PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE VAR. BOULARDII TỪ CHẾ PHẨM THUỐC BIOFLORA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN
SỰ SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN SACCHAROMYCES
CEREVISIAE VAR. BOULARDII TỪ CHẾ PHẨM THUỐC
BIOFLORA

Họ và tên sinh viên: NGUYỄN THỊ THÚY LIỄU
Ngành: BẢO QUẢN CHẾ BIẾN NÔNG SẢN THỰC PHẨM
VÀ VI SINH THỰC PHẨM
Niên khóa: 2007-2011

Tháng 08/2011


PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ SINH
TRƯỞNG CỦA NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE VAR.
BOULARDII TỪ CHẾ PHẨM THUỐC BIOFLORA

Tác giả

NGUYỄN THỊ THÚY LIỄU

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư ngành
Bảo quản chế biến nông sản thực phẩm và Vi sinh thực phẩm

Giáo viên hướng dẫn:
ThS. DƯƠNG THỊ NGỌC DIỆP

TS. VŨ THỊ LÂM AN

Tháng 08 năm 2011
i


LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
Ban Giám Hiệu và Quý Thầy Cô Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh,
đặc biệt là các Thầy Cô Khoa Công nghệ Thực Phẩm đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt
những kiến thức bổ ích và những kinh nghiệm quý báu cho em.
ThS. Dương Thị Ngọc Diệp và TS. Vũ Thị Lâm An đã tận tình chỉ bảo, đóng góp
nhiều ý kiến quý báu cho việc hoàn chỉnh luận văn này.
Người thân, bạn bè đã động viên và giúp đỡ nhiệt tình khi tôi thực hiện đề tài này.
Do hạn chế về thời gian, điều kiện thí nghiệm và kinh nghiệm của bản thân tác giả
nên quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn này sẽ không tránh khỏi những thiếu
sót. Kính mong quý thầy cô và bạn bè đóng góp ý kiến để luận văn được hoàn chỉnh hơn.

ii


TÓM TẮT
Đề tài “Phân lập và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm
men Saccharomyces cerevisiae var. boulardii từ chế phẩm thuốc Bioflora” được tiến hành
tại Phòng thí nghiệm vi sinh và Phòng thí nghiệm hóa sinh thuộc Khoa Công nghệ Thực
Phẩm – Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chi Minh, thời gian thực hiện từ tháng 03 đến
tháng 07 năm 2011.
Mục tiêu của đề tài nhằm phân lập chủng nấm men S. cerevisiae var. boulardii (S.
boulardii) và khảo sát khả năng chống chịu của loài vi sinh này trong điều kiện môi
trường nhiệt độ cao, pH thấp và có tác động của enzyme thủy phân. Đề tài tiến hành

nghiên cứu các vấn đề: phân lập tế bào nấm men S. boulardii từ chế phẩm thuốc Bioflora,
từ đó xây dựng đường cong sinh trưởng của S. boulardii và khảo sát sự ảnh hưởng của
nhiệt độ, pH, enzyme đến khả năng sinh trưởng và phát triển của loài vi nấm này. Tất cả
các thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố với 3 lần lặp
lại.
Kết quả thí nghiệm cho thấy tế bào nấm men S. boulardii sinh trưởng tốt trong môi
trường YNB ở 37 oC, sinh khối đạt cực đại sau 12 giờ nuôi cấy. Tế bào S. boulardii có thể
tồn tại được trong thời gian dài ở nhiệt độ 60 oC, tỷ lệ sống sót sau 1 giờ nuôi cấy là
94,48%. Ở nhiệt độ 80 oC, các tế bào chết hoàn toàn sau 30 phút nuôi cấy. Bên cạnh đó,
sự sinh trưởng và phát triển của nấm men S. boulardii không chịu tác động nhiều bởi môi
trường pH ở các giá trị 4, 6 và 8. Với môi trường có giá trị pH 2, số lượng tế bào nấm
men S. boulardii giảm nhưng không quá nhanh. Tỷ lệ sống sót sau 18 giờ nuôi cấy là
76,88%. Đồng thời, các tế bào nấm men S. boulardii có thể tồn tại được trong môi trường
có sự hiện diện của enzyme tiêu hóa pepsin và pH 1,9.

iii


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa................................................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN.......................................................................................................................ii
TÓM TẮT........................................................................................................................... iii
MỤC LỤC .......................................................................................................................... iii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...............................................................................vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BẢNG............................................................................ viii
Chương 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề ....................................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu đề tài ................................................................................................................ 2
1.3 Nội dung thực hiện ......................................................................................................... 2

Chương 2.TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................... 3
2.1 Tổng quan về probiotic ................................................................................................... 3
2.1.1 Lịch sử probiotic .......................................................................................................... 3
2.1.2 Định nghĩa probiotic .................................................................................................... 4
2.1.3 Vai trò và cơ chế hoạt động của probiotic ................................................................... 5
2.1.3.1 Vai trò của probiotic ................................................................................................. 5
2.1.3.2 Cơ chế tác động của probiotic .................................................................................. 5
2.1.4 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic ........................................................ 6
2.1.5 Một vài kết quả về ứng dụng của probiotic ................................................................. 7
2.2 Tổng quan về nấm men S. boulardii .............................................................................. 7
2.2.1 Lịch sử nghiên cứu S. boulardii .................................................................................. 7
2.2.2 Phân loại ...................................................................................................................... 8
2.2.3 Đặc điểm về hình thái, kích thước và cấu tạo tế bào ................................................... 8
2.2.4 Cấu trúc gen ................................................................................................................. 9
2.2.5 Đặc điểm sinh học ....................................................................................................... 9
iv


