Vi khuẩn e coli và một số phương pháp phòng bệnh

Danh sách thành viên nhóm:
Họ và tên

MSSV

1 Hồ Thị Lan

56136397

2 Châu Thị Khánh Linh

56131088

3 Lê Ngọc Mai

56136678

4 Võ Thị Nường

56136757

5 Trần Thị Thảo Phương

56130143

1


Mục lục:
A. Mở đầu.......................................................................................................1
B. Nội dung.....................................................................................................2

I. Giới thiệu chung về E.coli ........................................................................4
1. Nguồn gốc và tên gọi.................................................................................4
2. Đặc điểm.....................................................................................................5
3. Qui trình tóm tắt xác định số lượng E.coli..............................................9
4. Một số phương pháp phát hiện E.coli
4.1. Phương pháp truyền thống: Phương pháp làm giàu vi khuẩn............11
4.2. Phương pháp hiện đại: Phương pháp ELISA.......................................14
II. E.coli O157: H7.........................................................................................17
1. Sơ lược về E.coli O157: H7.......................................................................18
2. Đặc điểm.....................................................................................................18
3. Cơ chế gây bệnh.........................................................................................19
4. Phát hiện E.coli O157: H7 bằng phương pháp ELISA..........................19
5. Các vụ nhiễm độc do E.coli O157: H7.....................................................22
6. Khả năng gây bệnh và biểu hiện bệnh.....................................................23
7. Nguyên tắc điều trị, phòng bệnh và đối tượng dễ lây nhiễm bệnh.......24
C. Kết luận.....................................................................................................27

2


A. MỞ ĐẦU:
Hiện nay, vệ sinh an toàn thực phẩm đang là vấn đề rất được quan tâm. Mỗi năm,
ước tính ở Hoa Kỳ xảy ra 76 triệu ca ngộ độc thực phẩm (26 nghìn ca trên 100
nghìn dân), 2 triệu ca xảy ra ở Anh (3.400 ca/100 nghìn dân) và 75 nghìn ca
ở Pháp(1.220 ca/100 nghìn dân). Ở Việt Nam nhiều vụ ngộ độc thực phẩm hay xảy
ra, đặc biệt là ngộ độc tập thể, rơi nhiều vào đối tượng công nhân (khi ăn, uống tại
các bếp ăn tập thể không đảm bảo vệ sinh, an toàn chất lượng thực phẩm). Theo
một thống kê năm 2008, mỗi năm ở Việt Namcó khoảng 250- 500 ca ngộ độc thực
phẩm với 7.000 - 10.000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong. Nhà nước Việt Nam
cũng phải chi trên 3 tỷ đồng cho việc điều trị, xét nghiệm và điều tra tìm nguyên

nhân. Tiền thuốc men và viện phí cho mỗi nạn nhân ngộ độc do vi sinh vật tốn
chừng 300.000 – 500.000 đồng, các ngộ độc do hóa chất (thuốc trừ sâu, phẩm
màu…) từ 3 – 5 triệu đồng, nhưng các chi phí do bệnh viện phải chịu thì còn lớn
hơn nhiều. Một số vụ việc được nhắc đến gồm: Trong tháng 8 năm 2012 đã xảy ra
4 vụ ngộ độc thực phẩm làm 179 người bị ngộ độc, trong đó 2 trường hợp tử
vong. Trưa 27/11/2012, 74 nữ công nhân của Công ty TNHH Giày Uy Việt (KCN
Đông Xuyên, TP Vũng Tàu) có dấu hiệu bị ngộ độc thức ăn sau khi ăn suất cơm
chay. Ở quận 12, TP HCM, 148 công nhân Công ty Terratex, cùng có triệu chứng
đau bụng, buồn nôn và chóng mặt. Theo các công nhân, thức ăn tập thể mà họ dùng
do chính nhà bếp của công ty nấu. Đây là lần thứ hai công ty này xảy ra ngộ độc
tập thể. Trong 2 ngày 6 và 7/3/2013, gần 30 người ăn bánh mì ở Đà Nẵng phải nhập
viện với các triệu chứng nôn ói kéo dài kèm đau đầu. Chiều 28/3/2013, Chi cục An
toàn vệ sinh thực phẩm Thái Bình cho biết đã có 69 người bị ngộ độc phải đưa vào
Bệnh viện đa khoa Tây Tiền Hải để điều trị. Tất cả 69 người bị ngộ độc đều là công
nhân của Công ty TNHH Global MFG Việt Nam. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến
ngộ độc thực phẩm, trong đó vi sinh vật cũng là nguyên nhân quan trọng. Đáng
quan tâm nhất là E.coli. E.coli là vi khuẩn chỉ thị về vệ sinh thực phẩm rõ ràng
3


nhất. Nếu phát hiện E.coli cho phép ta xác định được thực phẩm bị nhiễm bẩn
tương đối do phân. Vi khuẩn này hiện diện một cách rất tự nhiên trong đường ruột
của chúng ta, có cả hàng trăm chủng E.coli, đa số là chủng có lợi nhưng lại có một
số chủng rất có hại. Vì vậy, việc nghiên cứu E.coli đang được các nhà nghiên cứu
quan tâm.
Đề tài: “E.coli và các bệnh đường ruột”
B. NỘI DUNG:
I. Giới thiệu chung về E.coli:
1. Nguồn gốc và tên gọi:
Escherichia coli (thường được viết tắt là E.coli)

hay còn được gọi là vi khuẩn đại tràng là một
trong những loài vi khuẩn chính ký sinh trong
đường

ruột

của động

vật

máu

nóng (bao

gồm chim và động vật có vú). Vi khuẩn này cần
thiết trong quá trình tiêu hóa thức ăn và là thành
phần của khuẩn lạc ruột. Sự có mặt của E.coli
trong nước ngầm là một chỉ thị thường gặp cho ô
nhiễm phân. E.coli thuộc

họ

vi

Hình 1.1: Hình chụp vi khuẩn
E.coli dưới kính hiển vi với kích
thước 2 µm

khuẩn Enterobacteriaceae và thường được sử dụng làm sinh vật mô hình cho các
nghiên cứu về vi khuẩn.

