Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của florfenicol đối với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra tại Đồng Tháp và An Giang

1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ
KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG
LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
MÃ SỐ: 304
XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU CỦA
FLORFENICOL ĐỐI VỚI VI KHUẨN
Edwardsiella
ictaluri
GÂY BỆNH TRÊN
CÁ TRA TẠI ĐỒNG THÁP VÀ AN GIANG
SINH VIÊN THỰC HIỆN
PHẠM THỊ LINH MỤI
MSSV:06803021
Lớp NTTS K1
Cần Thơ, 2010
2
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ
KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG
LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
MÃ SỐ: 304
XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU CỦA
FLORFENICOL ĐỐI VỚI VI KHUẨN
Edwardsiella
ictaluri
GÂY BỆNH TRÊN
CÁ TRA TẠI ĐỒNG THÁP VÀ AN GIANG
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
Th.s LÂM PHÚC NHÂN PHẠM THỊ LINH MỤI

Ks. PHẠM THANH HƯƠNG MSSV:06803021
Lớp NTTS K1
Cần Thơ, 2010
3
XÁC NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
ĐẠI HỌC
Luận văn
: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của florfenicol đối với vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri
gây
bệnh trên cá tra tại Đồng Tháp và An Giang.
Sinh viên thực hiện
: PHẠM THỊ LINH MỤI
Lớp
: Nuôi trồng thủy sản K1
Đề tài được hoàn thành theo yêu cầu cuả cán bộ hướng dẫn và hội đồng bảo vệ luận văn đại học
Khoa Sinh Học Ứng Dụng – Đại Học Tây Đô.
Cần Thơ, ngày……tháng……năm…….
Cán bộ hướng dẫn Sinh viên thực hiện
ThS. LÂM PHÚC NHÂN PHẠM THỊ LINH MỤI
KS. PHẠM THANH HƯƠNG
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
PG.s. T.s. NGUYỄN VĂN BÁ
4
LỜI CẢM TẠ
Sau 3 tháng thực tập từ tháng 3 năm 2010 đến tháng 6 năm 2010 tại Chi Cục Thủy Sản Thành
Phố Cần Thơ, 168 Hai Bà Trưng, Phường Tân An -Quận Ninh Kiều-Thành Phố Cần Thơ, áp
dụng những kiến thức đã học kết hợp với kinh nghiệm thực tế, luận văn đã được chỉnh sữa và
hoàn thành.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với thầy Lâm Phúc Nhân và cô Phạm Thanh Hương

Phòng Thí Nghiệm Chi Cục Thủy Sản TP. Cần Thơ đã tận tình giúp đỡ cho em suốt thời gian
làm đề tài.
Em xin chân thành cám ơn quý thầy cô – Khoa Sinh Học Ứng Dụng – Trường Đại Học Tây Đô
đã tận tình dạy bảo, truyền đạt cho em những kiến thức qúy báu trong những năm học vừa qua,
tạo dựng hành trang để em bước vào cuộc sống sau này.
Xin cám ơn tất cả cô chú, anh chị trong Chi Cục Thủy Sản Thành Phố Cần Thơ đã tận tình chỉ
dẫn, giúp đỡ và đóng góp ý kiến bổ ích để hoàn thành thực tập tốt nghiệp.
Chân thành cám ơn tất cả các bạn trong lớp NTTS K1 trong thời gian qua luôn ủng hộ, động
viên để hoàn thành thực tập tốt nghiệp.
Em xin cám ơn Cha, mẹ, anh, em tôi đã luôn động viên và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập
và nghiên cứu.
Với sự hiểu biết còn hạn hẹp và thu thập tài liệu còn hạn chế nên báo cáo tốt nghiệp không
tránh khỏi sự sai sót. Kính mong được sự đóng góp ý kiến của quý thầy cô và các bạn.
Em xin chân thành cám ơn và ghi nhớ!
PHẠM THỊ LINH MỤI
5
CAM KẾT KẾT QUẢ
Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và kết
quả nghiên cứu này chưa được dùng cho bất kỳ luận văn cùng cấp nào khác.
PHẠM THỊ LINH MỤI
Ngày: ………………
6
TÓM TẮT
M
ụ
c tiêu c
ủ
a nghiên c
ứ
u là xác đ

ị
nh n
ồ
ng đ
ộ ứ
c ch
ế
t
ố
i thi
ể
u c
ủ
a thu
ố
c kháng sinh florfenicol lên
10 ch
ủ
ng vi khu
ẩ
n
Edwardsiella ictaluri
gây b
ệ
nh trên cá tra
ở
t
ỉ
nh An Giang và
Đồ

ng Tháp. K
ế
t
qu
ả
phân l
ậ
p ki
ể
m tra các ch
ỉ
tiêu c
ơ
b
ả
n và đ
ị
nh danh b
ằ
ng b
ộ
kit API 20E xác đ
ị
nh đ
ượ
c 10
ch
ủ
ng
E. ictaluri

gây b
ệ
nh gan th
ậ
n m
ủ
trên cá tra.
Để
đ
ạ
t đ
ượ
c m
ụ
c tiêu đ
ề
tài đ
ề
ra, ph
ươ
ng pháp
l
ậ
p kháng sinh đ
ồ ở
đ
ĩ
a kháng sinh th
ươ
ng m

ạ
i (30 µg) và đ
ĩ
a kháng sinh t
ự
t
ạ
o
ở
các n
ồ
ng đ
ộ
(50
µg, 70 µg, 90 µg, 110 µg, 130 µg, 150 µg) và ph
ươ
ng pháp pha loãng thu
ố
c kháng sinh trong môi
tr
ườ
ng l
ỏ
ng theo ph
ươ
ng pháp Broth (Geert Huys, 2002) nh
ằ
m xác đ
ị
nh đ

ộ
nh
ạ
y và giá tr
ị
MIC
c
ủ
a florfenicol lên 10 ch
ủ
ng vi khu
ẩ
n
E. ictaluri
trên.
K
ế
t qu
ả
kháng sinh đ
ồ
trên 10 ch
ủ
ng vi khu
ẩ
n
E. ictaluri
có 30% s
ố
ch

ủ
ng vi khu
ẩ
n nh
ạ
y v
ớ
i
đ
ĩ
a kháng sinh florfenicol 30 µg, 60% ch
ủ
ng vi khu
ẩ
n nh
ạ
y
ở
90 µg và 90% ch
ủ
ng vi khu
ẩ
n
nh
ạ
y v
ớ
i 110 µg. K
ế
t qu

ả
giá tr
ị
MIC là 30% nh
ạ
y
ở
2 µg/ml, 60% nh
ạ
y
ở
32 µg/ml, 100%
nh
ạ
y
ở
128 µg/ml. K
ế
t qu
ả
nghiên c
ứ
u cho th
ấ
y kháng sinh florfenicol còn nh
ạ
y v
ớ
i vi khu
ẩ

n
E. ictaluri
nh
ư
ng v
ớ
i n
ồ
ng đ
ộ
thu
ố
c kháng sinh cao h
ơ
n n
ồ
ng đ
ộ
florfenicol chu
ẩ
n.
T
ừ
khóa:
Edwardsiella ictaluri
, florfenicol, gan th
ậ
n m
ủ
, cá tra.

7
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM TẠ

i
CAM KẾT KẾT QUẢ

ii
TÓM TẮT

iii
MỤC LỤC

iv
DANH MỤC BẢNG

vi
DANH MỤC HÌNH

vii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

viii
CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ

1
1.1 Giới thiệu

1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

2
1.3 Nội dung nghiên cứu

2
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

3
2.1 Đặc điểm sinh học cá tra

3
2.2. Một số nghiên cứu trên vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri

3
2.2.1.
Đặ
c đi
ể
m sinh lý, sinh hóa c
ủ
a vi khu
ẩ
n
E. ictaluri

.3
2.2.2. Phổ loài cảm nhiễm và phân bố của vi khuẩn
E.ictaluri

4
2.2.3. Triệu chứng và bệnh tích của cá bệnh

4
2.2.4. Đường lây truyền

5
2.3 Sơ lược về thuốc kháng sinh

5
2.3.1 Đặc điểm của kháng sinh florfenicol

6
2.3.2 Những nghiên cứu về kháng sinh florfenicol trong điều trị
bệnh trên động vật thủy sản.

