PHÂN LẬP, THỬ KHÁNG SINH ĐỒ VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘC LỰC VI KHUẨN Escherichia coli GÂY BỆNH TRÊN GÀ TẠI TỈNH BÌNH DƯƠNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP, THỬ KHÁNG SINH ĐỒ VÀ XÁC ĐỊNH
ĐỘC LỰC VI KHUẨN Escherichia coli GÂY BỆNH
TRÊN GÀ TẠI TỈNH BÌNH DƯƠNG

Ngành học

:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện :

PHAN THỊ QUYÊN

Khóa học

2007 – 2011

:

Tháng 07/2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP, THỬ KHÁNG SINH ĐỒ VÀ XÁC ĐỊNH
ĐỘC LỰC VI KHUẨN Escherichia coli GÂY BỆNH
TRÊN GÀ TẠI TỈNH BÌNH DƯƠNG

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. NGUYỄN TẤT TOÀN

PHAN THỊ QUYÊN

Tháng 07 năm 2011


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn Trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM, bộ môn Công
Nghệ Sinh Học, Bệnh Viện Thú Y - Trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM đã cho
phép và tạo điều kiện, giúp đỡ chúng tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Xin bày tỏ lòng biết ơn đến TS. Nguyễn Tất Toàn và TS. Nguyễn Thị Phước
Ninh đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM, Bộ Môn
Công Nghệ Sinh Học đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập. Xin
chân thành cảm ơn đến các thầy cô đã tận tình chỉ bảo và truyền lại những kiến thức,
kinh nghiệm quí báu giúp tôi có được sự hiểu biết như ngày hôm nay.
Để hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, cổ vũ động
viên của bạn bè và các anh chị trong Bệnh Viện Thú Y, Đại Học Nông Lâm TP. HCM.
Đồng thời, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình tôi, những người luôn

âm thầm theo dõi và động viên, giúp tôi có thể hoàn thành tốt 4 năm đại học.
Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn đối với mọi sự giúp đỡ quí báu đó.
Xin trân trọng cảm ơn!

i


TÓM TẮT
Phân lập vi khuẩn E. coli từ 35 mẫu túi khí được thu thập từ những gà bệnh với
các bệnh tích khác nhau tại tỉnh Bình Dương cho kết quả dương tính với E. coli là
22/34 (62,86%).
Tiến hành kiểm tra tính mẫn cảm của 22 gốc E. coli phân lập được với 13 loại
kháng sinh cho thấy, đa số các gốc vi khuẩn đề kháng với ampicillin (81,82%),
amoxicillin (77,27%), tetracycline (81,82%) và trimethoprim/sulphamethoxazone
(72,73%). Các gốc E. coli phân lập được chỉ còn nhạy cảm với norfloxacine,
tobramycin, neomycin và gentamicin với tỉ lệ 59,09 – 95,45%.
Thử nghiệm độc lực của 22 gốc vi khuẩn E. coli phân lập được từ gà bệnh trên
phôi trứng gà 12 ngày tuổi, cho tỉ lệ chết phôi trứng dao động trong khoảng 0 – 72%.
Trong đó, có 9/22 gốc cho tỉ lệ chết phôi ở mức độc lực cao (> 29%), 12/22 mẫu độc
lực trung bình (10 – 29%), và 1/22 mẫu không gây chết phôi.
Tiến hành chọn ra 12 gốc E. coli phân lập được có độc lực từ kết quả tiêm trên
phôi trứng để tiến hành kiểm tra độc lực trên gà con 1 ngày tuổi. Kết quả có 7/12 gốc
E. coli thử nghiệm gây chết gà con với tỉ lệ dao động 30 - 100%. Trong đó 3 gốc gây
chết 100% gà con và 5/12 gốc E. coli không gây chết gà con trong 7 ngày thí nghiệm.
Triệu chứng bệnh E. coli chỉ xuất hiện ở những lô có gà chết. Tuy nhiên, bệnh tích vẫn
xuất hiện trên những lô không gây chết gà con, nhưng điểm tổn thương thấp hơn so
với các lô có tỉ lệ chết gà là rất lớn.
Kết quả kiểm tra 2 gene liên quan đến độc lực của E. coli gây bệnh gia cầm là
fimC và iucD trên 21 gốc có độc lực bằng PCR cho thấy đa số các gốc vi khuẩn đều
mang 2 gene này. FimC được phát hiện với tỉ lệ là 100% và iucD là 90,91%.

ii


SUMMARY
Thesis title: “Isolation, Antimicrobial susceptibility pattern and determined
virulence of avian Escherichia coli pathogenic in Binh Duong provine”.
Isolated E. coli from 35 air sac samples were collected from the diseased
chickens with different diseases in Binh Duong, produces positive for E. coli is 22/34
(62.86%).
Proceed to test the sensitivity of 22 E. coli isolates with 13 antibiotics showed
that the majority of E. coli resistant to ampicillin (81.82%), amoxicillin (77.27%),
tetracycline (81.82%) and trimethoprim/sulphamethoxazone (72.73%). The E. coli
isolates is only sensitive to norfloxacine, tobramycin, neomycin and gentamicin 59.0995.45%.
Experimental virulence of 22 E. coli isolates from disease chickens on 12-dayold chicken eggs, mortality rate of them were isolated from 0 to 72%. There were 9/22
model for embryonic mortality in the highly virulent (>29%), 12/22 in moderate
virulent (10 - 29%), and 1/22 sample did not kill embryos.
Twelve E. coli isolates strains were picked out from the result of pathogenic in
12 day–old embryos to inject into 1 day – old chicks. The result of the pathogenicity
in one-old-day chicks indicated that only 5/12 samples were recorded in 90 to 100%
mortality, while 2/12 samples were in 30 - 40% motality and 5/12 samples were not
pathogenic for one-old-day chicks during the experiment. Symptoms of E. coli disease
only appear in the plots have dead-chickens. However, the lesions still appeared on the
non-lethal plots, but the lession scores is lower than in the strains had dead-chickens
are great.
In this study, the presence of the 2 virulence – associated genes in avian
pathogenic Escherichia coli was determined using PCR on 21 virulent samples. Most
of the E. coli isolates harbored two these genes. FimC gene was detected in 100% and
iucD in 90,91%.

iii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN...................................................................................................................i
TÓM TẮT....................................................................................................................... ii
SUMMARY................................................................................................................... iii
MỤC LỤC ..................................................................................................................... iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG ........................................................................................ viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ ........................................................................ ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................1
1.1.