Năm 1885, tại München, một bác sĩ nhi khoa tên là Theodor Escherich rất quan tâm
đến những phát hiện quan trọng của Louis Pasteur và Robert Koch về vi khuẩn.
Cùng với việc nghiên cứu bệnh tiêu chảy, Escherich tỏ rõ mối lưu ý tới một vi sinh
vật đường ruột trẻ em qua nhiều thí nghiệm lâm sàng. Vi khuẩn do Escherich phát
hiện từ trong tã lót của trẻ em được công bố với tên gọi đầu tiên là Bacterium coli
commune. Chỉ 4 năm sau vi khuẩn này được giới chuyên môn đổi tên
4


thành Escherich nhằm tri ân người có công khám phá. Tuy nhiên, nó được gọi bằng
tên Bacillus coli vào năm 1895 và Bacterium coli vào một năm sau đó, Sau nhiều
kiểu gọi, đến năm 1919, vi khuẩn kia được định danh thống nhất toàn cầu
là Escherichia coli.
2. Đặc điểm:
a. Đặc điểm hình thái:
E.coli là trực khuẩn Gram âm, có hình que,
2 đầu tròn, dài ngắn khác nhau. Kích thước
trung bình từ 2 đến 3µm x 0,5µm;, trong
những điều kiện không thích hợp (ví dụ như
trong môi trường có kháng sinh) vi khuẩn có
thể rất dài như sợi chỉ, thường đứng riêng lẽ từng tế bào, cũng có khi ghép từng
đôi một, có khi kết với nhau thành từng đám hoặc một chuỗi ngắn. Rất ít chủng
E.coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông và có khả năng di động.
b. Tính chất nuôi cấy:
E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Một số có thể
phát triển trên môi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng. Hiếu kỵ khí tùy ý.
Có thể phát triển ở nhiệt độ từ 5-400C. Nhiệt độ thích hợp xung quanh 370C.
Trong điều kiện thích hợp E.coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ khoảng
20 đến 30 phút. Cấy vào môi trường lỏng (như canh thang) sau 3 đến 4 giờ đã làm
đục nhẹ môi trường, sau 24 giờ làm đục đều; sau hai ngày trên mặt môi trường có

váng mỏng. Những ngày sau, dưới đáy ống có thể thấy lắng cặn. E.coli không mọc
trên canh thang Selenit.
Trên môi trường thạch thường, sau khoảng 8 đến 10 giờ, dung kính lúp đã có thể
quan sát được khuẩn lạc. Sau 24 giờ khuẩn lạc có kích thước khoảng 1,5mm. Hình
5


thái khuẩn lạc điển hình dạng S, nhưng có thể gặp dạng R, hoặc M. Trên môi
trường phân lập, tùy theo chất chỉ thị màu, E.coli có khuẩn lạc màu vàng (như trên
thạch lactose) hoặc màu đỏ (như trên thạch MacConkey). Không mọc được trên
môi trường SS.
Một số loại E.coli có tính chất nuôi cấy riêng có giá trị trong sàng lọc nhanh, như
EAEC tạo thành váng đặc trường khi nuôi cấy trên canh thang Muller-Hinton.
c. Tính chất hóa sinh :
E.coli có khả năng lên men nhiều loại đường và có sinh hơi. Hầu hết E.coli đều lên
men lactose và sinh hơi, trừ E.coli trơ (inactive) (trong đó có EIEC) không hoặc lên
men rất chậm. Một số chi khác trong họ vi khuẩn đường ruột cũng có khả năng lên
men nhanh lactose (như Klebsiella, Enterobacter, Serratia và Citrobacter) được
gộp vào một nhóm vi khuẩn có tên chung là coliform.
E.coli có khả năng sinh indole. Không sinh H 2S. Không sử dụng được nguồn
carbon của citrate trong môi trường Simmons. Có decarboxylase, vì vậy có khả
năng khử carboxyl của lysine, ornithin, arginin và acid glutamic. Betagalactosidase
dương tính. Thử nghiệm VP (Voges Proskauer) sau 24 giờ âm tính, sau 48 giờ có
thể dương tính.

Bảng 1.1: Tính chất hóa sinh của một số loài thuộc chi Escherichia
Các loài
E.coli
Thử nghiệm
CNPG

Indole

(bình

E.coli

E.blat

(inactive) tae
thường)
+
T
+
T
6

E.fergu

E.herm

E.vulne

E.albert

sonii

annii

ris

ii

T
+

+
+

+
-

-


Đỏ methyl
Voges-

+

+

+

+

+

+

?

-

-

-

-

-

-

-

-

-

T

T

-

-

-

T

T

+

+

-

T

+

T

-

-

-

-

T

-

T

T

+

+

+

-

+

+

-

-

+

+

+

-

+

+

+

+

+

+

+

+

-

+

+

+

+

+

+
T
+
+
T

T

T
+
T
T

+

+
+
+
+

T
T
+
+
+

T
+
+
+

+
+

+
vàng
ONPG: Ortho-nitrophenyl-beta-Dgalactopyranoside

T

-

Proskauer
Citrate
(Simmons)
Lysine
decarboxylase
Arginine
dihydrolase
Ornithine
decarboxylase
Di động
D-Glucose
acid
D-Glucose
sinh hơi
Lactose
Sucrose
D-Mannitol
Adonitol
Cellobiose
D-Sorbitol
D-Arabitol
L-Ramnose
Sinh sắc tố