2.2.6 Vai trò của S. boulardii ............................................................................................ 10
2.2.7 Một số nghiên cứu về nấm men dược tính S. boulardii ............................................ 12
2.2.7.1 Tính bám dính và khả năng chống chịu dưới tác động của pH acid, enzyme tiêu
hóa và muối mật của S. boulardii ....................................................................................... 12
2.2.7.2 Tính kháng khuẩn ................................................................................................... 14
2.2.7.3 Các điểm giống và khác nhau về cấu trúc phân tử và đặc điểm sinh lý giữa S.
boulardii và S. cerevisiae ................................................................................................... 15
2.2.7.4 Dược động học của nấm men S. boulardii ........................................................... 17
Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 20
3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm................................................................................. 20
3.2 Nguyên liệu................................................................................................................... 20
3.3 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất sử dụng .......................................................................... 20

3.4 Phương pháp thí nghiệm............................................................................................... 21
3.4.1 Phân lập nấm men S. boulardii từ chế phẩm thuốc Bioflora .................................... 21
3.4.1.1 Chuẩn bị mẫu .......................................................................................................... 21
3.4.1.2 Phương pháp phân lập nấm men S. boulardii ........................................................ 21
3.4.2 Xây dựng đường cong sinh trưởng của S. boulardii ................................................. 22
3.4.2.1 Mục đích ................................................................................................................. 22
3.4.2.2 Bố trí thí nghiệm ..................................................................................................... 22
3.4.2.3 Chỉ tiêu theo dõi ..................................................................................................... 22
3.4.2.4 Phương pháp thực hiện ........................................................................................... 23
3.4.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, enzyme đến khả năng sinh trưởng và phát
triển của nấm men S. boulardii........................................................................................... 23
3.4.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm men S.
boulardii ............................................................................................................................. 23
3.4.3.2 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm men S.
boulardii ............................................................................................................................. 23
3.4.3.3 Ảnh hưởng của enzyme tiêu hóa đến khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm
men S. boulardii ................................................................................................................. 24
v


3.5. Xử lý số liệu ............................................................................................................... 25
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................... 26
4.1 Phân lập nấm men S. boulardii từ chế phẩm thuốc Bioflora ....................................... 26
4.2 Khảo sát đường cong sinh trưởng của S. boulardii ...................................................... 27
4.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, và enzyme tiêu hóa đến khả năng sinh
trưởng và phát triển của nấm men S. boulardii ................................................................. 31
4.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm
men S. boulardii ................................................................................................................. 31
4.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường pH đến khả năng sinh trưởng và phát triển của
nấm men S. boulardii ........................................................................................................ 33

4.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của enzyme tiêu hóa đến khả năng sinh trưởng và phát triển của
nấm men S. boulardii ......................................................................................................... 35
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................................. 38
5.1 Kết luận......................................................................................................................... 38
5.2 Đề nghị ......................................................................................................................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................. 39
PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 412

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Saccharomyces boulardii: Saccharomyces cerevisiae var. boulardii
DNA: Deoxyribonucleic acid
EIEC: Enteroinvasive Escherichia coli
EHEC: Enterohemorrhagic Escherichia coli
ETEC: Enterotoxigenic Escherichia coli
EPEC: Enteropathogenic Escherichia coli
FAO: Food and Agriculture Organization - Tổ chức Lương Nông Thế Giới
IgA: Immunoglobulin A
PCR: Polymerase Chain Reaction - Phản ứng khuếch đại gen
RNA: Ribonucleic acid
VSV: Vi sinh vật
WHO: World Health Organization - Tổ chức y tế thế giới
YMA: Yeast Malt Agar
YNB: Yeast Nitrogen Base
Ctv: Cộng tác viên

vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BẢNG
Trang
Hình 2.1 Tế bào S. boulardii ............................................................................................ 8
Hình 2.2 Khả năng sản sinh kháng thể IgA của S. boulardii so với các tác nhân khác . 10
Hình 2.3 Cơ chế kháng khuẩn của S. boulardii .............................................................. 14
Hình 2.4 Tăng trưởng của S. boulardii và S.cerevisiae W303 trong môi trường YPD
(2% glucose) ở 30 oC và 37 oC ...................................................................................... 16
Hình 2.5 Sự sống sót của S. boulardii và S. cerevisiae W303 ở các điều kiện 49 oC,
52 oC, môi trường mô phỏng dạ dày và môi trường mô phỏng ruột .............................. 17
Hình 2.6 Thời gian loại thải S. boulardii ở người khi được dùng một liều duy nhất (1
g). .................................................................................................................................... 18
Hình 2.7 Tỷ lệ thu hồi S. boulardii ở 3 liều dùng 200 mg, 1 g và 3 g .......................... 18
Hình 3.1 Pha loãng và cấy trang mẫu ............................................................................. 22
Hình 4.1 Khuẩn lạc nấm men S. boulardii ..................................................................... 26
Hình 4.2 Tế bào S. boulardii dưới kính hiển vi.............................................................. 27
Hình 4.3 Đường cong sinh trưởng của S. boulardii trên môi trường YNB .................. 28
Hình 4.4 Đường cong sinh trưởng của S. boulardii trên môi trường YNB .................. 29
Hình 4.5 Đường cong tăng trưởng của S. boulardii ở 28 oC và 37 oC trong 48 giờ....... 30
Hình 4.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm men
S. boulardii ..................................................................................................................... 31
Hình 4.7 Tỷ lệ sống sót của S. boulardii sau 30 phút và 1 giờ nuôi cấy trong môi trường
YNB ở nhiệt độ 60 oC..................................................................................................... 32
Hình 4.8 Tỷ lệ sống sót của S. boulardii sau 30 phút và 1 giờ nuôi cấy trong môi trường
YNB ở nhiệt độ 80 oC..................................................................................................... 33
Hình 4.9 Sơ đồ biểu diễn ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng và phát triển của
nấm men S. boulardii ..................................................................................................... 34

