NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY ĐỒNG THỜI LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS, BACILLUS SUBTILIS, SACCHAROMYCES CEREVISIAE TRÊN CANH TRƯỜNG MRS CẢI TIẾN

BỘ GIÁO DỤC VÀ DÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY ĐỒNG THỜI
LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS, BACILLUS SUBTILIS,
SACCHAROMYCES CEREVISIAE TRÊN CANH TRƯỜNG
MRS CẢI TIẾN

Họ và tên sinh viên: TRẦN THỊ KIM TRÚC
Ngành: BẢO QUẢN VÀ CHẾ BIẾN NÔNG SẢN THỰC PHẨM
Niên khóa: 2007-2011

Tháng 8/ 2011
1


NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY ĐỒNG THỜI
LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS, BACILLUS SUBTILIS,
SACCHAROMYCES CEREVISIAE TRÊN CANH TRƯỜNG
MRS CẢI TIẾN

Tác giả

TRẦN THỊ KIM TRÚC

Khóa luận được đệ trình đề để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư Ngành:
Bảo Quản Và Chế Biến Nông Sản Thực Phẩm

Giáo viên hướng dẫn:

Ths. BÙI HỒNG QUÂN

Tháng 8/ 2011
i


LỜI CẢM ƠN
Con gởi về Bố Mẹ và gia đình những tình cảm kính yêu mãi mãi.
Tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến quý Thầy Cô khoa Công Nghệ Thực Phẩm
Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tận tình dạy bảo và truyền đại kiến
thức cho tôi trong suốt bốn năm học tại trường.
Tôi xin gửi lòng biết ơn chân thành đến Thầy Bùi Hồng Quân, người đã trực
tiếp hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài này.
Tôi xin cảm ơn Viện Công nghệ Sinh học - Thực phẩm, Trường Đại học Công
Nghiệp TP. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực
hiện đề tài.
Cảm ơn các bạn sinh viên lớp DHSH5, CDSH11 trường Đại Học Công Nghiệp
TP. HCM, đặc biệt là bạn Phạm Ngọc Hà đã đồng hành cùng tôi khi tôi thực hiện đề
tài.
Xin chân thành cảm ơn.
Trần Thị Kim Trúc

ii


TÓM TẮT
Đề tài “Nghiên cứu nuôi cấy đồng thờiLactobacillus acidophilus, Bacillus subtilis,
Saccharomyces cerevisiae trên canh trường MRS cải tiến” được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh
thuộc Viện Công nghệ Sinh học - Thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp TP.HCM

từ tháng 3/2011 đến tháng 7/2011. Các thí nghiệm được thiết kế và thực hiện theo
phương pháp quy hoạch thực nghiệm. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm được sử
dụng là phương pháp đáp ứng bề mặt - thiết kế cấu trúc có tâm (RSM - CCD).
Qua quá trình thực hiện đề tài chúng tôi đã xác định được một số kết quả:
− Khi nuôi cấy kết hợp trên canh trường MRS ở nhiệt độ 370C sự phát triển của
L. acidophilus và B. subtilis là tốt nhưng sự phát triển của S. cerevisiae là thấp, không
tương đồng với hai chủng còn lại.
− Kết quả sàng lọc theo ma trận Plackett – Burman đã xác định được sự ảnh
hưởng của các yếu tố pH, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy, lượng pepton bổ sung lên mật
độ vi sinh vật.
− Thiết kế RSM – CCD đã thu được môi trường nuôi cấy tối ưu ngoài thành phần
của môi trường MRS còn có các thành phần:
Pepton bổ sung:

9,64

%

D – glucose bổ sung

10

%

Với điều kiện nuôi cấy:
pH:

6,11

Nhiệt độ:

36,84 ≈ 37

Thời gian:

18

0

C

giờ

Mật độ vi sinh vật (CFU/ml) đạt được với các chủng L. acidophilus, B. subtilis,
S. cerevisiae lần lượt là 4,667 x 108; 3,574 x 108; 3,614 x 108, tổng mật độ ba chủng
trong môi trường nuôi cấy đạt 1,1684 x 109 (CFU/ml)

iii


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa .....................................................................................................i
Lời cảm ơn .................................................................................................ii
Tóm tắt ..................................................................................................... iii
Mục lục .....................................................................................................iv
Danh sách chữ viết tắt...............................................................................vi
Danh sách các hình ..................................................................................vii
Danh sách các bảng ............................................................................... viii
Chương 1. Mở đầu ......................................................................................................... 1

2.2.

Đặt vấn đề .................................................................................................. 1

2.3.

Mục đích .................................................................................................... 2

Chương 2. Tổng quan tài liệu ....................................................................................... 3
2.4.

Probiotic .................................................................................................... 3

2.5.

Lactobacillus acidophilus .......................................................................... 6

2.6.

Bacillus subtilis .......................................................................................... 8

2.7.

Saccharomyces cerevisiae ......................................................................... 9

2.8.

Các nghiên cứu có liên quan.................................................................... 10

Chương 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ...................................................... 11

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................. 11
3.2.

Vật liệu và phương tiện thí nghiệm ......................................................... 11

3.3.

Phương pháp thí nghiệm .......................................................................... 12

3.4.

3.3.1.

Kỹ thuật nuôi cấy ............................................................................ 12

3.3.2.

Kỹ thuật đếm số lượng vi sinh vật ................................................. 12

Nội dung thực hiện .................................................................................. 13
3.4.1.

Thí nghiệm 1: Khảo sát đường cong sinh trưởng của ba chủng lợi

khuẩn khi tăng sinh chung trên canh trường MRS ................................ 13
3.4.2.

Thí nghiệm 2: Thiết kế sàng lọc yếu tố thí nghiệm theo
Plackett - Burman ........................................................................... 14
iv

3.4.3.

Thí nghiệm 3: Thiết kế tối ưu hóa môi trường nuôi cấy theo
RSM – CCD .................................................................................... 15

3.4.4.

Chọn phương án sản xuất tối ưu - kiểm tra bằng thực nghiệm....... 17

Chương 4. Kết quả và thảo luận ................................................................................ 19
4.1.

Kết quả thí nghiệm 1 - Khảo sát đường cong sinh trưởng ..................... 19

4.2.

