Phát hiện vi khuẩn erwinia carotovora subsp. carotovora trên cây địa lan

1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
٭٭٭ 000٭٭٭







PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp.
carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG
PHƢƠNG PHÁP PCR


Luận văn kỹ sƣ
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học










Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2006

2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
٭٭٭ 000٭٭٭





PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp.
carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG
PHƢƠNG PHÁP PCR








Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN NGUYỄN THỊ THANH HÀ
KS. DƢƠNG THÀNH LAM

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2006

3


MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY. HO CHI MINH CITY
DEPARMENT OF BIOTECHNOLOGY
***000***






TO FIND BACTERIUM: Erwinia carotovora subsp. carotovora ON
THE Cymbidium BY THE PCR





Graduation thesis
Major: Biotechnology

Professor: Student:
PhD. LE DINH DON NGUYEN THI THANH HA
BSc. DUONG THANH LAM Term:2002 – 2006





Ho Chi Minh City
8/2006
4
LỜI CẢM TẠ

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi nhận đƣợc rất nhiều sự ủng hộ và giúp đỡ từ
gia đình, thầy cô và bạn bè. Nay tôi xin chân thành cảm ơn đến:
Cha mẹ và những ngƣời thân luôn tạo điều kiện, động viên con trong suốt quá trình
con học tập tại trƣờng.
Ban Giám Hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ
Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả thầy cô đã tận tình giúp đỡ, dạy dỗ,
truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trƣờng.
Thầy Lê Đình Đôn đã hết lòng hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập
tốt nghiệp.
Thầy Dƣơng Thành Lam đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
thực tập tốt nghiệp.
Anh Nguyễn Văn Lẫm, các anh chị làm việc tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm
Hóa Sinh, các anh chị làm việc tại Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật khoa Nông Học trƣờng Đại
Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực
hiện khóa luận.
Các bạn sinh viên lớp công nghệ sinh học 28 đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt
thời gian học và làm đề tài tốt nghiệp.

TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006

Nguyễn Thị Thanh Hà
5

TÓM TẮT KHÓA LUẬN
NGUYỄN THỊ THANH HÀ, Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.Tháng 8 năm 2006.
“PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp. carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN
(Cymbidium) BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR”
Giáo viên hƣớng dẫn:
Thầy Lê Đình Đôn
Thầy Dƣơng Thành Lam
Địa điểm: Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Thực Vật – Trung Tâm Phân Tích
Thí Nghiệm Hóa Sinh - Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.
Đối tƣợng nghiên cứu: vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora trên địa lan
(Cymbidium). Hiện nay, các vƣờn địa lan tại thành phố Đà Lạt bị thiệt hại rất lớn do bệnh
thối làm chết cây gây ra. Cho đến thời điểm này ngƣời ta vẫn chƣa xác định chính xác tác
nhân gây ra bệnh và chƣa có loại thuốc đặc trị hữu hiệu. Do đó, việc tìm hiểu phƣơng
pháp chẩn đoán, phát hiện tác nhân gây ra bệnh là hết sức cần thiết giúp xây dựng quy
trình phòng trừ bệnh hiệu quả hơn.
Nội dung nghiên cứu bao gồm:
1. Điều tra tình hình bệnh hại trên địa lan tại một số vƣờn trồng địa lan trên địa bàn TP.
Đà Lạt – Lâm Đồng.
2. Phân lập mẫu vi khuẩn và chủng bệnh lên củ khoai tây và lá địa lan.
3. Nhân sinh khối các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc.
4. Khuếch đại đoạn DNA nằm trong vùng 16S/23S rDNA và vùng gen pel mã hóa pectate
lyase của vi khuẩn bằng phƣơng pháp PCR.
Kết quả đạt đƣợc:

1. Tỷ lệ nhiễm bệnh tại các vƣờn điều tra:
- Bệnh do vi khuẩn: 20,17%.
- Bệnh do virus: 9,5%.
- Bệnh do nấm: 11,6%.
2. Phân lập đƣợc 2 dòng vi khuẩn có màu khuẩn lạc rất đặc trƣng:
- Khuẩn lạc vi khuẩn màu vàng trứng, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn.
- Khuẩn lạc vi khuẩn màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn.
3. Chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan:
6
- Trên củ khoai tây: 9 dòng vi khuẩn có khả năng gây bệnh mạnh sau 48 giờ chủng bệnh
(ở nhiệt độ phòng).
- Trên lá địa lan: hầu nhƣ các dòng vi khuẩn đều không gây bệnh sau khi chủng bệnh 10
ngày (ở 25
0
C), duy nhất chỉ có một dòng EC06-8 gây bệnh.
4. Khuếch đại đƣợc đoạn DNA có kích thƣớc 1,5 kb nằm trong vùng 16S/23S rDNA của
các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc.
7
MỤC LỤC

Phần Trang
Trang tựa ................................................................................................................. ii
Lời cảm tạ .............................................................................................................. iii
Tóm tắt ................................................................................................................... iv
Mục lục .................................................................................................................. vi
Danh sách các chữ viết tắt ..................................................................................... ix
Danh sách các hình ................................................................................................. x
Danh sách các bảng ............................................................................................... xi
PHẦN 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1

