTATGACCTG GGCTACACAC GTGCTACAAT GGACAGAACA AAGGGCAGCG
AAACCGCGAG GTTAAGCCAA TCCCACAAAT CTGTTCTCAG TTCGGATCGC AGTCTGCAAC
TCGACTGCGT GAAGCTGGAA TCGCTAGTAA TCGCGGATCA GCATGCCGCG GTGAATACGT
TCCCGGGCCT TGTACACACC GCCCGTCACA CCACGAGAGT TTGTAACACC CGAAGTCGGT
GAGGTAACCT TTTAGGAGCC AGCCGCCGAA GGTGGGACAG ATGATTGGGG TGAAGTCGTA
ACAAGGTAGC CGTATCGGAA GGTGCGGCTG GATCACCTCC TT
Hình 3.25. Trình tự gen 16S ARN ribosome của chủng ATCC6633. Gen
16S ARN ribosome của chủng ATCC6633 do chúng tôi giải m có chiều
dài 1542 cặp bazơ (bp) với 383 A, 362 C, 488 G và 309 T.
Một số thông tin về các trình tự gen 16S ARN ribosome của các chủng Du,
NT, và ATCC6633 đã giải đợc nêu ở bảng 3.12.
Bảng 3.12.
Chủng
Độ dài
Số A Số C Số G Số T
Tỷ lệ
gen G+C
Du 1544 394 349 477 324 53,5%
NT 1540 382 361 486 311 55,0%
ATCC6633 1542 383 362 488 309 55.0%
Hình 3.26. Kết quả so sánh trình tự nucleotide hai gen 16S ARN
ribosome của hai chủng Du và ATCC6633. Độ tơng đồng đạt 94,03%.
Hình 3.27. Kết quả so sánh trình tự nucleotide hai gen 16S ARN
ribosome của hai chủng NT và ATCC6633. Độ tơng đồng đạt 97,01%.
Hình 3.28. Kết quả so sánh trình tự nucleotide hai gen 16S ARN
ribosome của hai chủng NT và chủng Bacillus pumilus 8N-4 (số đăng ký
AY548949). Độ tơng đồng đạt 99,81%.
Nh vậy kết quả chúng tôi nhận đợc hoàn toàn phù hợp với kết quả
của Green và cs (1999). Tuy nhiên, khi so sánh trình tự nucleotide hai gen
16S ribosome của hai chủng Du và chủng Bacillus pumilus 8N-4 thì kết
quả nhận đợc lại rất khác biệt:
Hình 3.29. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen 16S ARN
ribosome của hai chủng Du và Bacillus pumilus 8N-4 (số đăng ký
AY548949).
Độ tơng đồng đạt 93,91%.
Bảng 3.13. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen 16S ribosome của chủng Du
và các chủng công bố trong Ngân hàng Gen quốc tế bằng phần mềm Fasta3 [118]
Alignment DB:ID Source Length Identity% Ungapped% Overlap E()
1
EM_PRO:AE016998 AE016998.1 Bacillus cereus ATC 307343 99.611% 99.611% 1544 2e-196
2
EM_PRO:AE016998
AE016998.1 Bacillus cereus
ATC
307343 99.547% 99.547% 1544
3.4e-
196
3
EM_PRO:AE016998
AE016998.1 Bacillus cereus
ATC
307343 99.547% 99.547% 1544
3.5e-
196
4
EM_PRO:AE017013
AE017013.1 Bacillus cereus
ATC
300975 99.547% 99.547% 1544
3.7e-
196
5
EM_PRO:AE016999
AE016999.1 Bacillus cereus
ATC
301056 99.482% 99.482% 1544
5.9e-
196
6
EM_PRO:AE017025 AE017025.1 Bacillus anthracis 290714 99.482% 99.482% 1544
5.9e-
196
7
EM_PRO:AE017000
AE017000.1 Bacillus cereus
ATC
301289 99.482% 99.482% 1544
5.9e-
196
8
EM_PRO:AE017334 AE017334.1 Bacillus anthracis 5228310 99.482% 99.482% 1544
5.9e-
196
9
EM_PRO:AE017334 AE017334.1 Bacillus anthracis 5228310 99.352% 99.352% 1544
8.4e-
196
10
EM_PRO:AY224384
AY224384.1 Bacillus cereus str
19424 99.547% 99.547% 1544
9.4e-
196
11
EM_PRO:AE017024 AE017024.1 Bacillus anthracis 290029 99.417% 99.417% 1544 1e-195
