PHÂN LẬP, THỬ KHÁNG SINH ĐỒ VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘC LỰC VI KHUẨN Escherichia coli GÂY BỆNH TRÊN GÀ TẠI MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP, THỬ KHÁNG SINH ĐỒ VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘC LỰC
VI KHUẨN Escherichia coli GÂY BỆNH TRÊN GÀ
TẠI MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN THỊ MỸ LINH

Niên khóa

: 2007 - 2011

Tháng 07/2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP, THỬ KHÁNG SINH ĐỒ VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘC LỰC
VI KHUẨN Escherichia coli GÂY BỆNH TRÊN GÀ

TẠI MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

SINH VIÊN THỰC HIỆN

TS. NGUYỄN TẤT TOÀN

NGUYỄN THỊ MỸ LINH

Tháng 07/2011


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn
TS. Nguyễn Tất Toàn và TS. Nguyễn Thị Phước Ninh đã tận tình hướng dẫn
cho tôi từ những ngày đầu cho đến khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Bệnh Viện Thú Y, trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh tạo mọi điều
kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập tại đây để tôi có thể hoàn thành
khóa luận. Các anh chị trong phòng xét nghiệm vi sinh đã hỗ trợ, hướng dẫn, chỉ bảo
rất tận tình trong suốt thời gian tôi thực tập làm khóa luận.
Các Thầy Cô ở Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Nông Lâm đã
hết lòng truyền đạt những kiến thức quí báu trong thời gian tôi theo học tại trường.
Gia đình và những người bạn đã ủng hộ, chia sẻ và giúp đỡ tôi rất nhiều trong
suốt thời gian qua.
TP. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2011
Nguyễn Thị Mỹ Linh

i

TÓM TẮT
Đề tài nghiên cứu “Phân lập, thử kháng sinh đồ và xác định độc lực vi khuẩn
Escherichia coli gây bệnh trên gà tại một số địa phương” được tiến hành tại Bệnh Viện
Thú Y, trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh trong thời gian từ 15/01/2011 –
30/06/2011.
Trong số 45 mẫu gà mổ khám chỉ có 24 mẫu có triệu chứng bệnh tích điển hình
tiến hành phân lập xác định có dương tính với E. coli hay không. Kết quả có 20 mẫu
dương tính với E. coli đạt tỷ lệ phân lập là 83,3%, trong đó có 10 mẫu từ Đồng Nai, 7
mẫu ở Quận 9, TP. HCM, 2 mẫu ở Tiền Giang và một mẫu ở Bình Phước.
Sau đó tiến hành thử kháng sinh đồ của 20 gốc E. coli cho kết quả là đa số các
mẫu đề kháng cao với kháng sinh như ampicillin (tỷ lệ 57,14% - 100%),
amoxicillin

(tỷ lệ 50% - 100%), trimethoprim/sulfamethoxazone (tỷ lệ 40% -

100%) và tetracycline (tỷ lệ 80% - 100 %). Trong số 13 loại kháng sinh trên thì E.
coli còn khá nhạy với một số kháng sinh như norfloxacine (50% - 100%),
tobramycin (90% - 100%). Vi khuẩn kháng trung bình với colistin, cephalexin,
cefuroxine, doxycyline, gentamicin, kanamycin, neomycine (tỷ lệ 10% – 42,86%).
Xác định độc lực của 20 gốc dương tính qua tiêm truyền trên phôi trứng 12 ngày
tuổi và gà con 1 ngày tuổi. Kết quả cho thấy ở Bình Phước và Tiền Giang có tỷ lệ chết
phôi trung bình tương ứng 54,55% và 45,45% là mức rất độc. Đồng Nai và Quận 9,
TP. HCM có tỷ lệ chết phôi trung bình từ 23% - 33,64% ở mức độc trung bình.
Tỷ lệ gà con chết sau khi tiêm vi khuẩn dao động trong khoảng 20% – 100%.
Triệu chứng chung của gà con sau 2 ngày tiêm huyễn dịch vi khuẩn là thở yếu, ngực
phập phồng nhẹ, xù lông, phản ứng nhanh với âm thanh. Tỷ lệ số gà chết cao nhất
thuộc các lô tiêm vi khuẩn phân lập được ở Đồng Nai. Sau khi mổ khám gà con ta thấy
có bệnh tích điển hình của bệnh do E. coli như gan viêm, viêm màng bao tim, phổi có
khối viêm, túi khí dày, lách xung huyết….

Xác định 2 gene độc lực iucD và fimC trong 15 gốc E. coli có độc lực thì cho kết
quả dương tính là 86,7% và 93,3%. Hầu hết các gốc E. coli đã phân lập đều chứa cả 2
gene độc lực.

ii


SUMMARY
The thesis title “Isolation, resistance status study, and determination virulence of
avian pathogenic Escherichia coli in some provinces of Vietnam” was conducted in
the Hospital Veterinary, Nong Lam University from January to June, 2011.
There was 24 post mortem chickens express typical symptoms and lesions among 45
ones, they were isolated to detective Escherichia coli. The result showed that 20 positive
samples with percentage 83,3%, there was 10 E. coli strains in Dong Nai province, 7 E. coli
strains in district 9, Ho Chi Minh city, 2 E. coli strains in Tien Giang province and 1 E. coli
strains in Binh Phuoc province.
After that, we performed antibiotic sensitivity test for 20 E. coli strains with 13
antibiotic agents. Result showed that a high level of resistance of all the isolates to four
antimicrobial agents such as ampicillin (57,14 – 100%), amoxicillin (50 – 100%),
trimethoprim/sulfamethoxazone (40 – 100%) and tetracycline (80 – 100%), intermediate
resistance of them to 7 such as colistin, cephalexin, cefuroxine, doxycyline, gentamicin,
kanamycin, neomycine (10 – 42,86%) and sensitive of them to 2 antimicrobial agents
norfloxacine (50 - 100%), tobramycin (90 - 100%).
Virulence determination of the 20 E. coli strains will be done by injection in twelve
day old embryonated fowls’ eggs and one day old chick. The result showed that rate of
death inoculated embryos was high in Binh Phuoc (54,55%) and Tien Giang (45,45%),
correlative isolates was virulent, medium in Dong Nai and district 9, Ho Chi Minh city (23
- 33,64%) correlative isolates was moderately.
The death of chick fluctuated 20 – 100%. The most common from of chicks
symptom after 2 day observed is light breathing with slight movement of the chest, ruffled