viii

Hình 4.10 Tỷ lệ sống sót của S. boulardii theo thời gian tăng sinh trong môi trường
YNB với điều kiện pH 2. ................................................................................................ 35
Hình 4.11 Sơ đồ biểu diễn ảnh hưởng của enzyme tiêu hóa đến khả năng sinh trưởng và
phát triển của nấm men S. boulardii............................................................................... 36
Hình 4.12 Tỷ lệ sống sót của S. boulardii theo thời gian tăng sinh trong môi trường
YNB với điều kiện pH 1,9 và có enzyme tiêu hóa. ........................................................ 37
Bảng 2.1 Khả năng chịu đựng pH thấp, muối mật và khả năng bám dính của 8 dòng S.
boulardii và 18 dòng S. cerevisiae ................................................................................. 13

ix


Chương 1

MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Probiotic được định nghĩa "là các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường
tiêu hoá với một số lượng đủ sẽ đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ” (FAO/WHO, 2001).
Nhiều probiotic đã và đang được ứng dụng phổ biến trong các sản phẩm thực phẩm, thực
phẩm chức năng và dược phẩm. Trong thực phẩm, những probiotic hiện đang được ứng
dụng nhiều nhất là vi khuẩn Bifidobacterium và Lactobacillus (Sanders, 1998).
Tổ chức Lương Nông Thế Giới (FAO) và Y Tế Thế Giới (WHO) (2001) khuyến
cáo rằng các sản phẩm thực phẩm có chứa probiotic nên có ít nhất 106 vi sinh vật sống
trong mỗi g hoặc ml của sản phẩm, vì ở mật độ này các probiotic mới đảm bảo phát huy
được các đặc tính sinh học cho cơ thể người và động vật. Tuy nhiên, có một thực tế là lợi
ích sinh học của các probiotic chỉ có tác dụng khi những vi sinh vật này tồn tại được trong
điều kiện môi trường khắc nghiệt của hệ thống đường ruột vật chủ, ví dụ với hiện diện
của nhiều enzyme thủy phân hay nồng độ acid và muối mật cao… Bởi vì đối với vi
khuẩn Bifidobacterium, nhiều nghiên cứu đã phát hiện ra khả năng chống chịu rất kém

của probiotic này trong những điều kiện môi trường không được thuận lợi, thậm chí ngay
cả trong sản phẩm mà nó thường hiện diện đó là sữa chua.
Saccharomyces cerevisiae var. boulardii (thường được gọi là Saccharomyces
boulardii), loài nấm men được phát hiện trên trái vải thiều Đông Dương vào những năm
1920, là loài nấm men duy nhất được cho là có tính năng cải thiện hệ vi sinh vật đường
ruột và giúp kiểm soát bệnh tiêu chảy. Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh S.
boulardii có khả năng chống viêm, kháng khuẩn, chuyển hóa trao đổi chất và giải độc .
Bột S. boulardii sấy đông khô (sấy thăng hoa) đang là dạng sử dụng phổ biến ở nhiều
nước trên thế giới, với hình thức là dược phẩm hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan đến
1


đường ruột và tiêu chảy. Các ứng dụng khác của S. boulardii chưa thấy công bố. Tại Việt
Nam, S. boulardii chủ yếu đang được nhập khẩu và sử dụng dưới dạng thuốc hỗ trợ tiêu
hóa như Bioflora, Florastor 250, Ultra-levure hay Normagut.
Với mục đích tìm hiểu về S. boulardii trên phương diện chuyên môn là vi sinh
trong công nghệ thực phẩm, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập và khảo sát
các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae var.
boulardii từ chế phẩm thuốc Bioflora”, từ đó bổ sung thêm kiến thức và khả năng vận
dụng thực tiễn loại probiotic này.
1.2 Mục tiêu đề tài
Phân lập chủng nấm men S. boulardii và khảo sát khả năng chống chịu của loài vi
nấm này trong điều kiện môi trường nhiệt độ cao, pH thấp và có tác động của enzyme
thủy phân để khẳng định hơn về đặc tính probiotic vượt trội của S. boulardii so với các
loài VSV khác và lựa chọn chế độ sản xuất tối ưu để sản phẩm vẫn giữ nguyên đặc tính
sinh học sau quá trình sản xuất. Đồng thời, thí nghiệm xây dựng đường cong sinh trưởng
của nấm men S. boulardii để xác định thời điểm thu sinh khối tối ưu phục vụ cho nhu cầu
sản xuất sản phẩm từ S. boulardii bằng phương pháp sấy phun.
1.3 Nội dung thực hiện
• Phân lập nấm men S. boulardii từ chế phẩm thuốc Bioflora.

• Khảo sát đường cong sinh trưởng của S. boulardii.
• Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, enzyme đến khả năng sinh trưởng và
phát triển của nấm men S. boulardii.