+: >90% dương tính

-: < 10% dương tính

T: 10-90% dương tính

*Cơ chế chuyển đổi: Indole được tạo ra bằng cách khử khử amin từ tryptophan qua
các axit indolepyruvic phân tử trung gian. Tryptophanase xúc tác phản ứng khử
amin, trong đó các amin (NH 2 ) nhóm các phân tử tryptophan được lấy ra. Sản
phẩm cuối cùng của phản ứng là indole, axit pyruvic , amoni (NH 4 + ) và năng
lượng. Pyridoxal phosphate được yêu cầu như một coenzyme .
7


d. Kháng nguyên :
Kháng nguyên O: người ta đã biết tới gần 160 yếu tố kháng nguyên O của E.coli.
Kháng nguyên K: Khoảng 100 yếu tố kháng nguyên K đã được xác định và được
chia thành ba loại: A, B và L, trong đó A dưới dạng vỏ quan sát được bằng kính
hiển vi quang học thông thường, B và L dưới dạng màng rất mỏng chỉ có thể quan
sát được nhờ kính hiển vi điện tử.
Kháng nguyên H: hơn 50 yếu tố kháng nguyên H đã được xác định.
e. Phân loại :
Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, E.coli được chia thành các type huyết thanh. Với
sự tổ hợp của các yếu tố kháng nguyên O, K và H sẽ có rất nhiều type huyết thanh
khác nhau. Mỗi type huyết thanh được ký hiệu bằng kháng nguyên O và K, ví dụ
O86B7 (yếu tố kháng nguyên O số 86, yếu tố kháng nguyên K số 7 loại B).
Dựa vào vị trí gây bệnh các E.coli có khả năng gây bệnh ở người được chia thành 2
nhóm: thứ nhất là nhóm gây bệnh đường ruột (IPEC-intestinal pathogenic E.coli)
hay E.coli gây tiêu chảy (DEC-Dierrheagenic E.coli), thứ hai là nhóm gây bệnh
ngoài đường ruột (ExPEC-extraintestinal pathogenic E.coli).
_ Các loại E.coli gây bệnh đường ruột (IPEC) đã được biết gồm:
EPEC (Enteropathogenic E.coli): E.coli gây bệnh đường ruột

ETEC (Enterotoxigenic E.coli): E.coli sinh độc tố ruột
8


EIEC (Enteroinvasive E.coli): E.coli xâm nhập ruột
EAEC (Enteroaggregative E.coli): E.coli ngưng tập ruột
DAEC (Diffusely adherent E.coli): E.coli bám dính phân tán
EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli): E.coli gây xuất huyết ruột
_ Hai loại E.coli gây bệnh ngoài đường ruột quan trọng nhất là:
MAEC (Meningitidis-associated E.coli): E.coli gây viêm màng não
UPEC (Uropathogenic E.coli): E.coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu
3. Quy trình tóm tắt xác định số lượng E.coli:

Chuẩn bị mẫu: Cân 50 g mẫu + 450ml dung dịch đệm phosphate.
Đồng nhất mẫu

Pha loãng mẫu: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 …
9 -2, 10-3 vào0 ống chưa 10 ml LSB
Chuyển 1 ml dung dịch 10-1, 10
Ủ ở 35 C / 24-48 giờ
(mỗi nồng độ pha loãng cấy 3 ống nghiệm lặp lại)
Ghi nhận ống dươngCấy
tínhống
(sinh
hơi) ởtính
mỗivào
nồng
độEC
phaủ loãng
dương

canh
ở 450C/ 24 giờ


Số ống dương tính (sinh hơi) ở mỗi nồng độ pha loãng
Cấy ống dương tính lên EMB . Ủ ở 350C/ 24 – 48 giờ
Chọn khuẩn lạc điển hình làm thử nghiệm IMViC

Test IMViC ++-Đếm số ống EC dương tính với E.coli
E.coli

4. Một số phương pháp phát hiện E.coli:
Phương pháp chuẩn đoán chủ yếu nhất là nuôi cấy phân lập. Bệnh phẩm phân
được nuôi cấy trên môi trường phân lập có chất ức chế chọn lọc như DCL, Endo.
Nước tiểu giữa dòng được tiến hành cấy đếm trên môi trường đặc, trước đây
thường sử dụng thạch thường, hiện nay có môi trường uriselect vừa có giá trị cấy
đếm, vừa có khả năng định danh. Tiến hành cấy máu khi nghi có nhiễm khuẩn
máu.
Sau khi đã phân lập được vi khuẩn thuần nhất thì xác định tính chất sinh vật hóa
học và định tên bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính với các kháng huyết
thanh mẫu.
Để xác định các E.coli sinh độc tố người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp
khác nhau như phương pháp quai ruột, phương pháp thử nghiệm trên tế bào nuôi,
phương pháp đồng ngưng kết, ELISA, kỹ thuật khuếch đại gen PCR…
10


Có 2 loại phương pháp:
_Phương pháp truyền thống: phương pháp MPN, phương pháp đếm khuẩn lạc,
phương pháp làm giàu vi khuẩn…

_Phương pháp hiện đại: phương pháp PCR, phương pháp ELISA…
4.1 Phương pháp truyền thống: Phương pháp làm giàu vi khuẩn
a. Nguyên lý
Phương pháp này dựa vào làm giàu vi khuẩn trước trong canh thang dinh dưỡng và
MacConkey, rồi làm giàu trong canh thang LST và EE sau đó ria lên thạch L-EMB.
Những khuẩn lạc khả nghi được kiểm tra về đặc tính sinh hóa và huyết thanh của
EEC.
b. Thiết bị và đồ thủy tinh
1.
2.
3.
4.

Chậu nước 440C và 41,50C
Tủ ấm 350C
Máy pha trộn
Ống nghiệm, pipet, đĩa Petri
c. Môi trường và thuốc thử
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.

13.
14.

Môi trường lên men (carbohydrate fermentation medium) (mt 46)
Thạch L-EMB (Levine’s methylene blue agar) (mt 76)
Canh thang EE (Enteric enrichement broth) (mt 14)
Môi trường indole và thuốc thử (mt 44, mt 98)
Canh thang LST (Lauryl sulphate tryptose broth) (mt28)
Thạch MacConkey (mt 80)
Canh thang MacConkey (mt 17)
Canh thang nitrate (Nitrate broth) (mt 19)
Canh thang dinh dưỡng (Nutrient broth) (mt 6)
Canh thang KCN (Potassium cyanide broth) (mt 3)
Thạch TSI (Triple sugar iron agar) (mt 86)
Canh thang urê (các thành phần là thạch urê nhưng không có agar) (mt 93)
Môi trường V.P (Voges Proskauer medium) (mt 54)
Kháng huyết thanh E.coli
11


d. Cách làm
1.

