PHÁT HIỆN VI KHUẨN Leifsonia xyli subsp. xyli, TÁC NHÂN GÂY BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR TỪ MẪU PHÂN LẬP VÀ DỊCH CHIẾT CÂY MÍA BỆNH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÁT HIỆN VI KHUẨN Leifsonia xyli subsp. xyli,
TÁC NHÂN GÂY BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG
KỸ THUẬT PCR TỪ MẪU PHÂN LẬP VÀ
DỊCH CHIẾT CÂY MÍA BỆNH

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: DANH QUỐC TRANG

Niên khóa

: 2007 – 2011

Tháng 7/2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÁT HIỆN VI KHUẨN Leifsonia xyli subsp. xyli,
TÁC NHÂN GÂY BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG
KỸ THUẬT PCR TỪ MẪU PHÂN LẬP VÀ
DỊCH CHIẾT CÂY MÍA BỆNH

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN

DANH QUỐC TRANG

ThS. HÀ ĐÌNH TUẤN

Tháng 7/2011


LỜI CẢM ƠN
Để có điều kiện học tập và hoàn thành bài luận văn tốt nghiệp này tôi xin chân thành
cảm ơn:
Ban giám hiệu Trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức
cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
TS. Lê Đình Đôn đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực
tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
ThS. Hà Đình Tuấn, Trung tâm nghiên cứu và phát triển mía đường Bến Cát,
Bình Dương đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện khóa luận.
Thầy Nguyễn Văn Lẫm, anh Nguyễn Phan Thành cùng toàn thể các bạn sinh viên

thực hiện khóa luận tại Viện công nghệ sinh học và môi trường, Trường ĐH Nông
Lâm TPHCM đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian qua.
Bạn bè thân yêu của lớp DH07SH đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời
gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập.
Sau cùng, con xin bày tỏ lòng kính yêu và biết ơn sâu sắc đối với ba mẹ; cảm ơn
ba mẹ và anh chị đã luôn tin tưởng, yêu thương, tạo mọi điều kiện cho con học tập và
hoàn tốt khóa luận này.

Sinh viên thực hiện

Danh Quốc Trang

i


TÓM TẮT
Ở nước ta cũng như nhiều nước trên thế giới hiện nay, mía là nguyên liệu chính
để chế biến ra đường ăn. Đồng thời, mía mang hiệu quả kinh tế cao cho người trồng
nên là cây xóa đói giảm nghèo cho nông dân. Tuy nhiên, trên mía có rất nhiều loại sâu
bệnh gây hại, trong số đó có bệnh cằn mía gốc. Bệnh có thể gây thiệt hại từ 5 – 15%
sản lượng và mức tổn thất có thể lên đến 50% đối với vụ mía gốc do vi khuẩn
Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) gây ra chủ yếu cản trở sự vận chuyển nước và chất dinh
dưỡng của cây làm cho cây bị còi cọc làm giảm năng suất và phẩm chất mía. Từ thực
tiễn trên, đề tài này được thực hiện nhằm nghiên cứu một phương pháp phát hiện vi
khuẩn Lxx nhanh chóng và chính xác, góp phần vào chiến lược kiểm soát và hạn chế
tác hại của bệnh cằn mía gốc một cách hiệu quả.
Đề tài đã tiến hành đánh giá ảnh hưởng của bệnh cằn mía gốc trên các giống
ngoài sản xuất bằng phương pháp nhuộm STM. Sau đó dịch chiết của cây bị bệnh
được cấy trang lên môi trường MSC và SC nhằm phân lập các dòng vi khuẩn Lxx ở
khu vực Đông Nam Bộ. Đồng thời quy trình phát hiện vi khuẩn Lxx từ dịch chiết cây

mía và từ mẫu đã phân lập bằng kỹ thuật PCR cũng được khảo sát.
Kết quả nhuộm STM cho thấy phần lớn các giống ngoài sản xuất đều bị nhiễm
bệnh với mức độ khác nhau. Một số dòng khuẩn lạc của vi khuẩn Lxx cũng đã được
phân lập trên môi trường SC và MSC. Bên cạnh đó, quy trình phản ứng PCR để phát
hiện vi khuẩn Lxx từ dịch chiết và mẫu phân lập một cách nhanh chóng và chính xác
với cặp primer Lx1/Lx2 cũng đã được thiết lập thành công.

ii


SUMMARY
Thesis title “Detection Leifsonia xyli subsp. xyli cause ratoon stunting disease on
sugarcane by PCR from isolated samples and fibrovascular fluid of infected sugarcane
plants”.
Recently, sugarcane is the raw material to make processing into sugar in Viet
Nam as well as many countries in the world. Simultaneously, sugarcane offer high
economic efficiency for the plant cane growers that attitude to reduce poverty for
farmers. However, the sugarcane have a lot of pests and diseases. One of them is
Ratoon stunting disease (RSD). It can cause losses yield from 5 to 15% , even up to
50% for original sugarcane crop. Bacterial Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) caused of
this disease has mainly hindered the transport of water and nutrients within plant.
Hence, it makes sugarcane become stunt and reduces the yield as well as the quality of
sugarcane. From those practical, this study was made to investigate a method for
detection Lxx bacteria quickly and exactly, contributing to strategic of the effectively
control and limit for the harmful effect of RSD.
Affection of RSD on sugarcane cultivars were assessed by the Staining by
Transpiration Method (STM). Next, extract liquid of infected plants was outspreaded
on MSC and SC medium in other to isolate Lxx bacteria strains in the Eastern South of
Vietnam region. Simultaneously, a protocol for detecting Lxx bacteria in the
sugarcane-extracted liquid and isolated specimens was assayed by the PCR reaction.

