VI KHUẨN CLOSTRIDIUM BOTULINUM TRONG đồ hộp
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (538.25 KB, 19 trang )
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
BÁO CÁO
VI KHUẨN CLOSTRIDIUM BOTULINUM
TRONG ĐỒ HỘP
GVGD: Ths Nguyễn Thị Thanh Hải
Danh sách nhóm:
Dương Thị Tuyết Sang
56130245
Đồng Thị Phượng
56136675
Hồ Thúy Sinh
56131970
Trần Minh Thảo
56131861
Huỳnh Chiếm Trọng
56132470
1
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU......................................................................................................................................................3
I.TỔNG QUAN VỀ CLOSTRIDIUM BOTULINUM:........................................................................................4
1. Giới thiệu:...........................................................................................................................................4
2. Cấu trúc:.............................................................................................................................................5
a. Cấu trúc tế bào:..............................................................................................................................5
b. Cấu trúc phân tử:...........................................................................................................................5
II. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CLOSTRIDIUM BOTALINUM:....................................................................6
1/ Phương pháp truyền thống...............................................................................................................6
1.1/ Thiết bị và vật liệu.......................................................................................................................6
1.2/ Môi trường, dụng cụ, hóa chất..................................................................................................6
1.3/ Quy trình phân tích.....................................................................................................................7
1.4/ Sơ đồ phân tích.........................................................................................................................10
1.5/ Kiểm tra độc tố của C.botulinum.............................................................................................10
2/ Phương pháp sử dụng môi trường Trypticase Peptone Glucose Yeast Extract với Trypin (TPGYT)
..............................................................................................................................................................11
2.1/ Chuẩn bị mẫu............................................................................................................................11
2.2/ Phát hiện tế bào vi khuẩn:.......................................................................................................11
2.3/ Phát hiện độc tố botulin...........................................................................................................13
III. CLOSTRIDIUM BUTALINUM TRONG ĐỒ HỘP:..................................................................14
1.
Các triệu chứng và dấu hiệu:.......................................................................................................15
2.
Cơ chế hoạt động của độc tố Butalinum:....................................................................................15
3.
Tiệt trùng đồ hộp:.........................................................................................................................16
KẾT LUẬN.............................................................................................................................................17
MỞ ĐẦU
Thực phẩm đóng hộp có trên thị trường và ngày càng được
nhiều người sử dụng. Là một trong những thực phẩm thường được dự
trữ. Nếu khi mua và sử dụng đồ hộp không cẩn thận, con người có
thề bị ngộ độc do ăn phải mầm bệnh phát triển trong loại thực phẩm
này. Ngộ độc thường được ghi nhận là do bị nhiễm độc tố vi khuẩn
Clostridium Botulinum có trong đồ hộp, còn gọi là ngộ độc Botulism,
2
có thể gây tử vong, gây phá hủy hệ thần kinh. Bệnh ngộ độc
Botulism là bệnh nhiễm độc do độc tố xâm nhập vào thực phẩm,
phát triển và sinh ra độc tố. Người ăn phải thức ăn có độc tố sẽ bị
nhiễm độc. Còn vi khuẩn thường không gây ra bệnh vì nó không sinh
sản được trong cơ thể người.
Vi khuẩn Clostridium Botulinum lần đầu tiên được công nhận và
cô lập năm 1896 bởi Emile van Ermengem từ nơi chế biến thịt đùi
lợn dính líu vào một ổ dịch Botulism. Các cô lập ban đầu được dặt
tên là Botulinus baciluss. Tuy nhiên, cô lập từ các ổ dịch tiếp theo
luôn luôn tìm thấy là những dạng bào tử kỵ khí, do đó, Bengston đề
xuất sinh vật được đặt vào chi Clostridium.
C. botulinum phân bố khắp nơi trong đất. Đặc biệt những nơi
như đất vườn, nghĩa trang, nơi chăn nuôi gia súc, gia cầm. Trong các
loại rau quả, kể cả mật ong cũng có thể chứa loại khuẩn này. Chúng
cũng có trong ruột của các động vật nuôi trong nhà, ruột cá, đôi khi
có cả trong ruột người. Do vi khuẩn này có nhiều trong tự nhiên nên
rất dễ nhiễm vào thực phẩm trong quá trình sản xuất, chế biến, vận
chuyển và bảo quản.
Vì vậy, để việc sử dụng đồ hộp cũng như các loại thực phẩm
khác một cách an toàn, nhóm sẽ tìm hiểu về vi khuẩn C. Botulinum
và việc hình thành độc tố botulin trong đồ hộp của vi khẩn này.
3
I.TỔNG QUAN VỀ CLOSTRIDIUM BOTULINUM:
1. Giới thiệu:
Vực (domain): Bacteria
Ngành (phylum): Firmicutes
Lớp (class):
Clostridia
Bộ (ordo):
Clostridiales
Họ (familia):
Clostridiaceae
Chi (genus):
Clostridium
Loài(species): C.Botulinum
Clostridium botulinum là vi khuẩn Gram dương, hình que, kị khí
tuyệt đối (phát triển trong môi trường không có oxy), hầu hết không
di chuyển. Dưới ảnh hưởng của nhiệt độ cao và các yếu tố môi
trường bất lợi, vi khuẩn chuyển thành các bào tử hình oval rất bền
vững. Vi khuẩn phát triển thuận lợi ở 3-43°C. Ở nhiệt độ thích hợp,
không có oxy, ẩm ướt và pH acid yếu ( pH> 4,6), bào tử biến đổi lại
thành vi khuẩn và phát triển, tiết ra độc tố botulin.