7
CHƯƠNG 3:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

9
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

9
3.2 Vật liệu nghiên cứu

9
3.2.1 Đối tượng thí nghiệm

9

3.2.2 Dụng cụ thí nghiệm

9
8
2.2.3 Hóa chất thí nghiệm

9
3.3. Phương pháp nghiên cứu

9
3.3.1. Ph
ươ
ng pháp thu m
ẫ
u b
ả
o qu
ả
n và v
ậ
n chuy
ể
n

9
3.3.2. Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn

10
3.3.3. Phương pháp kiểm tra kháng sinh đồ

11
3.3.4. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tôi thiểu (MIC)

12
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN

14
4.1 Kết quả thu mẫu cá tra

14
4.2 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn cá bệnh

15
4.2.1 Kết quả phân lập vi khuẩn và kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa

15
4.2.2. K
ế
t qu
ả
ki
ể
m tra các ch
ỉ
tiêu sinh hóa b
ằ
ng b
ộ
kít API 20E trên
vi khu

ẩ
n
E.ictaluri

17
4.3 Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ trên các chủng vi khuẩn
E. ictaluri

19
4.4 Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kháng sinh lên vi khuẩn
E. ictaluri

22
4.5 So sánh tính nh
ạ
y c
ủ
a vi khu
ẩ
n
E. ictaluri
ở
hai t
ỉ
nh An Giang và
Đồng Tháp

24
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

26
5.1 Kết luận

26
5.2 Đề xuất

26
TÀI LIỆU THAM KHẢO

27
PHỤ LỤC
9
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1.1 Dấu hiệu bệnh lý và đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri

14
Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra các đăc điểm hình thái, sinh hóa của vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri

17
Bảng 4.3 Kết quả test API 20E trên vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri
phân lập
từ cá tra

18
Bảng 4.4 Kết quả kháng sinh đồ của florfenicol ở nồng độ30 μg, 70 μg, 90 μg
và 110 μg lên chủng vi khuẩn E10068.

20
B
ả
ng 4.5 B
ả
ng Giá tr
ị
MIC c
ủ
a 10 ch
ủ
ng vi khu
ẩ
n
E. Ictaluri

23
10
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 2.1 Công th
ứ
c c
ấ
u t
ạ
o florfenicol

6

Hình 4.1: Cá bị bệnh gan thận mủ với nhiều đốm trắng ở gan, thận, tỳ

15
Hình 4.2: Khuẩn
Edwardsiella ictaluri
Phát triển trên môi trường TSA sau 48h,
kích thước li ti có màu trắng đục

16
Hình 4.3: Hình nhuộm Gram vi khuẩn
E. ictaluri
Gram âm (100X)

17
Hình 4.4: Bộ kit API 20E (A) và kết quả test các chỉ tiêu sinh hóa của vi khuẩn
E. ictaluri
sau 24 giờ (B)

19
Hình 4.5:
Đĩ
a kháng sinh
ở
n
ồ
ng đ
ộ
30
μ
g, 70

μ
g, 90
μ
g và 110
μ
g

22
Hình 4.6: K
ế
t qu
ả
giá tr
ị
MIC c
ủ
a kháng sinh florfenicol lên ch
ủ
ng
vi khu
ẩ
n E10077

24
Hình 4.7:
Đườ
ng kính vô trùng (mm) c
ủ
a vi khu
ẩ

n
E. ictaluri
phân l
ậ
p
ở
An (A)
Giang và
Đồ
ng Tháp (B) v
ớ
i đ
ĩ
a kháng sinh florfenicol th
ươ
ng m
ạ
i (30 µg)

25
Hình 4.8: Giá tr
ị
MIC c
ủ
a vi khu
ẩ
n
E. ictaluri
phân l
ậ

p
ở
An Giang (A) và
Đồ
ng Tháp (B)

26
11
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Đồng bằng sông cửu long ĐBSCL
Edwardsiella ictaluri E. ictaluri
Edwardsiella ictaluri
10058 E10058
Edwardsiella ictaluri
10059 E10059
Edwardsiella ictaluri
10063 E10063
Edwardsiella ictaluri
10064 E10064
Edwardsiella ictaluri
10066 E10066
Edwardsiella ictaluri
10068 E10068
Edwardsiella ictaluri
10073 E10073
Edwardsiella ictaluri
10074 E10074
Edwardsiella ictaluri
10075 E10075
Edwardsiella ictaluri

10077 E10077
Minimal inhibitory concentration MIC
Trytone Soya Agar TSA
Nutrient Agar NA
Mueller Hinton Agar MHA
Nutrient Broth NB
12
CH
ƯƠ
NG 1
ĐẶ
T V
Ấ
N
ĐỀ
1.1 Gi
ớ
i thi
ệ
u
Trong nhi
ề
u n
ă
m qua ngành th
ủ
y s
ả
n Vi
ệ

t Nam đã có nh
ữ
ng b
ướ
c phát tri
ể
n nhanh và
ổ
n đ
ị
nh góp
ph
ầ
n quan tr
ọ
ng vào s
ự
t
ă
ng tr
ưở
ng c
ủ
a n
ề
n kinh t
ế
qu
ố
c dân. T

ỷ
tr
ọ
ng c
ủ
a th
ủ
y s
ả
n trong
kh
ố
i nông, lâm và ng
ư
nghi
ệ
p và trong kinh t
ế
qu
ố
c dân t
ă
ng d
ầ
n qua các n
ă
m. Ngành th
ủ
y s
ả

n đã
tr
ở
thành ngành kinh t
ế
quan tr
ọ
ng, góp ph
ầ
n chuy
ể
n đ
ổ
i c
ơ
c
ấ
u nông nghi
ệ
p nông thôn, tham
gia xóa đói gi
ả
m nghèo, c
ả
i thi
ệ
n cu
ộ
c s
ố

ng c
ộ
ng đ
ồ
ng dân c
ư
.
Các đ
ố
i t
ượ
ng nuôi hi
ệ
n nay ch
ủ
y
ế
u là các loài cá n
ướ
c ng
ọ
t và tôm bi
ể
n.
Ở Đồ
ng B
ằ
ng Sông
C
ử

u Long đ
ố
i t
ượ
ng cá n
ướ
c ng
ọ
t đ
ượ
c nuôi nhi
ề
u nh
ấ
t là cá tra. Cá tra đ
ượ
c xem là m
ộ
t trong
nh
ữ
ng m
ặ
t hàng th
ủ
y s
ả
n xu
ấ
t kh

ẩ
u có th
ế
m
ạ
nh c
ủ
a Vi
ệ
t Nam. Tuy nhiên, trong hai n
ă
m tr
ở
l
ạ
i đây đã có nhi
ề
u d
ấ
u hi
ệ
u b
ấ
t
ổ
n xu
ấ
t hi
ệ
n trong quá trình nuôi và tiêu th

ụ
cá tra, mà d
ấ
u hi
ệ
u rõ nét
nh
ấ
t là s
ự
s
ụ
t gi
ả
m di
ệ
n tích nuôi và t
ổ
ng giá tr
ị
kim ng
ạ
ch xu
ấ
t kh
ẩ
u.
Theo báo cáo c
ủ
a C

ụ
c Th
ủ
y S
ả
n n
ă
m 2009 di
ệ
n tích nuôi tr
ồ
ng th
ủ
y s
ả
n toàn vùng phía Nam là
926.770 ha v
ớ
i s
ả
n l
ượ
ng đ
ạ
t 2.123.160 t
ấ
n, chi
ế
m 79,0% v
ề

di
ệ
n tích và 80,0% s
ả
n l
ượ
ng
c
ủ
a c
ả
n
ướ
c. Trong đó, riêng di
ệ
n tích nuôi cá tra là 6.788 ha v
ớ
i s
ả
n l
ượ
ng đ
ạ
t 998.255 t
ấ
n (
Đỗ
H
ả
i Linh, 2009).