2


Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về probiotic
2.1.1 Lịch sử probiotic
Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20. Vào năm 1907
Elie Metchnikoff - nhà khoa học người Nga làm việc tại viện Pasteur, được giải
thưởng Nobel - đã chứng minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các
nội độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe
của những người Cô-dăc ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới
115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên
men, điều này được ông báo cáo trong sách “Sự kéo dài sự sống” – “The Prolongation
of life”, xuất bản năm 1908.
Cùng thời kỳ với Metchnikoff, Henry Tissier (1906), một nhà nghiên cứu nhi
khoa người Pháp, đã phát hiện ra rằng khi quan sát phân của những trẻ bị tiêu chảy thì
thấy số lượng vi khuẩn hình có hình chữ Y thấp so với trẻ bình thường nên đã đề xuất
cho thêm vi khuẩn này vào những trẻ bị tiêu chảy.
Có thể nói Tissier và Metchnikoff là những người đầu tiên đưa ra những đề
xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về
probiotic.
Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota (1899 - 1982) phân lập và
nuôi cấy được một chủng vi khuẩn thuộc loài Lactobacillus casei. Chúng đề kháng
mạnh mẽ với dịch dạ dày (nơi có độ acid rất cao) và dịch mật cùng với các enzyme

tiêu hóa khác, do đó chúng đến được ruột non và phát triển được ở đó.
Cùng năm đó, các nhà nghiên cứu Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus
acidophilus có khả năng làm giảm bệnh táo bón thường xuyên. Tại trường đại học
Havard, các nhà khoa học đã phát hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng một vai trò

3


quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và
các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất ra được. Sau đó 5
năm, một trong các đồ uống lên men từ sữa - đặt tên là “Yakult” được cho là hỗ trợ
sức khỏe đường ruột (intestinal health) - bắt đầu được sản xuất. Khái niệm probiotic
được chấp nhận ở Châu Á sau nhiều năm các sản phẩm sữa lên men probiotic đầu tiên
được giới thiệu ở Châu Âu.
Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacterium hoặc Lactobacillus
được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới. Đây được xem như những nguồn
thực phẩm giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như vật nuôi.
2.1.2 Định nghĩa probiotic
Theo ngôn ngữ Hi Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống”. Ý tưởng sử dụng vi
khuẩn probiotic đã được Elie Metnhicoff khởi xướng vào năm 1907. Khi khảo sát việc
tiêu thụ sữa chua của người Bungary, tác giả đã tìm thấy ảnh hưởng vi khuẩn
Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus đến việc kéo dài tuổi thọ của họ. Lilley và
Stillwell (1965) cũng dùng thuật ngữ này để mô tả những chất được bài tiết ra từ một
sinh vật nào đó mà có tác dụng kích thích tăng trưởng cho một sinh vật khác. Năm
1974 Paker đã định nghĩa probiotic là các sinh vật và các hợp chất góp phần vào sự
cân bằng vi sinh hệ trong hệ thống tiêu hóa. Sau đó Fuller (1989) đã chỉnh sửa và định
nghĩa lại, probiotic là sự bổ sung một loại thức ăn vi sinh vật sống mà có tác dụng có
lợi cho vật chủ qua việc cải tiến sự cân bằng hệ vi sinh trong đường ruột của vật chủ.
Từ đó đến nay thuật ngữ probiotic đã được cả thế giới sử dụng để chỉ những
chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích khi được đưa vào cơ thể động vật thông qua thức ăn

hoặc nước uống tạo nên những ảnh hưởng có lợi cho vật chủ.
Hiện có hai định nghĩa được cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của probiotic
và được sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học:
• Theo Fuller (1989), probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn
giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng có lợi
cho vật chủ”.
• Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), probiotic là “các vi sinh vật sống
khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số lượng đủ sẽ đem lại sức
khoẻ tốt cho vật chủ”.
4


2.1.3 Vai trò và cơ chế hoạt động của probiotic
2.1.3.1 Vai trò của probiotic
Từ khi kháng sinh bị cấm sử dụng trong chăn nuôi ở một số nước thuộc khối
liên minh châu Âu (bắt đầu là Thụy Điển vào năm 1986) thì probiotic được coi là một
trong những nguồn thay thế có triển vọng nhất vì có nhiều đặc tính ưu việt. Trên cơ sở
các kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả, Patterson (2003) đã tổng kết các ảnh hưởng
có lợi của probiotic đối với đời sống động vật thể hiện ở các khía cạnh sau:
- Thay đổi cấu trúc quần thể vi sinh vật đường ruột theo chiều hướng có lợi cho vật
chủ.
- Tăng cường khả năng miễn dịch.
- Giảm phản ứng viêm.
- Ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh.
- Tăng sản xuất các acid béo bay hơi.
- Tăng cường quá trình sinh tổng hợp các vitamin nhóm B.
- Tăng hấp thu chất khoáng.
- Làm giảm cholesterol huyết thanh.
- Làm tăng năng suất vật nuôi.
- Giảm hàm lượng amoniac và urê trong chất thải.

Ngoài ra probiotic còn rất an toàn với động vật và thân thiện với môi trường. Vì là
chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích, việc sử dụng probiotic sẽ không tạo ra các chất
tồn dư trong các sản phẩm chăn nuôi có hại cho sức khỏe người tiêu dùng.
2.1.3.2 Cơ chế tác động của probiotic
Theo một số những công trình công bố gần đây, cơ chế hoạt động của vi khuẩn
probiotic có thể theo các khía cạnh: (1) cạnh tranh loại trừ vi khuẩn gây bệnh hoặc tạo
ra hoạt chất ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh; (2) cung cấp chất dinh dưỡng
cần thiết để tăng cường dinh dưỡng cho vật chủ; (3) cung cấp men tiêu hóa để gia tăng
quá trình tiêu hóa ở vật chủ; (4) trực tiếp hấp thụ hoặc phân hủy vật chất hữu cơ hoặc
chất độc trong nước cải thiện chất lượng nước; (5) thay đổi quá trình trao đổi chất của
vi khuẩn và/hoặc kích thích hệ miễn dịch của vật chủ (Phụ lục 1).