Kết quả thí nghiệm 2 - thiết kế sàng lọc yếu tố thí nghiệm theo
Plackett – Burman ................................................................................... 20

4.3.

Kế quả thí nghiệm 3 - thiết kế tối ưu hóa môi trường nuôi cấy theo

RSM – CCD
4.3.1.

22

Kết quả phân tích thực nghiệm theo cấu trúc có tâm cho
L. acidophilus .................................................................................. 24

4.4.

4.3.2.

Kết quả phân tích thực nghiệm cấu trúc có tâm cho B. subtilis...... 26

4.3.3.

Kết quả phân tích thực nghiệm cấu trúc có tâm.cho S. cerevisiae . 28

Chọn phương án sản xuất tối ưu – kiểm tra bằng thực nghiệm ............... 30

Chương 5. Kết luận và kiến nghị ............................................................................... 35
5.1.

Kết luận .................................................................................................. 35

5.2.

Kiến nghị ................................................................................................. 36

Tài liệu tham khảo ....................................................................................................... 37
Phụ lục

................................................................................................................. 41

v

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
CCD

:

Central Composite Design

EMP :

Embden Meyerhof Pathway

FDA

:

Food and Drug Administration

FAO

:

Food and Agriculture Organization of the United Nations

GRAS :

Generally Recognized As Safe

RSM

Response Surface Methodology

:

WTO :

World Health Organization

Ctv

cộng tác viên

:

vi


DANH SÁCH CÁC HÌNH
trang
Hình 3.1: Khuẩn lạc của L. acidophilus, B. subtilis, S. cerevisiae ............................... 13
Hình 4.1: Đồ thị diễn tả đường cong sinh trưởng của L. acidophilus,
B. subtilis, S. cerevisiae khi nuôi cấy kết hợp trên canh trường MRS. ................ 19
Hình 4.2: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của các yếu tố thí nghiệm đến mật độ của
L. acidophilus........................................................................................................ 25
Hình 4.3: Đồ thị 3D biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến số lượng của
L. acidophilus. ............................................................................................................... 26
Hình 4.4: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến số lượng của
B. subtilis. ...................................................................................................................... 27
Hình 4.5: Đồ thị 3D biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến số lượng của

B. subtilis. ...................................................................................................................... 28
Hình 4.6: Đồ thị 3D biểu diễn ảnh hưởng của Pepton bổ sung và thời gian
đến số lượng của S. cerevisiae....................................................................................... 29
Hình 4.7: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của các yếu tố thí nghiệm lên mật độ của
S. cerevisiae. ......................................................................................................... 30
Hình 4.8: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của các chỉ tiêu theo dõi đến mật độ
tối đa của ba chủng vi sinh vật.............................................................................. 32
Hình 4.9: Đồ thị 3D biểu diễn sự tương tác của các yếu tố thí nghiệm đến mật độ
tối đa của cả ba chủng vi sinh vật ........................................................................ 33

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1: Môi trường nuôi cấy vi sinh vật ................................................................... 11
Bảng 3.2: Các yếu tố sử dụng trong Plackett - Burman................................................ 14
Bảng 3.3:Chỉ tiêu theo dõi trong trong đề tài ............................................................... 15
Bảng 3.4: Bảng ma trận theo thiết kế Plackett - Burman ............................................. 15
Bảng 3.5: Các yếu tố sử dụng trong RSM – CCD ........................................................ 17
Bảng 3.6: Kế hoạch bố trí thí nghiệm theo CCD .......................................................... 18
Bảng 4.1: Kết quả thí nghiệm sàng lọc theo Plackett-Burman ..................................... 21
Bảng 4.2: Kết quả phân tích mức ảnh hưởng của các yếu tố thí nghiệm đến
chỉ tiêu theo dõi theo Plackett – Burman .............................................................. 21
Bảng 4.3: Kết quả ma trận quy hoạch thực nghiệm theo RSM – CCD ........................ 23
Bảng 4.4: Kết quả phân tích ANOVA thực nghiệm cho L. acidophilus ...................... 24
Bảng 4.5: Kết quả phân tích ANOVA thực nghiệm cho B. subtilis ............................. 27
Bảng 4.6: Kết quả phân tích ANOVA thực nghiệm cho S. cerevisiae ......................... 29
Bảng 4.7: Các giải pháp tối ưu theo RSM - CCD......................................................... 33
Bảng 4.8: Kết quả kiểm tra thực nghiệm ...................................................................... 31

viii


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Thực phẩm có bổ sung vi sinh vật sống (probiotic) đã được nhiều nghiên cứu

xác định là có lợi cho sức khỏe con người và động vật và hiện vẫn đang được các
chuyên gia trên nhiều lĩnh vực có liên quan nghiên cứu để tạo ra nhiều chế phẩm sinh
học có lợi (Ross và ctv, 2005). Vì vậy thực phẩm chứa probioic đang đượcngười tiêu
dùng và cả nhà sản xuất quan tâm.Hiện nay, các sản phẩm chứa probiotic không dừng
lại ở việc chỉ tồn tại một giống vi sinh vật nào đó mà còn là hỗn hợp của nhiều giống
vi sinh vật probiotic nhằm tạo ra lợi ích rộng lớn hơn trên một liều dùng.
Lactobacillus acidophilus là vi khuẩn có lợi thường trú trong đường
ruột giúp giữ cân bằng cho hệ vi sinh vật đường ruột,ức chế sự phát triển
của các vi sinh vật có hại(Kligler vàCohrssen, 2008),hỗ trợ điều trị một số chứng bệnh
liên quan đến tiêu hóa(Frank và Roelof, 1993),sinh ra enzyme lactase giúp cơ thể hấp
thu đường sữa(Monatalto và ctv, 2006).
Bacillus subtilislà một trong những vi sinh vật quan trọng trong việc kích thích
hệ thống miễn dịch tự nhiên, được dùng để điều trị một số chứng bệnh lên quan đến
tiêu hóa (Kahl, 1999), sinh ra một số enzyme có lợi cho hệ tiêu hóa như amylase,
protease,…
Saccharomyces cerevisiaegiúp cải thiện tỉ lệ tiêu hóa các chất dinh dưỡng
(Ghasemi và ctv, 2006), tăng khả năng đáp ứng miễn dịch (Asli và ctv, 2007), cạnh
tranh vị trí bám dính,cạnh tranh dinh dưỡng với vi sinh vật gây bệnh trong đường ruột.
Sự nuôi cấy ba giốngvi sinh vật kể trên trên cùng một môi trường là cần

thiết, giúp đơn giản hóa quá trình nuôi cấy, thuận tiện cho việc thu sinh khối tạo sản
phẩm probiotic có mặt cả L. acidophilus, B. subtilis, S. cerevisiae và sản phẩm nàycó
được tác dụng là tác dụng cộng gọp của cả ba giống probiotic trên.

