KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÊN MEN ETHANOL TỪ HẠT NHÃN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÊN MEN ETHANOL
TỪ HẠT NHÃN

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: TRẦN NGUYỄN ANH QUANG

Niên khóa

: 2007 – 2011

Tháng 07/2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÊN MEN ETHANOL

TỪ HẠT NHÃN

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. NGUYỄN MINH HIỀN

TRẦN NGUYỄN ANH QUANG

Tháng 07/2011


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Minh Hiền đã trực tiếp hướng
dẫn, hết lòng giúp đỡ, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm để em có thể hoàn thành đề
tài tốt nghiệp của mình.
Xin gửi lời cảm ơn đến anh Nguyễn Phan Thành, quản lý phòng thực nghiệm di
truyền phân tử thuộc Bộ môn Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ về hóa chất, trang thiết
bị để em thực hiện đề tài tốt nghiệp.
Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến những người trong gia đình, đặc biệt là cha
mẹ đã sinh thành, dạy dỗ, tạo điều kiện tốt nhất trong cuộc sống cũng như trong quá
trình học tập, giúp con có được sự trưởng thành ngày hôm nay.
Xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ
Chí Minh, đặc biệt là các thầy cô thuộc Bộ môn Công nghệ Sinh học đã truyền đạt
kiến thức, kỹ năng cũng như đã tạo điều kiện thuận lợi cho em được học tập và rèn
luyện trong suốt thời gian học đại học.
Cuối cùng, không quên gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp DH07SH, đặc biệt là các
thành viên nhóm 3n, các bạn luôn gắn bó cả trong học tập và vui chơi, chia sẻ cùng
nhau không chỉ là kiến thức mà còn là những niềm vui, nỗi buồn trong suốt quãng đời

sinh viên.
Chúc mọi người luôn may mắn, thành công và hạnh phúc!
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 07 năm 2011

Trần Nguyễn Anh Quang

i


TÓM TẮT
Đề tài: “Khảo sát khả năng lên men ethanol từ hạt nhãn”.
Nhãn (Dimocarpus longan Lour) được trồng rộng rãi ở Việt Nam. Hạt nhãn là
phụ phẩm của ngành công nghiệp chế biến nhãn (nhãn khô, nhãn đóng hộp). Hạt nhãn
có hàm lượng carbohydate cao. Trong hạt nhãn khô có khoảng 40 - 60% tinh bột,
6,96% cellulose. Khi ngành công nghiệp chế biến nhãn phát triển, hạt nhãn trở thành
một nguồn gây ô nhiễm môi trường. Do đó, nghiên cứu tận dụng hạt nhãn để lên men
ethanol góp phần tạo ra một sản phẩm hữu ích đồng thời giảm ô nhiễm môi trường.
Tiến trình gồm 2 bước: thủy phân với enzyme (bước 1) và lên men ethanol (bước
2). Giai đoạn thủy phân cellulose được thực hiện với 0,1% (w/v) Celluclast 1,5L ở pH
4,5, 50oC trong 20 phút, sau đó dịch hóa với 0,1% (w/v) Termamyl 120L ở pH 5,5,
95°C trong 120 phút rồi đường hóa với 0,14% (w/v) AMG 300L ở pH 4,5, 60°C trong
150 phút. Celluclast 1,5L làm tăng hàm lượng đường khử và rút ngắn thời gian thủy
phân. Sau quá trình thủy phân, hàm lượng đường khử tăng từ 7,27 g/l lên 95,46 g/l.
Trong giai đoạn lên men, ảnh hưởng của 6 chủng Saccharomyces cerevisiae (S.c) (S.c
W7, S.c SLS, S.c LVC, S.c TVA, S.c F28, S.c LV7) được nghiên cứu. S.c SLS tốt hơn
những chủng khác. Nồng độ ethanol sau 72 giờ lên men là 4,31% (v/v), hiệu suất lên
men là 46,7%.

ii

SUMMARY
Theme: “Examination the ability of ethanol fermentation from longan seeds”
Longan (Dimocarpus longan Lour) is widely grown in Vietnam. Longan seeds
are byproduct of the industrial longan processing (dried and canned longan). Seeds
have high carbohydrate content. In dried seeds have about 40 - 60% starch, 6,96%
cellulose. Since the industrial longan processing has developed, seeds become one of
the sources of environmental pollution. Therefore, studying on utilizing longan seed to
ferment ethanol contributed creating one of the useful products as well as reducing
environmental problem of longan processing.
The procedure included 2 steps: enzymatic hydrolysis (step 1) and ethanol
fermentation (step 2). The cellulose hydrolysis stage was excuted with 0,1% (w/v)
Celluclast 1,5L at pH 4,5 and 50oC for 20 minutes, the gelatinizing stage was excuted
with 0,1% (w/v) Termamyl 120L at pH 5,5 and 95°C for 120 minutes while the
saccharization stage with 0,14% (w/v) AMG 300L at pH 4,5 and 60°C for 150
minutes. Celluclast 1,5L enhanced the reducing sugar and decreased time for
enzymatic hydrolysis. After hydrolysis stage, the reducing sugar increased from 7,27
gL-1 to 95,46 gL-1. In the fermentation, the effect of 6 Saccharomyces cerevisiae (S.c)
strains (S.c W7, S.c SLS, S.c LVC, S.c TVA, S.c F28, S.c LV7) was investigated. S.c
SLS was better than other strains. The ethanol concentration after 72 hours fermenting
was 4,31% (v/v), the productivity of fermentation achieved 46,7%.
Keywords: ethanol, longan seed, Saccharomyces cerevisiae, hydrolysis.

iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ...............................................................................................................i
Tóm tắt ................................................................................................................... ii

Summary ............................................................................................................... iii
Mục lục ..................................................................................................................iv
Danh sách các chữ viết tắt.......................................................................................vi
Danh sách các bảng ...............................................................................................vii
Danh sách các hình .............................................................................................. viii
Chương 1 MỞ ĐẦU ................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ....................................................................................................1
1.2. Nội dung nghiên cứu và yêu cầu của đề tài ...................................................1
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................3
2.1. Tổng quan về nhãn, nguyên liệu chính sử dụng trong đề tài .........................3
2.1.1. Đặc điểm thực vật học, nguồn gốc và phân bố .......................................3
2.1.1.1. Đặc điểm thực vật học ....................................................................3
2.1.1.2. Nguồn gốc và phân bố ....................................................................4
2.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ nhãn trên thế giới và tại Việt Nam ..........4
2.1.3. Thành phần hóa học chính của hạt nhãn.................................................5
2.1.4. Một số nghiên cứu về hạt nhãn trên thế giới và Việt Nam......................5
2.2. Kỹ thuật sản xuất rượu ethylic ......................................................................6
2.2.1. Giới thiệu chung về rượu ethylic............................................................6
2.2.2. Cellulose và quá trình thủy phân cellulose bằng cellulase ......................7
2.2.3. Tinh bột và quá trình thủy phân tinh bột bằng enzyme...........................8
2.2.3.1. Tinh bột và cấu trúc của tinh bột.....................................................8
2.2.3.2. Các phương pháp thủy phân tinh bột ..............................................9
2.2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme.................................11
2.2.4. Quá trình lên men dịch đã thủy phân ...................................................13
2.2.4.1. Nấm men Saccharomyces cerevisiae ............................................13
2.2.4.2. Quá trình lên men .........................................................................14
iv


2.2.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ................................15

2.2.5. Chưng cất và tinh chế cồn....................................................................17
2.3. Các nghiên cứu liên quan đến lĩnh vực của đề tài........................................17
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................21
3.1. Địa điểm và thời gian thực hiện ..................................................................21
3.1.1. Địa điểm thực hiện ..............................................................................21
3.1.2. Thời gian thực hiện..............................................................................21
3.2. Vật liệu - Hóa chất thí nghiệm ....................................................................21
3.3. Thiết bị - Dụng cụ.......................................................................................22
3.4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................22
3.4.1. Thí nghiệm 1: ảnh hưởng của cellulase (Celluclast 1,5L) tới................22
3.4.2. Thí nghiệm 2: hiệu quả của quá trình thủy phân dịch bột hạt nhãn.......23
3.4.3. Thí nghiệm 3: ảnh hưởng của các dòng men Saccharomyces ...............24
3.5. Phương pháp xử lý số liệu ..........................................................................25
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...............................................................26
4.1. Kết quả thí nghiệm 1...................................................................................26
4.2. Kết quả thí nghiệm 2...................................................................................27
4.3. Kết quả thí nghiệm 3...................................................................................30
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................34
5.1. Kết luận ......................................................................................................34
5.2. Đề nghị.......................................................................................................34
Tài liệu tham khảo .................................................................................................36

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ctv: cộng tác viên
CU: cellulase unit
DP: degree of polymerisation
ĐVHĐ: đơn vị hoạt động

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Một số thành phần hóa học trong hạt nhãn ...............................................5
Bảng 2.2 Nhiệt độ và pH tối ưu của một số chế phẩm enzyme thương mại............12
Bảng 2.3 Ảnh hưởng của sự xử lý enzyme khi thủy phân bã khoai mì ...................18
Bảng 3.1 Tỷ lệ Celluclast 1,5L khảo sát ở các nghiệm thức ...................................22
Bảng 3.2 Tỷ lệ các enzyme sử dụng ở các nghiệm thức .....................................23
Bảng 4.1 Tóm tắt các bước xử lý enzyme trong thí nghiệm 2 ................................28