Chuẩn bị mẫu:
Cân 25g mẫu bằng thao tác vô khuẩn rồi cho vào 225ml canh thang
MacConkey và 225ml canh thang dinh dưỡng trong blender vô khuẩn và làm

2.

đồng nhất trong 30 giây (1:10)

Ria thẳng
Ria từ canh thang dinh dưỡng đồng nhất lên thạch L-EMB, thạch

3.

MacConkey. Ủ ấm 350C trong 24h.
Làm giàu vi khuẩn :
ủ ấm canh thang MacConkey ở 350C trong 20h , chuyển một quai cấy sang
30ml canh thang LST. Ủ ấm 44 0C trong 20h. Ủ ấm canh thang dinh dưỡng
350C trong 6h, Chuyển một quai cấy sang 30ml canh thang EE. Ủ ấm 41,5 0C

4.

trong 18h.
Xét nghiệm sơ bộ về huyết thanh :
Trung hòa canh thang LST và EE với 10% NaHCO 3, nhỏ một giọt canh
thang của mỗi thứ lên trên phiến kính sạch và cho thêm một giọt huyết thanh
đa giá OB và một giọt nước muối 0,5%. Trộn các giọt trên và xem ngưng

5.

kết.
Xác nhận tính chất sinh vật hóa học :
Ria từ canh thang LST dương tính lên thạch L-EMB và EE dương tính lên

thạch MacConkey và thạch L-EMB. Ủ ấm ở 350C trong 24h.
e. Chọn những khuẩn lạc điển hình và cấy vào môi trường: TSI, VP, indole,
urease, KCN, citrate và adonitol. Đồng thời cấy lên mặt thạch nghiêng PCA cùng
một khuẩn lạc dùng để kiểm tra huyết thanh.
Đặc tính sinh vật hóa học của E.coli

TSI

+

(H2S) V.P.

acid
+

IndoleUrease

+
12


KCN Adonitol

-

Cytochrome oxidase

-

f. Nhận diện huyết thanh E.Coli gây bệnh đường ruột:
*Thạch EMB: Thạch Eosin methylene thạch màu xanh, có chứa thuốc nhuộm eosin
và xanh methylene. EMB agar chọn lọc bởi vì thuốc nhuộm anilin trong phương
tiện truyền thông tím ức chế sự phát triển của sinh vật Gram dương. Lactose men
chuyển hóa đường lactose trong các phương tiện truyền thông và sản xuất các sản
phẩm phụ axit, gây ra một sự thay đổi màu sắc trên môi trường. Vì vậy, EMB cũng
là một phương tiện khác biệt . Sản xuất axit mạnh mẽ bởi các sinh vật như E.coli

kết quả trong một ánh xanh kim loại. Yếu hơn quá trình lên men kết quả lactose
trong môi trường với một màu hơi hồng tím . Thuộc địa của men nonlactose vẫn
không màu, hoặc ít nhất không đậm hơn so với màu sắc của các phương tiện truyền
thông.
4.2 Phương pháp hiện đại: Phương pháp ELISA
a. Nguyên tắc
Sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên ngoài những đĩa giếng (microplate). Nếu có
sự hiện diện của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ được giữ
lại trên bề mặt giếng. Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng
kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme như horseradish peroxidase hay alkaline
phosphate. Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu enzyme vào giếng, enzyme sẽ xúc tác
phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các phản ứng có màu hay phát sáng. Bằng
cách theo dõi sự đổi màu, có thể phát hiện sự hiện diện và định lượng kháng
nguyên.

13


Kháng nguyên ( Antigen ) là những chất có khả năng huy động hệ miễn dịch tiết ra
kháng thể đặc hiệu với chúng gây ra phản ứng miễn dịch đặc hiệu. Kháng nguyên
bao gốm protein lạ, axit nucleic, một số lipit và poli saccarit. Cấu trúc kháng
nguyên:
_E.coli có 3 cấu trúc kháng nguyên với tên gọi là O ( kháng nguyên thân), K
(Kháng nguyên bề mặt) và H (kháng nguyên lông).
_Kháng thể ( Antibody ) là protein ‫ ﻹ‬- globulin được sinh ra bởi tế lympo tham gia
phản ứng miễn dịch đặc hiệu với kháng nguyên
Elisa đã được sử dụng rộng rãi dưới dạng các bộ hóa chất (kit). Elisa có thể sử dụng
phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng
sinh. Kỹ thuật này có độ nhạy phát hiện khoảng 10 6CFU/ml(một số báo cáo cho
rằng giới hạn này có thể đạt được 104).

b. Các phương pháp Elisa :
*ELISA gián tiếp (indirect ELISA) gồm các bước chính:
_Chuyển KN đã biết lên bề mặt cứng (được gọi chung là các đĩa). KN sẽ được cố
định trên bề mặt. Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này dùng để thiết lập đường
chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các mẫu chưa biết.
_Chuyển các mẫu KN chưa biết vào các giếng khác. KN chưa biết được hòa tan
trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu KN chuẩn.
_Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) như albumin
huyết thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu
chuẩn). Bước này được gọi là "blockin" do protein huyết thanh có tác dụng ngăn
cản sự hấp phụ của các protein khác lên bề mặt của đĩa.

14


_Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa.
KT sẽ kết hợp với các KN đã được cố định mà không kết hợp với protein của huyết
thanh.
_Thêm KT thứ cấp (secondary antibody), KT thứ cấp sẽ kết hợp với bất kỳ một KT
còn dư (bước này có thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng để phát hiện KN đã gắn
với enzyme).
_Rửa đĩa, các kháng thể gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ.
_Thêm cơ chất. Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang
hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng như yếu tố khuyếch đại).
*Nhược điểm cơ bản: Bước cố định KN không có tính đặc hiệu nên bất kỳ protein
nào cũng gắn với bề mặt đĩa vì vậy KN (có nồng độ thấp) phải cạnh tranh với các
protein khác trong huyết thanh khi gắn kết với bề mặt của điwax. Sandwich ELISA
hạn chế được nhược điểm này.
*Sandwich ELISA:
Phương pháp được sử dụng để phát hiện KN trong mẫu nghiên cứu và bao gồm các

bước cơ bản sau (quy trình có thể được thay đổi trong nhiều trường hợp):
(1) Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn KT
(2) Khóa tất cả những vị trí gắn kết không đặc hiệu trên bề mặt.
(3) Phủ mẫu chứa kháng KN cần xác định
(4) Rửa đĩa, kháng KN không được gắn kết sẽ bị rửa trôi
(5) Thêm các KT đặc hiệu cho KN cần chẩn đoán
(6) Thêm KT thứ cấp đã được gắn với enzym (KT thứ cấp đặc hiệu cho KT sơ cấp
ở bước 5)
(7) Rửa đĩa, phần không gắn kết sẽ bị rửa trôi.