feathers and alert. The high percentage of the chick died in after they were injected with
isolates in Dong Nai. The most important lesion was pericarditis, the air sac membranes
become thicker and cloudy in appearance. Liver may show a thin covering of fibrinous
exudates. Spleen was congestion. Lung had lesions.
Using PCR to detect the presence of 2 virulent gene iucD and fimC. The result
showed that rate of iucD and fimC were 93,3%, 86,7% repectively. Most of the isolates
E. coli harboring combination iucD and fimC gene.

iii


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN.................................................................................................................. i
TÓM TẮT....................................................................................................................... ii
SUMMARY................................................................................................................... iii
M ỤC LỤC .................................................................................................................... iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG .......................................................................................... ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH ..............................................................................................x
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................1
1.2. Yêu cầu của đề tài.....................................................................................................2
1.3. Nội dung thực hiện ...................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................................3
2.1. Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) ..........................................................................3
2.1.1. Định nghĩa ............................................................................................................3
2.1.2. Tính chất nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa ..............................................................3
2.1.3. Cấu tạo kháng nguyên ...........................................................................................4
2.1.4. Phân loại E. coli .....................................................................................................4

2.1.5. Shiga toxigenic E. coli (STEC) .............................................................................5
2.1.5.1. Thuật ngữ ............................................................................................................5
2.1.5.2. Shiga toxin và những yếu tố độc lực liên quan ..................................................5
2.1.6. Enteropathogenic E. coli (EPEC) ..........................................................................6
2.1.7. Enterotoxingenic E. coli (ETEC) ..........................................................................6
2.1.7.1. Các yếu tố độc lực ..............................................................................................6
2.1.8. Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) ..........................................................8
2.2. Bệnh do E. coli gây trên gà ....................................................................................10
2.2.1. Động vật cảm thụ.................................................................................................10
2.2.2. Những phương thức truyền lây............................................................................10
2.2.3. Triệu chứng và bệnh tích .....................................................................................10
2.2.3.1. Thể viêm túi khí................................................................................................10

iv


2.2.3.2. Thể bại huyết ....................................................................................................10
2.2.3.3. Thể viêm ruột ...................................................................................................10
2.2.3.4. Thể viêm vòi trứng ...........................................................................................11
2.2.3.5. Thể chết phôi ....................................................................................................11
2.2.3.6. Các thể khác .....................................................................................................11
2.2.4. Chẩn đoán ............................................................................................................11
2.2.5. Phòng và trị bệnh .................................................................................................11
2.2.5.1. Phòng bệnh .......................................................................................................11
2.2.5.2. Trị bệnh.............................................................................................................11
2.3. Kỹ thuật PCR .........................................................................................................12
2.3.1. Khái niệm và nguyên tắc ....................................................................................12
2.3.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR ........................................................................12
2.3.3. Các thành phần của một phản ứng PCR ..............................................................13
2.3.4. Phân tích kết quả PCR .........................................................................................14

2.4. Một số nghiên cứu liên quan ..................................................................................14
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................16
3.1. Thời gian và địa điểm .............................................................................................16
3.1.1. Thời gian..............................................................................................................16
3.1.2. Địa điểm ..............................................................................................................16
3.2. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................................16
3.3. Nội dung nghiên cứu ..............................................................................................16
3.4. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................16
3.4.1. Phân lập các gốc E. coli trên gà bệnh ..................................................................17
3.4.1.1. Mục đích ...........................................................................................................17
3.4.1.2. Vật liệu .............................................................................................................17
3.4.1.3. Phương pháp tiến hành .....................................................................................18
3.4.2. Khảo sát kháng sinh đồ........................................................................................19
3.4.2.1. Mục đích ...........................................................................................................19
3.4.2.2. Vật liệu .............................................................................................................19
3.4.2.3. Thực hiện ..........................................................................................................20
3.4.2.4. Chỉ tiêu theo dõi ...............................................................................................20
3.4.3. Xác định độc lực qua tiêm truyền trên phôi trứng và gà con ..............................20
v


3.4.3.1. Mục đích ...........................................................................................................20
3.4.3.2. Vật liệu .............................................................................................................20
3.4.3.3. Tiêm trên phôi trứng 12 ngày tuổi ....................................................................21
3.4.3.4. Tiêm truyền trên gà 1 ngày tuổi .......................................................................23
3.4.4. Khảo sát các gen độc lực từ các gốc E. coli phân lập bằng phương pháp PCR ........25
3.4.4.1. Mục đích ...........................................................................................................25
3.4.4.2. Vật liệu .............................................................................................................25
3.4.4.3. Phương pháp tiến hành .....................................................................................25
3.4.4.4. Chỉ tiêu theo dõi ...............................................................................................26