Đặt vấn đề ...........................................................................................................1

1.2.

Yêu cầu – nội dung thực hiện .............................................................................2

1.2.1.

Yêu cầu ...............................................................................................................2

1.2.2.

Nội dung thực hiện .............................................................................................2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................................3
2.1.

E. coli gây bệnh trên gia cầm .............................................................................3

2.1.1.

Lịch sử ................................................................................................................3

2.1.2. Dịch tễ học .........................................................................................................3
2.1.2.1. Đặc điểm hình thái của E. coli ...........................................................................3
2.1.2.2. Động vật cảm thụ ...............................................................................................3
2.1.2.2. Chất chứa căn bệnh ............................................................................................4
2.1.2.3. Phương thức truyền lây ......................................................................................4
2.1.2.4. Triệu chứng bệnh ................................................................................................4
2.1.2.5. Các đặc điểm của E. coli gây bệnh trên gia cầm ................................................6
2.1.2.3. Chẩn đoán bệnh ..................................................................................................8
2.1.2.4. Phòng ngừa và điều trị........................................................................................8
2.2.

Thử độc lực trên trứng gà có phôi ......................................................................9

2.3.

Động vật thí nghiệm ...........................................................................................9

2.4.

Kĩ thuật PCR ....................................................................................................10

2.4.1. Nguyên tắc ........................................................................................................10
2.4.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR .....................................................................10

iv


2.4.3.

Thành phần phản ứng .......................................................................................10

2.4.4.

Kiểm tra kết quả PCR .......................................................................................11

2.5.

Nghiên cứu có liên quan ...................................................................................11

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................13
3.1.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu ....................................................................13

3.1.1.

Thời gian...........................................................................................................13

3.1.2.

Địa điểm ...........................................................................................................13

3.2.

Đối tượng và số lượng mẫu ..............................................................................13

3.3.

Nội dung nghiên cứu ........................................................................................13

3.4.

Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................13

3.4.1.

Phân lập vi khuẩn E. coli từ gà bị bệnh ............................................................14

3.4.1.1. Mục đích ...........................................................................................................14
3.4.1.3. Phương pháp tiến hành .....................................................................................15
3.4.2.

Kiểm tra kháng sinh đồ các gốc E. coli phân lập được ....................................16

3.4.2.1. Mục đích ...........................................................................................................16
3.4.2.2. Dụng cụ và hóa chất .........................................................................................16
3.4.2.3. Phương pháp thực hiện .....................................................................................17
3.4.2.4. Chỉ tiêu theo dõi ...............................................................................................17
3.4.3.

Thử nghiệm độc lực gốc E. coli trên phôi trứng gà và gà thí nghiệm..............18

3.4.3.1. Mục đích ...........................................................................................................18
3.4.3.2. Thử nghiệm độc lực gốc E. coli phân lập được trên phôi trứng gà ..................18

3.4.3.3. Thử nghiệm độc lực gốc E. coli phân lập được trên gà thí nghiệm .................20
3.4.3.4. Xử lý số liệu .....................................................................................................24
3.4.4.

Phát hiện một số gene độc lực của các gốc E. coli bằng kĩ thuật PCR ............24

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................25
4.1.

Kết quả phân lập vi khuẩn E. coli trên gà bệnh................................................26

4.2.

Kết quả kháng sinh đồ các gốc E. coli phân lập được......................................27

4.3.

Kết quả thử nghiệm độc lực các gốc E. coli trên phôi gà và gà thí nghiệm .....29

4.3.1.

Kết quả thử nghiệm độc lực các gốc E. coli trên phôi trứng gà .......................29

4.3.2.

Kết quả thử nghiệm độc lực gốc E. coli phân lập được trên gà thí nghiệm .....30

4.3.2.1. Tỉ lệ gà con chết sau khi tiêm huyễn dịch vi khuẩn .........................................30
4.3.2.2. Triệu chứng lâm sàng của gà thí nghiệm .........................................................31
v

4.3.2.3. Bệnh tích đại thể ...............................................................................................32
4.4.

Kết quả kiểm tra một số gene độc lực của vi khuẩn E. coli .............................33

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................35
5.1.

Kết luận ............................................................................................................35

5.2.

Đề nghị .............................................................................................................35

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................36
PHỤ LỤC

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
APEC

:

Avian pathogenic Escherichia coli

BA

:

Blood agar

BHI

:

Brain heart infusion

CFU

:

Colony – forming units

ctv

:

Cộng tác viên

CRD

:

Chronic Respiratory Disease

DNA

:

Deoxyribonucleic acid

dNTP

:

Deoxyribonucleoside triphosphate

EMB

:

Eosin methyl blue

EAST - 1

:

E. coli heat-stable enterotoxin-1

IMViC

:

Indol, Methyl red, Voges – Proskauer, Citrate

KIA

:

Kligle iron agar

NA

:

Nutrient agar

LH

:

Heat – Labile toxins

ST

:

Heat – Stable toxins

SHS

:

Swollen Head Syndrome

Stx2f

:

Shiga Toxin 2 Variant

TAE

:

Tris – acetate EDTA

TBE

:

Tris – borate EDTA

TSH

:

Temperature – sensitive hemagglutinin

PCR

:

Polymerase chain reaction

vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Các yếu tố độc lực của E. coli gây bệnh gia cầm ............................................7
Bảng 3.1 Thu thập mẫu từ gà bệnh tại tỉnh Bình Dương ..............................................15
Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm tiêm E. coli vào trứng gà có phôi .....................................18
Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm trên gà con 1 ngày tuổi ......................................................21
Bảng 3.4 Điểm thương tổn các cơ quan trên gà nhiễm E. coli .....................................22
Bảng 3.5 Điểm triệu chứng của gà bị nhiễm E. coli .....................................................23
Bảng 3.6 Thành phần phản ứng PCR ............................................................................24
Bảng 3.7 Trình tự các primer được sử dụng trong phản ứng PCR ...............................25
Bảng 3.8 Chu trình nhiệt phản ứng PCR ......................................................................25
Bảng 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn E. coli..................................................................26
Bảng 4.2 Kết quả kháng sinh đồ của các gốc vi khuẩn E. coli phân lập được ............27
Bảng 4.3 Kết quả tỉ lệ phôi trứng chết sau 2 ngày theo dõi ..........................................29
Bảng 4.4 Tỉ lệ chết của gà con thí nghiệm sau 7 ngày theo dõi....................................30
Bảng 4.5 Điểm triệu chứng trung bình các lô gà thí nghiệm ........................................31
Bảng 4.6 Điểm bệnh tích trung bình ở một số cơ gan sau 7 ngày ................................33
Bảng 4.7 Tỉ lệ phát hiện gene độc lực...........................................................................33

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 3.1 Sơ đồ các bước thử nghiệm độc lực vi khuẩn E. coli. ...................................14
Hình 3.2 Sơ đồ phân lập vi khuẩn E. coli. ....................................................................16
Hình 3.3 Sơ đồ thử độc lực E. coli trên phôi trứng.......................................................19
Hình 3.1 Bệnh tích trên phổi sau khi nhiễm chủng APEC. ..........................................22
Hình 3.2 Những thay đổi hình thái của tim khi nhiễm chủng APEC ...........................23
Hình 3.3 Những thay đổi hình thái của túi khí khi nhiễm chủng APEC. .....................23

Hình 4.1 Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của E. coli .................................................... 28
Hình 4.2 Bệnh tích đại thể trên phôi gà. .......................................................................30
Hình 4.3 Gà có triệu chứng nhiễm E. coli. ...................................................................32
Hình 4.4 Bệnh tích đại thể trên gà thí nghiệm. .............................................................32

ix


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Escherichia coli là một tác nhân gây bệnh chủ yếu trong chăn nuôi gia cầm
thương mại thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, ảnh hưởng đáng kể đến tổn thất
nền kinh tế nông nghiệp. E. coli gây bệnh ở gà được gọi chung là E. coli gây bệnh
cúm gia cầm (Avian pathogenic Escherichia coli: APEC) và có liên quan chủ yếu với
nhiễm trùng ngoài đường ruột như nhiễm trùng túi khí, viêm màng ngoài tim, viêm
phúc mạc, viêm vòi trứng, viêm màng hoạt dịch, viêm xương tủy, viêm mô tế bào, và
nhiễm trùng túi lòng đỏ. Bệnh do vi khuẩn E. coli gây ra thường không có dấu hiệu rõ
ràng và đặc trưng nên dễ nhầm lẫn với các bệnh khác, và chúng có khả năng lây lan
nhanh, cùng với mật độ nuôi dày làm cho người chăn nuôi không phát hiện kịp thời
gây hậu quả nghiêm trọng. Vì vậy, cần chẩn đoán chính xác bệnh để phòng trị bệnh
kịp thời.
Khả năng gây bệnh của E. coli tương quan rất nhiều với các yếu bên ngoài và bên
trong liên quan đến gia cầm. Bản thân vi khuẩn E. coli gây bệnh trên gia cầm tổng
hợp nhiều yếu tố, có yếu tố là độc tố và có yếu tố không phải là độc tố. Nhưng chưa có
yếu tố độc lực cụ thể nào được xác định là chịu trách nhiệm gây bệnh E. coli ở gia cầm
(dẫn liệu theo Antão và ctv, 2008). Đồng thời, do có nhiều chủng kháng nguyên E. coli
gây bệnh và việc điều trị bằng kháng sinh hiện nay không đạt được hiệu quả cao. Vì
vậy, việc kiểm soát và phòng trị bệnh gặp rất nhiều khó khăn.
Do đó, việc sử dụng các mô hình gây nhiễm thực nghiệm trên phôi gà và gà thí
nghiệm để kiểm tra mức độ gây độc của E. coli. Đồng thời, sử dụng kĩ thuật sinh học

phân tử như PCR để phát hiện một số gene độc lực của các chủng E. coli gây bệnh trên
gia cầm là điều cần thiết. Từ đó có những hiểu biết sâu hơn về đặc điểm gây bệnh của
E. coli trên gia cầm. Đồng thời, kiểm tra tính mẫn cảm của E. coli với một số loại
kháng sinh giúp hiểu hơn về tình trạng sử dụng thuốc hay kháng sinh hiện nay, từ đó
tìm ra được các biện pháp phòng trị bệnh hữu hiệu nhằm bảo vệ sức khỏe con người và
vật nuôi. Do đó, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập, thử kháng sinh đồ
và xác định độc lực vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh trên gà tại tỉnh Bình Dương”.
1


1.2. Yêu cầu – nội dung thực hiện
1.2.1. Yêu cầu
Phân lập và thử kháng sinh đồ của các mẫu vi khuẩn E. coli phân lập từ gà bệnh
tại tỉnh Bình Dương
Xác định một số gene liên quan độc lực của E. coli gây bệnh gia cầm trên các
mẫu phân lập được
1.2.2. Nội dung thực hiện
Phân lập vi khuẩn E. coli từ gà bệnh
Kiểm tra tính mẫn cảm của E. coli với một số loại kháng sinh thường được sử
dụng trong phòng trị bệnh trên gà
Thử nghiệm độc lực vi khuẩn E. coli phân lập được trên phôi trứng gà và gà thí
nghiệm
Sử dụng kĩ thuật PCR để kiểm tra một số gene độc lực của vi khuẩn E. coli
(iucD, fimC)