Do nhu cầu cá tra xuất khẩu và tiêu thụ trong nước đều tăng cao, nên giải pháp quan
trọng để tạo thêm nhiều sản phẩm là nuôi công nghiệp tập trung. Tuy nhiên, môi
trường nuôi ngày càng biểu hiện xấu kết hợp với việc nuôi cá tra phát triển nhanh mà
không theo quy hoạch (số lượng chất hữu cơ thải trực tiếp ra môi trường là rất lớn so
với nuôi các đối tượng thủy sản khác) nên cá nuôi ngày càng phải chịu đựng với điều
kiện môi trường sống khắc nghiệt, bệnh dễ có điều kiện phát triển lây lan (Nguyễn
Quốc Thịnh, 2006).
Các bệnh thường xuất hiện trên cá tra nuôi hiện nay như: bệnh ký sinh trùng, các bệnh
nhiễm khuẩn như bệnh đốm đỏ, bệnh gan thận mủ, bệnh lở loét… Trong đó bệnh gan
thận mủ do Edwardsiella ictaluri được xem là bệnh nguy hiểm nhất vì gây chết rất
nhanh và tỉ lệ chết cao (Từ Thanh Dung và ctv, 2004). Trước đây, thuốc kháng sinh
chloramphenicol được người nuôi sử dụng nhiều trong việc điều trị bệnh gan thận mủ
trên cá tra do hiệu lực diệt khuẩn cao. Nhưng từ năm 2004 Bộ thủy sản Việt Nam đã
cấm sử dụng chloramphenicol trong nuôi trồng thủy sản vì chúng gây ra hiện tượng
thoái hóa tủy xương. Tuy nhiên, dẫn xuất Florinated của kháng sinh này đã được thay
thế là florfenicol và nhanh chóng được sử dụng phổ biến trong chăn nuôi và thủy sản.
13
Crumlish et al (2002) ghi nhận các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri nhạy hoàn
toàn với thuốc florfenicol. Sau thời gian nuôi nông dân sử dụng nhiều loại kháng sinh
kết quả đã hình thành Edwardsiella ictaluri kháng với florfenicol với tỷ lệ là 42,5%
(Nguyễn Hữu Thịnh và ctv, 2007).
Theo báo cáo Chi c
ụ
c Th
ủ
y S
ả
n Thành ph
ố
C

ầ
n Th
ơ
đã làm kháng sinh đ
ồ ở
n
ồ
ng đ
ộ
30

g/đ
ĩ
a, v
ớ
i
n
ồ
ng đ
ộ
này đã không kìm hãm đ
ượ
c s
ự
phát tri
ể
n c
ủ
a vi khu
ẩ

n
Edwardsiella ictaluri
nh
ư
ng
thông tin t
ừ
vài h
ộ
nuôi cá tra thì florfenicol v
ẫ
n còn dùng đ
ể
tr
ị
b
ệ
nh do vi khu
ẩ
n
Edwardsiella
ictaluri
nh
ư
ng ch
ư
a xác đ
ị
nh đ
ượ

c n
ồ
ng đ
ộ
t
ố
i thi
ể
u. Chính vì th
ế
đ
ề
tài “
Xác
đị
nh n
ồ
ng
độ ứ
c
ch
ế
t
ố
i thi
ể
u c
ủ
a florfenicol
đố

i v
ớ
i vi khu
ẩ
n
Edwardsiella ictaluri
gây b
ệ
nh trên cá tra t
ạ
i
Đồ
ng Tháp và An Giang
” đ
ượ
c th
ự
c hi
ệ
n là r
ấ
t c
ầ
n thi
ế
t.
1.2 M
ụ
c tiêu nghiên c
ứ

u
Xác đ
ị
nh hàm lu
ợ
ng
ứ
c ch
ế
t
ố
i thi
ể
u c
ủ
a florfenicol đ
ố
i v
ớ
i vi khu
ẩ
n
Edwardsiella ictaluri
gây
trên cá tra nh
ằ
m làm c
ơ
s
ở

cho vi
ệ
c ch
ọ
n l
ự
a hàm l
ượ
ng thu
ố
c florfenicol trong vi
ệ
c đi
ề
u tr
ị
b
ệ
nh gan th
ậ
n m
ủ
trên cá tra ngoài th
ự
c t
ế
hi
ệ
n nay.
1.3 N

ộ
i dung nghiên c
ứ
u
Phân l
ậ
p, đ
ị
nh danh vi khu
ẩ
n
Edwardsiella ictaluri
trên 10 m
ẫ
u cá tra b
ệ
nh.
L
ậ
p kháng sinh đ
ồ
10 ch
ủ
ng vi khu
ẩ
n trên v
ớ
i kháng sinh florfenicol.
Xác đ
ị

nh n
ồ
ng đ
ộ ứ
c ch
ế
t
ố
i thi
ể
u MIC (Minimal inhibitory concentration) c
ủ
a florfenicol đ
ố
i
v
ớ
i các ch
ủ
ng vi khu
ẩ
n trên.
14
CH
ƯƠ
NG 2
L
ƯỢ
C KH
Ả

O TÀI LI
Ệ
U
2.1
Đặ
c
đ
i
ể
m sinh h
ọ
c cá tra
B
ộ
siluriformes
H
ọ
Pangasidae Bleeker, 1858
Gi
ố
ng
Pangasianodon
Rainboth, 1996
Loài
P.hypophthalmus
Sauvage, 1878
Cá tra
Pangasianodon hypophthalmus
phân b
ố ở

l
ư
u v
ự
c sông Mekong, có m
ặ
t
ở
c
ả
4 n
ướ
c:
Vi
ệ
t Nam, Lào, Thái Lan và Campuchia.
Ở
n
ướ
c ta cá b
ộ
t và cá gi
ố
ng ch
ủ
y
ế
u v
ớ
t trên sông Ti

ề
n,
cá tr
ưở
ng thành ch
ỉ
th
ấ
y
ở
trong ao tù n
ướ
c đ
ọ
ng, nhi
ề
u ch
ấ
t h
ữ
u c
ơ
, oxy hòa tan th
ấ
p và có th
ể
nuôi v
ớ
i m
ậ

t đ
ộ
cao. Tu
ổ
i thành th
ụ
c: 3-4 n
ă
m tu
ổ
i. Cá có t
ậ
p tính di c
ư
ng
ượ
c dòng đi đ
ẻ
. Mùa
sinh s
ả
n c
ủ
a cá trên sông Mekong t
ậ
p trung t
ừ
tháng 5-7 (âm l
ị
ch) hàng n

ă
m. Trong t
ự
nhiên, cá tra
là loài
ă
n t
ạ
p, cá
ă
n đ
ượ
c mùn bã h
ữ
u c
ơ
, r
ễ
cây sinh v
ậ
t, rau qu
ả
, tôm tép, cua, côn trùng,
ố
c và cá
Cá 3 ngày tu
ổ
i
ă
n phiêu sinh đ

ộ
ng v
ậ
t (trích b
ở
i Nguy
ễ
n V
ă
n Th
ườ
ng, 2008). Cá tra là loài cá t
ố
c
đ
ộ
sinh tr
ưở
ng nhanh, sau 1 n
ă
m nuôi cá đ
ạ
t tr
ọ
ng l
ượ
ng 1–1,5 kg/con, trong nh
ữ
ng n
ă

m sau
cá l
ớ
n nhanh h
ơ
n, có th
ể
đ
ạ
t 25 kg
ở
cá 10 tu
ổ
i.
2.2 M
ộ
t s
ố
nghiên c
ứ
u trên vi khu
ẩ
n
Edwardsiella ictaluri
2.2.1
Đặ
c
đ
i
ể

m sinh lý, sinh hóa c
ủ
a vi khu
ẩ
n
E. ictaluri
Vi khu
ẩ
n
E. ictaluri
đ
ượ
c mô t
ả
b
ở
i Hawker
et al
(1981) là m
ộ
t loài đ
ặ
c tr
ư
ng thu
ộ
c nhóm
Enterobacteriaceae, là vi khu
ẩ
n Gram âm, hình que ng

ắ
n, kích th
ướ
c 0,75 x 1,5-2,5

m. Theo
k
ế
t qu
ả
nghiên c
ứ
u c
ủ
a Plumb (1993) thì vi khu
ẩ
n
E. ictaluri
c
ũ
ng có d
ạ
ng hình que th
ẳ
ng
nh
ỏ
nh
ư
ng kích th