1


Trên cơ sở đó chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nuôi cấy đồng
thờiLactobacillus acidophilus,Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiaetrên
canh trường MRS cải tiến”.
1.2.

Mục đích
Mục đích: nuôi cấy đồng thờiL. acidophilus, B. subtilis, S. cerevisiae trên canh

trường MRS cải tiến nhằm đạt mật độmỗi chủng≥106CFU/ml dịch nuôi cấyứng dụng
thu sinh khối sản xuất sản phẩm probiotic chứa cả ba loại vi sinh vật có lợi trên.
Để đạt được mục đích trên, đề tài thực hiện những nội dung sau:
1.

Xác định đường cong sinh trưởng của ba chủng vi sinh vật thí nghiệm

khi tăng sinh chung trên canh trường MRS.
2.

Thí nghiệm sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến mật độ vi sinh vật nuôi

cấy theo thiết kế Plackett – Burman.
3.

Tối ưu hóa quá trình nuôi cấy sử dụng phương phápRSM-CCD.

4.

Đánh giá mức độ tương thích của giải pháp tối ưu bằng thực nghiệm.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.

Probiotic
Probiotic được FAO/ WTO (2001) định nghĩa là: “Các vi sinh vật sống mà khi

dùng với số lượng đủ sẽ tạo ra lợi ích về sức khỏe trên vật chủ”. Hiện nay thuật ngữ
“probiotic”được sử dụng để chỉ những chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích khi được đưa
vào cơ thể động vật và con người thông qua thức ăn hoặc nước uống tạo nên những
ảnh hưởng có lợi cho vật chủ.
Việccon người sử dụng vi sinh vật sống nhằm tăng cường sức khỏe không phải
là mới. Từ lâu, con người đã biết tiêu thụ các thực phẩm chứa vi sinh vật sống có lợi
chẳng hạn như các sản phẩm lên men: sữa chua, chao, rau quả lên men để chữa chứng
đầy bụng, ăn không tiêu, táo bón, đau bụng tiêu chảy dù không biết đến tác động của
hệ vi sinh vật có lợi trong sản phẩm. Năm 1930 các nhà khoa học ở đại học Havard đã
chứng minh rằng các vi khuẩn đường ruột đóng một vai trò quyết định trong quá trình
tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác
nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất ra được (Fuller, 1992).
Trong những năm gần đây, các nhà nghiên cứu quan tâm đến khả năng kháng vi
khuẩn gây bệnh củavi sinh vật probiotic để thay thế cho việc sử dụng kháng sinh và hỗ

trợ việc sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh, phòng ngừa và làm chậm quá trình
phát triển của bệnh ung thư, giảm cholesterol máu.
Có nhiều giống vi sinh vật được nuôi cấy và sử dụng với vai trò là probiotic
nhưng chủ yếu thuộc chủng Lactobacillus và Bifidobacterium; ngoài ra còn có một số
loài thuộc Enterococcus, Streptococus, Saccharomyces, Bacillus,… (Tannock, 2001).
Trong đó hiện nay L. acidophilus, B. subtilis, S. cerevisiae là các dòng chính được áp
dụng (Chen và ctv, 2009).Vamanu (2002) cho rằng các sản phẩm probiotic thu được
với sinh khối hỗn hợp (vi khuẩn và nấm men) có thể đóng một vai trò quan trọng

3


trongđiều trị các bệnh khác nhau, lợi thế của các sản phẩm này là không cần sự hổ trợ
của thuốc và không hề có tác dụng phụ.
Hiệu quả của probiotic phụ thuộc vào loại vi sinh vật sử dụng, liều dùng, độ
tuổi, tình trạng sức khỏe của người dùng. Liều dùng thường được khuyến cáo là 5 - 10
tỉ tế bào sống trên một liều dùng hằng ngày cho trẻ em và 10 - 20 tỉ cho người lớn
(Kligler và Cohsen, 2008).Hiện nay, khoa học cũng đã chứng minh ở mức độ lâm sàng
là probiotic được dùng với liều lượng thích hợp có tác dụng tích cực đối với sức khỏe
như tăng cường số vi sinh vật có lợi trong đường ruột, tăng khả năng tiêu hóa thức ăn
do sinh vitamin và emzym ngoại bào, đặc biệt là enzym phân giải đường lactose. Theo
Desmond và ctv năm 2000 thì probiotic còn giúp tăng cường hệ miễn dịch tự nhiên
chống lại những bệnh nhiễm trùng đường tiêu hóa và rối loạn tiêu hóa do sử dụng
kháng sinh. Còn theo công bố của Kligler và ctv năm 2008 thì probiotic còn có hiệu
quả trị những vấn đề liên quan đến tiêu hóa như: tiêu chảy, táo bón, dị ứng thức ăn;
điều này trùng với nghiên cứu củaKim vào năm 2006. Năm 2000Brady cùng cộng sự
đã cho rằng ngoài tác dụng tốt đến hệ tiêu hóa probiotic còn có hiệu quả trong ngăn
ngừa và làm chậm sự phát triển của một số bệnh ung thư như: ung thư ruột kết, bệnh
viêm ruột, viêm đại tràng,Tamayocũng như Liong cùng các cộng sự của mình trong
năm 2008, O’Keefe trong năm 2009cũng đã nghiên cứu và có cùng kết luận như