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................27
4.1. Phân lập các gốc E. coli trên gà bệnh .....................................................................27
4.2. Khảo sát kháng sinh đồ..........................................................................................28
4.3. Xác định độc lực qua tiêm truyền trên phôi trứng và gà con .................................31
4.3.1. Kết quả tiêm trên phôi trứng ...............................................................................31
4.3.1.1. Ghi nhận số phôi chết trong thời gian theo dõi ( 24 - 48 giờ) ..........................31
4.3.1.2. Quan sát bệnh tích đại thể trên những phôi trứng đã chết ................................32
4.3.1.3. Phân lập lại vi khuẩn E. coli từ những trứng đã chết phôi ...............................34
4.3.2. Xác định độc lực qua tiêm truyền trên gà............................................................34
4.3.2.1. Số gà con chết sau khi tiêm truyền huyễn dịch vi khuẩn .................................34
4.3.2.2. Triệu chứng lâm sàng của gà con trong thời gian theo dõi ..............................35
4.3.2.3. Bệnh tích quan sát được ...................................................................................35
4.3.2.4. Tái phân lập E. coli trên EMB ..........................................................................37
4.4. Khảo sát các gene độc lực từ các gốc E. coli phân lập bằng PCR .........................38
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................39
5.1. Kết luận...................................................................................................................39
5.2. Đề nghị ...................................................................................................................39
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................41
PHỤ LỤC

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A/E

: Attaching and effacing

APEC

: Avian pathogenic Escherichia coli

BA

: Blood agar

CF

: Colonization factor

CFU

: Colony forming units

DNA

: Deoxyribonucleic acid

dNTP

: Deoxyribonucleotide triphosphat

EaggEC = EAEC : Enteroaggregative E. coli
EHEC

: Enterohaemorrhagic E. coli

EIEC

: Enteroinvasive E. coli

EMB

: Eosin methylen blue agar

EPEC

: Enterophathogenic E. coli

ETEC

: Enterotoxigenic E. coli

Hly

: Haemolysin

HUS

: Haemolytic uraemic syndrome

IMViC

: Indol, Methyl Red, Voges - Proskauer, Simmon Citrate

KIA

: Kligle iron agar

LEE

: Locus of enterocyte effacement

LT

: Heat labile toxin

MCK

: MacConkey agar

NA

: Nutrient agar

PCR

: Polymerase chain reaction

ST

: Heat stable toxin

STEC

: Shiga toxin-producing E. coli

Stx

: Shiga toxin

Tir

: Translocated intimin receptor

Tm

: Melting temperature

TSH

: Temperature sensitive haemagglutinin

UV

: Ultra violet

vii


VT

: Verotoxin

VTEC

: Verotoxigenic E. coli

viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Các yếu tố độc lực của E. coli gây bệnh trên gia cầm .......................................... 9
Bảng 3.1 Số lượng mẫu gà đã mổ khám ............................................................................. 18
Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm tiêm vi khuẩn trên phôi trứng 12 ngày ................................... 21
Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm tiêm vi khuẩn lên gà con ......................................................... 23
Bảng 3.4 Điểm triệu chứng lâm sàng ................................................................................ 24
Bảng 3.5 Cho điểm bệnh tích đặc trưng do E. coli của các cơ quan .................................. 24
Bảng 3.6 Trình tự primer .................................................................................................... 26
Bảng 4.1 Kết quả phân lập................................................................................................... 27
Bảng 4.2 Kết quả kháng sinh đồ các gốc E. coli phân lập được từ tỉnh Đồng Nai .......... 28
Bảng 4.3 Kết quả kháng sinh đồ các gốc E. coli phân lập được từ Quận 9, TP. HCM..... 29
Bảng 4.4 Kết quả kháng sinh đồ gốc E. coli phân lập được ở tỉnh Tiền Giang ................ 29
Bảng 4.5 Kết quả kháng sinh đồ gốc E. coli phân lập được ở tỉnh Bình Phước................ 30
Bảng 4.6 Kết quả sau khi tiêm vào phôi trứng................................................................... 32
Bảng 4.7 Kết quả gây bệnh và tỷ lệ chết trên gà thực nghiệm sau 7 ngày theo dõi .......... 34
Bảng 4.8 Điểm triệu chứng trung bình trên gà con sau khi tiêm truyền vi khuẩn ............. 35
Bảng 4.9 Điểm trung bình bệnh tích trên một số cơ quan .................................................. 37
Bảng 4.10 Tỷ lệ các gốc có mang gene iucD và fimC ........................................................ 38

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 3.1 Sơ đồ các bước thí nghiệm. ..........................................................................17
Hình 3.2 Sơ đồ quy trình phân lập E. coli ....................................................................18
Hình 3.3 Quy trình thử nghiệm độc lực vi khuẩn trên phôi trứng ................................22
Hình 4.1 Kết quả kháng sinh đồ. ..................................................................................28
Hình 4.2 Đặc điểm phôi trứng sau khi tiêm .................................................................33
Hình 4.3 Nội quan. ........................................................................................................33

Hình 4.4 Phổi xuất huyết. .............................................................................................33
Hình 4.5 Màng bao tim dày đục, chứa dịch bên trong. ................................................36
Hình 4.6 Phổi có khối viêm. .........................................................................................36
Hình 4.7 Gan nhạt màu có lớp tơ huyết phủ, tim tích dịch...........................................36
Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại của fimC và iucD. .............................38

x


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Bệnh E. coli trên gia cầm là do một nhóm vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn E. coli
gây bệnh ngoài đường ruột, chúng có khả năng gây bệnh trên tất cả các cơ quan như
viêm túi khí, viêm màng bao quanh gan, tim, viêm phổi, viêm ống dẫn trứng, u não,
gây nhiễm trùng máu…. Các tổn thương nghiêm trọng trong các cơ quan thường dẫn
đến cái chết cấp tính, bệnh lây lan nhanh trong đàn gây thiệt hại lớn về kinh tế (Barnes và
Gross, 1999). Triệu chứng và bệnh tích bên ngoài cũng dễ bị nhầm lẫn với một số bệnh
trên gia cầm khác. Vì thế cần phải xác định chính xác bệnh do nhiễm E. coli gây ra để
phòng và điều trị kịp thời. Việc kiểm tra tính nhạy cảm của E. coli với một số kháng
sinh là rất cần thiết từ đó nâng cao hiệu quả trong công tác phòng và điều trị bệnh do
E. coli gây ra.
Khả năng gây bệnh của E. coli còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố bên trong và bên
ngoài tác động như: điều kiện môi trường (chuồng nuôi không đủ tiêu chuẩn, thức ăn
và nước uống bị ô nhiễm, tình trạng nuôi nhốt quá đông) và gia cầm bị trong giai đoạn
nhạy cảm (suy giảm miễn dịch, stress, chấn thương … ) (Dho - Moulin và Fairbother,
1999). Trong chính vi khuẩn E. coli cũng chứa các yếu tố độc lực và những yếu tố
không độc. Một số yếu tố liên quan đến yếu tố độc lực của E. coli nhưng không có
gene độc lực cụ thể nào chịu trách nhiệm hoàn toàn trong việc gây bệnh trên gia cầm
(Antão và ctv, 2008). Việc sử dụng phôi gà và gà con làm mô hình thử nghiệm để gây
nhiễm với E. coli phân lập từ thực địa kết hợp với kĩ thuật sinh học phân tử như PCR