ướ
c có thay đ
ổ
i 1

m x 2-3

m. Di đ
ộ
ng y
ế
u
ở
25-30
0
C, không di đ
ộ
ng
ở
nhi
ệ
t đ
ộ
cao, lên men glucose, không oxy hóa, ph
ả
n
ứ
ng catalase d
ươ
ng tính, âm tính trong

ph
ả
n
ứ
ng
ở
oxidase, phát tri
ể
n t
ố
t
ở
28
0
C và phát tri
ể
n y
ế
u
ở
37
0
C (T
ừ
Thanh Dung và
ctv
,
2004).
T
ừ

Thanh Dung và
ctv
(2004) vi khu
ẩ
n có th
ể
phân l
ậ
p t
ừ
m
ẫ
u cá b
ệ
nh (Gan, th
ậ
n, t
ỳ
t
ạ
ng) trên
môi tr
ườ
ng TSA (Trytone Soya Agar) ho
ặ
c NA (Nutrient Agar) sau 48 gi
ờ ở
28
0
C t

ạ
o thành
khu
ẩ
n l
ạ
c tr
ắ
ng đ
ụ
c.
Đặ
c đi
ể
m sinh hóa vi khu
ẩ
n
E. ictaluri
cho h
ầ
u h
ế
t các ph
ả
n
ứ
ng âm tính,
ch
ỉ
có 2 ph

ả
n
ứ
ng d
ươ
ng tính là Lysine và Gluose. Vi khu
ẩ
n
E. ictaluri
cho ph
ả
n
ứ
ng Indole và
H
2
S âm tính. Còn theo k
ế
t qu
ả
ki
ể
m tra API 20E c
ủ
a L
ươ
ng Tr
ầ
n Th
ụ

c
Đ
oan (2006) cho th
ấ
y
15
vi khu
ẩ
n
E. ictaluri
ph
ả
n
ứ
ng d
ươ
ng tính GLU (Glucose) còn các đ
ườ
ng khác MAN, INO,
SUR, RHA, SAC, MEL, AMY và ARA đ
ề
u âm tính, vi khu
ẩ
n còn cho ph
ả
n
ứ
ng âm tính v
ớ
i

ONPG, ADH, ODC, H
2
S, URE, TDA, IND, VP, GEL. Ngoài ra còn cho ph
ả
n
ứ
ng d
ươ
ng tính
v
ớ
i LDC và CIT.
2.2.2 Ph
ổ
loài c
ả
m nhi
ễ
m và phân b
ố
c
ủ
a vi khu
ẩ
n
E. ictaluri
Vi khu
ẩ
n
E. ictaluri

đ
ượ
c phân l
ậ
p đ
ầ
u tiên trên cá Nheo M
ỹ
b
ở
i Hawker (1979). Sau đó Austin
(1999) đã phát hi
ệ
n ra vi khu
ẩ
n này gây b
ệ
nh nhi
ễ
m trùng máu c
ấ
p tính trên cá Nheo M
ỹ
gây t
ỉ
l
ệ
hao
h
ụ

t cao, v
ớ
i tên là
Enteric Septicemia
of Catfish (ESC), gây thi
ệ
t h
ạ
i l
ớ
n cho ngành công nghi
ệ
p
nuôi cá nheo. N
ă
m 1985, Boonyaratpalin c
ũ
ng đã phát hi
ệ
n khu
ẩ
n
E.ictaluri
gây b
ệ
nh trên cá trê
tr
ắ
ng (
Clarias bactrachus

) và trong môi tr
ườ
ng n
ướ
c Thái Lan (trích d
ẫ
n b
ở
i Kasornchandra,
1987). N
ă
m 2003,
ở
Indonesia nhóm nghiên c
ứ
u c
ủ
a Yuasa
et al
c
ũ
ng l
ầ
n đ
ầ
u tiên ch
ứ
ng minh
Edwardsiella ictaluri
là tác nhân gây b

ệ
nh đ
ố
m tr
ắ
ng n
ộ
i t
ạ
ng cá tra.
Bệnh mủ gan do vi khuẩn E. ictaluri gây ra được phát hiện đầu tiên tại Việt Nam năm
1998 trên cá tra nuôi bè với dấu hiệu bệnh có nhiều nốt trắng trên gan (Ferguson et al,
2001). Đây là một bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng cho các hộ nuôi cá tra ở ĐBSCL.
Theo Từ Thanh Dung và ctv (2004) bệnh mủ gan xuất hiện ở các tỉnh nuôi cá tra thâm
canh phát triển mạnh như Vĩnh Long, Đồng Tháp và Cần Thơ. Tỉ lệ xuất hiện bệnh
mủ gan trên cá tra khoảng 61% (mô hình nuôi ao), 73,4% (mô hình nuôi bè) và 88% ở
mô hình nuôi đăng quầng (Trần Anh Dũng, 2005). Trong khi kết quả điều tra của
Nguyễn Chính (2005), tỉ lệ xuất hiện bệnh mủ gan trên cá nuôi ở An Giang và Cần
Thơ thì mô hình nuôi ao tỉ lệ xuất hiện là 82% và mức độ thiệt hại có thể lên đến 60-
80%, ở mô hình nuôi bè tỉ lệ xuất hiện là 100% và mức độ thiệt hại có thể xảy ra từ
80-90%.
2.2.3 Tri
ệ
u ch
ứ
ng và b
ệ
nh tích c
ủ
a cá b

ệ
nh
Vào nh
ữ
ng n
ă
m 2004, theo nghiên c
ứ
u c
ủ
a
Đỗ
Th
ị
Hòa và
ctv
cá b
ị
nhi
ễ
m vi khu
ẩ
n
E. ictaluri
thu
ờ
ng có bi
ể
u hi
ệ

n kém
ă
n ho
ặ
c b
ỏ ă
n, g
ầ
y y
ế
u, b
ụ
ng th
ườ
ng tr
ươ
ng to, xung quanh mi
ệ
ng
th
ườ
ng có nh
ữ
ng đám xu
ấ
t huy
ế
t. M
ộ
t s

ố
cá có m
ắ
t l
ồ
i, đ
ụ
c m
ộ
t hay c
ả
hai bên m
ắ
t (Nguy
ễ
n
H
ữ
u Th
ị
nh và
ctv
, 2007).
K
ế
t qu
ả
nghiên c
ứ
u mô h

ọ
c c
ủ
a Nguy
ễ
n Qu
ố
c Th
ị
nh và
ctv
(2004) cho th
ấ
y cá b
ệ
nh bi
ể
u hi
ệ
n
ở
các c
ơ
quan: Gan, th
ậ
n cá b
ị
s
ư
ng r

ấ
t to, th
ậ
n có hi
ệ
n t
ượ
ng nh
ũ
n, t
ỳ
t
ạ
ng s
ư
ng ít l
ớ
n. Trên
gan, th
ậ
n, t
ỳ
t
ạ
ng xu
ấ
t hi
ệ
n nhi
ề

u đ
ố
m tr
ắ
ng tròn, đ
ườ
ng kính kho
ả
ng 1-3 mm các c
ơ
quan này
to và có hi
ệ
n t
ượ
ng nh
ũ
n
ở
th
ậ
n. T
ỷ
l
ệ
ch
ế
t thay đ
ổ
i t

ừ
10-90% t
ổ
ng s
ố
cá nuôi trong bè. Ngoài
ra còn m
ộ
t s
ố
vùng b
ị
xung huy
ế
t đ
ộ
ng m
ạ
ch và t
ĩ
nh m
ạ
ch gan, nh
ữ
ng c
ụ
m vi khu
ẩ
n xu
ấ

t hi
ệ
n
ở
rìa các v
ế
t th
ươ
ng các v
ế
t ngo
ạ
i t
ử
t
ạ
o thành bó trên m
ẫ
u mô
ở
các c
ơ
quan gan, th
ậ
n và t
ỳ
t
ạ
ng.
16

Đặ
c bi
ệ
t là h
ệ
th
ố
ng mao m
ạ
ch, hi
ệ
n t
ượ
ng này làm cho t
ổ
ch
ứ
c gan s
ư
ng to.
Ở
th
ậ
n c
ũ
ng xãy
ra hi
ệ
n t
ượ

ng xung huy
ế
t. T
ỳ
t
ạ
ng là c
ơ
quan c
ũ
ng b
ị ả
nh h
ưở
ng tr
ầ
m tr
ọ
ng và có s
ự
xu
ấ
t
hi
ệ
n c
ủ
a nh
ữ
ng vùng ho