Result of staining STM showed that most of sugarcane cultivars are susceptible
with different levels. Several strains of Lxx bacteria were isolated on SC and MSC
medium. Finally, PCR protocol for detecting Lxx bacteria in sugarcane-extracted liquid
and isolated specimens quickly and exactly with a pair of primers Lx1/Lx2 was
established successfully.
Keywords: Leifsonia xyli subsp. xyli, ratoon stunting disease, sugarcane.

iii


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN.............................................................................................................................. i
TÓM TẮT .................................................................................................................................. ii
SUMMARY ..............................................................................................................................iii
MỤC LỤC .................................................................................................................................iii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................................... vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG ..................................................................................................... vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ....................................................................................................... vii
Chương 1 MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1

1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................1
1.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu .............................................................................2
1.2.1. Mục tiêu .................................................................................................................2
1.2.2. Nội dung ................................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................................... 3

2.1. Giới thiệu sơ lược về cây mía (Saccharum spp.) .....................................................3
2.1.1. Nguồn gốc và lịch sử phát triển .............................................................................3
2.1.2. Phân bố ..................................................................................................................3

2.1.3. Phân loại học .........................................................................................................3
2.1.4. Đặc điểm cơ bản của cây mía ................................................................................4
2.1.5. Giá trị kinh tế của cây mía .....................................................................................7
2.2. Các loại bệnh hại trên cây mía .................................................................................8
2.3. Sơ lược về bệnh cằn mía gốc ..................................................................................11
2.3.1. Nguồn gốc và phân bố .........................................................................................11
2.3.2. Tác nhân gây bệnh ...............................................................................................11
2.3.2. Triệu chứng..........................................................................................................12
2.3.3. Tác hại của dịch bệnh ..........................................................................................14
2.3.4. Sự phát triển, lan truyền dịch bệnh ......................................................................14
2.3.5. Biện pháp ngăn chặn và kiểm soát dịch bệnh .....................................................15
2.4. Các phương pháp chẩn đoán phát hiện vi khuẩn Lxx .............................................15
2.4.1. Chẩn đoán qua triệu chứng bên ngoài .................................................................15
iv


2.4.2. Chẩn đoán trực tiếp bằng kính hiển vi.................................................................15
2.4.3. Phương pháp nhuộm STM (Staining by Transpiration Method ) .......................16
2.4.4. Phương pháp huyết thanh học .............................................................................16
2.4.5. Phương pháp chẩn đoán dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử ...............................18
2.5. Tình hình nghiên cứu bệnh cằn mía gốc ................................................................19
2.5.1. Trên thế giới ........................................................................................................19
2.5.2. Trong nước ..........................................................................................................20
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................ 21

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..........................................................................21
3.2. Vật liệu và hóa chất thí nghiệm ..............................................................................21
3.2.1. Vật liệu thí nghiệm ..............................................................................................21
3.2.2. Hóa chất thí nghiệm.............................................................................................21
3.2.3. Thiết bị, dụng cụ ..................................................................................................22

3.3. Phương pháp tiến hành ...........................................................................................22
3.3.1. Phương pháp chuẩn bị mẫu .................................................................................22
3.3.2. Phương pháp ly trích dịch mía từ cây bệnh .........................................................24
3.3.3. Quan sát hình thái và gram vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram ..............24
3.3.4. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn ..........................................................................25
3.3.5. Phương pháp ly trích DNA vi khuẩn Lxx ............................................................25
3.3.6. Phương pháp kiểm tra DNA tổng số ........................................................................27
3.3.7. Phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn Lxx ..........................................................27
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................................. 29

4.1. Kết quả phát hiện bệnh và quan sát vi khuẩn Lxx dưới kính hiển vi .......................29
4.2. Kết quả nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx ..................................................................30
4.3. Kết quả phát hiện vi khuẩn Lxx trong dịch chiết cây mía bằng kỹ thuật PCR ......33
4.4. Kết quả phát hiện vi khuẩn Lxx bằng kĩ thuật PCR từ mẫu đã phân lập ................35
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................. 39

5.1. Kết luận...................................................................................................................40
5.2. Đề nghị ...................................................................................................................40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................ 41

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
bp

: base pair

CTAB

: Cetyltrimethlyammonium bromide

ctv

: cộng tác viên

dNTP

: Deoxyribonucleoside triphosphate

EB – ELISA

: Evaporative binding - Enzym Linked immunosorbent assay

FADCF

: Flourescent antibody directed counting filter

FAT

: Indirect flourescent antibody technique

LT – EIA

: Liquid Transfer Enzyme immunoassay

Lxx

: Leifsonia xyli subsp. xyli

IgG

: Immunoglobulin

ITS

: Intergenic transcribed spacer region

Mb

: Mega bases

mM

: Mili mol

NCM

: Nitrose cellulose membrance

PBS

: Dung dịch chứa PVP, BSA, Tween–20 và sodium azide.

PCR

: Polymerase Chain Reaction

rRNA

: Ribosome ribonuleic acid

RNase

: Ribonuclease.

RSD

: Ratoon Stunting Disease

STM

: Staining by Transpiration Method

Taq

: Thermus aquaticus

TBIA

: Tissue Blot Enzym Immunoassay

TRITC

: Tetramethylrhodamine isothiocyanate

µl

: Micro litre

µg

: Micro gram

µM

: Micro mol

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Danh sách các bệnh hại mía quan trọng và phổ biến do nấm..........................8
Bảng 2.2 Danh sách các bệnh hại mía quan trọng và phổ biến do vi khuẩn ..................9
Bảng 3.1 Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR .........................................................28
Bảng 3.2 Thành phần cho phản ứng PCR .....................................................................28
Bảng 4.1 Kết quả chẩn đoán bệnh cằn mía gốc bằng phương pháp STM ....................29
Bảng 4.2 Kết quả đo OD DNA ly trích từ dịch chiết ....................................................34
Bảng 4.3 Kết quả đo OD DNA ly trích từ mẫu phân lập ..............................................36
Bảng 4.4 Chương trình nhiệt tối ưu cho phản ứng PCR ...............................................36
Bảng 4.5 Mã số các trình tự vi khuẩn Lxx đã được công bố trên thế giới ............................36