trên.Liong vàShah trong nghiên cứu vào năm 2005 và 2008 đã cho rằng probiotic còn
có hiệu quả giảm cholesterol huyết thanh và giảm huyết áp máu khi có sự hiện diện
của prebiotic-chất kích thích sự sinh trưởng của lợi khuẩn.
Hiện nay, ngoài việc dùng probiotic như chế phẩm hỗ trợ tiêu hóa bổ sung vào
chế độ ăn uống, probiotic còn được dùng như một thuốc chữa bệnh, tuy nhiên chưa có
bằng chứng xác thực nào về hiệu quả của cách dùng này nên vẫn được WHO và FDA
quan tâm khuyến kích nghiên cứu.
Khi nói về tác động của probiotic, Kligler(2008) cho rằng tác dụng có lợi của
probiotic chỉ thể hiện khi chúng vẫn còn sống khi vào đến ruột non, các giống vi sinh
vật khác nhau thì có những lợi ích và kiểu tác động khác nhaunhưng chủ yếu có các
tác động như:
Cạnh tranh vị trí bám dính và cạnh tranh dinh dưỡng với các vi sinh vật có hại
hay cạnh tranh loại trừ. Các vi sinh vật probiotic cư ngụ và tăng dân số trong ruột,
4


khóa chặt các vị trí thụ cảm và ngăn cản sự bám dính của các vi sinh vật khác như
Escherichia coli, Salmonella,... Một số nấm men probiotic (S. cerevisiae; S.boulardii)
không chỉ tranh vị trí bám dính với các vi khuẩn khác mà còn có thể đẩy các vi khuẩn
có roi ra khỏi vị trí bám dính trên niêm mạc ruột (Kligler và Cohsen, 2008). Tuy nhiên,
cạnh tranh dinh dưỡng là phương thức cạnh tranh khốc liệt nhất, vì sự sinh sôi với số
lượng lớn của một loài vi sinh vật nào đó là một mối đe dọa nghiêm trọng đối với các
loài khác về nguồn cơ chất cho sự phát triển.
Vi sinh vật probiotic sinh ra chất kháng khuẩn sinh học, là các chất kìm hãm vi
khuẩn như lactoferrin, lysozym, hydrogen peroxide cũng như một số axit hữu cơ khác.
Các chất này gây tác động bất lợi lên vi khuẩn có hại chủ yếu là do sự giảm thấp pH
trong ruột (Conway, 1996), đồng thời cũng kích thích hệ thống miễn dịch tự nhiên của
vật chủ.
Ngoài ra, các vi sinh vật probiotic còn có thể sinh ra các chất có lợi cho vật chủ
như enzyme, vitamin.Enzyme có lợi cho tiêu hóathường được vi sinh vật tạo ra là

amylase, protease, đặc biệt là enzyme lactasehủy đường lactose giúp trị chứng không
dung nạp lactose (Gilliland, 1990); các vitamin thường là vitamin nhóm B và K (Rossi
và ctv, 2011) và một số chất khác giúp tăng hệ số hấp thụ thức ăn của vật chủ, cải
thiện khả năng giảm hấp thu khoáng.
Tuy vậy, không phải vi sinh vật có lợi nào cũng có thể làm probiotic, việc lựa
chọn các chủng vi sinh vật có chức năng probiotic là rất phức tạp. Tiêu chuẩn đầu tiên
đối với vi sinh vật làm probiotic là phải an toàn cho vật chủ, có khả năng sống sót
trong suốt quá trình sản xuất, bảo quản và trở nên chiếm ưu thế trong đường tiêu hóa
vật chủ. Các tiêu chuẩn lựa chọn này được hợp lý hóa thông qua các thí nghiệm in
vitro, từ đó sẽ tuyển chọn được các chủng có tiềm năng như là nguồn probiotic. Các
tiêu chuẩn để lựa chọn như sau:
Một là không gây bệnh, có lợi đối với vật chủ, dễ nuôi cấy, có thể sống sót và
ổn định trong suốt quá trình sản xuất chế phẩm.
Hai là có tính bám dính trên bề mặt đường tiêu hóa hoặc các tế bào biểu mô.
Các chủng probiotic phải bám dính được vào thành ruột non vàsinh sôi nảy nở ở đây.
Đây là một trong những chỉ tiêu quan trọng vì vi sinh vật có bám dính thì mới tồn

5


tại,phát triển trong đường tiêu hóa và có thời gian phải đủ lâu để phát huy tác dụng của
một probiotic.
Ba là có hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh. Lựa chọn
được các chủng có khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn là đặc tính quan trọng
trong phát triển probiotic. Các chủng probiotic cần có hoạt tính ức chế vi khuẩn gây
bệnh như E. coli, Salmonella và Campylobacteria (Klaenhammer và Kullen, 1999).
Bốn là có tỉ lệ sống cao khi qua hệ tiêu hóa vốn có axit thấp, enzyme và muối
mật. Khoang miệng và dạ dày của vật chủ là nơi có môi trường axit pH từ 2-3 và có
mặt các enzym tiêu hoá (amylase, protease, lysozym,…). Ngoài ra,các chủng probiotic
phải có khả năng tồn tại và phát triển với nồng độ muối mật ≥ 2%, hay có một số

giống nấm men, Bacillus và Lactobacillus có khả năng kháng lại muối mật
(Klaenhammer và Kullen, 1999). Hiện nay thị trường đã đưa vào sử dụng các bỏ bọc
bảo vệ hay bổ sung các chất prebiotic để tăng khả năng sống xót của vi sinh vật làm
probiotic.
Cuối cùng là có khả năng kháng lại kháng sinh vì kháng sinh cũng là một vấn
đề ảnh hưởng đếnkhả năng sống của vi sinh vật probiotic (Klaenhammer và Kullen,
1999).
2.2.