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. E. coli gây bệnh trên gia cầm

2.1.1. Lịch sử
E. coli là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế nhất trong hệ vi sinh vật đường
ruột của người và động vật. Phần lớn các vi khuẩn E. coli không có ảnh hưởng gì đáng
kể đến sức khỏe chỉ có một số E. coli có thể gây bệnh khi cơ thể bị stress hay bị bệnh.
E. coli được phát hiện đầu tiên vào những năm 1885 từ phân của trẻ sơ sinh với
tên gọi Bacterium coli commune. Sau đó được đổi tên thành Escherich nhằm tri ân
người có công khám phá (Theodor Escherich). Năm 1991, thống nhất với tên gọi là
Escherichia coli (viết tắt là E. coli).
Các báo cáo đầu tiên về nhiễm trùng ở gia cầm gây ra bởi sinh vật trực khuẩn
ruột là của David (1938, dẫn liệu theo Huq, 2002) và Twisselman (1939, dẫn liệu theo
Huq, 2002). Sau đó Wasserman và ctv (1954, dẫn liệu theo Huq, 2002) và Fahey
(1955, dẫn liệu theo Huq, 2002) đã báo cáo việc phân lập E. coli từ “bệnh túi khí”.
Nhóm huyết thanh gây bệnh của vi khuẩn E. coli phổ biến trong môi trường nuôi gia
cầm và có thể nguyên nhân gây bệnh túi khí, viêm màng ngoài tim, viêm phúc mạc,
viêm vòi trứng, viêm màng hoạt dịch, viêm tủy xương, viêm mô tế bào hoặc nhiễm
trùng túi lòng đỏ. Tập hợp các bệnh này tạo nên một tổn thất lớn về kinh tế đối với
ngành chăn nuôi gia cầm.
2.1.2. Dịch tễ học
2.1.2.1. Đặc điểm hình thái của E. coli
E. coli là trực khuẩn hình gậy ngắn, kích thước trung bình (0,5µ x 1-3µ) hai đầu
tròn, có lông, di động, không tạo bào tử, không hình thành nha bào, bắt màu Gram âm
(−) thường thẫm ở hai đầu, ở giữa nhạt, loại có độc lực thì có capsule, loại không có
độc lực không có capsule. Trong cơ thể, vi khuẩn có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng
rẽ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn.
2.1.2.2. Động vật cảm thụ
Gia cầm, các loài chim, động vật hữu nhũ ở mọi lứa tuổi đều có thể mắc bệnh do
E. coli gây ra, nhưng con non, những con đang bị bệnh, suy yếu thì dễ mắc bệnh hơn.
3

Trên gà, bệnh thường xảy ra ở giai đoạn 1 – 10 ngày tuổi, những con gà ở giai
đoạn chuẩn bị đẻ.
2.1.2.2. Chất chứa căn bệnh
Nơi chất chứa quan trọng nhất của E. coli là đường ruột của động vật, bao gồm
gia cầm. Ở gà, có khoảng 109 CFU của vi khuẩn trên mỗi gram phân. Trong số này,
106 CFU là E. coli, 10 – 15% trong số đó là nhóm huyết thanh gây bệnh và có thể lây
nhiễm sang hầu hết các động vật có vú và gia cầm do đó chúng có mặt toàn thế giới. E.
coli cũng thường được phân lập từ đường hô hấp. Ngoài ra, chúng còn có mặt trên da
và lông của gia cầm. Sự lây nhiễm E. coli vào trứng là phổ biến và có thể là nguyên
nhân gây tỉ lệ tử vong cao ở gà. Hầu hết, các chủng E. coli phân lập từ gia cầm là chỉ
gây bệnh trên các loài gia cầm, nhưng một số ít có thể gây bệnh cho động vật khác
(dẫn liệu theo Kabir, 2010).
2.1.2.3. Phương thức truyền lây
Các con đường lây bệnh chủ yếu của vi khuẩn E. coli trên gia cầm là truyền lây
qua trứng do cơ thể mẹ bị nhiễm bệnh, qua vỏ trứng do bị nhiễm bẩn từ phân hoặc môi
trường chuồng trại bị nhiễm khuẩn, qua đường hô hấp do gà bị bệnh CRD làm cho
niêm mạc phế quản bị tổn thương, vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể qua vết thương.
Truyền lây qua thức ăn và nước uống nhiễm trùng.
2.1.2.4. Triệu chứng bệnh
Thể viêm túi khí
Kế phát các bệnh CRD, tụ huyết trùng, viêm phế quản và khí quản truyền nhiễm.
Vi khuẩn E. coli có thể bị nhiễm vào những mô đã bị tổn thương của đường hô hấp. Vi
khuẩn phát triển rất nhanh và định hướng vào các túi khí. Túi khí bị dày lên có màu
trắng như bã đậu làm cho con vật khó thở. Vi khuẩn có thể lây lan ra các cơ quan phủ
tạng như tim, gan và các túi khí vùng bụng làm tăng sinh các màng túi khí. Chất dịch
viêm firin tiết ra gây viêm dính màng bao tim, màng bao gan và màng phúc mạc. Kết
quả làm cho tuần hoàn máu bị đình trệ, nhu động ruột giảm, tỷ lệ chết 8 - 10%.
Viêm túi noãn hoàng
Tỉ lệ nhiễm trùng túi lòng đỏ là cao nhất khi vỏ trứng bị ô nhiễm, chúng xảy ra
vào giai đoạn ấp trứng cuối cùng và nhiều phôi bị ảnh hưởng sẽ dẫn đến hiện tượng

chết phôi. Chỉ cần một vài vi khuẩn có độc tính ( ví dụ như O1: K1) cũng có thể dẫn
4