C. botulinum có khả năng sinh nhiều loại độc tố nhưng quan
trọng nhất là độc tố thần kinh. Có 7 loại độc tố thần kinh kí hiệu từ A
đến G, trong đó những độc tố loại A, B, E, F gây bệnh ở người còn
những độc tố loại C, D chỉ gây bệnh trên động vật. Bản thân vi
khuẩn và bào tử không gây ra bệnh mà bệnh là do độc tố của nó
sinh ra, gây liệt thần kinh.
Sự tăng trưởng của vi khuẩn có thể được ngăn chặn bởi acid cao,
tỷ lệ của đường hòa tan cao, nồng độ oxy cao, độ ẩm thấp hoặc lưu
trữ dưới nhiệ độ 38 o F.
C. botulinum có thể được chia thành 4 nhóm khác nhau dựa trên
đặc điểm sinh hóa và sinh lí:
*Nhóm C.botulinum I bao gồm:
- Chủng độc tố loại A
-Những biến dạng thủy phân protein của độc tố loại B và F.
-Những kiểu độc tố kép AB, AF, BF.
Đặc điểm chính: những thanh hơi cong với long roi có thanh
nhung rải rác, sản xuất bào tử với khả năng chịu nhiệt cao, độ pH tối
thiểu có thể ức chế hoạt động của vi khuẩn này trong nước là 0,944
4,6. Các chủng thuộc nhóm I không gây ảnh hưởng đến thần kinh và
vì vậy ít được chú ý hơn trong vấn đề bảo quản lạnh. . Tuy nhiên bào
tử bền nhiệt có thể dẫn đến các vấn đề trong việc xử lý các thực
phẩm cần qua gia nhiệt do các bào tử này quá bền vững và an toàn
đối với vi khuẩn.
*Nhóm C.botulinum II bao gồm:
- Chủng độc tố loại E.
-Những biến dạng không thủy phân protein nhưng phân giải
đường của độc tố loại B và F
Đặc điểm: bao gồm những thanh thẳng với long roi có lông
nhung rải rác, pH tối thiểu để ức chế hoạt động của vi khuẩn trong
nước là 0,97-5. Là nguy cơ tiềm ẩn trong các thực phẩm đông lạnh.
Chúng không phân giải các protein tự nhiên, có thể sinh trưởng và
tạo độc tố ở nhiệt độ 3 độ C và tạo bào tử có mức kháng nhiệt thấp.
Các chủng này có khả năng chống chịu với tác động ức chế của
muối khá tốt. Khả năng tăng trưởng và tạo độc tố ở giới hạn nhiệt độ
thấp của các chủng II không cao, và sẽ tiếp tục giảm nếu có thêm
những yếu tố bất lợi ảnh hưởng đến tăng trưởng
*Nhóm C.botulinum loại III bao gồm:
-Những độc tố loại C và D
-Những biến dạng nói chung là không có thủy phân protein.
Đặc điểm: thanh thẳng với lông roi có lông nhung rải rác, sản
xuất bào tử với khả năng chịu nhiệt trung gian. Thường gây bệnh ở
động vật và chim
* Nhóm V loại IV bao gồm:
- Thủy phân protein của chủng độc tố loại G.
Đặc điểm: tương tự nhóm III, vai trò của chúng trong ngộ độc
thực phẩm vẫn chưa được hiểu rõ. Các chủng thuộc nhóm này và
một số loài clostridia không tạo độc tố đã được gộp chung và tạo
nên một loài mới là Clostridium argentinens.
5
2. Cấu trúc:
a. Cấu trúc tế bào:
Trên tiêu bản nhuộm gram, vi
khuẩn bắt màu Gram dương, có hình
dạng thẳng hoặc hơi cong, kích thước
chiều rộng 0,3-0,7 µm, chiều dài 3,57,0 µm. Sinh bào tử, bào tử thường to
hơn chiều ngang của tế bào.
b. Cấu trúc phân tử:
Bộ gen của Clostridium botulinum là 3.886.916 bp,trong đó G +
khoảng 28,2 % ,ngoài ra còn có một plasmid 16,334 bp.
Toxin được tổng hợp từ một chuỗi polypeptid có trọng lượng
phân tử gần 150.000 dalton. Ở cấu trúc này phân tử độc tố có hoạt
lực tương đối thấy, nhưng khi bị một số enzym của vi khuẩn và
trypsin tách ra thành hai chuỗi nặng (100.000 dalton) và nhẹ
(50.000 dalton) nối với nhau bằng cầu nối sunfur có gắn một phân tử
Zn.
II. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CLOSTRIDIUM BOTALINUM:
1/ Phương pháp truyền thống
1.1/ Thiết bị và vật liệu
- Tủ lạnh
-
Giấy thấm khô
-
Đèn cồn
-
Dụng cụ vô trùng
-
Cối và chày vô trùng
-
Pipet có nút và bông gòn vô khuẩn
-
Ống nghiệm vô trùng
-
Que cấy
-
Tủ ấm, 35± 1°C và 26± 1°C
-
Bình vô khuẩn bảo quản mẫu dự trữ
-
Giá đựng ống nghiệm
6
-
Kính hiển vi
-
Đĩa petri vô trùng 15100 mm
-
Ống ly tâm
-
Máy li tâm lạnh tốc độ cao
-
Ống tiêm vô trùng 1 hoặc 3 ml với kích cỡ 25cm, 1cm, 6cm để
tiêm vào chuột
-
Chuột (khoảng 12-20g)
1.2/ Môi trường, dụng cụ, hóa chất
- Pepton đệm bufer pepton water (BPW)
-
Iron suphide Agar (ISA)
-
Perfringns selective Agar (shahidi ferguson ferfringns, SPF)
-
Môi trường dịch thể TPGY hay với trypsin (TPGYT)
-
Môi trường dịch thể gan băm hay môi trường thịt chín (hoặc
nước luộc thịt)
-
Môi trường thạch- lòng đỏ trứng-gan- thịt bê hay thạch- lòng
đỏ trứng yếm khí
-
Dung dịch cồn- odine (iodine 4% cồn 70%)
-
Dung đệm phosphate vô trùng, pH=6,2
-
Dung dịch nước muối vô trùng
-
Dung dịch NAOH 1N
-
Dung dịch HCl 1N
-
Dung dịch trypsin (difco, 1:250)
-
Thuốc nhuộm Gram, tím kết tinh hay xanh methylene
1.3/ Quy trình phân tích
a. Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích
-
Mẫu được giải đông ở nhiệt độ không quá 45°C và được
phân tích ngay sau khi giải đông
-
Cân 25g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225ml dung
dịch đệm phosphat và đồng nhất mẫu
-
Pha loãng nồng độ theo dãy thập phân (10 -1, 10-2, 10-3,…).
7
Mẫu được xử lý ở nhiệt độ 70-80°C trong 20 phút để diệt
bớt tế bào sinh dưỡng của cơ thể vi sinh vật khác
-
b. Tiến hành cấy
-
Cấy vào đĩa petri đã vô trùng 1ml dịch mẫu đã được pha
loãng
-
Tiếp tục cho vào 20-25ml môi trường ISA đã được ủ ẩm ở
45°C vào đĩa, lắc đều
-
Đĩa đã được cấy mẫu đem ủ ở 37°C trong 24-48h trong các
bình kị khí
c. Thu thập kết quả
-
Quan sát, ghi nhận khuẩn lạc nghi ngờ (khuẩn lạc có tần
số xuất hiện nhiều nhất) tiến hành quan sát tế bào dưới
kính hiển vi và test sinh hóa, đếm tổng số khuẩn lạc.
C1. Test sinh hóa
Tính chất của các chủng:
- tính chất sinh hóa: lên men các loại đường và sinh khí
Nhóm
Dạng độc tố
I
A,B,
F
Làm tan Gelatin
Lên men Glucose
Lên men Fructose
Lên men Mannose
Lên men Maltose
II
B,E,
F
+
+
±
±
IV
G
+
+
±
+
±
+
-
D
+
+
+
+
+
8
III
C,
Lên men
Succarose
Lên men
Trehalose
Lên men Lactose
Lipase
Lecithinase
Sinh H2S
-
+
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
- hình thể: trực khuẩn 2 đầu tròn, nhiều lông quang thân, không
sinh vỏ.
- Nha bào: bầu dục nằm gần đầu vi khuẩn
- Nuôi cấy: kị khí tuyệt đối, môi trường 35-37°C, pH trong khoảng
6-7
- Môi trường đặc nuôi cấy: khuẩn lạc nhỏ, chắc, hình đậu, hình sợi
- Môi trường lỏng nuôi cấy: đục đều môi trường cặn ở đáy
- Môi trường thạch máu nuôi cấy: có vòng tan máu
C2. Quan sát tế bào
Lấy tế bào:
-
Cho 1 giọt nước lên tâm lam kính, sau đó dùng que cấy lấy
khuẩn lạc trong đĩa petri bôi lên chổ giọt nước và dàn đều
có đường kính 2cm
-
Cố định tế bào: hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn (chú ý
không để nóng quá và hơ mặt dưới lam kính tránh để tế
bào tiếp xúc trực tiếp ngọn lửa vì có thể chết tế bào cần
quan sát), để diệt bớt hoặc ức chế một số tế bào.
Tiến hành nhuộm:
-
Nhỏ dung dịch thuốc nhuộm tím Violet lên tế bào, khoảng
15s đi rửa bằng nước cất (chú ý rửa nước cho trôi theo một
chiều đồng thời không dội trực tiếp lên chỗ tế bào) đến khi
nước rửa không còn màu tím thì dừng lại.
-
Để khô tự nhiên hoặc có thể hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn
-
Tiếp tục cho Liugon vào tế bào vi khuẩn, tương tự sau 15s
đem rửa và làm khô (mục đích để cho tế bào bắt màu tím
bền hơn).
9
-
Sau đó nhỏ cồn 90° vào, dùng để tẩy màu vì cồn có thể
thấm vào trong tế bào khi đó một số tế bào có màu tím và
một số không có màu tím, tương tự cũng tiến hành rửa và
làm khô.
-
Cuối cùng nhuộm đỏ Fuchin, mục đích phân biệt vi khẩn G +
(có màu tím) và vi khuẩn G-(có màu đỏ).