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Cây mía ............................................................................................................4
Hình 2.2 Các bộ phận phát triển từ hom mía sau khi trồng ...........................................5
Hình 2.3 Bệnh do nấm ...................................................................................................9
Hình 2.4 Bệnh do vi khuẩn ..........................................................................................10

Hình 2.5 Bệnh do virus ................................................................................................10
Hình 2.6 Cây mía có dấu hiệu của bệnh cằn mía gốc ...................................................11
Hình 2.7 Vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli dưới kính hiển vi điện tử ......................12
Hình 2.8 Triệu chứng của cây mía bị bệnh cằn mía gốc ..............................................13
Hình 3.1 Quy trình nhuộm STM để chuẩn đoán cây mía bệnh ....................................23
Hình 4.1 Lát mỏng cắt ngang của thân mía sau khi nhuộm STM. ...............................29
Hình 4.2 Vi khuẩn Lxx từ dịch mía sau khi nhuộm gram .............................................30
Hình 4.3 Khuẩn lạc vi khuẩn Lxx .................................................................................31
Hình 4.4 Vi khuẩn Lxx dưới kính hiển vi .....................................................................33
Hình 4.5 Vi khuẩn Lxx dưới kính hiển vi điện tử .........................................................33
Hình 4.6 Kết quả điện di DNA tổng số.........................................................................33
Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR từ primer Cxx1/Cxx2...................................33
Hình 4.8 Kết quả điện di DNA tổng số vi khuẩn Lxx từ mẫu phân lập. .......................35
Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR từ mẫu nuôi cấy và dịch mía. ......................37
Hình 4.10 Kết quả so sánh trình tự DNA vi khuẩn từ mẫu dịch chiết..........................38
Hình 4.11 Kết quả so sánh trình tự DNA vi khuẩn từ mẫu phân lập ...........................38
Hình 4.12 Kết quả so sánh sự tương đồng DNA Lxx dịch chiết và phân lập ..............39

viii


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Mía là một trong những loại cây công nghiệp cho hiệu quả kinh tế cao ở nước ta
cũng như nhiều nước trên thế giới (Brazil, Ấn Độ, Cu Ba, Australia) là cây lấy đường
chính phục vụ cho tiêu dùng trong nước và xuất khẩu, ngoài ra mía còn là nguyên liệu
quý của ngành năng lượng, ngành giấy, sợi nhân tạo và một số ngành có liên quan.
Mía là cây trồng có khả năng tạo sinh khối lớn, tái sinh mạnh, thích ứng rộng. Tuy
nhiên, ở cây mía có đến 126 loại bệnh xảy ra làm giảm đáng kể đến năng suất và sản
lượng của cây, gây thiệt hại to lớn đối với ngành công nghiệp đường trên thế giới

(Ricaud và ctv., 1989). Trong số đó, bệnh cằn mía gốc do vi khuẩn Leifsonia xyli
subsp. xyli (Lxx) kí sinh đã gây thiệt hại không nhỏ đến sản lượng mía trên thế giới.
Bệnh có thể gây thiệt hại từ 5 – 15% sản lượng (Comstock, 2005) và mức tổn thất có
thể lên đến 50% đối với vụ mía gốc (Davis, 1980).
Lxx kí sinh chuyên tính trong bó mạch nên việc nghiên cứu loại vi khuẩn này rất
khó khăn. Trên thế giới, vi khuẩn Lxx mới được quan tâm nghiên cứu trong thời gian
gần đây. Cho đến nay, các nhà khoa học trên thế giới đã đạt được một số thành công
nhất định từ quá trình nghiên cứu bệnh cằn mía gốc như: phân lập thành công vi khuẩn
Lxx từ dịch chiết của cây bị bệnh (Davis, 1980); thiết lập quy trình phát hiện Lxx trong
dịch chiết và dịch khuẩn lạc bằng kĩ thuật PCR (Y Pan và ctv, 1998); giải mã trình tự
bộ gen của Lxx (Monteiro-Vitorello và ctv, 2004); phát hiện sớm Lxx trên lá mía bằng
kĩ thuật real-time PCR (Grisham và ctv, 2007).
Ở nước ta bệnh cằn mía gốc đã xuất hiện từ lâu và gây ra những thiệt hại không
nhỏ cho người trồng mía và ngành mía đường, tuy nhiên tình hình nghiên cứu trong
nước về bệnh cằn mía gốc vẫn còn nhiều hạn chế. Vì thế cần phải có nhiều nghiên cứu
sâu hơn để có những căn cứ từ đó đưa ra biện pháp phòng tránh những thiệt hại do
bệnh này gây ra. Việc phát hiện sớm vi khuẩn Lxx trên cây mía là một yêu cầu cấp
thiết trong công tác tuyển chọn và kiểm định giống nhằm tạo ra một nền nông nghiệp
ổn định, hiệu quả, trực tiếp thúc đẩy ngành công nghiệp mía đường phát triển, đáp ứng
đủ nhu cầu trong nước và xuất khẩu. Trước thực tiễn trên đề tài "Phát hiện vi khuẩn
Leifsonia xyli subsp. xyli, tác nhân gây bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR từ mẫu
1


phân lập và dịch chiết cây mía bệnh" đã được thực hiện, nhằm đưa ra một phương
pháp phát hiện vi khuẩn Lxx một cách nhanh chóng và chính xác, góp phần vào chiến
lược kiểm soát và hạn chế tác hại của bệnh cằn mía gốc.
1.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
1.2.1. Mục tiêu
- Nghiên cứu tạo tiền đề cho phát hiện nhanh vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli

từ đó có biện pháp phòng, trừ bệnh cằn mía gốc hiệu quả.
1.2.2. Nội dung
Đề tài gồm bốn nội dung chính sau
- Ứng dụng phương pháp nhuộm STM để chẩn đoán bệnh cằn mía gốc và thu
dịch chiết từ cây mía bệnh. Sau đó, xác định sự hiện diện của vi khuẩn Lxx trong dịch
chiết cây mía dưới kính hiển vi.
- Phân lập vi khuẩn Lxx từ dịch chiết của cây mía bị bệnh trên môi trường thạch
MSC và SC.
- Phát hiện vi khuẩn Lxx bằng kỹ thuật PCR từ dịch chiết cây mía bệnh.
- Phát hiện vi khuẩn Lxx bằng kĩ thuật PCR từ mẫu đã phân lập.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu sơ lược về cây mía (Saccharum spp)
2.1.1. Nguồn gốc và lịch sử phát triển
Theo các tài liệu nghiên cứu về kiến tạo địa chất, nhiều tác giả cho rằng cây mía
xuất hiện trên trái đất từ khi lục địa châu Á và châu Úc còn dính liền, cách đây hàng
vạn năm. Ấn Độ và Trung Quốc là hai nước trồng mía có lịch sử lâu đời nhất trên thế
giới. Ở Trung Quốc, căn cứ vào những tài liệu ghi chép cổ xưa cùng với sự phân bố
rộng rãi của mía dại ở nhiều nơi trong nước và mức độ phong phú của những giống
mía thương mại cho thấy cây mía được trồng rất lâu đời, khoảng thế kỉ VI trước công
nguyên.
Nghề trồng mía ở châu Á được truyền bá đi khắp nơi trên thế giới theo hai con
đường: từ Trung Quốc truyền sang phía Đông Nam đến Philippine, Nhật Bản,
Indonexia; từ Ấn Độ sang phía Tây tới Iran, Ai Cập, Tây Ban Nha, Ý,... Cây mía được
trồng ở các nước vùng Địa Trung Hải vào khoảng đầu thế kỉ XIII. Năm 1940, trong
chuyến vượt biển lần hai, Christopher Columbus mới đưa mía sang châu Mỹ, đầu tiên

trồng ở đảo Santo Domingo, sau đó tới Mexico (1502), Brazil (1532), Peru (1533),
Cuba (1650) (Đoàn Thị Thanh Nhàn, 1996).
2.1.2. Phân bố
Vì nhiệt độ thích hợp cho mía phát triển từ 24 – 300C nên mía chỉ thích hợp trồng
ở vùng có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, mía có thể trồng được ở 35 vĩ độ bắc và
35 vĩ độ nam, tuy nhiên nơi có vĩ độ cao nhất mà cây mía được trồng là Natal,
Argentina, cực nam của Australia (khoảng 30 độ S), phía tây nam Pakistan (khoảng 34
độ N) và phía nam Tây Ban Nha (37 độ N) (Trích dẫn bởi Nguyễn Anh Khoa, 2006).
2.1.3. Phân loại học
Cây mía thuộc: Ngành có hạt (Spermatophyta)
Lớp một lá mầm (Monocotyledoneae)
Họ hòa thảo (Gramineae)
Giống Saccharum.
Trong giống Saccharum có năm loài:
Loài nhiệt đới (Saccharum officinarum L)
3


Loài Trung Quốc (Saccharum sinence Roxh Ement Jesw)
Loài Ấn Độ (Saccharum barberi Jesw)
Loài hoang dại thân nhỏ (Saccharum spontaneum L)
Loài hoang dại thân to (Saccharum robustum Bround and Jesw)
Các giống mía thương mại hiện nay là sản phẩm lai tự nhiên, lai nhân tạo giữa
các loài kể trên với nhau hoặc do quá trình tuyển chọn từ ba loài Saccharum
officinarum, Saccharum sinence, Saccharum barberi (Trần Văn Sỏi, 2003).
2.1.4. Đặc điểm cơ bản của cây mía
2.1.4.1. Các bộ phận
Rễ mía: thuộc loại rễ chùm, có hai loại
rễ là rễ sơ sinh (rễ hom) mọc ra từ đai rễ của
hom và rễ thứ sinh mọc ra từ đai rễ của cây

con nhiệm vụ bám đất, hút nước, cung cấp
chất dinh dưỡng cho cây.
Thân mía: bao gồm nhiều lóng, đốt mía
hợp lại. Thân mía không chỉ là nơi để giữ bộ
lá mà còn có nhiệm vụ dẫn nước, chất dinh
dưỡng từ rễ tới lá và dự trữ đường. Cho nên,
thân mía là đối tượng thu hoạch và quyết định
năng suất của ruộng mía.
Lá: gồm có bẹ lá và phiến lá. Bẹ lá là
phần bao bọc thân mía, bảo vệ mắt mầm;
phiến lá có hình lưỡi mác, có một gân giữa

Hình 2.1 Cây mía (Claude
Spoocramanien, 2000).

màu sáng và hình dáng, kích thước khác nhau tùy giống. Lá là tổ chức đồng hóa thực
sự của cây, có nhiệm vụ hô hấp và thực hiện quá trình quang hợp.
Hoa (bông cờ): hoa mía có tổ chức sinh sản ngầm với cấu trúc đơn giản. Mỗi
hoa bao gồm cả tính đực và tính cái với ba nhị, một bầu noãn và hai nhụy. Tuy nhiên,
trong sản xuất người ta không thích mía ra hoa.
Hạt mía: là vật liệu sinh sản hữu tính của cây mía, đây là kết quả cuối cùng của
giai đoạn sinh thực. Hạt mía giống một chiếc vảy nhỏ, hình thoi và nhẵn, độ dài 1 -

4


1,25 mm, nặng 0,15 - 0,25 mg. Hạt mía chỉ có ý nghĩa trong lai tạo tuyển chọn giống
mía (Nguyễn Huy Ước, 1999; Trần Thùy, 1996).
2.1.4.2. Sinh trưởng và phát triển
Dù là mía tơ hay mía gốc, chu kì sinh trưởng của cây mía gồm 6 thời kì mỗi thời

kì có một yêu cầu riêng và có một vị trí nhất định đối với sự sinh trưởng và phát triển
của cây mía.
Thời kì nảy mầm: thời kì nảy mầm tính từ khi đặt hom trồng cho tới lúc mầm
mía nảy thành cây con, mở đầu cho hoạt động sống của cây mía. Hom mía từ trạng
thái ngủ chuyển sang trạng thái hoạt động trải qua một loạt biến đổi sinh hóa phức tạp.
Trong quá trình nảy mầm, hom mía hô hấp mạnh. Dưới tác dụng của enzyme, đường
saccharose và protein trong hom mía được phân giải thành glucose và acid amine cung
cấp cho hoạt động sống của mầm, rễ.