để xác định gene độc lực giúp chúng ta hiểu rõ hơn cơ chế gây bệnh, các yếu tố độc
lực liên quan đến E. coli trên gia cầm.
Do đó, được sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường đại học Nông
Lâm TP. Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Tất Toàn tôi đã thực hiện
đề tài: “Phân lập, thử kháng sinh đồ và xác định độc lực vi khuẩn Escherichia coli gây
bệnh trên gà tại một số địa phương”.

1


1.2. Yêu cầu của đề tài
Phân lập E. coli trên gà bệnh và thử kháng sinh đồ, xác định một số gene độc lực
của mẫu E. coli đã phân lập được tại một số địa phương.
1.3. Nội dung thực hiện
Phân lập các gốc E. coli trên gà bệnh
Khảo sát kháng sinh đồ
Xác định độc lực qua tiêm truyền trên phôi trứng và gà con
Tiến hành PCR kiểm tra một số gene gây độc từ các gốc E. coli đã phân lập.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli)
2.1.1. Định nghĩa
Vi khuẩn Escherichia coli là tên được đặt theo tên của nhà bác sĩ nhi khoa người
Đức Theodor Escherich (1857 - 1911), ông là người đầu tiên phân lập và mô tả vi
khuẩn này vào năm 1885.Vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống
Escherichia (Theo hệ thống phân loại của Bergey).
E. coli là trực khuẩn hình que thẳng, kích thước dài ngắn khác nhau, trung bình

từ 2 – 3 µm, rộng 0,5 µm, đôi khi trong môi trường nuôi cấy trực khuẩn dài 6 – 8 µm.
Trực khuẩn có thể có vỏ, có lông di động (có thể một số chủng không đi động), không
sinh nha bào, bắt màu Gram âm (Đoàn Thị Nguyện, 2001).
2.1.2. Tính chất nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa
Vi khuẩn kỵ khí hiếu khí tùy nghi, phát triển được ở nhiệt độ 15 - 40oC, tốt nhất
là 37oC, pH 7 - 7,2. Trong môi trường lỏng sau 4 - 8 giờ E. coli đã làm đục nhẹ môi
trường nuôi cấy, càng để lâu càng đục nhiều và sau vài ngày có thể có váng mỏng trên
mặt môi trường. Để lâu vi khuẩn lắng xuống đáy ống.
E. coli có thể được phục hồi dễ dàng từ những mẫu có nguồn gốc khác nhau trên
môi trường chọn lọc ở 37oC trong điều kiện hiếu khí. E. coli thường được phân lập
bằng môi trường Mac Conkey (MCK) hoặc eosin methylene blue agar (EMB). Trên
môi trường thạch EMB, E. coli cho khuẩn lạc tím ánh kim; trên môi trường thạch
MCK, E. coli cho khuẩn lạc đỏ hồng.
E. coli mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng (NA: nutrient agar), sau 24 giờ
hình thành những khuẩn lạc màu xám trắng, tròn, ướt, bề mặt bóng, kích thước khoảng
2 - 3 mm. Lên men và sinh hơi một số loại đường thông thường như lactose, glucose,
manitol, ramnose… Người ta căn cứ vào khả năng lên men đường lactose để phân biệt
E. coli với một số vi khuẩn đường ruột khác. Môi trường Kligler iron agar (KIA): lên
men đường glucose và lactose (vàng/vàng), sinh gas, không sinh H 2 S. Nghiệm pháp
IMViC (+ + - -): indol (+), methyl đỏ (+), Voges Proskauer (-),simmon citrate (-).

3


E. coli có sức đề kháng yếu, các chất sát khuẩn thông thường như nước Javel
1/200, phenol 1/200 giết chết vi khuẩn sau 2 - 4 phút. Nhiệt độ 55oC giết vi khuẩn sau
1 giờ và 60oC sau 30 phút (Đoàn Thị Nguyện, 2001).
2.1.3. Cấu tạo kháng nguyên
Kháng nguyên thân O (somatic): có bản chất là lipopolysaccharide của màng
ngoài tế bào, bền với nhiệt và cồn, khi đun nóng ở 100oC trong 2 giờ vẫn giữ được tính