5


2.1.4 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic
Một loại probiotic có hiệu quả phải có khả năng tồn tại và hoạt động trong một
môi trường đa dạng dưới nhiều hình thức khác nhau. Theo Fuller (1989) thì probiotic
cần phải có những khả năng như sau: (1) là một sản phẩm sống ở qui mô kỹ nghệ; (2)
không mang mầm bệnh và độc tố; (3) tạo ra tác dụng có lợi trên vật chủ; (4) có khả
năng tồn tại và phát triển trong môi trường ruột của vật chủ; (5) duy trì ổn định và tồn
tại lâu dài để được sử dụng sau này trong điều kiện lưu trữ và điều kiện ngoài hiện
trường.
Nhưng trước hết, chủng VSV probiotic được lựa chọn phải an toàn cho quá
trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng sống sót và chiếm lĩnh (colonization) trong
đường tiêu hóa vật chủ. Các tiêu chuẩn lựa chọn này được hợp lý hóa thông qua các
thí nghiệm in vitro, từ đó sẽ tuyển chọn được các chủng có tiềm năng như là nguồn
probiotic.
Các chủng vi sinh vật probiotic được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chủ yếu sau:
- Tính bám dính trên bề mặt đường tiêu hóa hoặc các tế bào biểu mô: Các

chủng probiotic phải bám dính được vào thành ruột non, khu trú tốt trong đường tiêu
hoá và sinh sôi nảy nở. Khả năng bám dính được xem là một yêu cầu quan trọng để
tăng khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh, bảo vệ biểu mô và tăng khả năng miễn dịch
của vật chủ. Đặc tính này làm tăng khả năng cạnh tranh của các chủng probiotic đối
với các vi sinh vật bất lợi khác.
- Hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh: Lựa chọn được các
chủng có khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn là đặc tính quan trọng nhất trong
phát triển probiotic. Các chủng probiotic cần có hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh
như E. coli, Salmonella và Campylobacterium. Hoạt tính kháng khuẩn của chúng có
thể theo nhiều cơ chế khác nhau như:
+ Sản sinh ra các chất bacteriocin.
+ Làm giảm độ pH bởi khả năng tạo ra acid lactic.
+ Tạo ra H 2 O 2 .
+ Làm giảm độc tố theo các cơ chế khác nhau.
+ Khả năng làm giảm sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh trên bề mặt.
+ Cạnh tranh dinh dưỡng với các vi khuẩn gây bệnh.
6


- Khả năng tồn tại trong môi trường acid dạ dày: Khoang miệng và dạ dày của
vật chủ là nơi có môi trường acid cao với giá trị pH từ 2-3 và có mặt các enzym tiêu
hoá (amylase, protease, lysozyme…). Các chủng vi sinh vật được coi như là nguồn
probiotic phải tồn tại được trong điều kiện này. Hiện nay hình thức vi bọc (hay vi nang
- microcapsule) được khuyến cáo ứng dụng cho các chế phẩm probiotic nhằm tăng khả
năng sống của vi khuẩn probiotic khi đi qua khoang miệng và dạ dày.
- Khả năng chịu muối mật: Thông thường, muối mật trong dịch tiêu hoá của
động vật dao động 1-3%. Để tồn tại và phát triển, các chủng probiotic phải có khả
năng tồn tại và phát triển với nồng độ muối mật ≥ 2%.
- Ngoài ra một số chủng probiotic (nấm men, Bacillus và Lactobacillus) có khả
năng sinh enzyme tiêu hoá như: amylase, xenlulase và protease, lipase và phytase có

vai trò làm tăng khả năng tiêu hoá thức ăn và hấp thu chất dinh dưỡng của vật chủ.
2.1.5 Một vài kết quả về ứng dụng của probiotic
Trong những năm gần đây có khá nhiều nghiên cứu về khả năng sống sót của
probiotic khi đi qua hệ tiêu hóa người. Một số chủng Lactobacillus và Bifidobacterium
được xác định là có khả năng sống sót qua hệ tiêu hóa người và chúng được sử dụng
như vi khuẩn probiotic (Saarela và ctv, 2002).
Hầu hết những nghiên cứu trước đây về probiotic thường tiến hành trên sữa và
các sản phẩm từ sữa như pho mai, sữa chua, kem,... Hiện nay, lĩnh vực này được mở
rộng đối với các sản phẩm về thịt lên men mà không qua xử lý nhiệt như xúc xích
chua, lạp xưởng chua,.... Erkkila (2001), Pennacchia và ctv (2004) cho thấy việc sử
dụng các vi sinh vật có tính probiotic vào trong các sản phẩm thịt lên men có tác dụng
cải thiện giá trị dinh dưỡng. Rebucci (2007) trích dẫn từ Sameshima và ctv (1998) cho
rằng khi sử dụng các vi khuẩn có tính probiotic sẽ tạo ra những hợp chất có mùi thơm
cho sản phẩm xúc xích lên men và những vi khuẩn này có khả năng ức chế sự phát
triển của một số vi khuẩn gây bệnh.
2.2 Tổng quan về nấm men S. boulardii
2.2.1 Lịch sử nghiên cứu S. boulardii
Vào những năm 1920, nhà sinh học người Pháp Henri Boulard đã thực hiện một
chuyến đi vòng quanh châu Á với mục đích tìm kiếm chủng vi sinh vật chịu nhiệt
được dùng trong sản xuất rượu vang. Khi đặt chân đến Đông Nam Á, ông chứng kiến
7