Hình 2.2 Các bộ phận phát triển từ hom mía sau khi
trồng (Julien và ctv, 1989).
Thời kì cây con: bắt đầu từ khi cây có lá thật thứ nhất cho đến khi phần lớn cây
trong ruộng mía có 5 lá thật. Sau khi rễ cây đã phát triển mạnh thì nhiệm vụ cung cấp
5


dinh dưỡng chính do rễ cây đảm nhiệm. Do đó, trong thời kì này, phải tạo điều kiện
cho lá sinh trưởng mạnh để cây quang hợp tốt, đồng thời thúc đẩy rễ cây phát triển
nhanh.
Thời kì đẻ nhánh (nhảy bụi hoặc đâm chồi): đẻ nhánh thực chất là sự nảy mầm
của những mầm ở phần gốc của cây. Khi cây mía có từ 6 – 7 lá thật, các mầm nằm ở
dưới mặt đất nảy thành nhánh. Từ thân mẹ đẻ ra nhánh cấp 1, nhánh cấp 1 đẻ ra nhánh
cấp 2 và tiếp tục thành một bụi mía.
Thời kì vươn cao (vươn lóng): trong thời kì này thân vươn cao nhanh, đường
kính thân tăng mạnh, trên cơ sở bộ lá và bộ rễ đã phát triển hoàn chỉnh, các quá trình
sinh lý của cây đạt tới đỉnh cao, hiệu lực sử dụng độ phì đất đai, phân bón, năng lượng
ánh sáng mặt trời tăng lên. Trong thời kì này mía sinh trưởng nhanh, tốc độ tăng
trưởng chiều cao đạt từ 10 – 50 cm/tháng. Do đó, thời kì vươn cao là thời kì quyết định
trọng lượng thân, tức là thời kì quyết định năng suất mía cây.
Thời kì chín công nghiệp: bước vào thời kì chín công nghiệp, cây mía sinh

trưởng chậm lại và bước vào thời kì tích lũy đường mạnh mẽ. Chín công nghiệp là khi
hàm lượng đường trong cây mía đạt mức thích hợp để thu hoạch ép đường. Quá trình
tích lũy đường trong cây mía diễn ra từ dưới lên trên, lần lượt lóng này đến lóng khác,
lóng dưới chín trước lóng trên. Khi hàm lượng đường của phần thân ngọn tương
đương phần thân gốc là đúng độ chín công nghiệp.
Thời kì chín sinh lí (trổ cờ ra hoa kết quả): trổ cờ là giai đoạn phát triển sinh lí
của cây mía. Ở nước ta, mía thường trổ cờ từ tháng 10 (miền Nam) đến tháng 12 (miền
Bắc). Khi mía trổ cờ, thân ngừng sinh trưởng, tỉ lệ đường giảm, tỉ lệ xơ tăng. Vì vậy,
trong sản xuất mía thường tìm cách hạn chế sự trổ cờ ra hoa kết hạt (Trần Văn Sỏi,
2003).
2.1.4.3. Quang hợp
Mía là một trong những cây có chỉ số diện tích lá lớn nhất lại có cường độ quang
hợp cao nhất nên được mệnh danh là cây đặc biệt “cao sản”. Nó có thể sản xuất ra một
lượng sinh khối lớn từ 200 đến 250 tấn/ha/năm, bao gồm kể cả gốc, thân, lá. Chưa có
cây nào vượt qua nó về lĩnh vực này (Trần Văn Sỏi, 2003).
2.1.4.4. Sự hình thành và tích lũy đường
Sự hình thành và tích lũy đường trong cây mía bao gồm hai giai đoạn: giai đoạn
một là sự kết hợp của CO2 và H2O thành đường đơn glucose với sự có mặt của diệp
6


lục và ánh sáng. Giai đoạn hai là quá trình chuyển hóa đường đơn thành đường
saccharose và các đường đa khác, giai đoạn này không cần ánh sáng và diệp lục.
Các bộ phận của cây mía như thân, lá đều có thể tổng hợp đường mía từ đường
đơn. Đường mía tổng hợp từ lá chuyển vào thân, một phần dùng cho hô hấp và cấu tạo
thân, lá, rễ; phần còn lại tích lũy trong thân dưới dạng saccharose.
Trong thời kỳ đầu, thân còn non, các tế bào nhu mô mọng nước, vách tế bào
mỏng. Trong quá trình vươn cao những lóng tiếp tục trưởng thành tiếp tục to lên và dài
thêm, vách tế bào dày và cứng dần lên, đường tích lũy tăng dần, chất khô phi đường
tăng, hàm lượng nước giảm. Cuối cùng lóng không vươn dài và to thêm nữa, lá và bẹ