kháng nguyên. Có trên 160 loại

phân bố trong vách tế bào. Kháng nguyên H

(flagellar): bản chất là protein, chịu nhiệt thấp, phần lớn E. coli có chung type kháng
nguyên này. Kháng nguyên bề mặt K (capsular): bản chất là polysaccharide, chịu nhiệt
kém. Kháng nguyên K gồm 4 nhóm: A, B, L, M các kháng nguyên này có khả năng
ngưng kết với huyết thanh của kháng nguyên O. Kháng nguyên F (pili): là kháng
nguyên tiêm mao, bản chất là protein kết dính vào tế bào thành ruột, có hình dạng sợi
giúp kết dính vi khuẩn vào nhung mao ruột. (Đoàn Thị Nguyện, 2001).
2.1.4. Phân loại E. coli
Dựa trên đặc điểm gây bệnh (đặc tính độc lực, sự tác động khác nhau lên màng
nhày của ruột, hội chứng lâm sàng của bệnh và sự khác nhau về mặt dịch tễ của bệnh),
E. coli được chia thành 5 nhóm sau:
• STEC (Shiga toxin – producing E. coli) hoặc VTEC (Vero toxigenic E. coli)
và EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli) : mang nhiều gen độc lực như gene eae chịu
trách nhiệm sản sinh intimin giúp vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột; gen hly sản
sinh độc tố gây dung giải hồng cầu; gen stx1, stx2 sản sinh các độc tố shiga gây hội
chứng viêm kết tràng xuất huyết (HC = hemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu
(HUS = hemolytic uraemic syndrome) ở người, gene stx2e sản sinh độc tố vero gây
bệnh phù thủng và tiêu chảy ở heo cai sữa.
• EPEC (Enteropathogenic E. coli) : mang gene eae sản sinh protein intimin, …
• EAEC (Enteroaggregative E. coli)
• ETEC (Enterotoxigenic E. coli) : mang gene lt sản sinh độc tố ruột kém chịu
nhiệt (heat labile toxin = LT) và gene st sản sinh độc tố ruột chịu nhiệt (heat stable
toxin = ST) gây tiêu chảy trên người và vật nuôi.
• Những nhóm khác gây bệnh tiêu chảy:
−

EIEC (Enteroinvasive E. coli)

4


−

DAEC (Diffusely adherent E. coli)

(Nataro và Kaper, 1998)
Ngoài ra còn có nhóm ExPEC (extra intestinal pathogenic E. coli) gây bệnh
ngoài đường ruột trong đó có nhóm APEC (Avian pathogenic E. coli) gây bệnh trên
gia cầm.
2.1.5. Shiga toxigenic E. coli (STEC)
2.1.5.1. Thuật ngữ
Những hướng khác nhau trong nghiên cứu đã đưa ra những thuật ngữ khác nhau
để gọi tên cho nhóm E.coli này. Tên gọi Verotoxigenic E. coli (VTEC) được
Konowalchuck và ctv (1977) đặt cho nhóm này khi phát hiện việc sản xuất độc tố gây
độc cho dòng tế bào Vero. Tên gọi Enterohaemorrhagie E. coli (EHEC) là do dòng này
gây viêm kết tràng xuất huyết (HC) và hội chứng huyết niệu (HUS). (Nataro và Kaper,
1989). Và thuật ngữ Shiga toxin – producing E. coli (STEC) trước đây gọi là Shiga –
like toxin – produccing E. coli – SLTEC) chỉ rõ khả năng sinh độc tố gây độc tế bào
giống như độc tố Shiga (Calderwood và ctv, 1996).
2.1.5.2. Shiga toxin và những yếu tố độc lực liên quan đến đặc tính gây bệnh của
STEC
STEC sản xuất độc tố Shiga – like toxin (Slt), còn gọi là Shiga toxin (Stx) hoặc
Verotoxin (VT). Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo với nhau là
Stx1 và Stx2. Trong khi Stx1 có tính bảo tồn cao thì Stx2 rất thay đổi về trình tự, tạo ra
nhiều subtype như Stx2c, Stx2hb, Stx2e (Calderwood và ctv, 1996), Stx2g (Leung và
ctv, 2003). Một dòng STEC có thể sản sinh Stx1, Stx2 hoặc cả Stx1 và Stx2, và thậm
chí nhiều dạng của Stx2.

Cả hai độc tố Stx1 và Stx2 đều được cấu tạo từ 5 tiểu đơn vị B 7,7 kDa và một
tiểu đơn vị A 32 kDa. Tiểu đơn vị A gồm peptide A 1 28 kDa và A 2 4 kDa nối với nhau
bằng cầu nối disulfit. Peptide A 1 có hoạt tính enzyme và peptide A 2 có nhiệm vụ gắn
kết tiểu đơn vị A vào những tiểu đơn vị B. Những tiểu đơn vị B giúp độc tố kết hợp
với receptor đặc hiệu Gb3 (Globotriaosylceramide) hiện diện trên bề mặt của tế bào
eukaryote (Stx2e có receptor là Gb4). Sau khi được chuyển vào bên trong tế bào, tiểu
đơn vị A đến tế bào chất và tác động lên tiểu phần 60S của ribosome. Peptide A 1 có
hoạt tính enzyme hoạt động như một N – glycoside cắt một gốc adenin khỏi rRNA 28S

5


của ribosome, do đó gây trở ngại cho sự tổng hợp protein. Do không tổng hợp được
protein, những tế bào bị Stx tác động sẽ chết.
Yếu tố bám dính của STEC / EHEC đã chứng minh là đóng vai trò quan trọng
trong sự định vị của vi khuẩn ở ruột. Đó là intimin - một loại protein có trọng lượng
phân tử 94 – 97 kDa. Protein intimin được mã hóa bởi gene eae (E. coli attaching và
effacing). Intimin gây tổn thương dạng bám dính và phá hủy (attaching - and effacing, A/E) ở ruột già do vi khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô (Donnerberg và ctv,
1993).
Yếu tố độc lực khác của STEC là enterohaemolysin (EHEC - Hly) và có thể là
độc tố chịu nhiệt heat - stable enterotoxin (EAST1). Gene mã hóa EHEC - Hly nằm
trên plasmid 60 - MDa mà plasmid này được tìm thấy ở tất cả các dòng O157:H7 và
cũng hiện diện ở các dòng STEC không phải O157 (Nataro và Kaper, 1998).
2.1.6. Enteropathogenic E. coli (EPEC)
Thuật ngữ enteropathogenic E. coli được gọi tên đầu tiên bởi Neter và ctv (1955) để
chỉ những dòng E. coli gây tiêu chảy ở trẻ em.
Dấu hiệu của sự nhiễm bệnh do EPEC là hình thành bệnh tích kiểu A/E, có thể
quan sát được trên mẫu sinh thiết ruột từ những bệnh nhân hay thú bị nhiễm và trong
nuôi cấy tế bào (Nataro và Kaper, 1998). Dạng tổn thương này được đặc trưng bởi sự
hư hại của các vi nhung mao và sự kết dính chặt giữa vi khuẩn và màng tế bào biểu