đợt bùng phát một ổ dịch tả lớn trong một ngôi làng. Ông quan sát thấy người dân bản
địa uống một loại trà làm từ vỏ của trái vải và măng cụt để kiểm soát các triệu chứng
của bệnh tả. Từ đó ông nghiên cứu và phân lập được một giống nấm men nhiệt đới
thuộc loài Saccharomyces và ông đã đặt tên của mình cho giống nấm men này
là Saccharomyces boulardii.
Bắt đầu từ năm 1980, hàng loạt các cuộc nghiên cứu về S. boulardii đã được
tiến hành để xác định lợi ích của nó đối với vật chủ và cơ chế hoạt động của nó.

2.2.2 Phân loại
Hàng loạt các cuộc nghiên cứu (McFarland (1996); McCullough và ctv (1998);
Hennequin và ctv (2001); Mitterdorfer và ctv (2002)), với nhiều biện pháp kỹ thuật
tiên tiến: điện di, PCR,… được tiến hành để xác định rõ hơn về nguồn gốc phân loại
của S. boulardii. Và kết quả phân loại về S. boulardii thu được:
Saccharomyces
ngành

boulardii

thuộc

Saccharomycotina,

lớp

giới

nấm,

ngành

Saccharomycetes,

bộ

Ascomycota,

phân

Saccharomycetales,

họ Saccharomycetaceae, chi Saccharomyces.
Kết quả nghiên cứu còn cho ra được S. boulardii và S. cerevisiae là hai loài
khác nhau của chi Saccharomyces hemiascomycete.
2.2.3 Đặc điểm về hình thái, kích thước và cấu tạo tế bào

Hình 2.1: Tế bào S. boulardii
Tế bào nấm men S. boulardii có hình elip, hình bầu dục hay đôi khi có hình cầu
với vách tế bào dày, khoảng 5-10 μm. Thành tế bào chiếm khoảng 30% trọng lượng
khô của tế bào, được cấu trúc gồm các polysaccharide (85%) và protein (15%). Trong
thành phần polysaccharide có glucose (80-91%), N-acetylglucosamine (GlcNAc) (18


2%), mannose (10-20%). Tế bào chất có chứa các aminoacid, vitamin B, enzyme và
nhiều hợp chất khác (Lesage và ctv, 2006).
2.2.4 Cấu trúc gen
S. boulardii và S. cerevisiae được xác định là hai loài khác nhau của
chi Saccharomyces hemiascomycete. Hệ gen của S. boulardii gần giống với S.
cerevisiae - sinh vật có nhân điển hình. Trình tự bao gồm 13.000.000 cặp base, 6.275
gen, trong đó có 5885 gen mã hóa cho protein. Khoảng 140 gen mã hóa cho RNA
ribosome (rRNA), 40 gen cho RNA thông tin (mRNA) và 275 gen cho RNA vận
chuyển (tRNA). Khoảng 23% hệ gen của S. boulardii giống hệt với hệ gen của con
người (Goffeau và ctv, 1996).
2.2.5 Đặc điểm sinh học
Tuy cùng một chi nhưng trong thực tế, đặc điểm sinh lý và trao đổi chất của S.
boulardii và S. cerevisiae rất khác biệt, S. boulardii chịu được nhiệt độ và kháng acid
mạnh hơn S. cerevisiae. Trong khi các chủng S. cerevisiae phát triển và chuyển hóa
các chất ở 30 oC thì S. boulardii lại là một loài chịu nhiệt, phát triển tối ưu ở 37 oC
(Czrucka và ctv, 2007). Những nghiên cứu gần đây đã xác định rằng S. boulardii có

thể chịu được độ pH thấp ở dạ dày và chịu được tác động của muối mật ở ruột.
S. boulardii là loài nấm men yếm khí tùy tiện, nó có thể phát triển trong điều
kiện hiếu khí hoặc kỵ khí.
Theo Van Rij (1984); Martini (1998) và Lourens-Hattingh và Viljoen (2001), S.
boulardii không đồng hóa hay lên men đường lactose, sinh trưởng và phát triển tốt trên
cơ chất galactose, glucose. Trong quá trình chuyển hóa carbohydrate có sinh một
lượng nhỏ acid lactic (1,04%) và rượu (0,5%). Ngoài ra, S. boulardii còn chuyển hóa
được các monosaccharide, polysaccharide, oligosaccharide, ethanol, acetate, glycerol,
pyruvate và lactate. S. boulardii là vi sinh vật (VSV) dị dưỡng, sử dụng năng lượng từ
glucose qua con đường glycolysic. S. boulardii cũng không thể sử dụng một số acid
hữu cơ, như: acid citric và acid succinic, nhưng tăng trưởng tốt trên môi trường chứa
acid lactic, và không thủy phân các hợp chất protein, lipid.
S. boulardii sinh sản vô tính theo phương thức nảy chồi. Trong quá trình sinh
sản vô tính, chồi mới phát triển từ tế bào nấm men mẹ khi các điều kiện thích hợp và

9


sau đó, khi chồi đạt tới kích thước của tế bào nấm men trưởng thành thì nó tách ra khỏi
tế bào nấm men mẹ.
2.2.6 Vai trò của S. boulardii
Các nghiên cứu đã chứng minh rằng S. boulardii không chỉ mang lại hiệu quả
cho đường ruột mà còn trợ giúp đắc lực cho hệ miễn dịch:
• S. boulardii giữ vai trò quan trọng trong việc phát triển và hoạt động của hệ
miễn dịch niêm mạc ruột: nó giúp hệ miễn dịch ruột sản sinh kháng thể IgA
chống lại độc tố khi ruột nhiễm vi khuẩn gây bệnh, lưu ý rằng 80% hệ miễn
dịch của cơ thể nằm ở ruột (Hình 2.2).