Tiến hành quan sát dưới kính hiển vi:
-
Tế bào Clotridium có hình que dạng vùi trống, bắt màu tím
ở một đầu.
-
Quan sát kĩ hơn về hình thái, xem có tế bào đang ở giai
đoạn sinh sản không.
1.4/ Sơ đồ phân tích
Đồng nhất và pha loãng mẫu theo dãy thập phân
(10-1,10-2,10-3,..) rồi tiến hành xử lý mẫu ở 80°C
Cấy 1ml mẫu vào đĩa petri, đổ 10-15ml môi trường
ISA ở 45°C
10 lắc đều
Ủ trong bình kín ở 37°C trong 24-48h
Đổ lớp ISA thứ 2 khi lớp thứ nhất đã đông đặc
Đếm tất cả các khuẩn lạc màu đen có đường kính
>0.5 mm
Tính kết quả
Công thức tính:
Trong đó:
A: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên đĩa
V: Thể cấy vào mỗi đĩa
d: nồng độ pha loãng tương ứng
1.5/ Kiểm tra độc tố của C.botulinum
a) Thí nghiệm trên chuột
- Chuẩn bị thức ăn cho chuột và tẩm ướt dịch khuẩn
- Tiến hành quan sát, nếu chuột không có triệu chứng gì thì
khẳng định ngay chuột có khả năng kháng botulin, hay nói cách
khác C.botulinum không gây độc hại đến sức khỏe, còn nếu có
những triệu chứng như lông xù lên, thở mạnh từng hồi, liệt và yếu
dần rồi chết thì ta tiến hành kiểm tra xem chuột chết phải do độc tố
botulin không.
b) Tiến hành kiểm tra
11
- Chuẩn bị mẫu: lấy dịch ruột của con chuột chết để tiến hành
kiểm tra.
- Tiến hành thực hiện như mục 1.3.
* Nếu kết quả quan sát được giống với khuẩn lạc C.botulinum thì
khẳng định chuột chết là do độc tố botulin
* Nếu kết quả không giống thì có thể chuột chết là do nguyên
nhân khác.
Khuẩn lạc C.botulinum 48 tiếng. Xuất hiện kết tủa bao quanh khuẩn lạc
2/ Phương pháp sử dụng môi trường Trypticase Peptone Glucose
Yeast Extract với Trypin (TPGYT)
2.1/ Chuẩn bị mẫu
Mẫu là thực phẩm đóng hộp còn nguyên có đánh số thứ tự mẫu.
Đối với thực phẩm rắn và lỏng, cho vào cối vô trùng, thêm một
lượng dung dịch đệm phosphate rồi nghiền bằng chày vô trùng. Hay
có thể gắp từng mẫu nhỏ thực phẩm cho vào môi trường tăng sinh
nhờ cặp ghép vô trùng. Cấy trực tiếp thực phẩm mẫu lỏng vào môi
trường nuôi cấy bằng pipet. Chuẩn bị các mẫu dự trữ, sau khi nuôi
cấy, chuyển từng phần mẫu dự trữ vào bình đựng mẫu dự trữ và
bình đựng mẫu vô trùng để sử dụng các test khi cần thiết.
2.2/ Phát hiện tế bào vi khuẩn:
* Tăng sinh:
- Chuẩn bị 4 ống nghiệm vô trùng (có nút bông), cho vào mỗi
ống 1 ống Durham
12
- Loại bỏ oxi trong môi trường tăng sinh bằng hơi nước trong 1015 phút và làm lạnh nhanh
- Cấy vào hai ống nghiệm chứa môi trường thịt chín 1-2 gam
thực phẩm rắn hay 1-2ml thực phẩm lỏng (cho 15ml môi trường tăng
sinh). Ủ ở 35°C.
- Cho vào hai ống nghiệm môi trường TPGYT thay thế được vi
khuẩn nghi ngờ là chủng không phân hủy protein chứa các kháng
nguyên B, E hay F.
- Lưu ý: Phải cho mẫu thực phẩm chìm vào bên dưới bề mặt môi
trường. Sau 5 ngày ủ, kiểm tra canh trường vi khuẩn, kiểm tra độ
đục của môi trường, sự tạo khí, hay sự phân hủy cơ chất của thịt.
Lưu ý mùi tạo thành, kiểm tra canh trường vi khuẩn dưới kính hiển vi
bằng cách chuẩn bị và quan sát vết bôi dịch vi khuẩn nhuộm Gram
(hay giọt ép dưới kính hiển vi đối pha có độ phân giải cao, hay
nhuộm đơn với tím kết tinh hay xanh methylene dưới kính hiển vi
nền sáng). Kiểm tra hình thái vi khuẩn và lưu ý tế bào điển hình của
C.botulinum số lượng tìm thấy, mức độ bào tử hóa và vị trí của bào
tử trong tế bào. Cũng thời điểm này, kiểm tra vi khuẩn về khả năng
tạo toxin, thông thường toxin được tạo ra với nồng độ lớn nhất sau 7
ngày ủ, ủ thêm 10 ngày nữa để phát hiện ra bào tử tổn thương do
chậm phát triển thành tế bào dinh dưỡng trước khi hấp nước ở áp
suất cao để loại bỏ môi trường này. Để phân lập giống thuần, bảo
quản canh trường tại thời điểm tạo nhiều bào tử nhất ở 4°C.