1.2. Mục đích – yêu cầu .......................................................................................... 1
1.2.1. Mục đích ....................................................................................................... 1
1.2.2. Yêu cầu ......................................................................................................... 1
1.2.3. Giới hạn ........................................................................................................ 2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 3
2.1. Điều kiện tự nhiên của TP. Đà Lạt với việc
nuôi trồng Cymbidium ..................................................................................... 3
2.2. Giới thiệu về lan Cymbidium ........................................................................... 3
2.2.1. Phân loại – phân bố ...................................................................................... 3
2.2.2. Đặc điểm thực vật học .................................................................................. 4
2.2.3. Yêu cầu sinh thái .......................................................................................... 5
2.2.4. Sâu bệnh ....................................................................................................... 5
2.2.5. Tình hình sản xuất lan Cymbidium của Tp. Đà Lạt
và trên thế giới ................................................................................................ 7
2.3. Giới thiệu về vi khuẩn Erwinia carotovora subsp.
carotovora và tác hại của nó ................................................................................ 8
2.3.1. Phân loại ....................................................................................................... 8
2.3.2. Erwinia carotovora ...................................................................................... 8
2.3.3. Erwinia carotovora subsp. carotovora ....................................................... 9
2.4. Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh do vi khuẩn gây ra ......................................... 13
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 17
8
3.1. Vật liệu thí nghiệm ........................................................................................ 17
3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .............................................................. 17
3.1.2. Vật liệu ....................................................................................................... 17
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................... 18
3.2.1. Điều tra tình hình bệnh chết cây trên địa lan
tại TP Đà Lạt – Lâm Đồng ......................................................................... 18
3.2.2. Phân lập mẫu vi khuẩn ............................................................................... 18
3.2.3. Quan sát vi khuẩn trên môi trƣờng KB

và môi trƣờng YDC .................................................................................... 19
3.2.4. Chủng vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan ............................................ 19
3.2.5. Tăng sinh khối vi khuẩn trên môi trƣờng LB lỏng ..................................... 21
3.2.6. Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn............................................................ 21
3.2.7. Thực hiện phản ứng PCR ........................................................................... 22
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 25
4.1. Tình hình bệnh hại trên địa lan tại TP. Đà Lạt – Lâm Đồng ......................... 25
4.1.1. Các triệu chứng bệnh trên địa lan ............................................................... 25
4.1.2. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm
gây ra qua các vƣờn điều tra ........................................................................ 27
4.2. Phân lập mẫu vi khuẩn .................................................................................. 28
4.3. Quan sát vi khuẩn trên môi trƣờng KB và môi trƣờng YDC ........................ 29
4.3.1. Trên môi trƣờng KB ................................................................................... 29
4.3.2. Trên môi trƣờng YDC ................................................................................ 30
4.4. Chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan ...................................... 31
4.4.1. Trên củ khoai tây ........................................................................................ 31
4.4.2. Trên lá địa lan ............................................................................................. 32
4.5. Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn............................................................... 32
4.6. Phản ứng PCR ............................................................................................... 34
4.6.1. Phản ứng PCR với cặp primer
Xan 1330 và Xan 322 .................................................................................. 34
9
4.6.2. Phản ứng PCR với cặp primer
Erw1 và Erw2 .............................................................................................. 35
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 37
5.1. Kết luận.......................................................................................................... 37
5.2. Đề nghị .......................................................................................................... 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 38

10
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PCR : Polymerase chain reaction
DNA : Deoxyribonucleotide acid
RNAse : Ribonuclease
TE : Tris EDTA
SDS : Sodium dodecyl sulfate
NaCl : Natri clorua
TAE : Tris Acetate EDTA
dNTP : Deoxynucleotide triphosphate
Taq : Thermus aquaticus
UV : Ultra violet
LB : Luria – Bertani
KB : King et al. 's medium B agar
CVP : Crystal violet - pectate
PGA : Potato Glucose Agar
EtBr : Ethidium bromide
YDC : Yeast extract – dextrose – CaCO
3

Ecc : Erwinia carotovora subsp. carotovora
CTAB : Cethyltrimethylammonium bromide
T
m
: Melting temperature
ELISA : Enzyme linked Immuno Sorbent Assay
μl : micro lít
μg : micro gam

μM : micro mol / lít
mM : mili mol / lít
ctv : cộng tác viên
ha : hecta
ng : nano gam
bp : base pair

11
DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG
Hình 2.1. Hình thái vi khuẩn Erwina carotovora .................................................. 8
Hình 4.1. Các triệu chứng bệnh trên chồi địa lan ................................................. 25
Hình 4.2. Các triệu chứng bệnh trên giả hành ...................................................... 26
Hình 4.3. Các triệu chứng bệnh trên phát hoa ...................................................... 26
Hình 4.4. Vi khuẩn phân lập từ chồi địa lan bị bệnh
trên môi trƣờng PGA ............................................................................ 29
Hình 4.5.1. Khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trƣờng KB
chiếu dƣới tia UV sau 24 giờ nuôi cấy (ở nhiệt độ phòng) .................. 30
Hình 4.5.2. Hình thái của khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trƣờng YDC
sau 24 giờ nuôi cấy (ở nhiệt độ phòng) ............................................... 30
Hình 4.6.1. Các triệu chứng bệnh trên củ khoai tây
chủng vi khuẩn sau 48 giờ (ở nhiệt độ phòng) .................................... 31
Hình 4.6.2. Triệu chứng bệnh trên lá địa lan
chủng vi khuẩn sau 10 ngày (ở 25
0
C).................................................. 32
Hình 4.6.3. Vi khuẩn phân lập từ lá địa lan bị bệnh
sau khi chủng vi khuẩn 10 ngày trên môi trƣờng PGA ...................... 32
Hình 4.7. Sản phẩm ly trích DNA tổng số của vi khuẩn ...................................... 33

Hình 4.8. Sản phẩm PCR với cặp primer
Xan 1330 và Xan 322 (nhiệt độ bắt cặp 56
0
C) ....................................... 34
Hình 4.9. Sản phẩm PCR với cặp primer
Xan 1330 và Xan 322 (nhiệt độ bắt cặp 58
0
C) ....................................... 34
Hình 4.10. Sản phẩm PCR với cặp primer Erw1 và Erw2 ................................... 35
12
DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ

BẢNG TRANG
Bảng 4.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm
gây ra qua các vƣờn điều tra ................................................................. 27

ĐỒ THỊ TRANG
Đồ thị 4.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm
gây ra qua các vƣờn điều tra .................................................................... 28