Hình 2.2: Khả năng sản sinh kháng thể IgA của S. boulardii so với các tác nhân khác
(Nguồn: Qamar và ctv, 2000)

Theo nghiên cứu của Qamar và ctv (2000) (Hình 2.2), nấm men S. boulardii
kích thích giúp sản sinh một lượng lớn IgA - đóng vai trò quan trọng trong miễn dịch
niêm mạc ruột. Vai trò của S. boulardii tăng cao hơn so với các tác nhân khác.
• S. boulardii tiết polyamine (spermine và spermidine) trong quá trình vận
chuyển qua đường ruột để điều chỉnh tổng hợp gen và protein,
kích thích hoạt động của các enzyme ở niêm mạc đại tràng.
• Kích thích hệ miễn dịch tự nhiên: Kích hoạt hệ thống lưới nội mô, gia tăng
sự di cư của bạch cầu đơn nhân, bạch cầu hạt. Hơn nữa còn làm gia tăng số
lượng tế bào Kupfer (đại thực bào hình sao).
• Ngăn ngừa dị ứng: S. boulardii giúp hệ miễn dịch của cơ thể phân biệt được
giữa kháng nguyên bệnh và kháng nguyên vô hại, nhờ đó ngăn ngừa hệ
10


miễn dịch đáp ứng quá mẫn đối với kháng nguyên vô hại và không gây phản
ứng dị ứng.
• Theo Pothoulakis và ctv (1993); Castagliuolo và ctv (1996), S. boulardii
tiết ra protease 54 kDa có vai trò ức chế độc tố A và B của Clostridium
difficile - vi khuẩn kỵ khí sản sinh hai độc tố (A và B) gây tiêu chảy ở
người. S. boulardii ức chế tăng trưởng của C. difficile, có khả năng kích
thích hoạt động của niêm mạc của vật chủ để tăng cường phản ứng miễn
dịch niêm mạc ruột.
• Thụ thể lectin trên bề mặt tế bào vi nấm làm cho E. coli và S.
typhimurium kết dính vào tế bào vi nấm và bị thải loại qua phân.
• Giảm tăng tiết quá mức nước và Cl- trong tiêu chảy do vi khuẩn tả Vibrio
cholerae gây ra.
• Tăng cường các enzyme thủy phân đường đôi như maltase, sucrase,
lactase… ở niêm mạc ruột làm giảm tiêu chảy do rối loạn men tiêu hóa và
kém hấp thu đường.
• Tăng hấp thu nước và chất điện giải ở người đang bị tiêu chảy.

• Duy trì các acid béo chuỗi ngắn cần thiết cho sự hấp thu nước và chất điện
giải.
• S. boulardii có thể làm giảm các phản ứng tiền viêm của tế bào biểu mô
đường ruột.
Đặc biệt, S. boulardii là một nấm men chứ không phải là vi khuẩn do đó không
bị ảnh hưởng bởi tác động của kháng sinh và sulfamide. Do đó, S. boulardii được xem
là phương tiện hữu hiệu trong việc phòng trị tiêu chảy do mất cân bằng hệ vi sinh
đường ruột trên những bệnh nhân phải điều trị kháng sinh lâu ngày. Nhiều probiotic
khác không có khả năng này.
Hiện nay, tại Việt Nam và trên thế giới, S. boulardii được sử dụng dưới dạng
đông khô trong các dược phẩm giúp hỗ trợ tiêu hóa như Normagut, Bioflora, hay
Ultra-levure,…(Phụ lục 2).

11


2.2.7 Một số nghiên cứu về nấm men S. boulardii
2.2.7.1 Tính bám dính và khả năng chống chịu dưới tác động của pH acid,
enzyme tiêu hóa và muối mật của S. boulardii
Theo nghiên cứu của Van der Aa Kuqhle và ctv (2004) các chủng thuộc dòng S.
boulardii đều có khả năng tồn tại lâu trong môi trường có pH thấp (mô phỏng theo pH
môi trường dạ dày) (khoảng 4 giờ) mặc dù không có sự tăng trưởng trong điều kiện
này. Chúng đề kháng tốt và có khả năng tăng trưởng được trong môi trường có 0,3%
muối mật.
Cũng theo kết quả nghiên cứu của Van der Aa Kuqhle và ctv (2004) (Bảng 2.1)
khả năng bám dính của dòng S. boulardii rất tốt, đặc biệt là các chủng S. boulardii 259
(tỷ lệ bám dính 16,2%), S. boulardii LSB (tỷ lệ bám dính 28%).