* Phân lập giống thuần
- Có thể phân lập nhanh các vi khuẩn C.botulunum từ hệ vi sinh
vật hỗn hợp trong môi trường tăng sinh hay mẫu thực phẩm ban đầu
nếu quá trình bào tử xảy ra tốt.
- Tiền xử lý mẫu để cấy ria: thêm vào ống nghiệm vô trùng có
nút bông chứa 1-2ml canh trường vi khuẩn một thể tích tương ứng
cồn tuyệt đối đã được lọc vô trùng, lắc đều và ủ nhiệt trong phòng
trong 1 giờ. Để phân lập vi khuẩn, lấy 1-2ml mẫu đã dự trữ cho vào
ống nghiệm có nút bông, thêm một thể tích tương ứng cồn tuyệt đối
đã lọc vô trùng, lắc đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Hay cách
khác, có thể đun 1 hay 2ml môi trường tăng sinh có chứa vi khuẩn ở
80°C trong 10-15 phút để tiêu diệt tế bào sinh dưỡng. Không xử
nhiệt với các vi khuẩn C.botulinum không phân hủy protein.
- Cấy mẫu đã xử lý: xử lý que cấy vòng cấy 1 hay 2 vòng cấy
chứa đầy dịch mẫu đã xử lý theo một trong hai cách trên môi trường
thạch-lòng đỏ trứng-gan thịt bê hay thạch-lòng đỏ trứng yếm khí để
13
tách khuẩn lạc phát triển riêng lẻ. Nếu có thể pha loãng đến mức có
thể cho các khuẩn phát triển dính vào nhau sau khi ủ. Ủ các đĩa khô
trước khi đem ủ nhằm tránh các vi khuẩn dính vào nhau sau khi ủ. Ủ
các đĩa ở 35°C trong 48 giờ trong điều kiện yếm khí.
* Chọn các khuẩn lạc vi khuẩn C.botulinum điển hình
- Chọn: chọn lấy mẫu 10 khuẩn lạc điển hình của vi khuẩn
C.botulinum phát triển độc lập. Những khuẩn lạc này có đặc điểm gỗ
cao hay dẹt, nhân hay xù xì. Chúng thường phát triển và phân bố
dàn trải và có mép không đều. Trên bề mặt trứng thì chúng có bề
mặt óng ánh khi kiểm tra dưới ánh sáng chiếu lệch góc. Những vùng
óng ánh này trông giống như lớp ngọc trai, theo trước và sau đường
viền không đều của khuẩn lạc. Bên cạnh vùng ngọc trai của khuẩn
lạc C.botulinum loại C, D và F thường được bao quanh bởi một vòng
kết tủa rộng (2-4mm), màu vàng. Các loại khuẩn lạc A và B thường
có vùng kết tủa nhỏ hơn.
- Cấy khuẩn lạc vào môi trường dịch thể: sử dụng que cấy vòng
để cấy khuẩn lạc C.botulinum loại E vào môi trường TPGY, các khuẩn
lạc sinh ra các toxin khác vào môi trường gan băm hay môi trường
thịt chín. Sau đó đem ủ trong 5 ngày, kiểm tra sự tạo thành toxin.
- Phân lập giống thuần: cấy ria lại các chủng loại toxin lên môi
trường thạch lòng đỏ trứng. Ủ một đĩa ở 35°C trong điều kiện yếm
khí, còn đĩa kia ủ ở 35°C trong điều kiện hiếm khí. Nếu khuẩn lạc
điển hình của C.botulinum phát triển trên đĩa thạch đã yếm khí và
không phát triển trên đĩa hiếu khí thì giống có thể đã thuần. Nếu
không phân lặp được C.botulinum từ ít nhất trong các khuẩn lạc đã
chọn thì có nghĩa là mật độ của chúng trong hệ vi sinh vật hỗn hợp
có thể thấp. Tiếp tục cấy chuyền liên tiếp vào môi trường tăng sinh
có thể làm tăng số lượng của chúng lên đủ để cho phép phân loại
được. Bảo vệ giống thuần ở trạng thái bào tử trong tủ lạnh, trên các
hạt thủy tinh, đông lạnh hay đông khô.
2.3/ Phát hiện độc tố botulin
Chuẩn bị mẫu: Lấy 1 phần mẫu để phát hiện tế bào vi khuẩn
C.botulinum sống, một phần khác để kiểm tra độc tính. Bảo quản
phần mẫu còn lại trong tủ lạnh. Ly tâm các mẫu chứa chất rắn lơ
lửng trong điều kiện và sử dụng phần lỏng để phân tích độc tính.
Chiết mẫu thực phẩm rắn với một thể tích tương ứng của dung dịch
trong đệm gel-phosphate pH=6,2. Tẩm ướt chất đệm vào mẫu thực
phẩm bằng cối và chày đã làm sạch. Ly tâm mẫu đã giã trong điều
kiện lạnh và sử dụng phần lỏng để phân tích độc tính.