ạ
i t
ử
. S
ự
ho
ạ
i t
ử ở
t
ỳ
t
ạ
ng
ả
nh h
ưở
ng nghiêm tr
ọ
ng đ
ế
n h
ệ
mi
ễ
n d
ị
ch
c
ủ

a cá, do đây là c
ơ
quan ch
ủ
y
ế
u s
ả
n xu
ấ
t ra b
ạ
ch c
ầ
u do đó cá b
ệ
nh n
ặ
ng kháng th
ể
h
ầ
u nh
ư
không còn. Ngoài, th
ậ
n, gan, t
ỳ
t
ạ

ng, nh
ữ
ng c
ơ
quan khác nh
ư
mang, c
ơ
, tim không có nh
ữ
ng
bi
ế
n đ
ổ
i l
ớ
n khi cá b
ị
b
ệ
nh tr
ắ
ng gan. Tuy nhiên
ở
mang có hi
ệ
n t
ượ
ng s

ư
ng ph
ồ
ng và dính l
ạ
i
c
ủ
a các tia mang th
ứ
c
ấ
p (Nguy
ễ
n Qu
ố
c Th
ị
nh và
ctv
, 2004).
2.2.4
Đườ
ng lây truy
ề
n
Theo Shott và
et al
(1986) thì vi khu
ẩ

n
E. ictaluri
có th
ể
nhi
ễ
m cho cá b
ằ
ng hai đ
ườ
ng khác
nhau. Vi khu
ẩ
n trong n
ướ
c có th
ể
qua đ
ườ
ng m
ũ
i c
ủ
a cá xâm nh
ậ
p vào c
ơ
quan kh
ứ
u giác và di

chuy
ể
n vào dây th
ầ
n kh
ứ
u giác, sau đó vào não đ
ế
n s
ọ
và da.
E. ictaluri
c
ũ
ng có th
ể
xâm
nhi
ễ
m qua đ
ườ
ng tiêu hóa qua niêm m
ạ
c ru
ộ
t vào máu gây nhi
ễ
m trùng máu. B
ằ
ng đ

ườ
ng này thì vi
khu
ẩ
n vào mao m
ạ
ch trong bi
ể
u bì gây ho
ạ
i t
ử
và m
ấ
t s
ắ
c t
ố
c
ủ
a da. Cá da tr
ơ
n còn nhi
ễ
m
E.
ictaluri
qua đ
ườ
ng mi

ệ
ng gây nhi
ễ
m khu
ẩ
n ru
ộ
t. B
ệ
nh phát tri
ể
n gây viêm ru
ộ
t, viêm gan và viêm
c
ầ
u th
ậ
n trong vòng 2 tu
ầ
n khi nhi
ễ
m b
ệ
nh. Tóm l
ạ
i, vi khu
ẩ
n
E. ictaluri

có th
ể
xâm nh
ậ
p vào
c
ơ
th
ể
cá t
ừ
môi tr
ườ
ng n
ướ
c qua da, qua mang cá và mi
ệ
ng b
ằ
ng đ
ườ
ng th
ứ
c
ă
n gây b
ệ
nh m
ủ
gan (Trích b

ở
i Châu H
ồ
ng Thúy, 2008).
2.3 Sơ lược về thuốc kháng sinh
Khái niệm thuốc kháng sinh: Thuốc kháng sinh là các chất hữu cơ có cấu tạo hóa học
phức tạp, có nguồn gốc sinh học (do xạ khuẩn, vi khuẩn và nấm sinh ra), hay do con
người tổng hợp nên, có tác dụng một cách chuyên biệt trên một giai đoạn chủ yếu
trong chu trình biến dưỡng của các vi khuẩn (tác nhân kháng khuẩn) của nấm (tác
nhân kháng nấm) (Nguyễn Văn Cảnh, 2004). Hiện tượng kháng sinh được Alexender
Fleming phát hiện từ năm 1928 thông qua phát hiện qua chất penicillin do một loại
nấm có tên là penicillin notatum sản sinh ra. Đến năm 1940, người ta đã sản xuất
thành công penicillin, thử nghiệm trên động vật đã cho kết quả tốt, đến năm 1946 đã
sản xuất penicillin kết tinh, từ đó đã bắt đầu thời kỳ mới của kháng sinh (Prescott,
2000).
Trong nuôi trồng thủy sản việc sử dụng kháng sinh rất có hiệu quả trong các truờng
hợp nhiễm khuẩn, giúp đông vật thủy sản phục hồi lại chức năng sinh lý bình thường,
nâng cao tỉ lệ sống, nếu dùng kháng sinh đúng liều, đúng thuốc, đúng bệnh và đúng
thời gian. Nhưng khi sử dụng kháng sinh có tác dụng tiêu cực vốn có của nó, nếu lạm
dụng quá mức, sử dụng kháng sinh tùy tiện, thiếu hiểu biết có thể gây hậu quả nghiêm
trọng tác động đến môi trường sinh thái, ảnh hưởng đến vật nuôi thủy sản, gây hiện
tượng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh và ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Tuy
17
vậy, việc dùng thuốc, đặc biệt là lạm dụng thuốc đang phổ biến trong ngành công
nghiệp nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam và các nước trong khu vực có thể đã mang lại
hậu quả, các ảnh hưởng này càng nặng nề khi những người nông dân tham gia nuôi
trồng thủy sản có những hiểu biết rất khiêm tốn về hiệu quả và tác dụng phụ của từng
loại thuốc mà họ dùng hàng ngày (Bùi Thị Tho, 2003).
2.3.1 Đặc điểm của kháng sinh florfenicol
Trong những năm trước, hầu hết người chăn nuôi đều biết đến hiệu quả điều trị "thần

kỳ" của chloramphenicol một kháng sinh của nhóm phenicol, nhưng hiện nay
chloramfenicol đã cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản Việt Nam. Theo Dowling
(2006) vì chloramphenicol có độc tính rất mạnh và là nguyên nhân gây ra hiện tượng
thoái hóa tỷ xương. Tuy nhiên, dẫn xuất Florinated của kháng sinh này, đã được thay
thế là florfenicol và nhanh chóng được sử dụng phổ biến trong chăn nuôi và thực
phẩm, bao gồm ngành thủy sản (Dowling 2006; Michel et al, 2003; Wrzsinsk et al,
2005).
Công thức hóa học C
12
H
14
Cl
2
FNO
4
S (2,2-dichloro-N-((1R,2S)-3-fluoro-1-hydroxy-1-
(4-(methylsulfonyl)phenyl)propan-2-yl)ethanamide).
Đặ
c tính
Florfenicol tan t
ố
t trong dimethylformamide, methanol, ít tan trong acid acetic và khó tan
trong n
ướ
c (Zhejiang Hioar pharmaceutical Co.,LTD.) (Trích b
ở
i Lê Th
ị
C
ẩ

m Tú, 2009).
Công dụng của kháng sinh florfenicol
Florfenicol là kháng sinh th
ế
h
ệ
m
ớ
i nh
ấ
t c
ủ
a phenicol, thu
ố
c có tác d
ụ
ng kìm khu
ẩ
n nh
ư
ng
c
ũ
ng có tác d
ụ
ng di
ệ
t khu
ẩ
n trong m

ộ
t s
ố
tr
ườ
ng h
ợ
p v
ớ
i đi
ề
u ki
ệ
n nh
ấ
t đ
ị
nh v
ớ
i n
ồ
ng đ
ộ
cao
h
ơ
n. Thu
ố
c có tác d
ụ

ng
ứ
c ch
ế
vi khu
ẩ
n v
ớ
i n
ồ
ng đ
ộ
th
ấ
p, là m
ộ
t lo
ạ
i ph
ổ
r
ộ
ng tác d
ụ
ng lên
nhi
ề
u lo
ạ
i vi khu