đến cái chết của tất cả các phôi, sau khi tiêm chúng vào túi lòng đỏ (Siccardi, 1966,
dẫn liệu theo Huq, 2002).
Nhiễm trùng đường hô hấp
Bệnh hô hấp liên hợp, liên quan đến nhiễm trùng thứ cấp do E. coli, thường xảy
ra từ 2 – 12 tuần tuổi, với thiệt hại xảy ra chủ yếu giữa tuần thứ 4 và 9. Đây là một
trong những bệnh gia cầm phổ biến nhất với thiệt hại đôi khi vượt quá 20%. Kết quả là
tăng trưởng kinh tế giảm và giảm hiệu quả thức ăn, tăng tỷ lệ tử vong (Huq, 2002).
Ở một số loại gà, nhiễm trùng đường hô hấp không được kiểm soát và các nhiễm
trùng E. coli trở thành nhiễm trùng máu. Hầu hết những con gà bị nhiễm trùng máu,
nhiễm trùng sẽ lan rộng đến các cơ tim và sau đó đến màng ngoài tim.
Nhiễm trùng máu cấp tính ở gà
E. coli gây nhiễm trùng máu cấp tính thường nhiễm trùng ở gà trưởng thành, biểu
hiện đặc trưng là gan sậm màu và cơ ngực tắc nghẽn. Đôi khi trên gan xuất hiện các
đốm hoại tử nhỏ. Trong một số trường hợp, viêm màng ngoài tim và viêm phúc mạc
cũng xuất hiện.
Viêm vòi trứng
Những loài gia cầm bị ảnh hưởng thường chết trong 6 tháng đầu tiên, những con
sống sót hiếm khi đẻ trứng.
Hội chứng sưng đầu
Hội chứng sưng đầu (SHS) đặc trưng là sưng phù nề, viêm mô tế bào, che mắt gà
thịt, gà thịt giống và gà đẻ thương mại.
Viêm mô tế bào
Viêm mô tế bào (đôi khi được gọi là viêm hoại tử da) ở thành bụng dưới bên
dưới lỗ thông hơi và đùi của gà thịt, tuy không dẫn đến tử vong nhưng sự hiện diện của
mảng bám fibrin gây thiệt hại đáng kể cả về chất lượng và mỹ quan của thịt.
Viêm ruột

Một vài báo cáo cho rằng, E. coli có thể là nguyên nhân gây viêm ruột ở gia cầm.
Sự hiện diện phổ biến nhất của nhóm huyết thanh gây bệnh E. coli trong đường ruột
của gia cầm thì không liên quan đến bệnh.
Bệnh thường nhiễm truyền kế phát sau các bệnh cầu trùng, viêm ruột hoại tử, kí
sinh trùng hoặc trong những trường hợp bị suy dinh dưỡng và thiếu vitamin A làm cho
niêm mạc ruột bị tổn thương. Khi nhiễm bệnh gà thường tiêu chảy nặng, phân thường
5


có dịch nhày màu nâu, xanh, trắng bị chảy nước kết hợp với trọng lượng giảm nhanh
chóng. Bệnh tích ở đường tiêu hóa có chứa máu và dịch nhày. Thành ruột sưng to, dày
và phù nề.
2.1.2.5. Các đặc điểm của E. coli gây bệnh trên gia cầm
Nhóm huyết thanh
Sự tồn tại của một số kiểu huyết thanh phụ thuộc vào điều kiện cụ thể như khu
vực địa lý, quốc gia, và thời gian cách ly.
Các kiểu huyết thanh khác nhau của E. coli được phân loại theo hệ thống Ewing
(Ewing và ctv, 1956, dẫn liệu theo Huq, 2002). Nhiều nghiên cứu trên toàn thế giới đã
xác định nhóm huyết thanh của E. coli có liên quan đến dịch bệnh ở gia cầm. Siccardi
(1966, dẫn liệu theo Huq, 2002) thấy rằng 48% nhóm huyết thanh được biết đến đã
gây bệnh cho gà, trứng có phôi hoặc cả hai. Trong số các nhóm huyết thanh O đã được
báo cáo là gây bệnh cho gia cầm là: 1, 2, 3, 6, 8, 15, 18, 35, 71, 74, 78, 87, 88, 95, 103
và 109. Trong đó nhóm huyết thanh O 1, 2 và 78 là phổ biến nhất trên thế giới, và một
số nhóm huyết thanh O vẫn chưa xác định được.
Pili
Pili thường được liên tưởng với sự bám dính của E. coli và đã có nhiều nghiên
cứu để xác định pili, điều này quan trọng với khả năng gây độc của E. coli gây bệnh
gia cầm. Naveh và ctv (1984, dẫn liệu theo Huq, 2002) đã chứng minh rằng ba chủng
vi khuẩn E. coli (O2, O78 và O88) từ E. coli nhiễm trùng máu gia cầm tạo ra pili khi
được nuôi cấy ở 37oC nhưng không tạo pili ở 18oC. Tiêm vào gà các chủng tạo pili dẫn

đến sự xuất hiện bệnh cao hơn đáng kể so với những con gà bị lây nhiễm với chủng
không tạo pili (nonpiliated ).
Kháng nguyên K1
Hầu hết các chủng vi khuẩn E. coli nhiễm trùng máu gia cầm chỉ thuộc về một số
nhóm O : K nhất định. Các nhóm O chủ yếu là 1, 2 và 78, và các kháng nguyên K phổ
biến nhất là K1 và K80. Các kháng nguyên K1 cũng liên quan với bệnh nhiễm trùng
ngoài ruột ở người và đã được chứng minh là chống lại bổ thể. Nó thường được kết
hợp với các O nhóm 1 hoặc 2. Bree và ctv (1989, dẫn liệu theo Huq, 2002) cho rằng
nhận biết K1 cũng được xem như xác định tính độc hại trong các chủng E. coli gây
bệnh gia cầm của các nhóm huyết thanh O2.