14
* Xác định độc tính của mẫu thực phẩm hay môi trường vi khuẩn
- Xử lý với Trypsin: nếu có mặt các độc tố của các vi khuẩn
không phân hủy protein trong mẫu thực phẩm thì cần phải kích hoạt
bằng Trypsin để xác định. Vì vậy cần xử lý phần lỏng của mẫu rắn
sau khi ly tâm hay mẫu lỏng hay dịch thịt chín chủng với Trypsin
trước khi phát hiện độc tính. Không xử lý Trypsin với môi trường
TPGY bởi vì môi trường này đã chứa sẵn Trypin và nếu xử lý tiếp với
trypin thì có thể làm giảm hoạt tính của các toxin đã được kích hoạt
ở mức cao nhờ trypsin có sẵn trong môi trường. Điều chỉnh pH của
mẫu lỏng về 6,2 với dung dịch NaOH 1N hay HCl 1N. Thêm 0,2ml
dung dịch trypsin bão hòa trong nước vào 1,8ml mỗi phần mẫu lỏng.
Ủ dịch hỗn hợp này ở 35-37°C trong 1 giờ, thỉnh thoảng trộn đều, để
kiểm tra độc tính. Để chuẩn bị cho dung dịch trypsin, cho 1g trypsin
(Difco,1:250) vào một ống nghiệm sạch và thêm 10ml nước cất, lắc
và hơ nóng nhẹ để hòa tan.
- Kiểm tra độc tính: Tiến hành test song song trên các mẫu đã xử
lý và không xử lý với trypsin (lặp đôi). Pha loãng một phần của mẫu
lỏng hay canh trường vi khuẩn chưa xử lý đến 1:2, 1:10, 1:100, trong
dung dịch đệm gel-phosphate. Tiến hành pha loãng tương tự với
từng mẫu loãng hay canh trường vi khuẩn đã được xử lý với trypin.
Tiêm vào bụng mỗi con chuột, theo từng cặp chuột, 0,5ml mẩu lỏng
chưa pha loãng vào 0.5ml mẫu kiểm tra chưa xử lý ở mỗi độ pha
loãng bằng cách sử dụng ống tiêm 1 hay 3ml với kim cỡ
- Vi khuẩn với độ pha loãng bằng cách sử dụng ống tiêm 1 hay
3ml với kích cỡ 2,5cm, 1,6cm. Lặp các bước này với các mẫu đã xử
lý với Trypsin (lặp đôi). Đun 1,5ml mẫu lỏng hay canh trường vi
khuẩn trong 10 phút ở 15°C. Làm lạnh rồi thêm 0,5ml (chưa pha
loãng) vào từng con chuột theo từng cặp. Chuột sẽ không chết, bởi
vì độc tố botulin nếu có sẽ bị bất hoại bởi nhiệt.
Quan sát tất cả các con chuột theo từng khoảng thời gian nhất
định trong 48 giờ. Chỉ nhận triệu chứng và thời gian chuột chết. Triệu
chứng ngộ độc ở chuột bắt đầu trong 24 giờ đầu tiên, long xù lên,
thở mạnh từng hồi, cơ thể yếu dần, cuối cùng là liệt và hơi thở yếu
dần và chết. Nếu chuột chết mà không có đủ các triệu chứng nói
trên thì không thể kết luận rằng độc tố botulin có trong chất lỏng
tiêm vào chuột. Mà chuột chết có thể do các hợp chất độc có trong mẫu tiêm
hay nhiễm trùng do vết thương.
15
III. CLOSTRIDIUM BUTALINUM TRONG ĐỒ HỘP:
C. botulinum gây ra các thể bệnh chính.
-Thứ nhất là thể nhiễm qua thức ăn (foodborne botulism). Tất cả các loại thức ăn
đều có thể bị nhiễm nếu bảo quản không kỹ nhưng nguồn lây bệnh chủ yếu là qua các
loại đồ hộp có độ acid thấp như đậu, ngô, củ cải đường. Thịt hộp, cá hộp cũng là một
nguồn lây bệnh tiềm tàng. Vi khuẩn C. botulinum phát triển trong các loại thực phẩm
nói trên, sinh độc tố và nếu ăn phải loại thức ăn này, các triệu chứng sẽ xuất hiện sau
18 - 36 giờ. Cá biệt, có trường hợp bệnh xuất hiện sớm sau ăn vài giờ hoặc muộn hơn,
sau vài ngày.
-Thể bệnh thứ hai do C. botulinum gây ra là thể ở trẻ em, chủ yếu là trẻ dưới 1t
tuổi và nhất là 6 tháng đầu sau đẻ. Nguyên nhân chủ yếu là cho trẻ ăn phải thức ăn
như mật ong, sữa, bột… có nhiễm C. botulinum ở dạng nha bào. Sau khi vào đường
tiêu hóa, C. botulinum sẽ phát triển và sinh ngoại độc tố.
-C. botulinum cũng có thể gây bệnh khi nhiễm qua các vết thương. Thể này hay
gặp ở những người chích ma túy, những người bị các vết thương nhỏ nhưng không
chú ý vô khuẩn đầy đủ. Vi khuẩn xâm nhập vào vết thương, nhân lên và sinh độc tố
gây hại.
Đồ hộp là thực phẩm luôn được ưu tiên sử dụng trong những chuyến đi xa, những
lúc bận rộn trong nhịp sống hiện đại do ưu điểm tiện lợi và nhanh chóng. Tuy nhiên,
nếu khi mua và sử dụng không cẩn thận, con người có thể bị ngộ độc do ăn phải mầm
bệnh phát triển ở trong loại thực phẩm này. Nha bào của vi khuẩn có thể chịu được
nhiệt độ 1200C trong 4 phút. C. botulinum sống trong đất, bùn, bụi bẩn, ruột cá, ruột
gia súc và đặc biệt phát triển mạnh trong thức ăn ôi thiu, môi trường kín như thịt hộp
để lâu ngày (đã từng có những vụ ngộ độc hàng loạt độc tố C. botulinum do ăn thịt
hộp).