tương ứng khô đi nhưng hàm lượng đường vẫn tiếp tục tăng cho đến khi hàm lượng
đường đạt đến mức tối đa (chín công nghiệp).
2.1.5. Giá trị kinh tế của cây mía
Cây mía là nguyên liệu quan trọng của ngành công nghiệp chế biến đường ăn ở
trong nước cũng như trên thế giới. Ngoài sản phẩm chính là đường còn những phụ
phẩm của cây mía như:
Bã mía: có thể dùng ngay làm nhiên liệu đốt lò hoặc làm bột giấy, ép thành ván
dùng trong kiến trúc. Cao hơn nữa, từ bã mía có thể làm ra furfural là nguyên liệu của
ngành sợi tổng hợp.
Mật gỉ: mật gỉ là nguyên liệu để chưng cất sản xuất rượu Rhums và cồn công
nghiệp (từ 1 tấn mật gỉ có thể sản xuất được 300 lít cồn tinh và 3800 lít rượu). Ngoài
ra, mật gỉ còn được sử dụng để sản xuất các loại men và các loại acid (acid acetic, acid
citric).
Bùn lọc: từ bùn lọc có thể rút ra sáp mía để sản xuất nhựa xerezin làm sơn, xi
đánh giày, bản sáp roneo. Sau khi lấy sáp, bùn lọc được tận dụng làm phân bón.
Mía còn là nguồn nguyên liệu quan trọng cho sản xuất ethanol, nước dẫn dầu
trong công nghệ sản xuất ethanol từ mía là Brazil. Tại quốc gia này đã có trên 90% ô
tô, xe máy chạy bằng nhiên liệu sinh học (bioethanol) được sản xuất từ cây mía và hạt
cải dầu.
Xét về phương diện sinh học, mía là loại cây trồng có khả năng cho sinh khối lớn,
tái sinh mạnh và thích ứng rộng nên có hiệu quả kinh tế cao cho người trồng (Đoàn
Thị Thanh Nhàn, 1996).

7


2.2. Các loại bệnh hại trên cây mía
Mía là loại cây trồng một lần nhưng lại có khả năng cho thu hoạch nhiều vụ, nên
đây cũng là một trong những điều kiện thuận lợi cho nhiều loài sâu bệnh tồn tại và
phát triển. Từ năm 1989 đến nay, thành phần bệnh hại mía trên thế giới và các tác

nhân gây bệnh chưa có gì thay đổi với 126 bệnh gồm: 9 bệnh do virus, 2 bệnh do
phytoplasma, 9 bệnh do vi khuẩn, 68 bệnh do nấm, 3 bệnh do thực vật kí sinh, 2 bệnh
do tác động cơ giới và 24 bệnh chưa xác định được nguyên nhân (Joaquin, 2001)
(Trích dẫn bởi Hà Đình Tuấn, 2004). Ở Việt Nam, tình hình nghiên cứu và khảo sát
bệnh trên cây mía không nhiều. Theo kết quả nghiên cứu của Hà Đình Tuấn (2004)
cho thấy vùng nguyên liệu mía Đông Nam Bộ có 3 bệnh do virus, 5 bệnh do vi khuẩn,
31 bệnh do nấm, 1 bệnh do phytoplasma, 4 bệnh chưa biết tác nhân và một số bệnh
khác do tuyến trùng, thực vật kí sinh, do yếu tố môi trường và dinh dưỡng gây ra.
Danh sách các bệnh hại mía phổ biến được trình bày ở bảng 2.1 và bảng 2.2.
Bảng 2.1 Danh sách các bệnh hại mía phổ biến do nấm gây ra
TT

Tên Việt Nam

Tên tiếng Anh

Tác nhân gây hại

1

Bệnh sọc nâu

Brown stripe

Cohliobalus stenospilus Drechs

2

Bệnh mốc sương

Downy mildew

Peronosclerospora sacchri T. Miyake

3

Bệnh đốm mắt én

Eye spot

Bipolaris sacchari shoemaker

4

Bệnh đốm trắng

White speck

Bipolaris sacchari T.C.Lo

5

Bệnh cháy lá

Leaf scorch

Stagonospora sacchari Lo and Ling

6

Bệnh dứa

Pinapple disease

Ceratosystis paradoxa Moreau

7

Bệnh xoắn cổ lá

Pokkah boeng

Fusarium moniliform Sheldon

8

Bệnh thối đỏ

Red rod

Colectotrichum falcatum Went

9

Bệnh rỉ sắt đỏ

Rust

Puccinia melanopcephala H. & P. Syd

10

Bệnh rỉ sắt vàng

Rust orange

P. kuehnii Butl

11

Bệnh than

Smut

Ustilago senaminea Syd

12

Bệnh đốm vàng

Yellow spot

Mycovellosiella koepket

13

Bệnh đốm vòng

Ring spot

Leptosphaeria sacchari van Berda de Haan

(Hà Đình Tuấn, 2004)

8


Bảng 2.2 Danh sách các bệnh hại mía phổ biến do vi khuẩn, phytoplasma và virus gây ra
TT

Tên Việt Nam

I

Bệnh do vi khuẩn

1

Bệnh gôm

Tên tiếng Anh
Gumming diease

Tác nhân gây hại
Xanthomonas camestris pv.
Vasculorum

2

Bệnh thân ngọn đâm chồi

Leaf scald

Xanthomonas alibilineans

3

Bệnh cằn mía gốc

Ratoon stunting disease

Leifsonia xyli subsp. xyli

4

Bệnh sọc đỏ

Red stripe

Pseudomonas rubrilineans

II

Bệnh doPhytoplasma

5

Bệnh chồi cỏ

Grassy shoot

Chưa rõ

6

Bệnh trắng lá

White leaf

Chưa rõ

III

Bệnh do virus

7

Bệnh sọc vàng

Chlorotic streak

Chưa rõ

8

Bệnh Fiji

Fiji disease

Fiji disease virus

9

Bệnh khảm

Mosaic

Sugarcane mosaic virus

10

Bệnh đốm sọc

Streak

Sugarcane streak virus

11

Bệnh vàng gân lá

Yellow leaf disease

Sugarcane yellow leaf virus

(Hà Đình Tuấn, 2004)

Hình 2.3 Bệnh do nấm (Frison và Putter, 1993).

9

Hình 2.4 Bệnh do vi khuẩn (Frison và Putter, 1993).

Hình 2.5 Bệnh do virus (Frison và Putter, 1993).