mô. Tổn thương này khác với dạng tổn thương do ETEC và Vibrio cholerae (ETEC và
V. cholerae bám theo kiểu không chặt, không gây bào mòn vi nhung mao). Gene cần
thiết cho việc tạo tổn thương A/E là gene eae mã hóa intimin. Protein này là yếu tố độc
lực cần thiết của EPEC (Donnerberg và ctv,1993). Theo Nataro và Kaper (1998), gene
eae hiện diện ở tất cả các chủng EPEC, EHEC, Clostridium rodentium và Hafnia
alvei, nhưng không hiện diện ở những dòng E. coli thuộc hệ vi khuẩn đường ruột
thông thường.
2.1.7. Enterotoxingenic E. coli (ETEC)
2.1.7.1. Các yếu tố độc lực
ETEC có hai nhóm quyết định độc lực là độc tố ruột (enterotoxin) và yếu tố định
vị (colonization factor - CF).

6


−Độc tố ruột enterotoxin
Nhóm ETEC sản sinh độc tố ruột. Có hai loại: độc tố ruột chịu nhiệt (ST) và độc
tố ruột kém chịu nhiệt (LT).
• Độc tố kém chịu nhiệt (heat – labile toxin – LT)
Độc tố LT của E. coli là oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức
năng với độc tố gây bệnh tả trên người (cholera toxin – CT) do Vibrio cholerae tiết ra.
LT - I: Được tiết bởi những dòng E. coli gây bệnh trên người và thú. LT - I là
một oligopeptide khoảng 86 kDa, được cấu tạo bởi 1 tiểu đơn vị A 28 kDa và 5 tiểu
đơn vị B 11,5 kDa. Gene mã hóa cho LT là elt hay lt - I nằm trên plasmid mà plasmid
này có thể chứa cả gene mã hóa ST và hoặc gene mã hóa những kháng nguyên của yếu
tố định vị (colonization factor antigen – CFA). (Nataro và Kaper, 1998).
LT – II: LT - II có cấu trúc giống với LT – I và CT khoảng 55 – 57% ở tiểu đơn
vị A, nhưng không giống với LT - I và CT ở tiểu đơn vị B. LT - II cũng làm gia tăng
cAMP trong tế bào qua cơ chế tương tự như LT - I, nhưng LT - II không liên quan
đến bệnh trên người và thú.

• Độc tố chịu nhiệt (heat – stable toxin – ST)
Ngược với LT, ST có trọng lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfur của nó
giải thích cho khả năng chịu nhiệt của độc tố này. ST được chia thành hai nhóm là STa
và STb. Hai nhóm này khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động. Gene mã hóa cho cả
hai nhóm được tìm thấy chủ yếu trên plasmid và vài gene mã hóa ST cũng được tìm
thấy trên transposon. ST giống 50% trình tự acid amin với độc tố chịu nhiệt EAST1
của EAEC. Một số báo cáo gần đây cho rằng một vài dòng thuộc nhóm ETEC ngoài
việc sản sinh ra STa, còn có thể sản sinh độc tố EAST1. Trong khi đó, STb chỉ được
tìm thấy ở ETEC.
−

Yếu tố định vị (colonization factor – CF)
Cơ chế mà ETEC kết dính và cư trú trên lớp màng nhầy ruột đã được nghiên cứu

kỹ. Để gây tiêu chảy, ETEC đầu tiên phải kết dính vào tế bào ruột non nhờ vào lông
trên bề mặt của vi khuẩn, gọi là yếu tố định vị (CF hay CFA - Colonization factor
antigens).
Hầu hết CFA, chúng được mã hóa bởi gene nằm trên plasmid, cũng là nơi mã
hóa độc tố ST và hoặc LT (Gaastra và Svennerholm, 1996).

7


2.1.8. Avian pathogenic Escherichia coli (APEC)
Nghiên cứu thực nghiệm cho thấy phổi và túi khí là vị trí quan trọng từ đó E.
coli xâm nhập vào máu trong giai đoạn đầu của nhiễm trùng và khả năng chống lại
thực bào của cơ thể là một cơ chế để phát triển bệnh.
Các yếu tố độc lực được xác định như là F1 kháng nguyên lông roi bám vào tế
bào biểu mô cơ quan hô hấp như hầu họng, khí quản (Dozois và ctv, 1994; Dho –
Moulin và Fairbrother, 1999). Yếu tố haemagglutinin nhạy nhiệt (TSH) giữ vai trò

chính trong tấn công túi khí (Dozois và ctv, 2000), và kháng nguyên P1 thì quan trọng
trong giai đoạn nhiễm sau để xâm nhập vào bên trong các cơ quan (Dho – Moulin và
Fairbrother, 1999), đưa tới khả năng chống lại sự thực bào (Pourbakhsh và ctv, 1997).
(Dẫn liệu theo tài liệu của Giovanardi và ctv, 2005).
Một số gene độc lực liên quan tới các yếu tố độc lực của APEC được biết như
iucD (tổng hợp aerobactin), tsh (haemagglutinin nhạy cảm với nhiệt độ), fimC (Loại
1-Fimbriae), hlyE (gây dung huyết E) và stx2f và astA (gene sản xuất nội độc tố), fyuA
và irp2 (liên quan đến hấp thu sắt), iss (gene liên quan đến yếu tố chống lại sự tiêu
diệt của vật chủ) (Janßen và ctv, 2003).