13
PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nói đến hoa Đà Lạt, chúng ta không thể nào không nói đến lan Cymbidium. Ngƣời
dân Đà Lạt thƣờng gọi lan Cymbidium là địa lan. Địa lan Đà Lạt rất phong phú về chủng
loại, đa dạng về cấu trúc và màu sắc. Loài hoa này từng là “sứ giả” của Đà Lạt ở Đông Âu
những năm trƣớc 1990. Mặc dù có những biến động bất lợi về thị trƣờng tiêu thụ hoa cắt

cành nhƣng gần đây, việc nuôi trồng hoa lan với quy mô lớn nhằm mục đích khai thác
kinh doanh đã dần dần đƣợc khôi phục. Hoa địa lan Cymbidium đƣợc nhiều ngƣời quan
tâm và đầu tƣ với quy mô lớn.
Tuy nhiên trong vài năm trở lại đây, ngƣời nông dân trồng địa lan tại TP. Đà Lạt
đang phải đối mặt với bệnh thối làm chết cây. Bệnh phát triển nhiều và lây lan nhanh
chóng trong mùa mƣa. Hiện nay, tình trạng bệnh chết cây địa lan vẫn chƣa đƣợc khống
chế do chƣa xác định chính xác tác nhân gây ra bệnh và chƣa tìm ra loại thuốc đặc trị hữu
hiệu. Thiệt hại về kinh tế do căn bệnh này gây ra là rất lớn. Đây là nỗi trở ngại, băn khoăn
của đa số các hộ trồng địa lan trên địa bàn thành phố Đà Lạt. Vấn đề đặt ra là làm sao xác
định chính xác tác nhân gây ra bệnh để từ đó xây dựng đƣợc quy trình phòng trừ bệnh
hữu hiệu giúp giảm thiệt hại do căn bệnh này gây ra cho ngƣời trồng địa lan.
Với tính cấp thiết của vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Phát hiện vi
khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora trên cây địa lan (Cymbidium) bằng phƣơng
pháp PCR”.
1.2. Mục đích – yêu cầu
1.2.1. Mục đích: thiết lập quy trình PCR cho vi khuẩn Erwinia carotovora subsp.
carotovora trên cây địa lan (Cymbidium).
1.2.2. Yêu cầu
- Điều tra tình hình bệnh hại tại các vƣờn trồng địa lan tại TP. Đà Lạt – Lâm Đồng.
- Phân lập mẫu vi khuẩn.
- Nhân sinh khối các dòng vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora.
- Nắm vững quy trình ly trích DNA vi khuẩn.
14
- Khảo sát các yếu tố nhƣ chu kỳ nhiệt, nồng độ primer, nồng độ DNA, số chu kì thích
hợp để thiết lập quy trình PCR.
1.2.3. Giới hạn
- Đề tài đƣợc thực hiện từ 15/02/2006 đến 30/07/2006.
- Chỉ làm đƣợc trên một số mẫu.
- Do thời gian và kinh phí có hạn nên không tiến hành giải trình tự sản phẩm PCR.
15

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Điều kiện tự nhiên của TP. Đà Lạt với việc nuôi trồng Cymbidium
Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới châu Á với nhiều vùng tiểu khí hậu rất khác
nhau, là một trong những nơi tập trung nhiều loài lan của thế giới, đặc biệt là từ các vùng
cao nguyên Trung Bộ đến miền Đông Nam Bộ. Ở nƣớc ta vƣơng quốc thật sự của các loài
lan là những vùng cao nguyên có độ cao từ 800 m đến 1.000 m nhƣng đáng kể nhất vẫn là
ở Đà Lạt – Lâm Đồng.
Thành phố Đà Lạt đƣợc đặt trọn trên cao nguyên Lâm Viên với độ cao trên dƣới
1.500 m, về phía Đông Bắc tỉnh Lâm Đồng. Phía Bắc giáp huyện Lạc Dƣơng, phía Nam
giáp huyện Đức Trọng, phía Đông và Đông Nam giáp huyện Đơn Dƣơng, phía Tây và
Tây Nam giáp huyện Lâm Hà. Nhiệt độ trung bình năm là 18,3
0
C, biên độ nhiệt trong
ngày 11 – 12
0
C. Khí hậu Đà Lạt chia làm hai mùa rõ rệt, mùa mƣa kéo dài từ tháng 4 đến
tháng 10 hàng năm, mùa khô từ tháng 10 năm trƣớc đến tháng 4 năm sau. Lƣợng mƣa
bình quân hàng năm ở Đà Lạt đạt 1.800 mm.Cƣờng độ mƣa tập trung vào các tháng 8, 9
hàng năm. Mùa khô kiệt nƣớc là tháng 12, 1 và 2. Nhìn chung, Đà Lạt có khí hậu ôn hòa
dịu mát quanh năm, mùa mƣa nhiều, mùa khô ngắn, không có bão. Đây là những điều
kiện hết sức thuận lợi để phát triển nuôi trồng các loại hoa ôn đới trong đó địa lan
Cymbidium là một trong những loại hoa ôn đới đặc thù của Đà Lạt.
2.2. Giới thiệu về lan Cymbidium
2.2.1. Phân loại – Phân bố
Phân loại: theo Otto Swartz (1799), chi Cymbidium thuộc:
Giới (Kingdom) : Plantae
Lớp (Class) : Liliopsida
Bộ(Order) : Asparagales
Họ (Family) : Orchidacaea
Họ phụ (Subfamily) : Epidendroideae