10


2.3. Sơ lược về bệnh cằn mía gốc
2.3.1. Nguồn gốc và phân bố
Bệnh cằn mía gốc được phát hiện đầu tiên
ở Australia từ năm 1944 - 1945 nhưng vào thời
điểm đó người ta vẫn chưa tìm ra nguyên nhân.
Hughes và Steindl (1955) đã tìm ra tác nhân gây
bệnh và cho rằng đó là do virus. Năm 1973, một
loại vi khuẩn nhỏ được phát hiện là có liên kết
với bệnh cằn mía gốc (Gillaspie và Teakle,
1989; Teakle và ctv, 1978) (Trích dẫn bởi
Claudia B. Monteiro-Vitorello và ctv, 2004).
Bệnh cằn mía gốc xảy ra ở hầu hết các khu
vực trồng mía trên thế giới: Antigua, Argentina,
Australia,

Bangladesh,

Barbados,

Belize,

Bolivia, Brazil, Burkina Faso, Cameron,

Hình 2.6 Cây mía có dấu hiệu của
bệnh cằn mía gốc (Brumbley và ctv,
2006).

Trung Quốc, Colombia, Congo, Costa Rica, Cuba, Ấn Độ, Indonesia, Nhật, Malaisia,
Mali, Mexico, Đài Loan, Thái Lan, Việt Nam,... (Gillaspie và Teakle, 1989; Davis và
Bailey, 2000). Đây được xem là bệnh gây hại nghiêm trọng nhất tác động đến sản
lượng mía trên thế giới, bệnh có thể gây thiệt hại từ 5 – 15% sản lượng (Comstock và
Lentini, 2005), đôi khi tổn thất lên đến 30 – 50% tổng sản lượng mía thu được đối với
các giống mía nhạy cảm và không có khả năng kháng (Bailey và Bechet, 1995; Pan và
ctv, 1998; Brumbley và ctv, 2006).
2.3.2. Tác nhân gây bệnh
Vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) là một loại vi khuẩn Gram dương, có
kích thước nhỏ (0,25 – 0,35 x 1 – 4 m, đôi khi dài đến 10 m) (Davis và ctv, 1980),
dạng coryne, hiếu khí và rất khó nuôi cấy do cần nguồn dinh dưỡng phức tạp. Chúng
sống ở các bó mạch gỗ của cây mía gây tắc bó mạch và lây truyền sang cây khác thông
qua vật liệu trồng bị nhiễm bệnh hay các dụng cụ trồng và thu hoạch (Taylor và ctv,
2003). Ban đầu, loại vi khuẩn này được xếp vào loài Clavibacter do các đặc tính kiểu
hình nhưng gần đây đã được thay đổi thành Leifsonia dựa vào các kết quả phân tích
11


gen rRNA. Cách phân loại này đã được xác nhận bởi Young và ctv (2006) (Trích dẫn
bởi Brumbley và ctv, 2006).

Hình 2.7 Vi khuẩn leifsonia xyli subsp. xyli dưới kính hiển vi điện tử
(Davis và ctv, 1984).

Vi khuẩn Lxx có dạng thẳng hay gậy mảnh nhưng một vài tế bào lại căng phình ra
ở ngoại biên hay ở giữa tế bào, sinh sản theo hình thức nhân đôi. Mesosome thường
hiện diện và thỉnh thoảng xuất hiện khi hình thành vách ngăn (hình 2.7). Cho đến nay,
người ta nhận thấy cây mía là kí chủ tự nhiên duy nhất của Lxx, loại vi khuẩn này kí
sinh chuyên tính trên cây mía nhưng không tạo ra các triệu chứng bệnh đặc trưng
(Davis và Bailey, 2000).
2.3.2. Triệu chứng
Thông thường, triệu chứng cằn cỗi và khả năng mọc chồi kém được cho là hậu
quả của sự tắc mạch. Tuy nhiên, Leifsonia xyli subsp. xyli không tạo ra các triệu
chứng bên trong hoặc bên ngoài đáng tin cậy (Brumbley và ctv, 2006). Triệu chứng
nghi ngờ là cây bị cằn cỗi, thấp, đường kính nhỏ, lóng ngắn, số lượng cây (bụi) ít hơn
bình thường. Trong các vụ gốc, cây bệnh sinh trưởng chậm và có thể chết đối với các
giống mẫn cảm cao. Ở các giống mẫn cảm cao, cây bị rũ xuống trong điều kiện thiếu
ẩm độ, bị thối ở đỉnh và mép lá. Hệ thống rễ của cây bị bệnh phát triển kém hơn so với
cây khỏe mạnh bình thường.

12


Bệnh gây ra làm cho các bó mạch ở phía dưới đốt mía bị đổi màu, nhưng triệu
chứng này thường chỉ xuất hiện trong thời gian rất ngắn. Khi chẻ dọc thân mía của cây
bị bệnh có các đốm nhỏ từ màu vàng đến nâu đỏ, dạng dấu phẩy, ngắn và sự đổi màu
này không kéo dài khắp lóng mía như triệu chứng của các bệnh khác (Davis và Bailey,
2000). Ở một số giống, cây mía non cũng có sự đổi màu từ vàng đến nâu đỏ của tế bào
mạch dẫn ngay dưới mô phân sinh ngọn; triệu chứng có thể có là làm cho 1 phần thân
chuyển thành màu hồng ngay tại các đỉnh sinh trưởng của chồi non hay hóa đỏ cam tại
các bó mạch ở giữa đốt của những thân mía đã trưởng thành (Brumbley và ctv, 2006).

A

C

B

D

Hình 2.8 Triệu chứng của cây mía bị bệnh cằn mía gốc. (A) Cây bệnh còi cọc kém
phát triển; (B) Đốt thân ngắn; (C) Vết đổi màu tại đỉnh sinh trưởng của chồi non; (D) Vết
đổi màu trong thân cây mía bệnh (www.pakissan.com; Guatemala & Ovalle, 1997;

Davis và ctv, 1998).