Lactobacillus acidophilus
Phân loại:
Bộ:

Bacilli

Họ:

Lactobacillaceae

Giống:

Lactobacillus

Loài:

Lactobacillus acidophilus

L. acidophilus được xem là vi khuẩn thân thiện thường trú trong đường
ruột, miệng và âm đạo của người; thuộc nhóm vi khuẩn Gram+, không sinh bào
tử, là loài vi sinh vật dị dưỡng, kỵ khí hoặc vi hiếu khí; lên men được 15 loại đường

khác nhau trong đó có glucose, galactose, lactose, fructose, sucrose,… (Wheater,
1955). Là vi khuẩn lên men lactic đồng hình theo EMP, sinh ra các chất hữu cơ có vai
trò là kháng sinh. Sinh sản bằng cách nhân đôi.
L. acidophiluslà vi khuẩn vi hiếu khí nên phát triển được trên môi trường không
có hoặc có ít oxy(Klaenhammer và Kullen, 1999); pH tăng trưởng tốt là từ 4,5 đến7,
6


tối ưu ở pH 6 (Riaz, 2010). Nhiệt độ phát triển trong khoảng 20-48 0C, phát triển tối
ưu ở 370C.
L. acidophiluslà loài có nhu cầu dinh dưỡng rất phức tạp, ngoài nguồn cabon và
nitơ L. acidophilus còn có nhu cầu tuyệt đối đối với một số axit amin và chất
khoáng.Trong môi trường MRSA đổ kỵ khí sau 48 giờ ở 370C xuất hiện khuẩn lạc
nhỏ, hình cầu rìa dẹp có màu vàng nhạt.Trên mặtmôi trường PDA L. acidophilus phát
triển rất yếu, chỉ tạo ra các chấm nhỏ li ti màu trắng.
Theo nghiên cứu của Nguyễn Vũ Tường Vy và ctv năm 2007thìL. acidophilus
chịu được môi trường axit trong 2 giờ ở pH 1 và 2 với tỷ lệ rất thấp nhưng ở pH 3 và 4
là 41-65%; đề kháng với ít nhất là 3 kháng sinh, có thể chịu được ampicillin (32
μg/ml), streptomycin (32 μg/ml) hơn 10 giờ. Hood và Zottola (1988) cho rằng sinh
khối L.acidophilus ở pH 4,0 không giảm đáng kể sau 2 giờ.
L. acidophilus được xem là vi khuẩn thân thiện trong đường ruột,thường liên
quan đến sự ức chế của các loài vi sinh vật gây bệnh, giúp hỗ trợ tiêu hóa, đặc biệt là
với những người không dung nạp được đường lactose (Hovevà ctv, 1999; Vrese và
ctv, 2001; Monatalto và ctv, 2006). L. acidophiluscó liên quan đến việc ngăn ngừa tiêu
chảy có liên quan đến sử dụng kháng sinh, nhiễm virut hay tiêu chảy “du lịch” do ăn
phải thực phẩm nhiễm khuẩn, cải thiện chứng nhiễm trùng âm đạo,giảm khả năng ung
thư ruột kết (Gillilandvà ctv, 1990; Havenaar và ctv, 1992; Frank và Roelof, 1993).
Điều trị triệu chứng của hội chứng ruột kích thích và bệnh viêm ruột (Bhatia và ctv,
1989; Kligler vàCohrssen, 2008)tăng đáp ứng miễn dịch (Perdigon,và ctv, 1990), giảm
mức độ cholesterol trong huyết thanh bằng cách phân giải muối mật (Gilliland, 1990;

Frank và Roelof, 1993), điều trị viêm da dị ứng ở trẻ em (Kligler vàCohrssen, 2008).
Theo Sanders và Klaenhammer (2001) L. acidophilusđược biết đến là vi khuẩn sản
xuất kháng sinh tự nhiên và có thể hạn chế được 27 loại vi khuẩn, trong đó có 11 loại
gây bệnh điển hình như Staphylococcus aureu, Salmonella, Clostridium, E.coli(Kligler
vàCohrssen, 2008).
Liều dùng được khuyến cáo 100 triệu đến 35 tỉ tế bào sống/ ngày(Kligler và
Cohsen, 2008)

7


2.3.

Bacillus subtilis
Phân loại:
Bộ:

Bacillales

Họ:

Bacillaceae

Giống:

Bacillus

Loài:

Bacillus subtilis

Vi khuẩn B. subtilis thuộc nhóm vi khuẩn bắt buộc trong đường ruột, chúng
được phân bố hầu hết trong tự nhiên: đất, nước, bụi, cỏ khô,… nhưng chủ yếu nhiều
nhất là trong đất. B. subtilis thuộc nhóm trực khuẩn, Gram+, có khả năng sinh nội bào
tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi (Dahl, 1999); lên men được các loại đường: glucose,
maltose, manittol, saccharose, xylose, arabinosse.B. subtilis có kháng nguyên H và O,
cấu trúc kháng nguyên dạng D và L-glutamic axit; sản sinh kháng sinh subtitracin có
tác dụng ức chế vi khuẩn G+, G- . Sinh sản bằng cách nhân đôi hoặc nảy mầm do sự nứt
bào tử, có khả năng chịu nhiệt, chịu ấm (Tô Minh Châu, 2000).
B. subtilislà vi khuẩn hiếu khí nhưng cũng có thể phát triển trong môi trường
thiếu oxy.pH phát triển từ 7đến 7,4; tối ưu ở pH 7,2. Nhiệt độ phát triển từ 30 – 45oC,
tối ưu ở 370C. Dinh dưỡng cần C, H, O, N và một số nguyên tố vi lượng khác.B.
subtiliskhông phát triển được trong môi trường MRSA đổ yếm khí; trên bề mặt môi
trườngPDA tạo vết loan màu trắng, răng cưa không đều trên mặt thạch,rìa dẹp nhạt
màu ở xung quanh.
B. subtilis là vi khuẩn chịu được axit dạ dày và chất dịch tiêu hóa trong đường
ruột. Nguyễn Vũ Tường Vyvà ctv(2007)chỉ ra rằngB. subtilis chịu được môi trường
axit trong 2 giờ ở pH 1; 2; 3 và 4 lần lượt là 3; 9; 70 và 85%, chịu được môi trường có
0,5 - 1% và 1,5 - 2% muối mật trong 10 giờ lần lượt là 2% và 1%. B. subtilis đề kháng
với ít nhất là 4 kháng sinh, có thể chịu được ampicillin (32 μg/ml) hơn 10 giờ,
streptomycin (2 mg/ml) hơn 5 giờ.
Đây là loại vi sinh vật có hệ enzyme phong phú nhưng quan trọng nhất là
amylase và protease, là hai loại enzyme thuộc hệ thống men tiêu hóa nên có tác dụng
hỗ trợ tiêu hóa thức ăn.B. subtilis có thể ức chế sự phát triển của E. coli, Salmonella và
được dùng trong điều trị tiêu chảy, viêm ruột cấp và mãn tính, rối loạn tiêu hóa, trẻ em
đi ngoài phân sống, viêm đại tràng.
8


B. subtilistừ lâu được sử dụng để sản xuất nhiều loại enzyme và sử dụng cả tế

bào sống trong nhiều quá trình sản xuất và chế biến thực phẩm như một vi sinh vật an
toàn (Kahl, 1999).
2.4.