15


(8) Thêm cơ chất. Enzym sẽ biến đổi cơ chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu hóa
điện.
(9) Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳng quang, tín hiệu điện hóa... qua đó xác
định sự có mặt và hàm lượng KT.

Hình 2.10: Các bước tiến hành trong Sanwich ELISA

Các bước trong Sandwich ELISA. (1) Phủ đĩa bằng KT (2) Thêm mẫu cần xác định
KN. KN (nếu có) sẽ gắn với KT; (3) kháng thể dùng để phát hiện được thêm vào và
kết hợp với KN; (4) Thêm KT thứ cấp liên kết với enzyme. KT thứ cấp sẽ gắn với
KT dùng để phát hiện; (5) Thêm cơ chất. Enzym sẽ làm biến đổi cơ chất và phát tín
hiệu có thể phát hiện và đo được.
*ELISA cạnh tranh:
(1) "Ủ" KT không được đánh dấu với KN.
(2) Đưa hỗn hợp này vào các giếng của vi phiếm có chứa KN.
(3) Rửa đĩa, KT không được gắn kết sẽ bị rửa trôi. Lượng KN càng lớn, lượng KT
gắn thành công với KN trong đĩa càng thấp do "cạnh tranh".

(4) Thêm KT thứ cấp (KT của KT ở bước 1). KT thứ cấp gắn với enzym.
(5) Thêm cơ chất. Lượng enzym còn dư sẽ giải phóng tín hiệu hỳnh quang hay tín
hiệu màu.
Trong phương pháp này, hàm lượng KN gốc càng cao, tín hiệu sản sinh càng yếu.
Một số trường hợp, enzym được gắn với KN chứ không phải KT.
16


II. E.coli O157: H7:
EHEC còn được gọi là E.coli sinh độc tố Shiga. Yếu tố động lực chính của EHEC
là độc tố Stx (Shiga toxin) hay độc tố gây độc đối với tế bào Vero
VT(veroccytotoxin) vì vậy loại này thuộc nhóm có tên là VTEC – Verocytotoxin
E.coli.Hiện nay, có ba loại Stx do EHEC sinh ra đã được xác định là Stx1, Stx2 và
Stx2v.Các độc tố này được mã hóa bởi các gen prophage thích hợp trên nhiễm sắc
thể. Độc tố Shiga hủy hoại chọn lọc các vi nhung mao hất thu của tế bào biểu mô
ruột.Nó cũng xâm nhập vào tế bào biểu mô đại tràng,ức chế quá trình tổng
hợp protein dẫn đến làm chết tế bào. Hậu quả là viêm đại tràng xuất huyết, gây tiêu
chảy phân như máu. Những trường hợp hoại tử nặng có thể gây thủng ruột. Stx còn
có thể gây hội chứng tăng ure huyết tan máu (HUS-haemorrhagicuremic
syndrome). Stx vào máu đến thận gây tổn thương tế bào biểu mô tiểu cầu thân,làm
hẹp và tắc mao mạch tiểu cầu thận. Hậu quả của quá trình này là mức lọc của thận
suy giảm, bệnh nhân bị suy thận cấp
1. Sơ lược về E.coli O157: H7:
Escherichia coli O157: H7 là một

Escherichia coli O157: H7

enterohemorrhagic serotype của vi
khuẩn Escherichia
nguyên

nhân

gây

coli và
ra

là
bệnh.

Nhiễm E.coli O157: H7 sau khi
uống thực phẩm bị ô nhiễm hoặc Hình ảnh địa hình của các thuộc địa của E. coli
nước, hoặc tiếp xúc bằng miệng với
các bề mặt bị ô nhiễm. E.coli

chủng H7 (A) 43895OW (:O157 curli phi sản xuất)
và (B) 43895OR (curli sản xuất) được trồng trên môi
trường thạch trong 48 giờ ở 28 ° C.

O157:H7 có thể được tìm thấy
trong ruột và trong phân của các loài gia súc, đặc biệt là trong phân bò. Vi khuẩn
này được xác định lần đầu tiên vào năm 1982 tại Hoa Kỳ nhân biến cố ngộ độc
thực phẩm do hamburger gây ra. Từ đó vi khuẩn này còn có tên là vi khuẩn của
17


bệnh hamburger. Tại lò sát sinh, E.coli O157:H7 hiển diện trong phân và có thể lây
nhiểm vào quầy thịt. Thịt bằm, thịt xay hay còn gọi là thịt hamburger nếu là thịt bò
thường thì có tỷ lệ nhiểm khuẩn cao nhất, ngoài ra E.coli O157:H7 cũng còn có thể