8


Bảng 2.1 Các yếu tố độc lực của E. coli gây bệnh trên gia cầm
Yếu tố gây độc

Tính gây độc

Tiêm mao (fimbria)
−

Tiêm mao F1 (loại 1)

−

Bám dính với các tế bào biểu mô

của đường hô hấp
−

Tiêm mao P

−

Bám dính vào cơ quan nội tạng

−

Curli

−

Bảo vệ vi khuẩn chống lại sự thực

bào
Hệ thống hấp thu sắt
−

Aerobactin

−

Loại bỏ chất sắt khỏi tế bào chủ

−

Yersinabactin

−

Giúp vi khuẩn tăng trưởng và

nhân lên nhanh chóng
Haemolysins (gây dung huyết)
−

Haemolysin E

−

TSH (yếu tố haemagglutinin nhạy

−

Liên quan đến sự phát triển các

tổn thương và fibrin gắn kết vào túi
khí

nhiệt)

−

Tiêu hủy hồng cầu

−

Bảo vệ chống lại cơ chế diệt

Hệ thống phòng thủ chống vật chủ

−

Các protein màng ngoài

−

Protein Iss

−

Màng Lipopolysaccharide phức

khuẩn của tế bào chủ trong máu,

tạp
−

Vỏ K

−

Sản xuất Colicin V

chủ yếu là do sự ức chế hệ thống
bám dính bổ sung

Độc tố và cytotoxins
−

Độc tố chịu nhiệt (EAST - 1)

−

−

Độc tố Shiga (Stx2f)

trở cho quá trình trao đổi chất trong

−

Cytotoxin (verotoxin)

tế bào

−

Độc tố roi

−

(Janßen và ctv, 2003).

9

Vẫn chưa được hiểu rõ, có thể cản

Tạo không bào của tế bào

2.2. Bệnh do E. coli gây trên gà
2.2.1. Động vật cảm thụ
Các loại gia cầm đều nhiễm bệnh này, riêng ở gà trong mọi lứa tuổi đều có thể
bị nhiễm.
2.2.2. Những phương thức truyền lây
Truyền lây qua trứng do cơ thể mẹ bị nhiễm bệnh, hoặc truyền lây qua đường hô
hấp do gà bị bệnh hô hấp mãn tính làm cho niêm mạc phế quản bị tổn thương, vi
khuẩn xâm nhập qua vết thương vào cơ thể, truyền lây qua vỏ trứng do bị nhiễm bệnh
từ phân hoặc môi trường ở chuồng trại bị nhiễm trùng và có thể lây qua thức ăn và
nước uống bị nhiễm trùng.
2.2.3. Triệu chứng và bệnh tích
2.2.3.1. Thể viêm túi khí
Kế phát các bệnh viêm hô hấp mãn tính trên gà, tụ huyết trùng, viêm phế quản và
khí quản truyền nhiễm. Vi khuẩn E. coli có thể bị nhiễm vào những mô đã bị tổn
thương của đường hô hấp. Vi khuẩn phát triển rất nhanh và định hướng vào các túi
khí. Túi khí bị dày lên có màu trắng như bã đậu làm cho con vật khó thở. Vi khuẩn có
thể lây lan ra các cơ quan phủ tạng như tim, gan và các túi khí vùng bụng làm tăng
sinh các màng túi khí. Chất dịch viêm fibrin tiết ra gây viêm dính màng bao tim, màng
bao gan và màng phúc mạc. Kết quả làm cho tuần hoàn máu bị đình trệ, nhu động ruột
giảm, tỷ lệ chết 8 - 10%.
2.2.3.2. Thể bại huyết
Do vi khuẩn xâm nhập vào máu quá nhiều trong điều kiện sức khỏe gà kém như
khi vận chuyển, tiêm phòng, thức ăn thay đổi, giai đoạn đẻ cao và kế phát của các
bệnh về hô hấp. Triệu chứng mệt mỏi không thích đi lại. Chết đột ngột không rõ bệnh
tích. Tỷ lệ chết nhanh này chiếm 1 - 2%. Bệnh tích chỉ có ở những con bị bệnh kéo dài
từ 3 – 4 ngày trở đi: màng tim, gan và xoang phúc mạc bị viêm dính vào tim, gan và
ruột màu sắc trắng đục.
2.2.3.3. Thể viêm ruột
Bệnh thường nhiễm truyền kế phát sau các bệnh cầu trùng, viêm ruột hoại tử, kí
sinh trùng hoặc trong những trường hợp bị suy dinh dưỡng và thiếu vitamin A làm cho

niêm mạc ruột bị tổn thương. Khi nhiễm bệnh gà thường tiêu chảy nặng, phân thường

10


có dịch nhày màu nâu, xanh, trắng. Bệnh tích ở đường tiêu hóa có chứa máu và dịch
nhày. Thành ruột sưng to, dày và phù nề.
2.2.3.4. Thể viêm vòi trứng
Do vi khuẩn xâm nhập qua lỗ huyết, qua nang trứng hoặc từ máu vào. Vi khuẩn
gây viêm đường sinh dục, vì vậy khi trứng đi qua sẽ bị nhiễm E. coli làm cho phôi chết
trước khi nở hoặc sau khi nở. Gà mái đẻ giảm, trứng đôi khi có máu hoặc gà chết đột ngột .
2.2.3.5. Thể chết phôi
Gây chết phôi, nhiễm trùng E. coli là hiện tượng gây chết phôi. Vi khuẩn có thể
xâm nhập qua vỏ trứng vào phôi.
2.2.3.6. Các thể khác
Gây viêm rốn, rốn bị sưng đỏ do nhiễm khuẩn từ mẹ qua trứng vào phôi hay từ
môi trường ngoài vào rốn. Gây viêm khớp, khớp sưng to, đỏ.
2.2.4. Chẩn đoán
Dựa trên triệu chứng lâm sàng và đặc điểm bệnh tích quan sát được sau khi mổ
khám gà bệnh. Sau đó tiến hành lấy bệnh phẩm xét nghiệm và phân lập vi khuẩn.
Chú ý cần phân biệt với các bệnh có triệu chứng lâm sàng gần giống như bệnh
bạch lỵ, thương hàn, bệnh phó thương hàn và cần phân biệt với bệnh có bệnh tích gần
giống E. coli như hô hấp mãn tính.
2.2.5. Phòng và trị bệnh
2.2.5.1. Phòng bệnh
Phòng bằng vaccine.
Phòng bằng thuốc kháng sinh: có thể dùng một trong những loại kháng sinh sau
ampicillin, neomycin, cosumix, imequil hoặc flumequil. Định kỳ kiểm tra vi khuẩn và
làm kháng sinh đồ để xác định vi khuẩn đề kháng với thuốc.
Phòng bệnh bằng phương pháp vệ sinh: Vệ sinh chuồng trại định kỳ để giảm