ẩ
n Gram âm, Gram d
ươ
ng (Bùi Th
ị
Tho, 2003).
H
ì
nh
2.1
C
ô
ng
th
ứ
c
c
ấ
u
t
ạ
o
florfenicol
18
C
ơ
ch
ế
Florfenicol có hoạt tính chống lại sự phát triển của vi khuẩn bằng cách kết dính với
tiểu đơn vị 50S của ribosom, ngăn chặn cầu nối peptid giữa các acid amin. Vì vậy ức

chế sự tổng hợp protein làm cho vi khuẩn không còn khả năng phát triển và tồn tại
(Bùi Kim Tùng, 2001).
Cách dùng
Florfenicol có độ tồn dư thấp trong mô cơ. Dùng thuốc liều 10mg/kg thể trọng liên tục
12 ngày, khi ngưng sử dụng 7 ngày mức tồn dư trong cơ cá tra còn 0,222-0,109 ppm
(mức cho phép của Việt Nam và Mỹ là 1 ppm) (Schering Plough Animal Health
Comporation, 2005), sử dụng thuốc từ 7-10 ngày sẽ cho hiệu quả tốt, cá sẽ hồi phục
nhanh khi người nuôi thực hiện tốt khâu vệ sinh diệt mầm bệnh trong khu vực nuôi và
trong môi trường nước (Trích bởi Lê Thị Cẩm Tú, 2009).
2.3.2 Nh
ữ
ng nghiên c
ứ
u v
ề
kháng sinh florfenicol trong
đ
i
ề
u tr
ị
b
ệ
nh trên
độ
ng v
ậ
t th
ủ
y

s
ả
n
.
Ở
Th
ụ
y
Đ
i
ể
n, florfenicol là s
ự
l
ự
a ch
ọ
n đ
ầ
u tiên trong vi
ệ
c phòng tr
ị
b
ệ
nh cho cá b
ộ
t rainbow
trout do vi khu
ẩ

n
Flavobacterium psychrophilum
, cách s
ử
d
ụ
ng là tr
ộ
n vào th
ứ
c
ă
n (Michel
et al
,
2003). Theo Fukui
et al
(1987) (đ
ượ
c trích b
ở
i Michel
et al
, 2003) thì florfenicol đ
ượ
c xác đ
ị
nh
là đi
ề

u tr
ị
r
ấ
t hi
ệ
u qu
ả
trên đ
ộ
ng v
ậ
t th
ủ
y s
ả
n
ở
Nh
ậ
t B
ả
n,
ở
Ireland, florfenicol c
ũ
ng đ
ượ
c
khuy

ế
n cáo s
ử
d
ụ
ng đ
ể
đi
ề
u tr
ị
b
ệ
nh l
ở
loét trên cá da tr
ơ
n (ESC), b
ệ
nh trên cá h
ồ
i n
ướ
c ng
ọ
t gây
ra b
ở
i nhóm
Flavobacterium psychrophilum và Aeromonas salmonicidae

. Ngoài ra, kháng sinh
Aquaflor (50% florfenicol) đ
ượ
c khuy
ế
n cáo s
ử
d
ụ
ng v
ớ
i li
ề
u l
ượ
ng 20 mg/kg th
ể
tr
ọ
ng /ngày
(t
ươ
ng đ
ươ
ng 10mg/florfenicol/kg th
ể
tr
ọ
ng/ngày), dùng trong 10 ngày liên ti
ế

p cho cá da tr
ơ
n
(Kenilworth, 2004). Intervet Schering Plough animal health (2004) c
ũ
ng khuy
ế
n cáo s
ử
d
ụ
ng
florfenicol v
ớ
i li
ề
u 10mg/florfenicol/kg th
ể
tr
ọ
ng/ngày cá h
ồ
i do vi khu
ẩ
n
Aeormonas
salmonicida
(Trích d
ẫ
n b

ở
i Lê Th
ị
C
ẩ
m Tú, 2009). T
ươ
ng t
ự
, Bowker (2002) c
ũ
ng đi
ề
u tr
ị
hi
ệ
u qu
ả
b
ệ
nh trên cá h
ồ
i do vi khu
ẩ
n
Oncorhynchus clarki lewisi
và
Flavobacterium
psychrophilum

b
ằ
ng cách tr
ộ
n florfenicol vào th
ứ
c
ă
n v
ớ
i li
ề
u 10 mg/kg cá /ngày, cho
ă
n liên t
ụ
c
trong 10 ngày (Trích d
ẫ
n b
ở
i Lê Th
ị
C
ẩ
m Tú, 2009). C
ũ
ng li
ệ
u l

ượ
ng 10 mg/kg cá /ngày, cho
ă
n
liên t
ụ
c trong 10 ngày theo Gaunt
et al
(2004); Gaunt và
et al
(2006) đã xác đ
ị
nh là có hi
ệ
u qu
ả
đ
ể
kh
ố
ng ch
ế
vi khu
ẩ
n
E. ictaluri
gây b
ệ
nh ESC ph
ổ

bi
ế
n trên cá nheo.
19
Tính nh
ạ
y c
ủ
a thu
ố
c kháng sinh florfenicol c
ũ
ng đã đ
ượ
c xác đ
ị
nh trên m
ộ
t s
ố
m
ầ
m b
ệ
nh vi
khu
ẩ
n trên cá qua m
ộ
t s

ố
nghiên c
ứ
u nh
ư
Crumlish (2002) thì vi khu
ẩ
n
E. ictaluri
phân l
ậ
p
trên cá tra b
ệ
nh gan th
ậ
n m
ủ ở Đ
BSCL nh
ạ
y hoàn toàn v
ớ
i thu
ố
c kháng sinh florfenicol
(Crumlish, 2002 trích d
ẫ
n b
ở
i Nguy

ễ
n H
ữ
u Th
ị
nh và
ctv
2007). T
ươ
ng t
ự
nh
ư
k
ế
t qu
ả
trên,
nghiên c
ứ
u c
ủ
a T
ừ
Thanh Dung và
ctv
(2008) b
ằ
ng ph
ươ

ng pháp xác đ
ị
nh n
ồ
ng đ
ộ ứ
c ch
ế
t
ố
i
thi
ể
u (MIC
≤
0.25 µg/ml) thì tác gi
ả
cho r
ằ
ng thu
ố
c flofenicol còn nh
ạ
y hoàn toàn v
ớ
i vi khu
ẩ
n
E. ictaluri
phân l

ậ
p t
ừ
cá tra nuôi
ở Đ
BSCL thu t
ừ
nh
ữ
ng n
ă
m 2002-2005. Tuy nhiên, v
ớ
i k
ế
t
qu
ả
nghiên c
ứ
u c
ủ
a Châu H
ồ
ng Thúy (2008) thì có đ
ế
n 62,5% vi khu
ẩ
n
E. ictaluri

phân l
ậ
p t
ừ
cá
tra
ở
t
ỉ
nh Trà Vinh đã kháng v
ớ
i florfenicol (MIC
50
= 2 µg/ml và MIC
90
= 4 µg/ml).
Dù nh
ữ
ng nghiên c
ứ
u g
ầ
n đây cho th
ấ
y tính nh
ạ
y c
ủ
a thu
ố

c kháng sinh florfenicol b
ị
gi
ả
m so v
ớ
i
tr
ướ
c kia, nh
ư
ng theo s
ố
li
ệ
u đi
ề
u tra c
ủ
a Nguy
ễ
n T
ấ
n Duy Phong (2008) thì v
ẫ
n còn 50%
s
ố
h
ộ

nuôi cá tra
ở Đ
BSCL có s
ử
d
ụ
ng florfenicol trong đi
ề
u tr
ị
b
ệ
nh cá. Chính vì th
ế
, đ
ể
tránh
hi
ệ
n t
ượ
ng l
ờ
n thu
ố
c c
ủ
a vi khu
ẩ
n

E. ictauri
đ
ố
i v
ớ
i florfenicol x
ả
y ra thì c
ầ
n ph
ả
i tìm ra
li
ề
u l
ượ
ng s
ử
d
ụ
ng thu
ố
c florfenicol thích h
ợ
p nh
ấ
t đ
ể ứ
ng d
ụ

ng vào th
ự
c t
ế
tr
ị
b
ệ
nh cho cá
tra b
ệ
nh gan th
ậ
n m
ủ
.
20
CH
ƯƠ
NG 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Th
ờ
i gian và
đị
a
đ
i
ể
m nghiên c

ứ
u
Đề
tài đ
ượ
c th
ự
c hi
ệ
n t
ừ
tháng 03/2010 đ
ế
n tháng 06/2010
Đị
a đi
ể
m th
ự
c hi
ệ
n: Chi c
ụ
c Th
ủ
y s
ả
n Thành ph
ố
C