nhiểm vào nguồn nước (nếu nước không được khử rùng bằng cholorine), vào rau
cải, trái cây, giá sống, rượu cidre (apple cidre), sữa và các loại nước trái cây trong
lon, trong hộp nếu chúng không được khử trùng trước khi bán ra.
2. Đặc điểm:
Kích thước nhiễm sắc thể của E.coli O157: H7 là 5.5 Mb. Gen này bao gồm một
xương sống tự 4. 1 Mb bảo tồn trong tất cả E.coli chủng. Việc còn lại là cụ thể
cho E.coli O157: H7. Ngoài ra, hệ gen so sánh của E.coli O157: H7 với
nonpathogenic E. coli K12 mất 0,53 Mb của DNA E.coli O157: H7 việc giảm gen
cũng đã đóng một vai trò trong E.coli O157: H7 tiến hóa. Đa số các E.coli O157:
H7 trình tự DNA đặc hiệu (1,4 Mb) đều ngang chuyển DNA ngoại như prophage và
prophage giống như các yếu tố. E.coli O157: H7 có chứa 463 gen thực khuẩn liên
quan so với chỉ có 29 trong E.coli K-12. Một sự thay đổi G + C là một trong những
dấu hiệu cho thấy một khu vực của bộ gen đã được chuyển đoạn theo chiều ngang,
ước tính rằng ít nhất 53 loài khác nhau đã góp phần vào những trình tự này duy
nhất trong E.coli O157: H7. Việc thêm và mất DNA đã đóng một vai trò quan trọng
trong sự phát triển của bệnh sinh của E.coli O157: H7.
Một số nghiên cứu so sánh và dịch tễ cho thấy E.coli O157: H7 có thể có nguồn
gốc từ các phi toxigenic và ít độc lực chủng E.coli O55: H7 .E.coli O157: H7 đã
nổi lên qua bốn bước tuần tự; (i) thu được của một vi khuẩn stx2 chứa, (ii) thu lại
của Po157 và RFB khu vực, (iii) thu lại của bacteriophage stx1 chứa, và (iv) mất
khả năng lên men D-sorbitol và mất beta -glucuronidase (gud) hoạt động.
3. Cơ chế gây bệnh của E.coli O157:H7:

18


_Độc lực của STEC việc tạo ra enterohaemolysin (EHEC-Hly) và độc tố chịu nhiệt
EASTI. Mà EHEC-Hly được mã hoá bởi gen trên plasmid 60 Mda (pO157),
plasmid này được tìm thấy ở tất cả các dòng O157:H7.
_Hầu hết ổ dịch STEC/EHEC là do O157:H7,

_Phát triển nhanh ở 30 – 420C, tăng trưởng khó khăn ở 43 -440C, ngừng tăng
trưởng ở 450C.
_Liều gây nhiễm: rất nhỏ, từ 10 -100 vi khuẩn (Griffin 1994; Paton 1996), hiện
diện trong phân, thực phẩm với tần số thấp hơn so nhóm non - O157 (Paton, 1998).
_Độc tố Shiga: hủy hoại các vi nhung mao hấp thu cả tế bào biểu mô ruột, ức chế
quá trình tổng hợp protein của tế bào biểu mô đại tràng, dẫn đến làm chết tế bào,
gây hội chứng HUS.
4. Phát hiện E.coli O157:H7 bằng phương pháp ELISA:
4.1. Phản ứng ELISA gián tiếp:
a. Nguyên liệu:
_Microplate
_Kháng nguyên chuẩn, huyết thanh thỏ,conjugate (chất gắn kết) có gắn enzym
∆=

peroxidase, bub

trate (chất tạo màu phản ứng, thường là TMBZ (3,3’ 5,5’

tetramethybenzodine)), PBS,PBS-Tween, Sữa tách bơ(casein).
_Máy đọc phản ứng.
b. Trình tự phản ứng:
_Bước 1. Phủ kháng nguyên 100µl kháng nguyên pha loãng ở nồng độ thích hợp
được gắn trưc tiếp vào đĩa microplate. Thời gian ủ kháng nguyên thường là qua
đêm ở nhiệt độ 4oC hoặc 37oC trong 2h. Đổ bỏ dung dịch có trong microplate. Rồi
dùng dung dịch PBS( Phosphate Buffer Saline) có chứa Tween 20, 0,05% rửa đĩa 3
lần, và đập khô.
_Bước 2. Phủ đĩa bằng 200µl dung dịch sữa tách bơ 5% mỗi giếng, ủ ở nhiệt độ
phòng trong 2 giờ hoặc lắc ở 37 oC sau 1 giờ. Đổ bỏ dung dịch có trong microplate.
19

Rồi dùng dung dịch PBS( Phosphate Buffer Saline) cò chứa Tween 20, 0,05% rửa
đĩa 3 lần, và đập khô.
_Bước 3. Gắn kháng thể : 100µl huyết thanh pha loãng ở nồng độ thích hợp bằng
dung dịch PBS-sữa tách bơ 5%. Kháng thể ủ trong đĩa ở nhiệt độ 37 oC, lắc sau 30
phút. Đổ bỏ dung dịch có trong microplate. Rồi dùng dung dịch PBS( Phosphate
Buffer Saline) cò chứa Tween 20, 0,05% rửa đĩa 3 lần, và đập khô.
_Bước 4. Kháng thể đặc hiệu loài : 100µl conjugate pha loãng bằng PBS với độ pha
loãng là 10.000 lần, nhỏ mỗi giếng và ủ ở 37 oC trong 30 phút. Đổ bỏ dung dịch có
trong microplate. Rồi dùng dung dịch PBS( Phosphate Buffer Saline) cò chứa
Tween 20, 0,05% rửa đĩa 5 lần, và đập khô.
_Bước 5. Cơ chất tạo màu : 100µl TMB vào mỗi giếng, để nhiệt độ phòng 15 phút,
phản ứng sẽ chuyển sang màu xanh lục nếu là dương tính. Dừng phản ứng bằng
dung dịch H2SO4 1M, lúc này phàn ứng có màu vàng.
_Bước 6. Đọc đĩa trên máy đọc đĩa ELISA ở bước sóng 450 nm. Kháng nguyên thu
hoạch như trên, đươc đo nồng độ protein và giữa ở nhiệt độ -200C.
4.2. Ứng dụng của kháng thể đơn dòng trong xác định E.coli O157: H7:
_E.coli O157:H7 có hai loại kháng ngyên có ý nghĩa trong chuẩn đoán là kháng
nguyên O157 và H7. Vì vậy, kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các epitop của hai
loại kháng nguyên này thường sử dụng để xác định vi khuẩn trong các hệ thống
chuẩn đoán huyết thanh.
_Kháng thể đơn dòng đặc hiệu MAB 46E9-9 nhận biết đặc hiệu kháng nguyên lông
H7 của loài E.coli.
Kháng thể MAB 13C4 nhận biết theo hướng nhận biết kháng nguyên độc tố Stx1
của E.coli O157:H7.
20