Saccharomycescerevisiae
Phân loại:
Bộ:

Saccharomycetales

Họ:

Saccharomycetaceae

Giống:

Saccharomyces

Loài:

Saccharomycescerevisiae

S. cerevisiaethuộc nhóm vi sinh vật không thường trú trong đường ruột nhưng
rất phổ biến trong tự nhiên. Là loại nấm men hữu dụng nhất được sử dụng từ lâu đời
để lên men sinh ra cồn và sản xuất bánh mì.
S. cerevisiaelên men được hầu hết các loại đường trừ lactose và cellobiose. Tuy
nhiên, khả năng tăng trưởng của S. cerevisiaetrên các loại đường khác nhau là khác
nhau(Chen, 2009).Hệ enzyme của nấm men cũng khá phong phú bao gồm: saccarase,
catalase, invertase, amylase,… nhưng không có enzym phân hủy protein.S. cerevisiae
sinh sản chủ yếu bằng cách nảy chồi nhưng cũng có thể sinh sản hữu tính.

S. cerevisiaelà loài có thể phát triển trong điều kiện hiếu khí hay kỵ khí, ở điều
kiện hiếu khí sinh trưởng tăng sinh khối nhanh, điều kiện yếm khí chủ yếu lên men tạo
cồn; pH phát triển trong khoảng 4-6,8, tối ưu ở pH 5,8; nhiệt độ phát triểntrong
khoảngtừ 27 – 35oC, tối ưu ở 320C. Nguồn dinh dưỡng carbohydrate chính là các loại
đường, thích hợp nhất là đường fructose, có thể dùng nguồn nitơ vô cơ lẫn hữu cơ, sự
có mặt của biotin và một số nguyên tố vi lượng như sắt, canxi, magiê kích thích phát
triển của S. cerevisiae.S. cerevisiae trong môi trườngMRSA đổ yếm khí không phát
triển được, trên bề mặt môi trường PDA tạo khuẩn lạc màu trắng đục, tròn nhô cao, bề
mặt bóng.
Theo Nguyễn Vũ Tường Vy và ctv (2009), S. cerevisiae có thể sống trong môi
trường axit của dạ dày trong 3 giờ, một số chủng thuộc S. cerevisiae có khả năng thích
nghi tốt trong môi trường chứa pancreatine của ruột non và môi trường có chứa muối
mật. Khả năng bám dính ở ruột non của S. cerevisiaeđạt tối đa 80,88% (Hồ Lê Quỳnh
Châu và ctv, 2010). Khi sống trong hệ tiêu hóa S. cerevisiaekích thích tiêu hóa, hấp
9


thu chất độc và cạnh tranh vị trí bám dính, cạnh tranh dinh dưỡng với vi sinh vật gây
bệnh như E. coli, Shigella,Salmonella (Ghasemi và ctv, 2006; Asli và ctv, 2007),
Sthaphylococcus aureus(Vamanu, 2002). Đặc biệt,S. cerevisiae phát triển nhanh trong
một thời gian ngắn, tuy nhiên không cư trú lâu dài và dễ loại bỏ khỏi đường ruột.
2.5.

Các nghiên cứu có liên quan
Nguyễn Thanh Thoảng (2007) trong nghiên cứu của mìnhđã chỉ ra rằng khi

nuôi phối hợp B. subtilis và S. cerevisiae trên môi trường rỉ đường tối ưu thì vẫn giữ
được tốc độ tăng trưởng tương đương với trên môi trường tốt ưu của mỗi giống.
Hosoi và ctv (2000) cho rằng B. subtilis giúp tăng khả năng tăng trưởng và khả
năng tồn tại của Lactobacilli.

Benjamas và ctv (2003) thì cho rằng S. cerevisiae có những tác động tích cực
đến việc giảm lượng axit lactic dẫn đến hiệu ứng tích cực lên sự tăng trưởng của
Lactobacillus, bởi lượng axit do Lactobacillus sinh ra khi sinh trưởng làm giảm pH,
đến một lúc nào đó sẽ là tác nhân kìm hãm đối với chính nó,cồn do S. cerevisiae sinh
ra sẽ trung hòa một phần axit giữ pH môi trường nuôi cấy không giảm quá nhanh nên
kéo dài thời gian tăng trưởng của Lactobacillus.
Chúng tôi đã chọn môi trường MRS làm môi trường nuôi cấy thí nghiệm vì môi
trường này có đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết,pH nằm trong khoảng sinh trưởng tăng
sinh khối của cả ba chủng trên; chúng tôi thực hiện tối ưu hóa môi trường để đạt mật
độ tế bào của mỗi chủng là tối đa và tương đồng giữa ba chủng.

10


Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian tiến hành: 3/2011-7/2011
Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm vi sinh thuộc Viện Công nghệ Sinh học -

Thực phẩm, Trường Đại học Công Nghiệp TP.Hồ Chí Minh.
3.2.

Vật liệu và phương tiện thí nghiệm
Chủng vi sinh L. acidophilus, B. subtilis, S. cerevisiae được phân lập và bảo

quản tại Viện Công nghệ Sinh học - Thực phẩm, Trường Đại học Công Nghiệp
TP.HCM.