6


Các yếu tố gây độc của E. coli gây bệnh trên gia cầm
Một số yếu tố độc lực tiềm năng của APEC đã được xác định cho đến nay được
trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1 Các yếu tố độc lực của E. coli gây bệnh gia cầm
Yếu tố gây độc

Tính gây độc

Tiêm mao (fimbria)
− Tiêm mao F1 (loại 1)

− Bám dính với các tế bào biểu
mô của đường hô hấp

− Tiêm mao P

− Bám dính vào cơ quan nội tạng

− Curli

− Bảo vệ chống lại sự thực bào

Hệ thống hấp thu sắt
− Aerobactin

− Hấp thu sắt từ vật chủ

− Yersinabactin

− Sự tăng trưởng và nhân lên
nhanh chóng

Haemolysins
− Phát triển các tổn thương và tiền

− Haemolysin E

gửi fibrin trong túi không khí
− Tiêu hủy hồng cầu

− TSH
Hệ thống phòng thủ chống vật chủ

− Bảo vệ chống lại cơ chế diệt

− Các protein màng ngoài

− Protein Iss

khuẩn của máy chủ trong máu,

− Lipopolysaccharide complex

chủ yếu là do sự ức chế của hệ

− Vỏ K

thống cố định bổ sung

−

Sản xuất Colicin V
Độc tố và cytotoxins

− Độc tố ổn định nhiệt (EAST - 1)

− Vẫn chưa được hiểu rõ, có thể

− Độc tố Shiga (Stx2f)

gây trở ngại cho quá trình trao

− Cytotoxin (verotoxin)

đổi chất trong tế bào
− Không bào của tế bào

− Độc tố roi
(Dẫn liệu theo Janßen và ctv, 2003).
7


Ngoài ra, một số gene liên quan đến độc lực vi khuẩn E. coli gây bệnh trên gia
cầm đã được kiểm tra: gene adhesion (csgA, fimC, mat, tsh); một số gene mã hóa cho
sự hấp thu sắt(chuA, afa/ draB, bmaE, fyuA, ireA, iron, irp2, iucD, iutA, sit ep., sit
chr.); gene mã hóa cho khả năng phòng vệ và kháng huyết thanh (iss, neuC, kpsMTII,
ompA, traT; asta); gene độc tố vat, hlyA, gene liên quan đến khả năng xâm lấn (ibeA,
gimB, maIX) và gene mã hóa cho operon CoIV (cvi/cva). Ngoài ra, một số gene khác
cũng đã được xác định như focG, gafD, hrlA, papAH, papC, papEF, papG, sfaS (dẫn
liệu theo Antão và ctv, 2008).
2.1.2.3. Chẩn đoán bệnh
Những hình ảnh lâm sàng và/hoặc tổn thương sau khi chết thường cho thấy gà bị
nhiễm trùng E. coli, và sự phân lập E. coli từ các cơ quan tổn thương đặc trưng là
phương pháp chẩn đoán đã được áp dụng. Việc nuôi cấy cần được thực hiện từ những
mô bị ảnh hưởng như gan, lách, màng ngoài tim, và tủy để tránh lây nhiễm các vi sinh
vật đường ruột. Mẫu bệnh phẩm được cấy trên môi trường thạch Mac Conkey hoặc
môi trường thạch Eosin methylene blue (EMB).
Một chẩn đoán được cho là dương tính nếu các khuẩn lạc có màu sắc đặc trưng
của E. coli như màu hồng trên môi trường thạch Mac Conkey hoặc tím ánh kim trên
môi trường thạch EMB.
2.1.2.4. Phòng ngừa và điều trị
Do có nhiều chủng kháng nguyên E. coli nên việc phòng bệnh bằng vaccine ít có
hiệu quả. Quản lý tốt sẽ làm giảm lượng E. coli nhiễm nên ngừa được bệnh E. coli bộc
phát. Vệ sinh trứng ấp bằng thuốc sát trùng trứng, vệ sinh máy ấp, khu chăn nuôi.
Tăng cường vệ sinh chuồng trại, nuôi dưỡng chăm sóc nâng cao sức đề kháng, giảm
tối đa stress (như nhiệt độ cao, gió lùa, khí amoniac, mật độ nuôi quá dày, không đủ
thông thoáng, ...). Đồng thời hạn chế người ra vào nơi chăn nuôi và người ra vào cần

phải mặc quần áo bảo hộ để tránh làm phương tiện truyền vi khuẩn.
Sử dụng kháng sinh trong phòng trị bệnh, nhưng cần kiểm tra kháng sinh đồ
trước khi chọn loại kháng sinh để điều trị. Nó giúp chọn đúng loại kháng sinh và làm
giảm nguy cơ vi khuẩn kháng kháng sinh.