12

Bảng 2.1: Khả năng chịu đựng pH thấp, muối mật và khả năng bám dính của 8 dòng S.
boulardii và 18 dòng S. cerevisiae
Các dòng nấm
Khả năng sinh trưởng
Khả năng bám
men
dính (%)
pH 2,5
Muối mật 0,3%
S. cerevisiae var. boulardii từ dược phẩm
7103
+
5,4 ± 3,5
7135
+
4,5 ± 2,9
7136
+
4,5 ± 2,4
259
+
16,2 ± 2,8
Các dòng S. cerevisiae var. boulardii khác
Sb.A
+
1,1 ± 0,3
Sb.L
+
1,9 ± 0,5

Sb.P
+
1,9 ± 0,3
LSB
+
28,0 ± 5,9
S. cerevisiae từ thực phẩm và rau quả
KVL 012
+
1,9 ± 0,7
KVL 013
++
3,4 ± 1,2
CBS 1234
++
2,6 ± 1,4
CBS 1236
++
5,2 ± 1,2
56
+
13,6 ± 3,5
D4
+
++
3,7 ± 1,6
D7
+
++
16,8 ± 3,0

H 78
+
6,1 ± 1,7
H 97
+
7,6 ± 2,1
A6
+
+
2,1 ± 0,6
A18
+
+
1,9 ± 1,0
C1
+
+
2,7 ± 1,2
149
+
+
8,3 ± 2,1
139
+
+
2,2 ± 0,5
38
+
++
2,5 ± 0,5

SR 82
+
5,3 ± 1,6
SR 41
++
7,7 ± 1,7
SR 246
++
4,4 ± 3,0
(Nguồn: Van der Aa Kuqhle và ctv, 2004)
Ghi chú:

- Không tăng trưởng
+ Tăng trưởng nhưng bị ức chế sau 4 giờ
++ Không bị ức chế tăng trưởng

13


2.2.7.2 Tính kháng khuẩn
S. boulardii được xem là tác nhân có hiệu quả trong việc phòng chống và điều
trị bệnh tiêu chảy có liên quan đến C. difficile. Theo Castagliuolo và ctv (1999), S.
boulardii tiết ra enzyme protease 54-kDa để tiêu hóa độc tố A và B do C. difficile sinh
ra. Đồng thời, theo Tasteyre và ctv (2002) các protein trên thành tế bào nấm men S.
boulardii cùng với các enzyme protease serine (PMSF) có thể ức chế sự bám dính của
C. difficile trên niêm mạc ruột từ đó làm giảm sự tác động có hại của C. difficile đối
với vật chủ.

Hình 2.3: Cơ chế kháng khuẩn của S. boulardii
(Nguồn: Zannelo và ctv, 2009).

Theo Zannelo và ctv (2009) (Hình 2.3) cơ chế kháng khuẩn của S. boulardii
diễn ra theo các phương thức như sau:
• Phương thức A: S. boulardii dùng bằng đường uống giúp tăng cường tiết
các immunoglobulin A (IgA) vào trong đường ruột do sự tăng tiết các
polyamine trong quá trình dị hóa của S. boulardii .
• Phương thức B: Độc tố tả (CT) trên bề mặt biểu mô ruột sinh ra adenylate
cyclase (AC) gia tăng sự chế tiết chất điện giải chloride (Cl-), S. boulardii
sinh ra protein 120 kDa để ức chế sự kích hoạt AC từ đó làm giảm tiết
chloride.

14


• Phương thức C: S. boulardii sinh ra protein 54 kDa để thủy phân độc tố A,
B của C. difficile và sinh ra protein 63 kDa có tác động loại nhóm phosphate
của phân tử nội độc tố LPS do E. coli (EPEC) sinh ra.
• Phương thức D: Các tác nhân gây bệnh đường ruột Enterohemorrhagic
Escherichia coli (EHEC), Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) và
Shigella fexneri làm thay đổi tính toàn vẹn của tế bào biểu mô. S. boulardii
có thể loại trừ quá trình phosphoryl hóa chuỗi myosin MLC, giảm sự phân
phối zonula occludens 1 (ZO-1), zonula occludens 2 (ZO-2), và claudin-1,
từ đó khôi phục lại tính thấm của màng ruột.
2.2.7.3 Các điểm giống và khác nhau về cấu trúc phân tử và đặc điểm sinh lý
giữa S. boulardii và S. cerevisiae
Theo McFarland (1996); McCullough và ctv (1998); Hennequin và ctv (2001);
Mitterdorfer và ctv (2002); bằng phân tích DNA (xác định trình tự rDNA) đã xác định
S. boulardii là một loài phụ của loài S. cerevisiae. Trên thực tế, đặc điểm trao đổi chất
và sinh lý của S. boulardii khác xa đối với S. cerevisiae về kiểu tăng trưởng và khả
năng kháng chịu nhiệt độ và môi trường acid. Trong khi hầu hết các chủng S.
cerevisiae phát triển và chuyển hóa các chất ở nhiệt độ 30 °C, S. boulardii là nấm men

chịu nhiệt, phát triển tối ưu ở 37 oC (nhiệt độ sinh lý của cơ thể người (Czrucka và ctv,
2007). Nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng S. boulardii có khả năng chịu đựng tốt
hơn với các điều kiện bất lợi trong môi trường dạ dày mô phỏng so với S. cerevisiae
W303.
Nghiên cứu của Fietto và ctv (2004) khi so sánh về sự sinh trưởng của S.
boulardii và S. cerevisiae lại cho thấy không có sự khác biệt gì nhiều trong tăng
trưởng của hai loài nấm men này ở hai điều kiện nhiệt độ 30 oC và 37 oC. Tuy nhiên,
theo Hình 2.4 có thể thấy S. boulardii tăng trưởng nhanh chóng so với S. cerevisiae ở
cả hai mức nhiệt độ. Đặc điểm này là một lợi thế của S. boulardii trong việc ứng dụng
như là một probiotic bởi thời gian thế hệ ngắn sẽ tạo thuận lợi cho sản xuất công
nghiệp, đồng thời cũng đảm bảo loài vi nấm này thực hiện tốt chức năng cạnh tranh
đối với các VSV khác trong đường tiêu hóa do khả năng tăng trưởng nhanh.

15