1. Các triệu chứng và dấu hiệu:
Độc tố của C. botulinum khi vào cơ thể sẽ ngăn chặn sự giải phóng một chất dẫn
truyền thần kinh là acetylcholine tại các đầu mút thần kinh tiền sinap. Vì vậy, các
xung động thần kinh sẽ bị ngưng trệ dẫn đến triệu chứng liệt vận động là chủ yếu. Các
dấu hiệu bao gồm nói khó; khó nuốt; khô miệng; liệt mặt; liệt các dây thần kinh vận
nhãn gây nhìn đôi; sụp mi; khi liệt các cơ hô hấp (cơ liên sườn, cơ hoành, cơ ức đòn
chũm, cơ thang) thì gây khó thở, thậm chí gây ngừng thở dẫn đến tử vong. Bệnh tiến
triển rất nặng nếu dẫn đến liệt toàn thân. Thể bệnh nhiễm qua thức ăn thường có triệu
chứng đau bụng, nôn mửa, tiêu chảy. Táo bón có thể xuất hiện sau khi đã có các triệu
chứng liệt cơ. Ở trẻ em, táo bón thường là dấu hiệu đầu tiên trước khi xuất hiện yếu
cơ, khóc yếu, thở yếu, chảy nước dãi, sụp mi, bỏ bú hoặc không bú được, suy hô hấp
và liệt cơ toàn thân.
Tất cả các trường hợp nhiễm C. botulinum cần được theo dõi sát sao tại các cơ
sở y tế để theo dõi tiến triển của dấu hiệu liệt cơ. Thuốc có hiệu quả nhất hiện nay
16
đang được sử dụng là globulin miễn dịch botulism dùng đường tiêm tĩnh mạch
(Botulism Immune Globulin Intravenous Human - BIG-IV). Kháng độc tố C.
botulinum được chiết xuất từ ngựa cũng thường được sử dụng với liều từ 50.000 100.000 đơn vị. Khi đã có biểu hiện suy hô hấp, hết sức chú ý các dấu hiệu ho khạc,
thở gắng sức bằng các cơ hô hấp phụ… để có chỉ định đặt ống nội khí quản cho thở
máy. Tiên lượng của bệnh nhiễm C. botulinum thì tùy theo mức độ liệt cơ. Nếu đã liệt
nhiều cơ, nhất là cơ hô hấp phải thở máy, tỷ lệ tử vong có thể tới 60 - 70%.
2. Cơ chế hoạt động của độc tố Butalinum:
Độc tố của C.botulinum được xem là có độc tính mạnh nhất được biết đến, với
liều lượng gây tử vong cho người trưởng thành chỉ vào khoảng 10^(-8)g. Chúng là các
protein có khối lượng phân tử lớn (150kDa) và bị bất hoạt ở nhiệt độ 80°C trong 10
phút. Trong tự nhiên, các độc tố này được C.botulinum sản xuất trong pha tăng trưởng
log dưới dạng phức hợp và tiết ra môi trường xung quanh khi phân giải tế bào. Trong
phức hợp nhỏ nhất trong các phức hợp này (phức hợp M), độc tố thần kinh kết hợp
với một protein khác có kích thước tương tự (chưa rõ về hoạt tính sinh học). Trong khi
đó, trong các phức hợp lớn hơn (như phức hợp L), hợp chất hemmaglutinin cũng đồng
thời hiện diện. Như vậy, độc tố thần kinh này được tổng hợp thành một chuỗi tiền
protein và được hoạt hóa bằng cách cắt phân giải và tạo thành một phân tử gồm 2
thành phần: chuỗi nhẹ (Mr 50kDa) và chuỗi nặng (Mr 100kDa), được nối với nhau
bằng cầu nối disulfide. Nếu sinh vật không có khả năng tự tổng hợp enzyme phân giải
thì tiền protein sẽ được hoạt hóa bởi enzyme trypsin của ruột. Tuy nhiên nếu bị phân
giải quá mạnh thì độc tố sẽ bị bất hoạt. Chính vì điều này mà dù cho phức hợp tự
nhiên đã có một số cơ chế tự vệ, liều lượng độc tố A gây tử vong khi được tiêm thẳng
vào trong màng bụng chuột vẫn cao gấp 104-105 lần bình thường. Chuỗi nặng có tác
dụng giúp độc tố bám lên các tế bào thần kinh, còn chuỗi nhẹ giúp chúng xâm nhập
vào bên trong tế bào. Chuỗi nhẹ có bản chất là endopeptidase nhân kẽm, được hoạt
hóa bởi sự khử cầu nối disulfide trong protein.
Endopeptidase sau đó sẽ cắt rời các thành phần của phức hợp bám và dung hợp
trên màng của cúc synapse (nơi chứa chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine). Khi
protein này tấn công, nối peptide đặc hiệu sẽ được thủy giải bởi từng loại độc tố khác
nhau. Độc tố loại B, D, F và G sẽ thủy giải các loại nối peptide khác nhau trên protein
bám màng cúc synapse (còn gọi là synaptobrevin). Độc tố loại A và E tấn công vào
các nối khác nhau trên thể synapse (SNAP-25), còn loại C1 thì tấn công cả SNAP-25
lẫn syntaxin.