ầ
n Th
ơ
3.2 V
ậ
t li
ệ
u nghiên c
ứ
u
3.2.1
Đố
i t
ượ
ng thí nghi
ệ
m
Các ch
ủ
ng vi khu
ẩ
n
E.ictaluri
phân l
ậ
p t
ừ
cá tra (
Pangasianodon hypophthalmus
) b

ệ
nh đ
ượ
c
nuôi trên đ
ị
a bàn 2 t
ỉ
nh:
Đồ
ng Tháp, An Giang.
3.2.2 D
ụ
ng c
ụ
thí nghi
ệ
m
D
ụ
ng c
ụ
ti
ể
u ph
ẩ
u, khay m
ổ
, kéo, dao, que c
ấ

y, đèn c
ồ
n, gi
ấ
y, bút lông, pipet (100
μ
l, 1000
μ
l,
5 ml) chai n
ấ
u môi tr
ườ
ng (250 ml và 500 ml), đ
ĩ
a petri,
ố
ng nghi
ệ
m, g
ă
ng tay,
ố
ng tiêm, lame,
lamella, kính hi
ể
n vi
Gi
ấ
y nhôm, đ

ầ
u l
ọ
c, gi
ấ
y l
ọ
c, d
ụ
ng c
ụ
b
ấ
m gi
ấ
y l
ọ
c, t
ă
m bông ti
ệ
t trùng, bình x
ị
t c
ồ
n.
Các d
ụ
ng c
ụ

khác: N
ồ
i thanh trùng b
ằ
ng áp su
ấ
t (autoclave), t
ủ
c
ấ
y, t
ủ ấ
m, t
ủ
thanh trùng khô, t
ủ
l
ạ
nh, cân đi
ệ
n t
ử
(4 s
ố
l
ẻ
, Nh
ậ
t).
3.2.3 Hóa ch

ấ
t thí nghi
ệ
m
Môi tr
ườ
ng nuôi c
ấ
y vi khu
ẩ
n: Môi tr
ườ
ng Trypic Soy Agar (TSA), Nutrient Broth (NB),
Môi tr
ườ
ng Mueller Hinton Agar (MHA) (Hãng MERK).
Hóa ch
ấ
t nhu
ộ
m màu, Gram: Dung d
ị
ch Crytal violet, dung d
ị
ch Iodine, dung d
ị
ch
alcohol/acetone, dung d
ị
ch safanin. (Xem ph

ụ
l
ụ
c A.3)
Đĩ
a kháng sinh florfenicol th
ươ
ng m
ạ
i (30 µg) (Hãng OXOID), và đ
ĩ
a gi
ấ
y t
ự
t
ạ
o
ở
các n
ồ
ng đ
ộ
50
μ
g, 70
μ
g, 90
μ
g, 110

μ
g, 130
μ
g, 150
μ
g.(ph
ụ
l
ụ
c A.4).
Florfenicol 83,28% d
ạ
ng b
ộ
t, b
ộ
kit API 20E (Pháp).
Các lo
ạ
i hóa ch
ấ
t: C
ồ
n tuy
ệ
t đ
ố
i, n
ướ
c mu

ố
i sinh lý, c
ồ
n 70
0
C
3.3 Ph
ươ
ng pháp nghiên c
ứ
u
3.3.1 Ph
ươ
ng pháp thu m
ẫ
u b
ả
o qu
ả
n và v
ậ
n chuy
ể
n
Ph
ươ
ng pháp thu m
ẫ
u b
ệ

nh ph
ẩ
m cá
21
Mẫu cá được lấy khi cá còn sống hoặc mới chết không quá 10 phút.
Trong ao cá bệnh chọn số từ 3-5 (cá thịt), 5-7 (cá giống) có dấu hiệu bệnh lý đặc trưng
1-2 con cá khỏe.
Phương pháp bảo quản và vận chuyển mẫu.
Cá sống, cho nước vào không quá 1/3 túi nylon sau đó thả cá vào túi, bơm oxy và
buộc kín. Thời tiết nóng phải chuẩn bị một túi đá nhỏ đặt gần bọc cá. Trường hợp cá
chết (không quá 10 phút), cho cá vào mỗi túi nylon không chứa nước một mẫu cá,
buộc chặt và bảo quản lạnh.
Trong khi vận chuyển đặt mẫu trong phích lạnh. Mẫu được chuyển vào phòng thí
nghiệm, tiến hành phân tích trong vòng 24 giờ.
3.3.2 Ph
ươ
ng pháp phân l
ậ
p và
đị
nh danh vi khu
ẩ
n
Ph
ươ
ng pháp phân l
ậ
p vi khu
ẩ
n d

ự
a theo tài li
ệ
u Vi
ệ
n Nghiên C
ứ
u S
ứ
c Kh
ỏ
e
Độ
ng v
ậ
t Th
ủ
y
S
ả
n Thái Lan (AAHRI) (1993):
- Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường TSA (lấy mẫu bệnh phẩm trực tiếp từ gan,
thận, tỳ tạng).
- Ủ mẫu trong tủ ấm từ 48 giờ. Lặp lại thao tác này đến khi đạt đĩa cấy thuần.
- Quan sát hình d
ạ
ng màu s
ắ
c khu
ẩ

n l
ạ
c (Ph
ụ
l
ụ
c A.3).
- Nhu
ộ
m Gram, ph
ả
n
ứ
ng Oxydase, ph
ả
n
ứ
ng O/F và tính di đ
ộ
ng (Ph
ụ
l
ụ
c A.3).
Phương pháp định danh vi khuẩn bằng bộ kit API 20E (Biomerieus
®
SA 69280 marcy
I’Etoile-France).
- Cho một ít nước cất hoặc nước máy vào trong khay nhựa của bộ kit để giữ ấm
trong quá trình ủ trong tủ ấm. Đặt kit API vào khay nhựa.

- Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn: dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho
vào 5 ml nước muối sinh lý.
- Dùng dung dịch vi khuẩn cho vào đầy các ô CIT, VP và GEL.
- Tương tự cho vi khuẩn vào đầy phần tuýp các ô ADH, LCD, ODC, H
2
S và
URE, kế tiếp cho dầu paraffin vào đầy phần lõm các ô này. Tiếp theo dùng dung dịch
vi khuẩn cho vào đầy phần tuýp các ô còn lại.
- Đậy nắp khay và ủ trong tủ ấm ở 26-28
0
C.
- Đọc kết quả sau 48 giờ.
- Đọc kết quả:
 Kiểm tra và ghi nhận các chỉ tiêu không cần thêm thuốc thử.
22
 Các chỉ tiêu cần thêm thuốc thử:
 Cho một giọt thuốc thử TDA vào ô TDA, đọc kết quả sau vài giây.
 Cho một giọt thuốc thử IND vào ô IND, đọc kết quả sau vài giây. Cho
một giọt thuốc thử VP1 sau đó cho tiếp giọt thuốc thử VP2 vào ô VP,
đọc kết quả sau 10-15 phút.
 Trước khi đọc kết quả, bộ kit API 20E phải đạt tối thiểu 3 chỉ tiêu cho
kết quả dương tính. Ngược lại cần ủ mẩu thêm vài giờ.
 Sau khi cho thuốc thử vào thì đậy nắp khay nhựa lại.
 Khi đã cho thuốc thử vào các chỉ tiêu rồi thì không nên ủ lại trong tủ ấm.
 Kiểm tra kết quả test API 20E (Bảng A.2 và phụ lục A.3).
3.3.3 Ph
ươ
ng pháp ki
ể
m tra kháng sinh

đồ
Ph
ươ
ng pháp kháng sinh đ
ồ
d
ự
a theo ph
ươ
ng pháp c
ủ
a Vi
ệ
n Nghiên C
ứ
u S
ứ
c Kh
ỏ
e
Độ
ng V
ậ
t
Th
ủ
y S
ả
n Thái Lan (AAHRI) (1993).
Các b

ướ
c th
ự
c hi
ệ
n:
Dùng que c
ấ
y ti
ệ
t trùng l
ấ
y vi khu
ẩ
n cho vào
ố
ng nghi
ệ
m ch
ứ
a 5 ml n
ướ
c mu
ố
i sinh lý
ti
ệ
t trùng l
ắ
c đ