4.3. Ưu nhược điểm của phương pháp Elisa:
Ưu điểm:

_Nhanh chóng và thuận tiện.
_Kháng nguyên của nồng độ rất thấp hoặc không biết có thể được phát hiện kể từ
khi bắt giữ kháng thể chỉ lấy kháng nguyên cụ thể.
Nhược điểm:
_Thời gian xét nghiệm lâu.
_Chỉ có các kháng thể đơn dòng có thể được sử dụng như cặp phù hợp.
_Kháng thể đơn dòng có thể chi phí nhiều hơn so với các kháng thể đa dòng.
_Enzyme /chất nền phản ứng trong microwells phải được đọc càng sớm càng tốt
5. Các vụ nhiễm độc do E.coli O157: H7:
*Vụ án bánh mì kẹp thịt bò nhiễm khuẩn gây chấn động nước Mỹ
Thứ Tư ngày 13/1/1993, Brainne được chuyển tới Bệnh viện Nhi thành phố Seattle
vì cô bé bắt đầu đau bụng từ ba ngày trước. Một tuần trước, Brianne đã hai lần ăn
bánh mì kẹp thịt bò tại cửa hàng thức ăn nhanh Jack in the Box. Trong lúc dẫn con
tới phòng khám bác sĩ gia đình, mẹ của Brianne phát hiện dấu vết máu trong nước
tiểu con gái.Các bác sĩ chẩn đoán Brianne bị hội chứng tán huyết, tăng urê máu
(HUS), một biến chứng nguy hiểm gây ra bởi khuẩn E. coli sau nhiều ngày tiêu
chảy và thường gây suy thận đe dọa tính mạng, tình hình trở nên tệ hại hơn khi
nhiều bộ phận cơ thể cô lần lượt ngưng hoạt động. Một tuần sau Brianne rơi vào
cơn hôn mê kéo dài tới 42 ngày. Cô bị phù toàn thân, da vàng. Các bác sĩ buộc phải
phẫu thuật cắt bỏ ruột già của cô bé. Do lá lách của Brianne tê liệt, không thể sản
xuất ra insulin nên cô bị tiểu đường. Brianne đành sống nhờ các máy trợ tim, phổi
và thận. Vào hôm 24/2 Brianne tỉnh lại và dần hồi phục. Hơn 1.000 cơn co giật
trong gần nửa năm trời khiến hầu hết các cơ quan nội tạng và não bị thương tổn, cơ
bị teo. Cùng nhiễm bệnh trong đợt dịch với Brianne có hơn 700 người, trong đó
21


khoảng 170 người nhập viện và 4 trẻ em qua đời.Cùng lúc Brianne Kiner phát
bệnh, Sở Y tế Washington (WDOH) được tin rằng số bệnh nhân nhập viện ở khu
vực Seattle với triệu chứng đi cầu ra máu đang gia tăng, một vài trẻ em trong số đó

được xác nhận hội chứng HUS do vi khuẩn E. coli dòng O157:H7.
Trong vòng 2 tuần, từ ngày 3/1 đến 17/1/1993, có 5 người, phần lớn là trẻ em ở
Weston Washington đã vào viện với các triệu chứng đau bụng và đi tiêu chảy ra
máu. Một vài em do suy thận phải chạy thận nhân tạo.
Chỉ riêng ngày 19/1 có 38 ca được ghi nhận với các triệu chứng tương tự. Khoảng
40% bệnh nhân dưới 6 tuổi và 2/3 số bệnh nhân trên 15 tuổi. Có nạn nhân tử vong
do suy thận, bao gồm một bé gái 2 tuổi ở hạt Snohomish, một bé trai 2 tuổi khác ở
Tacoma và một bé trai 16 tháng tuổi ở Bellingham
*Dịch E. Coli vừa bùng phát tại Washington khiến ít nhất 32 trẻ nhiễm bệnh sau
khi chúng tham gia một lễ hội sữa và tiếp xúc với một vài loài gia súc.
Theo trang Food Poisioning Bulettin, dịch E.coli đang bùng phát trên diện rộng tại
Lynden, Washington khiến ít nhất 32 trẻ mắc bệnh tính cho tới ngày 1/5 vừa qua.
Những trẻ em này bắt đầu xuất hiện triệu chứng sau khi cùng khoảng 1300 trẻ khác
tới tham dự Lễ hội những người làm sữa ở hạt Whatcom.
Được biết trong quá trình tham gia sự kiện này, những đứa trẻ đã tiếp xúc với một
số loài vật như ngựa, cừu, nhỏ, gà và bê; và được tặng sữa chocolate tiệt trùng.
Hiện các quan chức y tế chưa thể xác định liệu có trẻ nào đang nhiễm chủng E. coli
O157:H7 mà lại xuất hiện thêm các biểu hiện của hội chứng tán huyết – tăng ure
máu (HUS) cũng do khuẩn E.coli gây ra hay không. Trẻ nhỏ là những đối tượng dễ
mắc căn bệnh chết người này nhất. HUS có thể gây ra những căn bệnh mãn tính
như đột quỵ, suy tim, suy hệ thần kinh, liệt cho dù các triệu chứng ban đầu có thể
chữa khỏi.
22


6. Khả năng gây bệnh và biểu hiện bệnh:
Ở những người có sức khỏe bình thường E.coli O157:H7 sẽ gây rối loạn tiêu hóa,
đau bụng, tiêu chảy, nôn mửa, thân nhiệt có thể tăng chút ít. Bình thường bệnh sẽ
khỏi sau một tuần hoặc 10 ngày. Bệnh có thể nặng hơn ở trẻ em, ở những người cao
tuổi và ở những người mà hệ miễn dịch đã bị suy giảm.