Môi trường nuôi cấy vi sinh:Môi trường giữ giống,hoạt hóa giống và đếm vi
sinh vật được trình bày ở bảng 3.1. Thành phần môi trường được trình bày tại phụ lục
1.
Bảng 3.1: Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Môi trường
Vi sinh vật

Giữ giống

Hoạt hóa giống

Đếm

L. acidophilus

MRSA

MRSB

MRSA

B. subtilis

NA

NB

PDA

S. cerevisiae

Thạch Sabouraud

Sabouraud

PDA

Hóa chất sử dụng: cồn 900, pepton, D-glucose, HCl 10%, NaOH 10%.
Thiếc bị: Nồi hấp tiệt trùng BK75
Tủ ấm hiệu SHELAB
Tủ cấy vô trùng ESCO
pH kế Sartorius-Docu
11


Cân kỹ thuật 2 số lẻ Sartorius TE 612
Tủ sấy hiệu SHELAB
Dụng cụ: nhiệt kế, pipettman, đĩa petri, ống nghiệm, que cấy tròn, que trang,
đèn cồn, erlen 150 ml, erlen 250 ml, ống đong, đầu típ và các điều kiện thông thường
khác của của phòng thí nghiệm vi sinh.
Đề tài thực hiện quy hoạch thực nghiệm bằng phương phápđáp ứng bề mặtthiết kế cấu trúc cótâm (RSM-CCD), phần mềm Design-Expert 7.0.0 được sử dụng
thiết kế thí nghiệm và sử lý số liệu.
3.3.

Phương pháp thí nghiệm

3.3.1. Kỹ thuật nuôi cấy
Từ môi trường giữ giống sau 24 giờ dùng que cấy tròn lấy một khuẩn lạc riêng
lẻ cấy vào erlen 150ml chứa 50ml môi trường hoạt hóa giống,L. acidophilus được ủ
370C; B. subtilis, S. cerevisiae nuôi cấy lắc 90 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng 30 ± 20C.

Dùng que cấy vòng lấy một vòng vi khuẩn từ môi trường hoạt hóa giống cấy
vào erlen 150ml chứa 50 ml môi trường thí nghiệm MRS. Thí nghiệm có nhiệt độ ≥
300C được điều chỉnh bởi tủ ấm, nhiệt độ dưới 300C được đặt trong phòng máy lạnh có
nhiệt kế để theo dõi.
3.3.3. Kỹ thuật đếm số lượng vi sinh vật
Với tất cả các nồng độ pha loãng được dùng để đếm khuẩn lạc, dùng pipettman
với đầu típ vô trùng hút 0,1 ml dịch nuôi cấy để cấy lên đĩa petri đã chuẩn bị sẵn môi
trường.Với L. acidophilussử dụng phương pháp đổ đĩa yếm khí, đổ dịch mẫu lên đĩa
trước rồi mới đổ một lớp 5 ml môi trường thạch lỏng lên, sau khi lớp môi trường này
đông hẳn thì đổ tiếp một lớp5 ml môi trường thạch lỏng lên tiếp để tạo môi trường kỵ
khí, để nguội. Với hai giống còn lại dùng phương pháp trang đĩa, dịch nuôi cấy lên
môi trường đã chuẩn bị sẵn một ngày trước đó và trang đều bằng que trang vô trùng. Ủ
những đĩa petri này trong tủ ấm ủ ở 370C trong 24 giờ đem ra đếm, 24 giờ sau đem ra
kiểm tra lại. Chỉ sử dụng số liệu của những đĩa có số lượng từ 25 đến 300 khuẩn lạc
của mỗi loại vi sinh vật.Khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch đếm được thể hiện
ở hình 3.1.
h

12


Hình 3.1: A: môi trường PDA, (a)-khuẩn lạc B. subtilis; (b)- khuẩn lạc S. cerevisiae
B: khuẩn lạc L. acidophilus trên MRS Agar.
Công thức tính mật độ tế bào:

Trong đó:

𝑁𝑁
∑ 𝑛𝑛𝑖𝑖 𝑉𝑉𝑓𝑓𝑖𝑖

𝐴𝐴 =

A là mật độ tế bào (CFU/ ml)
N là tổng số khuẩn lạc đếm được
n i là số đĩa được đếm ở nồng độ pha loãng i
V là số ml dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa
f i là nồng độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn đếm.
3.4.

Nội dung thực hiện

3.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát đường cong sinh trưởng của ba chủng vi sinh vật
khi tăng sinh chung trên canh trường MRS
Mục đích: lập đường cong sinh trưởng của ba chủng vi sinh vật nghiên cứu để
có được nhận định sơ bộ về sự sinh trưởng của ba chủng khi nuôi cấy chung trên canh
trường MRS. Đây là cơ sở để chọn yếu tố thí nghiệm và phạm vi nghiên cứu ở các thí
nghiệm tiếp theo.
Từ môi trường hoạt hóa giống dùng que cấy vòng cấy một vòng vi khuẩn vào
môi trường thí nghiệm, thí nghiệm được thực hiện trên 50ml môi trường, nhiệt độ
370C với ba lần lặp lại.
3.4.2. Thí nghiệm 2: Thiết kế sàng lọc yếu tố thí nghiệm theo Plackett - Burman
Mục đích: tìm ra yếu tố thí nghiệm ảnh hưởng nhát đến chỉ tiêu theo dõi, qua đó
loại bỏ bớt các yếu tố thí nghiệm.Kết quả thu được ở thí nghiệm 2 sẽ được dùng làm
yếu tố thí nghiệm ở thí nghiệm 3 tiếp theo.
Plackett-Burman là thiết kế chuyên biệt cho thí nghiệm từ 2- 31 yếu tố, mà mỗi
yếu tố là khác nhau hơn hai cấp độ. Thiết kế này được sử dụng khi giả định sự vắng
13


mặt của hai yếu tố tương tác, kiểm tra độ chắc chắn cho sự loại bỏ yếu tố tác dụng rất