Người ta thấy rằng gene mã hóa cho độc tố (ít nhất là đối với loại C và D) gắn liền
với phage ôn hòa. Gene này tồn tại trong cơ thể vi khuẩn như là prophage, kết hợp và
phân chia cùng với nhiễm sắc thể của vi khuẩn mà không gây ly giải tế bào. Tình
trạng tiềm tan này hiện diện rất phổ biến trong các loài vi khuẩn tự nhiên, thường
không gây ra biến đổi tính chất của vi sinh vật.
17
Botulism ở trẻ sơ sinh khác với những triệu chứng thông thường là vì chúng bắt
nguồn từ sự tạo khuẩn lạc C.botulinum trong đường ruột của trẻ và tiết độc tố ngay tại
vị trí khuẩn lạc.
3. Tiệt trùng đồ hộp:
Bào tử yếm khí Clostridium botulinum là mục tiêu chính trong quá trình chế biến
nhiệt vì:
- Có thể sản sinh ra độc tố làm chết người dù ở liều lượng rất thấp.
- Có khả năng thành lập bào tử, rất bền nhiệt
- Clostridium botulinum có thể tìm thấy bất cứ nơi đâu, vì vậy hầu hết nguyên liệu đều
nhiễm vi sinh vật này, nên chúng quan hệ mật thiết tới lĩnh vực an toàn thực phẩm
Chính vì những lý do trên, Clostridium botulinum được xem là nguyên nhân gây ngộ
độc thực phẩm. Để tránh sự "bùng nổ" về ngộ độc, các nhà chế biến thực phẩm cần :
- Giảm mật số bào tử Clostridium botulinum đến mức có thể chấp nhận được trong
thực phẩm
- Ngăn cản sự phát triển của Clostridium botulinum (bào tử) và quá trình sản sinh độc
tố. Trong thực tế rất khó vô hoạt bào tử Clostridium botulinum, vì vậy để tránh hư
hỏng đòi hỏi phải xử lý ở nhiệt độ cao, đây là nguyên nhân dẫn đến việc giảm tính
chất dinh dưỡng, cảm quan của các thực phẩm, không đáp ứng được đòi hỏi của người
tiêu dùng.
Chính vì thế, việc ngăn cản hư hỏng thực phẩm thường là hạn chế sự phát triển nhanh
của bào tử Clostridium botulinum hơn là vô hoạt. Việc xử lý nhiệt thành công để phá
hủy bào tử Clostridium botulinum là kết hợp với nhiều yếu tố (yếu tố bên trong và bên
ngoài) như pH, nhiệt độ, oxy, độ hoạt động của nước, phụ gia bảo quản hoặc kết hợp
với nhóm vi sinh vật cạnh tranh.
Thông thường bào tử Clostridium botulinum không hình thành và phát triển trong
thực phẩm có pH < 4,6. Vì vậy, pH : 4,6 được chọn là ranh giới phân chia giữa thực
phẩm acid và ít acid.
- Trong thực phẩm acid (pH < 4,6) bào tử Clostridium botulinum có thể hiện diện,
không có dấu hiệu liên quan đến sự phát triển nhanh, có thể áp dụng xử lý nhiệt trung
bình để phá hủy chúng (thanh trùng)
- Trong thực phẩm ít acid (pH > 4,6) xử lý nhiệt ở mức độ tương đối có thể sử dụng
với mục đích tiêu diệt bào tử Clostridium botulinum, nhưng phải kết hợp với quá trình
bảo quản mát. Trong trường hợp này, quá trình tiệt trùng thường được áp dụng hơn.
KẾT LUẬN
Qua nội dung tìm hiểu trên, chúng ta thấy rằng thực phẩm đóng vai trò rất quan
trọng trong mắc xích với thế giới vi sinh vật. Rõ ràng thực phẩm là môi trường lý
18
tưởng cho chúng sinh sôi phát triển. Sự có mặt của vi sinh vật trong các loại thực
phẩm một phần có lợi, song trong nhiều trường hợp chúng là mối đe dọa lớn đối với
con người. Clostridium botulinum là một loài đáng sợ trong nhiều thập kỷ trước và
ngay cả hiện nay. Việc tránh tác hại của nó trong các loại thực phẩm là điều vô cùng
cần thiết. Trong sản xuất và chế tạo các sản phẩm thực phẩm cần tuân thủ các điều
kiện vệ sinh tránh nhiễm các vi sinh vật này và nhiều loại có hại khác.
Bên cạnh các tác hại thấy rõ, y học ngày nay cũng đã biết cách khống chế và sử
dụng độc tố botulin như một liều thuốc làm trẻ hóa. Điển hình là Botox là sản phẩm
Botulinum Toxin type A do công ty Allergan (Mỹ) sản xuất, có tác dụng xóa những
nếp nhăn ở các vùng giữa hai chân mày, trán và đuôi mắt.
Cần phải có những hiểu biết về Clostridium botulinum cũng như độc tố Botulin
của loài vi sinh vật này để tránh các tác hại đáng tiếc xảy ra. Hi vọng rằng bài tiểu
luận này sẽ giúp một phần nào đó để đạt được mong muốn nói trên.
19