13


2.3.3. Tác hại của dịch bệnh
Bệnh cằn mía gốc có tác động xấu đến sản lượng mía trên thế giới, bệnh có thể
gây thiệt hại từ 5 – 15% sản lượng (Comstock, 2005) và mức tổn thất có thể lên đến
50% đối với vụ mía gốc (Davis, 1980). Vi khuẩn Lxx không gây ra các triệu chứng bên
ngoài đặc trưng, hơn nữa sự lan truyền vi khuẩn lại diễn ra rất nhanh trong các ruộng
mía làm cho thiệt hại do bệnh gây ra càng nặng nề hơn.
Vi khuẩn Lxx chủ yếu cản trở sự vận chuyển nước và chất dinh dưỡng của cây
làm cho cây bị còi cọc (Kao và Damann, 1978) làm giảm năng suất và phẩm chất mía,
mức độ bệnh trên đồng ruộng liên quan mật thiết với mật độ vi khuẩn gây bệnh và số
lượng các bó mạch chứa vi khuẩn (Comstock và ctv, 1996). Một số thống kê cho thấy
thiệt hại do bệnh gây ra là rất lớn, riêng ước tính hàng năm ở Úc lên đến 11 triệu USD
(Fegan và ctv, 1998) và ở Louisiana khoảng 36 triệu USD (Dean và Davis, 1984). Mặc
dù ở Brazil không có những ước tính về thiệt hại, nhưng bệnh cằn mía gốc được xem
là đối tượng đặc biệt quan trọng.
2.3.4. Sự phát triển, lan truyền dịch bệnh

Vì bệnh cằn mía gốc khó có thể phát hiện được bằng mắt nên vi khuẩn có thể lan
truyền từ vùng này sang vùng khác một cách "âm thầm" mà người nông dân vẫn
không biết cánh đồng mía của họ đang bị bệnh. Thậm chí, khi thấy ruộng mía có dấu
hiệu chậm phát triển, người ta thường quy cho các nguyên nhân khác như: điều kiện
canh tác nghèo nàn, thiếu độ ẩm hoặc chất dinh dưỡng. Vi khuẩn Lxx phát tán, lây lan
trong đồng ruộng thông qua các dụng cụ thu hoạch cơ giới hay thủ công, trong đó sự
lây nhiễm do máy móc khi thu hoạch cơ giới rất đáng kể. Các loài động vật ăn mía
cũng có thể là tác nhân truyền bệnh khi chúng gặm một thân mía bị bệnh sau đó lại
tiếp tục gặm sang một thân mía khỏe khác.
Theo Bailey và Tough (1992); Damann (1992); Comstock và ctv (1996), tùy
thuộc vào tính mẫn cảm của từng giống mía đối với bệnh mà mức độ lây nhiễm cũng
như mức thiệt hại khác nhau trong các cánh đồng. Thêm vào đó, các yếu tố bất lợi về
nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng, ngập lụt hay khô hạn cũng góp phần làm gia tăng tỉ lệ bệnh.
Bệnh gây thiệt hại nặng nề hơn trong các vụ mía gốc, mía tái sinh từ gốc sót lại cũng
dễ dàng lây bệnh sang mía tơ (Westphal và Mirkov, 2003).
14


2.3.5. Biện pháp ngăn chặn và kiểm soát dịch bệnh
Vi khuẩn Lxx chủ yếu làm cản trở sự vận chuyển nước và chất dinh dưỡng của
cây làm cho cây bị còi cọc (Kao và Damann, 1978). Để tiêu diệt hay ngăn cản sự xâm
nhiễm của mầm bệnh nên ngâm mía trong nước nóng (500C) trong hai giờ trước khi
đem trồng. Các dụng cụ thu hoạch phải được rửa sạch và sát trùng bằng hóa chất trước
khi thu hoạch sang ruộng khác. Các chất diệt trùng hóa học có thể sử dụng đối với
dụng cụ cắt mía bao gồm: lysol, dettol, ethanol, mirrol and roccal. Nên cho hóa chất
tiếp xúc với bề mặt cắt ít nhất 5 phút để đảm bảo chắc chắn vô trùng.
Ngoài ra, sử dụng giống kháng cũng là một biện pháp hiệu quả để kiểm soát
bệnh; mặc dù không có giống nào được tìm thấy là miễn dịch hoàn toàn đối với sự
xâm nhiễm của Lxx nhưng CP 78-1628 và CP 80-1743 là 2 giống đã được chứng minh
là có khả năng kháng đối với bệnh cằn mía gốc (Comstock và Lentini, 2005). Bởi vì

cây mía có thể phát triển thành 4 – 5 vụ mía gốc từ một vụ mía tơ nên phải thận trọng,
tránh sự xâm nhiễm của loại vi khuẩn này lên toàn bộ cánh đồng (Westphal và
Mirkov, 2003).
2.4. Các phương pháp chẩn đoán phát hiện vi khuẩn Lxx
2.4.1. Chẩn đoán qua triệu chứng bên ngoài
Dựa vào các triệu chứng biểu hiện bên ngoài như sự cằn cỗi của cây, số cây trong
một bụi ít, sự chuyển thành màu hồng tại mô mạch ở các mắt của cây mía trưởng thành
và màu hồng nhạt ở các lóng cây non (Hughes và Steindl, 1955). Tuy nhiên, cường độ
biểu hiện có sự khác nhau rất lớn giữa các giống cây cũng như giữa các cây trong cùng
một giống. Thêm vào đó, triệu chứng biểu hiện của bệnh không khác gì mấy với điều
kiện canh tác nghèo nàn, thiếu độ ẩm hoặc chất dinh dưỡng và bệnh do các tác nhân
thông thường gây ra trên mía như côn trùng, các nhân tố môi trường và sự hủy hoại cơ
học (Gillaspie và Teakle, 1989) (Trích dẫn bởi Taylor và ctv, 2003). Do đó, bệnh cằn
mía gốc thường được xác định thông qua các kĩ thuật phòng thí nghiệm.
2.4.2. Chẩn đoán trực tiếp bằng kính hiển vi
Dịch mía sau khi chiết được quan sát bằng kính hiển vi đối pha hoặc kính hiển vi
nền tối ở độ phóng đại 1000 lần để phát hiện vi khuẩn nhưng phương pháp này có độ
nhạy thấp (khoảng 106 tế bào/ml) và chậm khi chọn lọc một số lượng mẫu lớn (Taylor
15