ít hoặc không có tác động đến chỉ tiêu theo dõi. Kết quả sẽ đưa ra 3 hoặc 4 yếu tố có
mức ảnh hưởng nhất đến chỉ tiêu theo dõi.
Thí nghiệm được thực nghiệm ở mức một yếu tố,tức là làm các thí nghiệm chỉ
có một yếu tố thay đổi nhằm xác định ý nghĩa của các yếu tố nghiên cứu, xác định
phương hướng và mức độ ảnh hưởng của mỗi yếu tố trong các thí nghiệm tiếp theo của
quá trình tối ưu hóa.
Sau khi thực hiện thí nghiệm thăm dò, để xác định mức ảnh hưởng đến mật độ
vi sinh vật nuôi cấy, chúng tôi chọn các yếu tố thí nghiệm với phạm vi khảo sát của
các yếu tố theo dõi như bảng 3.2. Ma trận quy hoạch thực nghiệm theo thiết
kếPlackett-Burmanvới tổ hợp 12 thí nghiệm khác nhau được thiết lập bởi 5 yếu tố thí
nghiệm ở mức thấp (−1) và mức cao (1). Bố trí thí nghiệm được thực hiện như bảng
3.4; yếu tố thí nghiệm và chỉ tiêu theo dõi được trình bày trong bảng 3.2 và 3.3.
Bảng 3.2: Các yếu tố sử dụng trong Plackett-Burman
Yếu
tố

Tên yếu tố

X1

pH

X2

Nhiệt độ

X3

Đơn vị

Phạm vi
nghiên cứu

Mức

5,8 - 6,5

-1
5,8

1
6,5

0C

30 - 37

30

37

Thời gian

giờ

12 - 18

12

18

X4

Pepton bổ sung

%(w/v)

0 - 10

0

10

X5

D - glucose bổ sung

% (w/v)

0 - 20

0

20

Bảng3.3: Chỉ tiêu theo dõi trong đề tài
Chỉ tiêu theo dõi

Tên

Đơn vị

Y1

L. acidophilus

CFU /ml

Y2

B. subtilis

CFU /ml

Y3

S. cerevisiae

CFU /ml

Bảng 3.4: Bảng ma trận theo thiết kế Plackett-Burman
Nghiệm thức
1
2

X1
1
-1

X2

1
1

X3
-1
1
14

X4
1
-1

X5
1
1


3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

1
-1

-1
-1
1
1
1
-1
1
-1

-1
1
-1
-1
-1
1
1
1
-1
-1

1
-1
1
-1
-1
-1
1
1
1
-1

1
1
-1
1
-1
-1
-1
1
1
-1

-1
1
1
-1
1
-1
-1
-1
1
-1

α = 0,05
3.4.3. Thí nghiệm 3: Thiết kế tối ưu hóa môi trường nuôi cấy theo RSM - CCD
Mục đích: trên cơ sở kết quả thực hiện của thí nghiệm 2 ở mục 3.4.2, chúng tôi
tiến hành quy hoạch thực nghiệm, kết quả thu được là phương án sản xuất tối ưu nhất
thỏa các điều kiện đưa ra trước.Phương pháp quy hoạch thực nghiệm được sử dụng là
phương pháp hàm đáp ứng bề mặt - thiết kế cấu trúc có tâm (RSM – CCD).
Đối vối việc tối ưu môi trường nuối cấy vi sinh vật bằng RMS được miêu tả bởi

Giang Thị Kim Liên (2009), quá trìnhgồm hai giai đoạn cơ bản:
Giai đoạn đầu: Thực nghiệm một yếu tố. Tức là làm các thí nghiệm chỉ có một
yếu tố thay đổi nhằm xác định ý nghĩa của các yếu tố nghiên cứu, xác định phương
hướng và mức độ ảnh hưởng của mỗi yếu tố trong các thí nghiệm tiếp theo của quá
trình tối ưu hóa.
Giai đoạn thứ hai:Tìm một tương quan tối ưu cho các yếu tố quan trọng nhất
(có ý nghĩa nhất) trên cơ sở cố định các yếu tố còn lại để giảm bớt chi phí thí nghiệm.
Phương án cấu trúc có tâm (CCD) là một trường hợp đặc biệt trong nhóm các
mô hình quy hoạch thực nghiệm. Nó được cấu thành từ ba thành phần:
-

Nhân: là một phương án tuyến tính với 2k đỉnh của một hình khối đều

trong không gian k chiều. Nếu k>5, có thể giảm bớt số thí nghiệm bằng cách sử dụng
phương án yếu tố từng phần 2k-1.
-

2k điểm sao ( * ) nằm trên các trục tọa độ của không gian yếu tố. Các tọa

độ của các điểm sao là (±α,0,0,...,0), (0,±α,0,...,0),..., (0,0,...,0,±α). α là khoảng cách
từ tâm phương án đến điểm sao gọi là cánh tay đòn sao. Các điểm sao là cần thiết để

15


mở rộng không gian nghiên cứu khảo sát tác động của một yếu tố đơn để có thể tìm
được các ước lượng của hệ số b ii trong phương trình hồi quy bậc 2.
-

n 0 thí nghiệm ở tâm phương án để tìm phương sai tái hiện.

Cánh tay đòn sao α và số thí nghiệm n o ở tâm được chọn phụ thuộc vào tiêu
chuẩn tối ưu, thường là phương án trực giao hay phương án quay.
Phương trình hồi quy ( mô hình hóa) được biểu diễn bằng phương trình sau:
y = b 0 + b 1 x +b 2 x 2 + b 3 x 3

+

b 12 x 1 x 2

+

b 23 x 2 x 3 + b 13 x 1 x 3 + b 11 x 1 2 + b 22 x 2 2

+

b 33 x 3 2
Trong đó:
b 0:

là hệ số tự do

b 1 , b 2, b 3 :

là hệ số bậc 1

b 11 , b 22 , b 33 : là hệ số bậc 2
b 12, b 23, b 13 : hệ số của từng cặp yếu tố.
x1, x2, x3:

là các biến

y:

là chỉ tiêu theo dõi

Ta có:
bj =

1 N
∑ xij yi
N i =1

Nếu dùng phương trình hồi quy đầy đủ hơn có kể đến các hiệu ứng tương tác hai biến:

yˆ = b0 + b1 x1 + b2 x2 + b3 x3 + b12 x1 x2 + b13 x1 x3 + b23 x2 x3
Thì:
1 N
b j = ∑ xij yi
N i =1
b jl =

1 N
∑ ( x j xl ) i y i
N i =1

Phương sai của các hệ số được tính như sau:

SS bj =

SS PE
N

Tiến hành: thí nghiệm được bố trí theo thiết kế Central Composite. Thí nghiệm
được bố trí như bảng 3.6; yếu tố X5 được dùng ở mức 10% trong tất cả các thí nghiệm.

16