Tông (Tribe) : Cymbidiinae
Tông phụ (Subtribe) : Cyrtopodiinae
Giống (Genus) : Cymbidium (
16
Phân bố: trên thế giới, các loài Cymbidium phân bố chủ yếu ở châu Á, từ dãy Hy
Mã Lạp Sơn (Hymalaya) đến Nam Trung Quốc (Vân Nam), các nƣớc Đông Dƣơng (Việt
Nam, Malaysia, Mianma, Thái Lan) và một vài loài phân bố ở các châu lục khác. Phần
lớn các loài trong chi này sống ở các vùng rừng núi khá cao, khô và lạnh, một vài loài
khác chịu đƣợc điều kiện nóng ẩm của rừng nhiệt đới (Trƣơng Trỗ, 1988).
2.2.2. Đặc điểm thực vật học
Về hình thái bên ngoài, lan Cymbidium là những loài thân thảo, đa niên, đẻ nhánh
hằng năm tạo thành những bụi nhỏ.
Rễ: có loài rễ mọc bám trên vỏ cây, mặt đất (bì sinh hay phụ sinh); có loài rễ ăn
sâu trong bọng cây, trong đất mùn (địa sinh hay thực sinh). Rễ mới thƣờng chỉ mọc ở cây
con, cây mẹ khó ra rễ mới mà chỉ thấy phân nhánh từ rễ củ.
Thân (căn hành): thân ngầm của chúng (căn hành) thƣờng ngắn, nối những củ lan
với nhau. Các củ lan thực chất là những cành ngắn của căn hành. Củ già, khi bị tách khỏi
căn hành cũ, có thể mọc ra căn hành mới, từ đó mọc ra những cây con. Do đó mà ngƣời ta
xếp Cymbidium vào nhóm lan đa thân.
Củ lan (giả hành): thƣờng có dạng con quay hay dạng hột xoài, đƣờng kính từ 1 –
15 cm. Củ thƣờng tƣơi và đƣợc bọc trong các bẹ lá.
Lá: thƣờng có hai dạng: dạng vảy đính theo một đoạn căn hành và dạng thực đính
trên giả hành. Lá thực thƣờng có cuống lá, giữa bẹ lá và cuống lá có một tầng phân cách.
Khi phiến lá rụng vẫn còn đoạn bẹ ôm lấy giả hành. Vài loài không có cuống lá. Tùy theo
từng loài mà phiến lá rất khác nhau, có gân dọc nổi rõ hay chìm trong thịt lá. Một số loài
ít chịu rợp có phiến lá màu xanh vàng còn lại thƣờng xanh đậm. Bản lá và độ dày của lá
thay đổi theo từng loài: các loài sống ở trảng trống có lá hẹp và dày hơn các loài ƣa bóng
rợp. Lá có dạng dải, dạng mũi mác, dạng phiến. Đầu lá nhọn hay chia thành hai thùy.
Kích thƣớc của bản lá biến động từ 0,5 – 6 cm. Chiều dài lá thay đổi từ 10 – 150 cm.
Chồi hoa: thƣờng xuất hiện bên dƣới giả hành, trong các nách lá, tách các bẹ già,

đâm ra bên ngoài. Thông thƣờng mỗi giả hành chỉ cho hoa một lần. Chồi hoa thƣờng xuất
hiện đồng thời với chồi thân, những chồi hoa no tròn hơn còn chồi thân hơi dẹp.
17
Cọng phát hoa: không phân nhánh, dựng đứng hay buông thõng. Chiều dài của
phát hoa từ 10 cm đến hơn 100 cm. Cành hoa mang từ vài đến vài chục búp hoa xếp luân
phiên theo đƣờng xoắn ốc.
Hoa: hoa Cymbidium lƣỡng tính, nhị đực và nhụy cái cùng gắn chung trên một trụ
nhị - nhụy (hay trục hợp nhụy), hình bán trụ hơi cong về phía trƣớc. Quả lan là một nang
có 3 góc, bên trong có chứa hàng trăm ngàn hạt. Khi chín quả mở theo 3 đƣờng góc và
gieo vào không khí những hạt nhƣ bụi phấn màu vàng lụa. Khi rơi vào nơi có điều kiện
ẩm độ, ánh sáng thích hợp và có nấm cộng sinh tham gia hạt sẽ nảy mầm phát triển thành
cây mới (Trƣơng Trỗ, 1988).
2.2.3. Yêu cầu sinh thái đối với Cymbidium
Ánh sáng: nhu cầu ánh sáng từ 50 – 70% ánh sáng trực tiếp với độ chiếu sáng trên
dƣới 20.000 lux (khoảng 1/5 độ chiếu sáng của mặt trời vùng Đà Lạt trong khoảng tháng
4 đến tháng 8, từ 11 – 14 giờ) (Trƣơng Trỗ, 1988).
Nhiệt độ: loài lan môi trƣờng lạnh thƣờng đòi hỏi một chế độ nhiệt rất đặc biệt:
khoảng 15
0
C về mùa đông và 20
0
C về mùa hè và chênh lệch ngày đêm khoảng 6 – 7
0
C.
Điều này rất cần cho việc ra hoa. Khi các giả hành đã phát triển cần có nhiệt độ về đêm từ
6 – 12
0
C liên tục từ 3 – 4 tuần (Trần Văn Bảo, 1999).
Ẩm độ: do là địa lan nên bộ rễ của Cymbidium khác xa bộ rễ của các loài lan ký
sinh (epiphyte). Chúng đòi hỏi rễ luôn luôn ẩm (Trần Văn Bảo, 1999). Theo Trƣơng Trỗ