12
EM_PRO:AE017334 AE017334.1 Bacillus anthracis 5228310 99.417% 99.417% 1544 1e-195
13
EM_PRO:AE017265
AE017265.1 Bacillus cereus
ATC
287860 99.417% 99.417% 1544 1e-195
14
EM_PRO:AE017334 AE017334.1 Bacillus anthracis 5228310 99.417% 99.417% 1544 1e-195
15
EM_PRO:AE017024 AE017024.1 Bacillus anthracis 290029 99.417% 99.417% 1544 1e-195
16
EM_PRO:AY224380
AY224380.1 Bacillus cereus str
6985 99.611% 99.611% 1544
1.2e-
195
17
EM_PRO:AY224385
AY224385.1 Bacillus cereus str
13885 99.547% 99.547% 1544
1.2e-
195
18
EM_PRO:AE017024 AE017024.1 Bacillus anthracis 290029 99.417% 99.417% 1544
1.2e-
195
19
EM_PRO:AY224381
AY224381.1 Bacillus cereus str
12485 99.547% 99.547% 1544
1.3e-
195
20
EM_PRO:AY138271
AY138271.1 Bacillus cereus str
1554 99.676% 99.676% 1544
1.4e-
195
21
EM_PRO:AY224388
AY224388.1 Bacillus cereus str
8785 99.547% 99.547% 1544
1.7e-
195
22
EM_PRO:AE017264
AE017264.1 Bacillus cereus
ATC
287945 99.352% 99.352% 1544
1.7e-
195
23
EM_PRO:AE017334 AE017334.1 Bacillus anthracis 5228310 99.352% 99.352% 1544
1.7e-
195
24
EM_PRO:AE017026 AE017026.1 Bacillus anthracis 290214 99.352% 99.352% 1544
1.7e-
195
25
EM_PRO:AY224382
AY224382.1 Bacillus cereus str
7685 99.547% 99.547% 1544
1.9e-
195
26
EM_PRO:AY224379
AY224379.1 Bacillus cereus str
6985 99.547% 99.547% 1544 2e-195
27
EM_PRO:AY138270
AY138270.1 Bacillus cereus str
1554 99.547% 99.547% 1544 2e-195
28
EM_PRO:AE017039 AE017039.1 Bacillus anthracis 291804 99.352% 99.352% 1544
2.1e-
195
29
EM_PRO:AY224387
AY224387.1 Bacillus cereus str
8685 99.482% 99.482% 1544
2.9e-
195
30
EM_PRO:AY224383
AY224383.1 Bacillus cereus str
8275 99.482% 99.482% 1544 3e-195
31
EM_PRO:AY224386
AY224386.1 Bacillus cereus str
8185 99.482% 99.482% 1544
3.1e-
195
32
EM_PRO:AE017264
AE017264.1 Bacillus cereus
ATC
287945 99.352% 99.417% 1544
4.1e-
195
33
EM_PRO:AE017280
AE017280.1 Bacillus cereus
ATC
287248 99.352% 99.417% 1544
4.1e-
195
34
EM_PRO:AY138287
AY138287.1 Bacillus thuringien
1554 99.547% 99.547% 1544
4.1e-
195
35
EM_PRO:AY138284
AY138284.1 Bacillus thuringien
1554 99.547% 99.547% 1544
4.1e-
195
36
EM_PRO:AY138272
AY138272.1 Bacillus cereus str
1554 99.547% 99.547% 1544
4.1e-
195
37
EM_PRO:AY138282
AY138282.1 Bacillus thuringien
1554 99.547% 99.547% 1544
4.1e-
195
38
EM_PRO:AY138288
AY138288.1 Bacillus thuringien
1554 99.547% 99.547% 1544
4.1e-
195
39
EM_PRO:AY138290
AY138290.1 Bacillus thuringien
1554 99.547% 99.547% 1544
4.1e-
195
40
EM_PRO:AY138285
AY138285.1 Bacillus thuringien
1554 99.547% 99.547% 1544
4.1e-
195
41
EM_PRO:AY138273
AY138273.1 Bacillus cereus str
1554 99.547% 99.547% 1544
4.1e-
195
42
EM_PRO:AY138283
AY138283.1 Bacillus thuringien
1554 99.547% 99.547% 1544
4.1e-
195
43
EM_PRO:AY138286
AY138286.1 Bacillus thuringien
1554 99.547% 99.547% 1544
4.1e-
195
44
EM_PRO:AY138289
AY138289.1 Bacillus thuringien
1554 99.547% 99.547% 1544
4.1e-
195