8


2.2. Thử độc lực trên trứng gà có phôi
Thử nghiệm trên phôi gà là thử nghiệm bằng sinh vật được dùng nhiều sau thử
nghiệm trên gà nhằm xác định độc lực của loài gây bệnh quan tâm. Trứng gà có phôi
thường được sử dụng trong sản xuất vaccine hoặc xác định độc lực vi-rút.
Đây là phương pháp tiện lợi, tiết kiệm kinh phí và có kết quả nhanh chóng. Lấy
trứng gà đã thụ tinh cho ấp ở 38oC, độ ẩm 60% tùy thuộc vào tác nhân muốn thử
nghiệm, đồng thời chọn tuổi phôi thích hợp thường 6 – 13 ngày tuổi và lựa chọn
đường tiêm thích hợp.
2.3. Động vật thí nghiệm
Đây là phương pháp cổ điển, đã được sử dụng từ lâu (Pasteur đã tiêm vi-rút dại
vào não thỏ) và ngày nay nó còn được ứng dụng để phân lập vi-rút, để nghiên cứu
bệnh lý, tác dụng gây bệnh trên cơ thể và các tổ chức riêng biệt, những đặc tính sinh
học của vi-rút, sản xuất vaccine. Việc sử dụng động vật thí nghiệm hiện nay không chỉ
được áp dụng cho vi-rút mà còn được sử dụng cho các nghiên cứu độc lực, dịch tễ của
vi khuẩn. Tuy nhiên phương pháp này còn tương đối cồng kềnh, mất nhiều thời gian,
không kinh tế và đặc biệt là dễ gây ô nhiễm và lây lan mầm bệnh.
Phương pháp này, dùng huyễn dịch bệnh phẩm nghi có tác nhân gây bệnh tiêm
cho động vật cảm thụ, sau một thời gian động vật cảm thụ sẽ có các biểu hiện lâm sàng
hoặc chết do tác nhân được tiêm. Căn cứ vào biểu hiện lâm sàng và bệnh tích đặc
trưng khi mổ khám, có thể kết luận sự có mặt của tác nhân gây bệnh. Nếu sau khi tiêm,
động vật không biểu hiện triệu chứng, người ta cũng giết động vật sau 5 – 10 ngày,
xem sự biến đổi trong phủ tạng qua đó phán đoán sự tồn tại của tác nhân tiêm vào.

Động vật thí nghiệm có thể thay đổi tùy theo tác nhân tiêm vào, có thể là chuột lang,
chuột bạch, thỏ,… Tùy theo tính chất gây bệnh và tùy theo mục đích công việc nghiên
cứu mà lựa chọn đường tiêm thích hợp nhất.
Để nghiên cứu E. coli gây bệnh trên gà, phương pháp này là hoàn toàn cần thiết
để có một mô hình lây nhiễm thích hợp. Động vật được dùng thử nghiệm cho tác nhân
gây bệnh này là gà. Tuy nhiên, quan trọng hơn là những yếu tố khác nhau cần được
xem xét khi thực hiện trong các thí nghiệm in vivo này bao gồm các loại gà được sử
dụng, tuổi và tính nhạy cảm của gà và liều sử dụng trong mô hình lây nhiễm.

9


2.4. Kĩ thuật PCR
Năm 1985, K. Mullis đã phát minh ra phương pháp đơn giản để khuếch đại
nhanh nhiều bản sao của các đoạn DNA mà không qua tạo dòng. Kĩ thuật này được
gọi là polymerase chain reaction (PCR), là phản ứng dây chuyền, được thực hiện trong
ống nghiệm plastis (Phạm Thành Hổ, 2008).
2.4.1. Nguyên tắc
PCR là kĩ thuật khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro do sự xúc tác
của enzyme DNA polymerase. Sự khuếch đại được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt
lặp lại (có thể từ 30 – 40 lần) gồm đun nóng (95oC), làm nguội (60 – 65oC), và ủ dài ở
72oC. Trong dung dịch có các primer (thường có 2 primer) bắt cặp bổ sung ở hai đầu
mạch đơn tương ứng.
2.4.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR
Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba
giai đoạn:
Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ tăng lên 94 – 96 °C để tách hai sợi DNA ra. Tại
nhiệt độ này, các phân tử DNA mạch kép bị tách ra, tạo nên các sợi đơn dùng để làm
khuôn tổng hợp sợi mới. Thời gian: 1 – 2 phút
Giai đoạn bắt cặp: Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để

mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn. Bước này gọi là gắn mồi. Nhiệt độ giai đoạn này
phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính 50 °C (45 – 60 °C).
Thời gian: 1 – 2 phút.
Giai đoạn kéo dài chuỗi: nâng nhiệt phản ứng lên 72oC để DNA – polymerase
tổng hợp sợi mới. Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA – polymerase và
chiều dài đoạn DNA cần khuếch đại.
2.4.3. Thành phần phản ứng
Thành phần của một phản ứng PCR bao gồm: Khuôn mẫu (đoạn DNA cần
khuếch đại, không cần độ tinh sạch cao), cặp primer (nhân tố khuếch đại, thường chứa
18 – 25 nucleotide), polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase) (giúp chịu được nhiệt độ
biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng), dNTPs (các loại
nucleotide triphosphate), dung dịch đệm (thường là MgCl 2 ).

10


2.4.4. Kiểm tra kết quả PCR
Sản phẩm của phản ứng PCR sẽ được phát hiện bằng phương pháp điện di. Điện
di là hiện tượng dịch chuyển của các vật thể mang điện tích dưới tác động của điện
trường.
Axit nucleic là một phân tử tích điện âm, vì vậy, chúng có thể dịch chuyển qua
bản gel từ cực âm sang cực dương dưới tác dụng của điện trường. Trên cùng một bản
gel, có cùng một dòng điện những phân tử khác nhau về trọng lượng nên chạy được
những quãng đường khác nhau sau một thời gian như nhau. Sau khi phân tách bằng
điện di, để phát hiện phân tử DNA người ta dùng phương pháp làm hiện hình. Đối với
gel agarose, người ta nhuộm bằng ethidium bromide. Chất này sẽ gắn xen vào các base
của phân tử DNA và phát quang dưới tia tử ngoại. Như vậy dễ dàng cho phép phát
hiện vị trí các đoạn DNA trên gel. Đối với gel polyacrylamide, các phân tử được đánh
dấu bằng đồng vị phóng xạ và vị trí của chúng sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật phóng
xạ tự ghi. Tùy thuộc kích thước DNA mà người ta chọn loại gel, nồng độ gel, loại đệm

(TBE hay TAE) (Lò Thanh Sơn, 2009).
2.5.