(1988), từ 60 – 70% độ ẩm tƣơng đối của không khí và khoảng 70 – 80% độ ẩm của giá
thể là điều kiện tốt cho Cymbidium.
2.2.4. Sâu bệnh
Trong nuôi trồng hoa lan thƣờng gặp những dạng dịch hại phổ biến sau:
Bệnh do virus: bệnh do virus gây ra trên hoa lan thƣờng xuất hiện ở hai dạng sau:
virus gây khảm lá và virus làm khằn cây.
Virus gây khảm lá: gây hiện tƣợng biến vàng trên lá và hoa. Ở lá non có những sọc
hay đốm màu xanh nhạt hay màu vàng xen kẽ với những vệt xanh đậm trên phiến lá. Trên
những cây bị nhiễm nặng, cây không phát triển, bộ rễ còi cọc. Bệnh thƣờng xuất hiện
trong những vƣờn lan kém chăm sóc hoặc trên những cây lan bị tách chiết nhiều lần mà
18
không khử trùng dụng cụ. Rầy rệp chích hút cũng là một trong những tác nhân làm lây lan
dạng bệnh này.
Virus làm khằn cây: làm cho cây không phát triển bình thƣờng, lá trở nên dày hơn,
có màu xanh đậm, mặt lá gồ ghề, phiến lá cứng.
Bệnh do virus không có thuốc đặc trị. Khi thấy trong vƣờn có những cây lan có
biểu hiện trên, cần phải cách ly để chăm sóc riêng nếu cây bị nhiễm nhẹ. Trong trƣờng
hợp cây bị nhiễm nặng cần phải đốt bỏ để tránh lây lan sang các cây khỏe mạnh. Phải khử
trùng dụng cụ sau mỗi lần tách chiết một cây và quan tâm đến công tác phòng trừ rầy rệp,
làm vệ sinh mặt chậu và vƣờn lan thƣờng xuyên.
Bệnh do vi khuẩn
Bệnh thối nâu: vết bệnh màu nâu nhạt, hình tròn, mọng nƣớc, về sau chuyển sang
màu nâu đen. Bệnh gây hại trên lá, thân, mầm gây nên hiện tƣợng thối (có mùi khó chịu).
Nguyên nhân bệnh do vi khuẩn Erwinia carotovora gây ra.
Bệnh thối mềm: vết bệnh có dạng bất định, ủng nƣớc, màu trắng đục, thƣờng lan
rộng theo chiều rộng của phiến lá. Trong điều kiện ẩm độ cao sẽ gây hiện tƣợng thối úng.
Trong điều kiện khô ráo, mô bệnh khô, teo tóp và có màu trắng xám. Nguyên nhân bệnh
do vi khuẩn Pseudomonas Glagioli gây ra.
Bệnh do nấm
Bệnh đen thân cây con: vết bệnh xuất hiện ở gốc thân hoặc cổ rễ, có màu nâu, sau

đó lan dần làm khô đoạn thân gần gốc và cổ rễ, vết bệnh chuyển sang màu đen. Lá chuyển
sang màu vàng, cong dị hình. Cây con bị bệnh sau 2- 3 tuần, trong căn hành thƣờng có vệt
màu tím hay hồng nhạt. Nguyên nhân bệnh do nấm Fusarium oxysporum gây ra.
Bệnh đốm lá: vết bệnh thƣờng có hình thoi hoặc hình tròn nhỏ màu xám nâu, xuất
hiện ở mặt dƣới lá. Bệnh làm vàng lá, dễ rụng, cây sinh trƣởng kém. Nguyên nhân bệnh
do nấm Cercospora sp. gây ra.
Bệnh thán thƣ: vết bệnh thƣờng có hình tròn nhỏ, màu nâu vàng, xuất hiện từ mép
lá, chóp lá hoặc giữa phiến lá, kích thƣớc trung bình 3- 6 mm. Giữa vết bệnh hơi lõm có
màu trắng xám, xung quanh có gờ nhỏ màu nâu đỏ, trên mô bệnh có nhiều chấm nhỏ màu
đen. Nguyên nhân bệnh do nấm Colletotrichium gloeosrioides gây ra.
19
Ngoài ra, trên cây hoa lan còn có một số dạng bệnh khác nhƣ bệnh tàn cánh hoa,
bệnh thối trắng rễ, bệnh đốm vàng, bệnh thối đen ngọn, bệnh thối hạch, bệnh đốm vòng
trên cánh hoa, bệnh đốm nâu trên cánh hoa…
Côn trùng gây hại: chủ yếu có mấy loại bao gồm bọ trĩ (Thrips palmi và
Dichromothrips Corbetti), nhện đỏ, rệp, sâu hại, ốc sên, nhớt. Côn trùng gây hại thƣờng
phát sinh và phát triển trong suốt quá trình nuôi trồng. Vì vậy, ngƣời trồng lan phải luôn
luôn theo dõi, phát hiện kịp thời và có biện pháp phòng trừ thì mới thu đƣợc sản lƣợng và
chất lƣợng tốt (Nguyễn Văn Tới, 2003).
2.2.5. Tình hình sản xuất lan Cymbidium của TP. Đà Lạt và trên thế giới
Tại Đà Lạt: Từ năm 1978, Cymbidium Đà Lạt bắt đầu tham gia xuất khẩu sang thị
trƣờng Liên Xô, một ít qua Tiệp Khắc và Singapore, bƣớc đầu 3.000 cành (1978). Có
những năm cao điểm lên trên 32.000 cành (1989 – 1990) trên tổng sản lƣợng 65.000 cành.
Đến năm 1990, do tình hình biến động ở Đông Âu và Liên Xô, thị trƣờng hoa lan Đà Lạt
bị chững lại, chỉ tiêu thụ nội địa và một ít xuất sang thị trƣờng châu Á. Từ năm 1992 –
1998, ngành trồng hoa ở Đà Lạt giảm dần. Số lƣợng hoa lan chỉ còn đủ để tiêu thụ trong
nƣớc. Từ năm 1999 đến nay, ngành trồng lan Cymbidium của Đà Lạt mới dần dần hồi
phục nhƣng vẫn chƣa đủ để đáp ứng nhu cầu xuất khẩu. Cuối năm 2004, những bông hoa
cắt cành đầu tiên của Việt Nam đã bắt đầu xâm nhập thị trƣờng Mỹ thông qua một tập
đoàn nhập khẩu hoa National Wide Wholesale, mỗi tuần từ 1.300 – 1.500 cành chủ yếu