yếu sẵn vì bệnh tật. Từ 3%-5% trường hợp có thể gây biến chứng sau vài ba tuần
lễ… Độc tố Verotoxin của E.coli.O157:H7 làm xung huyết (hemolysis), hủy hoại
niêm mạc ruột gây têu chảy có máu, làm hư thận và đồng thời làm giảm lượng
nước tiểu. Khoa học gọi đây là hội chứng HUS ( Hemolytic Uremic Syndrome), rất
nguy hiểm có thể chết, bằng không thì cũng cần phải được lọc thận suốt đời. Nó
rất nguy hiểm , với mức thấp chỉ khoảng từ 10 đến 100 CFU của E.coli O157: H7
là đủ để gây nhiễm trùng, so với hơn một triệu CFU của chủng E.coli gây bệnh
khác.
Ví dụ, E.coli O26 sản xuất cùng một loại độc tố E.coli O157 sản xuất, và gây ra
một căn bệnh tương tự, mặc dù nó thường là ít có khả năng dẫn đến các vấn đề về
thận (gọi là hội chứng urê huyết tán huyết, hoặc HUS).
Các triệu chứng của nhiễm STEC khác nhau cho từng người nhưng thường bao
gồm chuột rút nặng bụng, tiêu chảy (thường có máu), và ói mửa. Nếu có sốt, nó
thường không phải là rất cao (ít hơn 101˚F / ít hơn 38.5˚C). Hầu hết mọi người
được tốt hơn trong vòng 5-7 ngày. Một số bệnh nhiễm trùng là rất nhẹ, nhưng
những người khác nghiêm trọng hoặc thậm chí đe dọa tính mạng.
Khoảng 5-10% những người được chẩn đoán nhiễm STEC phát triển một biến
chứng đe dọa tính mạng được gọi là hội chứng urê huyết tán huyết (HUS). Manh
mối rằng một người đang phát triển HUS bao gồm số lần đi tiểu giảm, cảm thấy rất
mệt mỏi, và mất màu hồng ở má và bên trong mí mắt. Người có HUS nên phải
23


nhập viện vì thận của họ có thể ngừng làm việc và họ có thể phát triển các vấn đề
nghiêm trọng khác. Hầu hết những người có HUS phục hồi trong vòng một vài
tuần, nhưng một số bị tổn thương vĩnh viễn hoặc chết.
7. Nguyên tắc điều trị, phòng bệnh và đối tượng dễ lây nhiễm bệnh:
7.1. Điều trị:
E.coli thuộc vào các vi khuẩn có tỷ lệ kháng thuốc cao, nhất là các chủng phân lập
được từ nước tiểu, vì vậy cần phải làm kháng sinh đồ để chọn kháng sinh thích

hợp.
Ngoài việc sử dụng kháng sinh, một số việc khác rất có giá trị trong điều trị như
bồi phụ nước, điện giải trong trường hơp ỉa chảy (việc này nhiều khi có vai trò
quyết định để cứu sống bệnh nhân), giải quyết các cản trở trên đường tiết niệu, rút
ống thông sớm nếu có thể được.
Đối với các bệnh gây ra do E.coli O157: H7, không có phương pháp điều trị hiện
nay có thể chữa trị các nhiễm trùng, làm giảm triệu chứng hoặc ngăn chặn các biến
chứng. Đối với hầu hết mọi người, tùy chọn tốt nhất là nghỉ ngơi và uống nhiều
nước để giúp đỡ với tình trạng mất nước và mệt mỏi. Tránh dùng một thuốc chống
tiêu chảy, điều này làm chậm hệ thống tiêu hóa, ngăn chặn cơ thể loại bỏ các độc
tố.
Thực hiện theo các biện pháp này để ngăn ngừa mất nước và giảm triệu chứng
trong khi hồi phục:
Chất lỏng. Uống nhiều chất lỏng, bao gồm nước, nước sô-đa và nước canh, gelatin
và nước trái cây. Tránh táo và nước ép quả lê, cà phê và rượu.
Thêm các loại thực phẩm dần dần. Khi bắt đầu cảm thấy tốt hơn, ăn vào ít chất
xơ thực phẩm lần đầu tiên. Hãy thử bánh soda, bánh mì nướng, trứng hoặc cơm.
24


Tránh các loại thực phẩm nhất định. Sản phẩm sữa, thức ăn béo, chất xơ thực
phẩm hoặc các loại thực phẩm rất cứng có thể làm triệu chứng nặng hơn.
7.2. Phòng bệnh
Hiện nay chưa có vắc xin, thuốc có thể bảo vệ khỏi bệnh E.coli, mặc dù các nhà
nghiên cứu đang nghiên cứu vắc-xin tiềm năng. Để làm giảm cơ hội tiếp xúc với vi
khuẩn E.coli, tránh các thực phẩm nguy hiểm và tránh lây nhiễm chéo.
Rủi ro từ thực phẩm
Tránh hamburger còn đỏ. Bánh mì kẹp thịt nên được thực hiện tốt. Thịt sống phải
được ướp lạnh càng sớm càng tốt cho đến khi sẵn sàng sử dụng. Khi nướng, thịt có
thể có màu nâu trước khi nó được nấu chín hoàn toàn, vì vậy nên sử dụng nhiệt kế

để đảm bảo rằng thịt được đun nóng ở nhiệt độ tối thiểu là 71 0 C tại điểm dày nhất
của nó. Nếu không có nhiệt kế, nướng thịt cho đến khi không thấy màu hồng ở
trung tâm.
Uống sữa tiệt trùng, nước trái cây và rượu táo. Bất kỳ nước trái cây đóng hộp hoặc
đóng chai được giữ ở nhiệt độ phòng có thể được tiệt trùng, thậm chí nếu nhãn
không nói như vậy. Tránh dùng các sản phẩm sữa còn sống hoặc nước trái cây chưa
được khử trùng.
Rửa nguyên liệu. Mặc dù rửa sẽ không nhất thiết loại bỏ tất cả E.coli, đặc biệt là
rau lá xanh, trong đó cung cấp nhiều điểm cho các vi khuẩn bám vào, rửa cẩn thận
có thể loại bỏ chất bẩn và làm giảm lượng vi khuẩn có thể bám vào.
Tránh lây nhiễm chéo
Rửa dụng cụ. Sử dụng nước xà phòng nóng trên dao, bàn, thớt trước và sau khi tiếp
xúc với sản phẩm tươi sống hoặc thịt sống.

25