Nghiên cứu có liên quan
Wooley và ctv (2002) đã xác định độc lực của E. coli phân lập được từ gia cầm

thông qua tỉ lệ chết phôi gà. Kết quả cho thấy rằng, nếu tỉ lệ phôi gà 12 ngày tuổi
>29% thì chủng rất độc, 10-29% độc lực trung bình, <10% không có độc lực trong 2
ngày sau khi tiêm 100 vi khuẩn/trứng. Kết quả nghiên cứu này được áp dụng để kiểm
tra độc lực vi khuẩn E. coli phân lập được, làm cơ sở cho các bước kiểm tra độc lực
trên gà và kiểm tra gene liên quan độc lực bằng PCR trong nghiên cứu của chúng tôi.
Sharada và ctv (2010), phân lập, đặc điểm và tỉ lệ mẫu nhạy cảm với kháng sinh
của E. coli phân lập từ gia cầm. Kết quả cho thấy tỉ lệ phân lập thành công E. coli từ
các mẫu bệnh tích khác nhau từ gà bệnh và tỉ lệ đề kháng với kháng sinh của các mẫu
phân lập được.
Janßen và ctv (2003) đã sử dụng kĩ thuật multiplex – PCR cho phép phát hiện đặc
hiệu và nhạy với E. coli gây bệnh gia cầm. Nghiên cứu cho thấy, multiplex – PCR có
thể phát hiện đồng thời nhiều gene liên quan đến yếu tố độc lực hay gene độc lực, từ
đó dễ dàng phát hiện chủng E. coli gây bệnh trên gia cầm.

11


Antão và ctv (2008) đã sử dụng gà 5 tuần tuổi như một mô hình lây nhiễm tự
nhiên bệnh ngoài đường ruột gây ra bởi APEC. Nghiên cứu cho thấy có sự khác biệt
giữa chủng E. coli độc lực và không độc thông qua tỉ lệ chết gà thí nghiệm, triệu
chứng và bệnh tích quan sát.
Các công trình nghiên cứu trên đã xác định được tỉ lệ nhiễm E. coli trên gà, độc
lực vi khuẩn qua tiêm truyền trên phôi trứng và gà thí nghiệm, phát hiện một số gene
liên quan độc lực của E. coli gây bệnh trên gia cầm bằng multiplex – PCR, và tỉ lệ

nhạy cảm với kháng sinh của các mẫu phân lập được. Từ các công trình nghiên cứu
trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu xác định độc lực vi khuẩn E. coli phân lập được
từ túi khí gà bệnh qua gây nhiễm thử nghiệm trên phôi trứng 12 ngày tuổi và gà con 1
ngày tuổi, đồng thời xác định 2 gene liên quan độc lực E. coli gây bệnh bằng PCR và
kiểm tra kháng sinh đồ các gốc phân lập được.

12


Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.1. Thời gian
Thời gian nghiên cứu từ ngày 17/1/2011 đến tháng 7/2011
3.1.2. Địa điểm
Địa điểm lấy mẫu: Bệnh Viện Thú Y trường ĐH Nông Lâm TP. HCM.
Địa điểm xét nghiệm: Phòng Vi Sinh - Bệnh Viện Thú Y trường ĐH Nông Lâm
TP. Hồ Chí Minh.
Thử nghiệm độc lực vi khuẩn E. coli trên trứng thực hiện tại phòng Vi Khuẩn Truyền Nhiễm Khoa Chăn Nuôi Thú Y.
Xét nghiệm PCR thực hiện tại Bộ môn Nội Dược – Khoa Chăn Nuôi Thú Y –
ĐH Nông Lâm TP. HCM.
3.2.

Đối tượng và số lượng mẫu
Đối tượng: Gà bệnh từ tỉnh Bình Dương
Số lượng mẫu khảo sát : 35 mẫu túi khí của gà bệnh

3.3.

Nội dung nghiên cứu

3.3.1. Phân lập vi khuẩn E. coli trên gà bệnh
3.3.2. Thử kháng sinh đồ các gốc E. coli phân lập được
3.3.3. Thử nghiệm độc lực các gốc E. coli phân lập được trên phôi trứng gà và gà
thí nghiệm
3.3.4. Sử dụng kĩ thuật PCR để phát hiện một số gene độc lực của E. coli phân lập
được
3.4.

Phương pháp nghiên cứu
Gà bệnh được mổ khám, lấy túi khí từ những con gà có bệnh đem phân lập.

Khi đã có được các gốc E. coli, tiến hành kiểm tra kháng sinh đồ, xác định mức độc
lực của các gốc vi khuẩn qua gây nhiễm thực nghiệm trên trứng gà có phôi và gà thí
nghiệm, phát hiện một số gene độc lực bằng kỹ thuật PCR. Các bước tiến hành thí
nghiệm (hình 3.1)

13


Gà có bệnh tích điển hình

Túi khí

Gà có bệnh tích không điển
hình

Phân lập
Kháng sinh đồ

Các gốc E. coli

Phát hiện gene độc lực
bằng PCR

Tiêm vào
xoang niệu mô
Trứng gà có phôi 12
ngày tuổi
Phôi chết
Tái phân lập E. coli

Quan sát bệnh tích đại thể

Xác định độc lực
Tiêm dưới da cổ
Cho điểm

Tái phân lập E. coli

Gà con một ngày tuổi

Tỉ lệ gà chết

Gốc E. coli

Quan sát bệnh tích
đại thể

Xác định độc lực

Đánh giá khả năng gây bệnh gốc E. coli phân lập được

Hình 3.1 Sơ đồ các bước thử nghiệm độc lực vi khuẩn E. coli.
3.4.1. Phân lập vi khuẩn E. coli từ gà bị bệnh
3.4.1.1. Mục đích
Phân lập và đánh giá tình hình nhiễm vi khuẩn E. coli trên gà bệnh tại tỉnh
Bình Dương.

14