đến các siêu thị hoa cao cấp ở bang Massachusetts và Ohio. Tuy nhiên bên môi giới vẫn
chƣa ký hợp đồng chính thức với công ty trên vì chƣa đánh giá đƣợc nguồn địa lan mà Đà
Lạt có thể cung cấp ổn định so với yêu cầu rất lớn từ phía Mỹ.
Trên thế giới: Nhu cầu về hoa lan trên thị trƣờng thế giới rất lớn, ngày càng tăng.
Năm 1994, Mỹ nhập từ Thái Lan 16,4 triệu cành, từ Singapore 289.000 cành. Hà Lan là
quốc gia duy nhất ở Châu Âu có công nghiệp trồng lan xuất khẩu. Do trồng trong nhà
kính nên Hà Lan có thể xuất khẩu hoa quanh năm nhất là Cymbidium. Italia là quốc gia
nhập khẩu hoa lan lớn nhất Châu Âu. Năm 1993, Italia nhập 75,3 triệu cành chủ yếu là từ
các nƣớc: Thái Lan 64 triệu cành, Hà Lan 10 triệu cành, Singapore 0,75 triệu cành. Đức
và Pháp là 2 quốc gia nhập khẩu lan đứng thứ 2 và 3 Châu Âu. Ở Châu Á, Nhật là quốc
20
gia nhập khẩu hoa lan đứng đầu. Theo thống kê tại Thái Lan, Singapore, Malaysia dành
600 ha đất trồng lan để xuất khẩu sang Nhật chủ yếu là Dendrobium, Cymbidium. Thái
Lan là nƣớc xuất khẩu hoa lan đứng đầu thế giới, xuất khẩu hơn 50 quốc gia trên thế giới
với giá từ 3 – 5 USD/cành, có khi tới 80 – 100 USD/ cành, những giống quý có thể lên tới
hàng ngàn USD (Trích Lê Hữu Quang, 2005).
2.3. Giới thiệu về vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora và tác hại của nó
2.3.1. Phân loại: Theo Winslow và ctv (1920), loài Erwinia thuộc:
Giới (Kingdom) : Bacteria
Ngành (Phylum) : Proteobacteria
Lớp (Class) : - Proteobacteria
Bộ (Order) : Enterobacteriales
Họ (Family) : Enterobacteriaceae
Giống (Genus) : Erwinia (Nguồn: ).

(Nguồn: )
Loài Erwinia là một thành viên của họ vi khuẩn Enterobacteriaceae, đƣợc chia thành 2
nhóm: nhóm gây thối mềm (soft rot) hay “carotovora” và nhóm gây bệnh héo hoặc tàn rụi
cây trồng “non – soft rot” hay “amylovora”.
2.3.2. Erwinia carotovora
Erwinia carotovora là tác nhân gây ra bệnh thối mềm (soft rot), một bệnh rất nguy
hiểm và tàn phá cây trồng. Nhiều loại thực phẩm có giá trị kinh tế nhƣ khoai tây, cà chua,
cải thìa (Chinese cabbages) có thể bị ảnh hƣởng bởi bệnh này. Loài Erwinia carotovora là
Hình 2.1. Hình thái vi khuẩn Erwinia carotovora.
a. Vi khuẩn có dạng hình gậy. b. Lông roi bao quanh thân.

a
b
21
một đơn vị phân loại phức tạp mà những dòng này thì đa dạng ở những mức độ khác nhau
(sinh lý, huyết thanh học, đặc tính di truyền và dãy kí chủ). Erwinia carotovora đƣợc chia
thành 5 nhóm phụ (subspecies) gồm: E. c. atroseptica (Eca), E. c. carotovora (Ecc), E. c.
betavasculorum (Ecb), E. c. wasabiae (Ecw), E. c. odorifera (Eco) (Seo và ctv, 2001).
2.3.3. Erwinia carotovora subsp. carotovora
Phân bố địa lý: Erwinia carotovora subsp. carotovora là một loại vi khuẩn phân
bố rộng khắp mà nó là nguyên nhân gây ra bệnh thối mềm trên các loại cây cảnh
(ornamental) và cây nông nghiệp (horticultural) khác nhau. Erwinia carotovora subsp.
carotovora phân bố rộng khắp cả vùng nhiệt đới và ôn đới, có phổ kí chủ rộng hơn
những nhóm phụ khác (Fiori và Schiaffino, 2003).
Đặc điểm: hình thái tế bào vi khuẩn đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi điện tử: vi
khuẩn có dạng hình gậy, đơn lẻ hoặc thành từng cặp, có khả năng di động do có lông roi
bao quanh và có kích thƣớc trung bình từ 0,6 – 0,7 2 – 2,5 μm. Bằng phƣơng pháp thử
các phản ứng sinh hóa đã xác định đƣợc Erwinia carotovora subsp. carotovora: vi khuẩn

Gram âm, kị khí tùy nghi (facultative anaerobe), catalase (+), oxidase (-), Indole (-), hóa
lỏng pectate (liquefied pectate) trên môi trƣờng CVP, khử nitrate thành nitrite, không phát
sáng trên môi trƣờng KB, phân giải esculine và gelatine nhƣng không phân giải tinh bột,
tạo acetoin và H
2
S nhƣng không tạo urease, tạo phản ứng quỳ sữa (acidized litmus milk),
không có khả năng thủy giải arginine hoặc khử sucrose, kháng erythromycin, lên men
glucose, chịu đựng đƣợc 5% NaCl và có thể phát triển đƣợc ở 37
0
C, tạo acid từ arabinose,
cellobiose, galactose, lactose, mannose, melibiose, ramnose, salicin, threalose, xylose,
inositol, manitol và sorbitol. Đối với maltose, - methyl glucoside và adonitol vi khuẩn
không tạo acid, có khả năng sử dụng asparagine, acetate, citrate, fumarate, lactate và
malate. Đối với alanine, arginine, threonine, valine, glycolate, gluconate, levulinate,
nicotinate, adipate, caprate, citraconate, formate, glutarate, malonate và tartrate thì không
(Fiori và Schiaffino, 2003).
Đƣờng lây nhiễm: Erwinia xâm nhập vào cây thông qua con đƣờng tự nhiên nhƣ
khí khổng (stomata) và lỗ vỏ, thân, rễ (lenticles) hoặc thông qua vết thƣơng gây ra bởi
côn trùng, động vật ăn cỏ (herbivorus), gió…(Marcos Montesano, 2002).
22
Khả năng gây bệnh: Erwinia carotovora subsp. carotovora là tác nhân gây bệnh
cơ hội mà tính độc của nó phụ thuộc vào sự tƣơng tác giữa nó với ký chủ và môi trƣờng.
Trong những điều kiện thuận lợi, tác nhân gây bệnh cây biểu hiện những nhân tố độc nhƣ
các enzyme ngoại bào (extracellular enzymes). Sự sản xuất các enzyme phân hủy thành tế
bào bao gồm: protease, pectinolytic enzymes là enzyme ngoại bào chính liên quan đến sự
phát triển của bệnh. Pectinases bao gồm pectate lyase (Pel), pectin lyases (Pnl),
polygalacturonases (Peh) và pectin methylesterases (Pme), phá vỡ và sử dụng pectins, gây
hƣ hại tế bào và làm mô suy yếu. Theo Darrasse và ctv (1994), một vài pel gen mã hóa
pectate lyase đã biết trình tự. Có 3 họ đã đƣợc xác định và giữa chúng có tính tƣơng đồng
cao: họ BC (BC family) chứa gen pel chung cho cả Erwinia carotovora và Erwinia