ề
u.
So màu quang ph
ổ ở
b
ướ
c sóng 590 nm và đi
ề
u ch
ỉ
nh m
ậ
t đ
ộ
vi khu
ẩ
n b
ằ
ng môi tr
ườ
ng
NB cho đ
ạ
t OD = 0.1+0.02 (kho
ả
ng 10
8
cfu/ml).
Dùng t
ă

m bông ti
ệ
t trùng nhúng vào trong
ố
ng nghi
ệ
m ch
ứ
a vi khu
ẩ
n và quét lên đ
ĩ
a agar đ
ể
kho
ả
ng 1 phút.
Dán các đ
ĩ
a kháng sinh vào đ
ĩ
a agar sao cho kho
ả
ng cách 2 đ
ĩ
a kháng sinh là 24 mm, kho
ả
ng
cách gi
ữ

a đ
ĩ
a kháng sinh và mép đ
ĩ
a petri là 10-15 mm. L
ậ
t đ
ĩ
a l
ạ
i và
ủ
trong t
ủ ấ
m
ở
nhi
ệ
t đ
ộ
28-30
0
C.
Đọ
c k
ế
t qu
ả
:
Sau 48 gi

ờ
xu
ấ
t hi
ệ
n các vòng tròn không có vi khu
ẩ
n phát tri
ể
n (vòng vô trùng)
ở
m
ỗ
i đ
ĩ
a kháng
sinh đo đ
ườ
ng kính c
ủ
a vòng vô trùng xác đ
ị
nh tính nh
ạ
y c
ả
m c
ủ
a vi khu
ẩ

n v
ớ
i kháng sinh.
3.3.4 Ph
ươ
ng pháp xác
đị
nh n
ồ
ng
độ ứ
c ch
ế
tôi thi
ể
u (MIC)
Phương pháp xác định MIC bằng phương pháp Broth (Geert Huys, 2002) có chỉnh sửa.
Ngày thứ nhất và thứ hai
Chuẩn bị: Đĩa TSA, Ống nghiệm 10 ml NB Chai 50 ml NB; Nước muối sinh 0.85%.
Nuôi vi khuẩn trên môi trường TSA, 48 giờ ở nhiệt độ 28
0
C bao gồm vi khuẩn cần
xác định MIC.
23
Kiểm tra sự thuần chủng của vi khuẩn bằng cách quan sát sự đồng nhất về hình
dạng, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc và nhuộm Gram.
Chọn 5 khuẩn lạc riêng lẻ trên đĩa TSA cho vào ống nghiệm chứa 10 ml NB, ủ ở
28
0
C, 48 giờ.

Ngày thứ ba
Pha thuốc: Pha hai ống nghiệm thuốc gốc, mỗi ống 50 ml (là thuốc kháng sinh hay
thuốc cần khảo nghiệm) (ống thứ nhất có hàm lượng thuốc là 1024 ppm và ống thứ
hai có hàm lượng thuốc là 256 ppm). Thuốc phải được pha bằng Ethanol.
Pha loãng thuốc với độ pha loãng hai lần từ 2-1024 ppm trong ống nghiệm 50 ml.
Hàm lượng thuốc 512 và 256 ppm được pha từ ống thuốc gốc thứ nhất (1024 ppm)
bằng cách thêm nước muối sinh lý. Hàm lượng thuốc 128, 64, 32, 16, 8, 4 và 2 ppm
được pha từ ống gốc thứ 2 (256 ppm) (Phụ lục A.4 Bảng A.3).
Lắc đều dung dịch thuốc trước khi pha loãng ở nồng độ tiếp theo. Điều cần chú ý là
ở mỗi độ pha loãng, hàm lượng thuốc sẽ giảm đi phân nữa sau khi cho dung dịch vi
khuẩn vào.
Đo mật độ vi khuẩn
Đo mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 590 nm và điều
chỉnh mật độ vi khuẩn bằng môi trường NB cho đạt OD = 0.1+0.02 (Khoảng 10
8
cfu/ml).
Lưu ý: đối chứng sử dụng khi so màu là môi trường NB, không dùng nước cất và
không nên cho khuẩn vào thuốc lâu hơn 1 giờ sau khi đo mật độ.
Cho 2ml vi khuẩn, đã điều chỉnh mật độ vào mỗi ống nghiệm có hàm lượng thuốc
từ 2-1024 ppm (Bảng A.2 và phụ lục A.4). Lắc đều dung dịch vi khuẩn trước khi cho
vào các ống nghiệm có thuốc.
Mỗi lần xác định MIC cần phải có: Đối chứng âm (2 ml NB + 2 ml nước cất); đối
chứng dương (2 ml vi khuẩn + 2 ml nước cất).
Tất cả các ống nghiệm được ủ ở 28°C trong 48 giờ.
Mỗi chủng vi khuẩn sau khi điều chỉnh mật độ được cấy lên môi trường TSA để
kiểm tra sự thuần chủng và được ủ trong cùng điều kiện với các ống MIC.
Ngày thứ 4: Đọc kết quả
Kiểm tra sự thuần chủng của chủng vi khuẩn xét nghiệm trên đĩa TSA. Nếu phát
hiện thấy có sự tạp nhiễm thì không đọc kết quả MIC.
Sự phát triển của vi khuẩn được xác định bằng cách so sánh độ đục của mỗi ống

MIC với ống đối chứng âm và dương.
24
Giá trị MIC được xác định là hàm lượng thuốc trong ống nghiệm đầu tiên không có vi
khuẩn phát triển. Trường hợp vi khuẩn phát triển ở tất cả các nồng độ thì giá trị MIC
được xác định ở ống nghiệm có hàm lượng thuốc mà sự phát triển của vi khuẩn giảm
khoảng 80% so với ống trước đó.
25
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả thu mẫu cá tra
Dấu hiệu bên ngoài
Cá tra khỏe có màu sắc tươi sáng, da trơn láng, cơ thể cân đối thường có màu xanh
đen trên lưng và phần đầu, ở phần bụng có màu trắng sữa, các tia vây có màu hồng
không sơ xác. Các cơ quan nguyên ven không có vết loét, hậu môn, mang cá có màu
đỏ tươi, cá bơi lội linh hoạt, phản ứng linh hoạt. Kết quả này phù hợp với nhận định
của Dương Nhựt Long (2003).
Qua kết kiểm tra ban đầu cho thấy cá bệnh gan thận mủ có dấu hiệu bên ngoài không
rõ ràng, một số trường hợp da cá bị tái lại, cá bơi lội chậm chập, cá kém ăn hoặc bỏ ăn,
thường xung quanh miệng, mắt, thường xuất huyết (Bảng 4.1). Quan sát này phù hợp
với mô tả cá tra bệnh gan thận mủ của Đỗ Thị Hòa và ctv (2004). Ngoài ra theo
Nguyễn Hữu Thịnh và ctv (2007) cá bệnh gan thận mủ còn có một số biểu hiện như
:
mắt lồi, đục một hay cả hai bên mắt.
Bảng 4.1: Dấu hiệu bệnh lý và đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
KH Vi
khuẩn
Dấu hiệu bệnh lý Mô tả khuẩn lạc
E10058 Phù đầu xuất huyết, gan
thận, tỳ tạng nhiều đốm trắng
Tròn nhỏ, trắng đục

E10059 Xuất huyết vi, nhiều đốm
trắng ở gan, thận, tỳ tạng, thận nhũn
Tròn nhỏ, trắng đục
E10063 Xuất hiện nhiều đốm trắng ở gan, thận, tỳ tạng. Tròn nhỏ, trắng đục
E10064 Xuất huyết quanh mắt, thận, tỳ tạng
nhiều đốm trắng
Tròn nhỏ, trắng đục
E10066 Phù đầu, phù mắt xuất huyết, gan, thận nhiều
đốm trắng
Tròn nhỏ, trắng đục
E10068 Thận, gan, tỳ tạng nhiều đốm trắng Tròn nhỏ, trắng đục
E10073 Gan, thận, tỳ tạng nhiều đốm trắng Tròn nhỏ, trắng đục
E10074 Bên ngoài nhợt nhạt, gan thận nhiều đốm trắng. Tròn nhỏ, trắng đục
E10075 Gan, thận, tỳ tạng sưng to có nhiều đốm trắng Tròn nhỏ, trắng đục
E10077 Gan, tỳ tạng, thận nhũn có nhiều đốm trắng Tròn nhỏ, trắng đục