lượng vi khuẩn trong môi trường. Chuồng trại phải được thông khí để các khí độc như
ammoniac sẽ không tích tụ gây độc cho cơ thể gà.
2.2.5.2. Trị bệnh
Dùng một trong các loại thuốc kháng sinh diệt vi khuẩn Gram âm như cosumix,
colicopha, anticoli B, imequil, flumequil, ampicillin, neomycin, spectam, gentamycin.
Ngoài ra cần cho uống bổ sung vitamin C, vitamin E và vitamin A để tăng sức đề
kháng tự nhiên cho gà (Nguyễn Xuân Bình và ctv, 2002).
11


2.3. Kỹ thuật PCR
2.3.1. Khái niệm và nguyên tắc
PCR (polymerase chain reaction - phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ
polymerase) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Đây là kỹ thuật invitro
cho phép nhân nhanh một gen mong muốn lên hàng triệu lần trong thời gian ngắn
(không cần hiện diện của tế bào).
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ
mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn
DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA
polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Các mồi này gồm có mồi “xuôi”
(forward primer mồi tác động lên sợi 3’ → 5’ và mồi “ngược” (reverse primer mồi tác
động lên sợi 5’ → 3’)
2.3.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba
giai đoạn:
 Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính (denaturation)
Hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau thành hai mạch đơn. Phân tử DNA
được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thường là ở
94 -95oC trong vòng 30 giây đến 1 phút.
 Giai đoạn 2: Giai đoạn ủ bắt cặp (anealing)

Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các primer) cho phép các primer bắt cặp
với khuôn, trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động khoảng 40 - 60oC tuỳ thuộc Tm
của các primer sử dụng và kéo dài từ 30 giây dến 1 phút.
 Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài (elongation hay extension)
Nhiệt độ giai đoạn này được tăng lên 72oC giúp DNA polymerase hoạt động tổng
hợp DNA tốt nhất với sự hiện diện của 4 deoxyribonucleotide triphosphate. Đoạn
DNA nằm giữa hai primer được tổng hợp tạo thành chuỗi DNA.
• Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên sẽ được lặp lại nhiều lần và mỗi lần làm tăng
đôi lượng DNA mẫu của lần trước. Tổng DNA khuếch đại được tính theo công thức:
Tổng DNA khuếch đại = m * 2n
Với:

n: Số chu k
m: Số bản sao của chuỗi mã hóa
12


• Số chu kỳ của phản ứng PCR
- Trong thực tế, không vượt quá 40 chu kỳ trong 1 phản ứng, vì phản ứng PCR
diễn ra qua hai giai đoạn:
+

Giai đoạn đầu, số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân, tỷ lệ với lượng mẫu

cung cấp ban đầu.
+

Giai đoạn sau đó, hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do: Phân hủy và cạn kiệt các

thành phần của phản ứng. Hoặc xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế lại phản ứng. Hoặc

do các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với primer mà lại bắt cặp với nhau.
2.3.3. Các thành phần của một phản ứng PCR
−

DNA mẫu: là thành phần cần khuếch đại.

−

Primer: Primer là những đoạn oligonucleotide mạch đơn, có trình tự bổ sung

với trình thự base của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA. Việc
chọn primer là giai đoạn quyết định của phản ứng PCR. Các primer được chọn phải
đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên
gen, không có sự bắt cặp bổ sung giữa primer xuôi và primer ngược và cũng không có
những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung trong cùng một primer. Chiều dài các
primer tối thiểu cho hầu hết các ứng dụng PCR là 18 nucleotide (thường là 18 - 24
nucleotide). Trình tự nằm giữa hai primer xuôi và ngược không quá lớn, phản ứng
PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1 kb.
−

Taq polymerase: Taq polymerase là một DNA polymerase chịu nhiệt, được

chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus ở suối nước nóng. Taq DNA polymerase
không bị phá hủy ở nhiệt độ cao và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản
ứng dưới sự hiện diện của Mg2+. Taq DNA polymerase tổng hợp DNA theo hướng
5’→ 3’ và hoạt động tốt nhất ở 70 - 72oC.
−

Các nucleotide (dNTP – deoxyribonucleotide triphosphate): là hỗn hợp 4 loại:

dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA.
−

Dung dịch đệm: thành phần dung dịch đệm có thể thay đổi tùy loại enzyme

được sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg2+. Nó hình thành một phức hợp hòa tan với
dNTP, rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme polymerase, làm
tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của DNA mạch đôi. Nồng độ Mg2+ (thường được sử
dụng ở dạng MgCl 2 ) là một yếu tố ảnh hưởng mạnh đến hiệu quả và tính đặc hiệu của
phản ứng PCR. Ngoài ra nồng độ MgCl 2 có thể ảnh hưởng đến quá trình bắt cặp của
13