chrysanthemi, họ ADE (ADE family) bao gồm những gen chỉ hiện diện trong Erwinia
chrysanthemi, nhóm thứ ba tƣơng ứng với gen đƣợc tìm thấy trên một vài dòng Erwinia
carotovora và trên vi khuẩn Yersinia pseudotuberculosis (Y family). Cellulases hoạt động
trên thành tế bào cây bằng sự thủy phân trong (endohydrolysis) của liên kết 1,4-β-D-
glucosidic trong cellulose, lichenin, β-D-glucan trong ngũ cốc. pH tối ƣu gần bằng 7,
cellulases phối hợp với các enzyme ngoại bào khác tấn công thành tế bào sơ cấp và thứ
cấp của cây trồng. Tuy nhiên, ngoài các enzyme phân hủy thành tế bào, các nhân tố khác
cũng ảnh hƣởng ở giai đoạn sớm, thành lập và xúc tiến sự lây nhiễm, đáp ứng tốt với cơ
chế kháng của ký chủ. Các nhân tố này bao gồm tính di động (motility), LPS
(lipopolysaccharides), kị sắt (siderophores), gen hrp (hypersensitive reaction and
pathogenicity), NLPs (Nep-1 like protein) (Nep: necrosis and ethylene inducing peptide)
và những nhân tố chống lại sự phá hủy của oxy (oxygen damage) hoặc những peptide
kháng khuẩn (antimicrobial peptides) (Heidi Hyytiainen, 2005).
Triệu chứng: triệu chứng phổ biến rất đặc trƣng cho các loài vi khuẩn Erwinia
carotovora là hiện tƣợng thối nhũn củ khoai tây, cà rốt, bắp cải, hành tây,…Hiện tƣợng
thối hỏng là hậu quả của quá trình phá vỡ cấu trúc mô tế bào của cây do tác động chủ yếu
của các enzyme phân giải của vi khuẩn. Toàn bộ thịt củ, quả bị thối biến thành một khối
nhão, có mùi (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999).
23
Mức độ gây hại của vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora: bệnh thối
mềm là một bệnh rất nguy hiểm bởi vì vi khuẩn này có khả năng kí sinh, chọn lọc phạm
vi kí chủ rất rộng bao gồm nhiều loại cây trong nhiều họ thực vật khác nhau. Hiện nay
chƣa có cách phòng trị hiệu quả, thiệt hại do vi khuẩn này gây ra là rất lớn.
Năm 1995, tại Argentina, trái và cây cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.
hybrid Tommy) từ các nhà kính thƣơng mại (commercial greenhouses) gần La Plata và
gần Chacabuco xuất hiện những triệu chứng bệnh gây ra bởi Erwinia carotovora subsp.
carotovora. Tỉ lệ bệnh 2% là phổ biến và gần 10% cây ở vùng ẩm ƣớt trong nhà kính thì
bị nhiễm bệnh.
Năm 1994, tại Thổ Nhĩ Kỳ, bệnh thối thân cây cà chua gây ra bởi Erwinia
carotovora subsp. carotovora và Erwinia chrysanthemi đƣợc phát hiện lần đầu tiên trong

nhà kính ở vùng phía đông Địa Trung Hải (eastern Mediterrean region). Từ năm 1999,
bệnh bùng phát nghiêm trọng trong nhiều nhà kính trồng cà chua ở vùng Địa Trung Hải
và Aegean của Thổ Nhĩ Kỳ. Năm 2003, phạm vi tác động của bệnh hơn 25% ở vùng Địa
Trung Hải và Aegean của Thổ Nhĩ Kỳ (Aysan và ctv).
Vụ đông và đông xuân năm 2002, xuất hiện bệnh trong một vài nhà kính thƣơng mại
(several commercial plastic- covered greenhouses) ở Mersin và Antakya, vùng phía đông
Địa Trung Hải của Thổ Nhĩ Kỳ. Phạm vi tác động của bệnh này khoảng 20 – 25% và 80
– 90% nhà kính ở Mersin và Antakya. Sau khi quan sát các triệu chứng, phân lập, mô tả
về mặt hình thái học, sinh lý, sinh hóa, kiểm tra tính gây bệnh và phân tích FAME (fatty
acid methyl ester) ngƣời ta đã xác định đƣợc nguyên nhân gây bệnh do vi khuẩn
Pseudomonas viridiflava, Erwinia carotovora subsp. carotovora và Erwinia chrysanthemi
(Aysan và ctv).
Tại Canada, thiệt hại do vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora gây ra là
12% và 20% vào năm 1996 và 1997 tại các nhà kính trồng tiêu (Capsicum annuum) tại St.
David
'
s, Ontario. Bệnh cũng đƣợc quan sát trên cánh đồng trồng tiêu gần Harrow năm
1996 – 1997. Đây là báo cáo đầu tiên về vi khuẩn gây thối thân (bacterial stem canker) tại
các nhà kính trồng tiêu ở Canada (Cerkauskas và Brown, 2001).
24
Ở New Zealand, một loại vi khuẩn đƣợc phân lập từ những củ cala (Zantedeschia
spp. ) bị nhiễm bệnh đƣợc xác định là Erwinia carotovora subsp. carotovora. Báo cáo
này cho thấy Erwinia carotovora subsp. carotovora là nguyên nhân gây ra bệnh thối
mềm trên cây hoa kiểng quan trọng ở New Zealand (Wright, 1998).
Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về vi khuẩn Erwinia carotovora subsp.
carotovora
Trên thế giới: trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn Erwinia
carotovora subsp. carotovora bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau.Với sự phát triển vƣợt
bậc của công nghệ sinh học, các kỹ thuật phân tử ra đời nhƣ PCR (Polymerase Chain
Reaction), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), AFLP (Amplified

Fragment Length Polymorphism), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA),… đã
tạo nên một sự chuyển biến mới trong công tác bảo vệ thực vật.
Một nhóm các nhà nghiên cứu Thái Lan sử dụng phƣơng pháp PCR để phát hiện
và phân loại vi khuẩn gây bệnh thối mềm Erwinia trên thực vật ở Thái Lan. Bằng cách sử
dụng cặp primer Y1 và Y2 để khuếch đại đoạn 434 bp trong khung đọc mở (open reading
frame) của pectate lyase (Pel) gen của Erwinia carotovora, cặp primer ADE1và ADE2 để
khuếch đại đoạn 420 bp trong khung đọc mở của pectate lyase gen của Erwinia
chrysanthemi. Kết quả chỉ có cặp primer Y1 và Y2 khuếch đại đƣợc đoạn gen mong
muốn của tất cả các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc (Phokum và ctv).
Darrasse và ctv, (1994) sử dụng phƣơng pháp PCR – RFLP trên gen pel (mã hóa
pectate lyases) để xác định mối quan hệ giữa Erwinia carotovora với bệnh trên cây khoai
tây. Bằng cách sử dụng cặp primer Y1 và Y2 cho phép khuếch đại một đoạn 434 bp của
những dòng Erwinia carotovora. Trong 89 dòng Erwinia carotovora đƣợc kiểm tra, chỉ
những dòng Erwinia carotovora subsp. betavasculorum là không phát hiện thấy. RFLP
đƣợc thực hiện trên đoạn đƣợc khuếch đại với 7 enzyme endonuclease: TaqI, HaeIII,
HhaI, AluI, HaeII, Sau3AI, HpaII thì thấy có sự đa hình giữa các dòng.
Seo và ctv, (2001) đã sử dụng phƣơng pháp PCR – RFLP nghiên cứu về kiểu hình
và đa dạng di truyền trên 87 dòng vi khuẩn Erwinia carotovora ssp. carotovora (Ecc)
phân lập từ các cây kí chủ khác nhau ở Nhật Bản, Hàn Quốc và Thái Lan. Thí nghiệm tiến
25
hành phân tích PCR – RFLP của gen 16S ribosomol DNA (rDNA) với cặp primer fD1 và
rP2, 16S – 23S rDNA intergenic spacer regions (ISRs) với cặp primer R16 - 1, R23 – 2R,
gen pel mã hóa pectate lyase với cặp primer Y1và Y2. Bằng phân tích RFLP trên sản
phẩm khuếch đại với các enzyme cắt giới hạn HinfI, MboI, Sau3AI, kết quả cho thấy sự
đa hình giữa các dòng nghiên cứu. Năm 2003, nhóm các nhà nghiên cứu này cũng đã sử
dụng phƣơng pháp PCR – RFLP và RAPD để nghiên cứu về mặt kiểu hình và đặc tính di
truyền của vi khuẩn Erwinia carotovora trên cây dâu tằm (mulberry) (Morus spp.). Thí
nghiệm đƣợc tiến hành trên 9 dòng vi khuẩn đƣợc phân lập từ cây dâu tằm. Bằng phƣơng
pháp thử các phản ứng sinh hóa, những dòng vi khuẩn này đƣợc chia thành 2 loại: type 1
và type 2. Hai dòng thuộc type 1 giống với Ecc trong khi 7 dòng thuộc type 2 thì khác biệt

với Ecc. Bằng nghiên cứu qua nhiều giai đoạn bao gồm thử nghiệm huyết thanh học
(serological assay), PCR chuyên biệt cho Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca),
PCR – RFLP với pectate lyase (Pel) gen và PCR – RAPD cho thấy những dòng vi khuẩn
thuộc type 2 thuộc về những nhóm phụ Erwinia carotovora khác hơn là Ecc và Eca.
Fiori và Schiaffino, (2003) cũng sử dụng phƣơng pháp PCR – RFLP để nghiên cứu
vi khuẩn gây bệnh thối mềm thân cây hồ tiêu (Capsicum annuum L.): Erwinia carotovora
subsp. carotovora tại các nhà kính ở Sardinia, Italia. Phản ứng PCR với cặp mồi Y
1
và Y
2

cho phép khuếch đại một trình tự có kích thƣớc 434bp. Phân tích RFLP trên sản phẩm
PCR đƣợc tiến hành với 4 enzyme endonuclase giới hạn AluI, HaeII, HpaII, Sau3AI thì
thấy có sự đa hình giữa các dòng.
Tại Việt Nam: hiện tại, theo chúng tôi tìm hiểu thì chƣa thấy có tài liệu nào nói về
việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong việc chẩn đoán, phát hiện vi khuẩn
Erwinia carotovora subsp. carotovora gây bệnh trên địa lan (Cymbidium).
2.3.4. Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh do vi khuẩn gây ra
Hàng loạt các kỹ thuật truyền thống và hiện đại đƣợc sử dụng để phát hiện sự tồn
tại của vi khuẩn gây bệnh trong hạt giống, tàn dƣ cây trồng, trong đất, nƣớc và các vector
truyền khác. Phần lớn vi khuẩn gây bệnh cây trồng đƣợc truyền thông qua hạt giống hoặc
các vật liệu nhân giống bị nhiễm bệnh. Do đó, phát hiện tác nhân gây ra bệnh trên cây