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Chùm nhãn, trái nhãn, cơm nhãn và hạt nhãn................................................ 3
Hình 2.2 Quy trình sản xuất rượu ethylic từ nguyên liệu tinh bột ................................ 7
Hình 2.3 Quá trình thủy phân cellulose bằng cellulase ................................................ 8
Hình 2.4 Amylose và amylopectin .............................................................................. 9
Hình 2.5 Nấm men Saccharomyces cerevisiae .......................................................... 13
Hình 3.1 Hạt nhãn ..................................................................................................... 21
Hình 3.2 Bột hạt nhãn ............................................................................................... 21
Hình 4.1 Ảnh hưởng của Celluclast 1,5L đến biến thiên hàm lượng đường khử ........ 26
Hình 4.2 Ảnh hưởng của việc thủy phân dịch bột hạt nhãn bằng các enzyme ............ 28
Hình 4.3 Ảnh hưởng của các dòng men Saccharomyces cerevisiae đến .................... 30
Hình 4.4 Ảnh hưởng của các dòng men Saccharomyces cerevisiae đến .................... 31
Hình 4.5 Ảnh hưởng của các dòng men Saccharomyces cerevisiae đến .................... 31

Hình 5.1 Quy trình đề nghị lên men ethanol từ hạt nhãn ở quy mô phòng. ................ 35

viii


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ethanol thường được biết là đồ uống có cồn, nay đang được xem là nguồn nhiên
liệu sinh học và được sử dụng ngày càng nhiều vì sự thân thiện với môi trường.
Nguyên liệu để sản xuất ethanol hiện nay là những nguyên liệu truyền thống như
gạo, tấm, sắn, ... Các nhà sản xuất đã và đang ra sức tìm kiếm nguồn nguyên liệu thay
thế để làm giảm giá thành sản xuất, tăng tính cạnh tranh của ethanol với xăng, dầu.
Một trong những hướng đi đầy hứa hẹn là tận dụng những nguồn nguyên liệu thô giá
rẻ có chứa đường hoặc những thành phần có thể chuyển đổi thành đường (tinh bột,
cellulose, …).
Nhãn là cây ăn quả có tính thích ứng rộng, được trồng khắp nơi trong cả nước.
Nhãn có giá trị kinh tế cao và là một loại quả quý trong tập đoàn giống cây ăn quả ở
nước ta. Cơm nhãn được dùng để ăn tươi và được sử dụng trong công nghiệp chế biến
thực phẩm như: đóng hộp, đông lạnh, sấy khô. Hạt nhãn được xem là nguồn phế thải
của ngành công nghiệp chế biến nhãn (nhãn sấy, nhãn đóng hộp, …). Ở các cơ sở sấy
nhãn chỉ một phần nhỏ hạt nhãn được sử dụng làm thức ăn gia súc hay chất đốt, phần
lớn hạt nhãn bị đổ đi, gây ô nhiễm môi trường. Trong khi đó, hàm lượng tinh bột trong
hạt nhãn khá cao, chiếm khoảng 40 - 60% (Trần Quốc Việt và ctv, 2005). Hạt nhãn lại
là một nguồn nguyên liệu dễ dàng vận chuyển và bảo quản. Như vậy, việc sản xuất
ethanol từ hạt nhãn là có cơ sở thực hiện. Trên cơ sở đó, đề tài: “Khảo sát khả năng lên
men ethanol từ hạt nhãn” được thực hiện.
1.2. Nội dung nghiên cứu và yêu cầu của đề tài
Nội dung nghiên cứu:
- Khảo sát quá trình thủy phân bột hạt nhãn bằng các enzyme cellulase, αamylase, glucoamylase.
- Khảo sát quá trình lên men dịch hạt nhãn đã thủy phân bằng các dòng men

Saccharomyces cerevisiae.
Yêu cầu của đề tài:
1


- Xác định được hiệu quả của việc thủy phân bột hạt nhãn bằng các enzyme
cellulase, α-amylase, glucoamylase, từ đó đưa ra quy trình thủy phân thích hợp.
- Trong số các dòng men Saccharomyces cerevisiae khảo sát, chọn được dòng
men thích hợp nhất để lên men dịch hạt nhãn đã thủy phân.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về nhãn, nguyên liệu chính sử dụng trong đề tài
2.1.1. Đặc điểm thực vật học, nguồn gốc và phân bố
2.1.1.1. Đặc điểm thực vật học
Nhãn có tên khoa học là Dimocarpus longan Lour, thuộc họ Bồ hòn Sapindaceae.

Hình 2.1 Chùm nhãn, trái nhãn, cơm nhãn và hạt nhãn
( />Cây nhãn cao 5 - 10 m. Vỏ cây xù xì, có màu xám. Thân nhiều cành, lá um tùm
xanh tươi quanh năm. Lá kép hình lông chim, mọc so le. Mùa xuân vào các tháng 2, 3,
4 ra hoa màu vàng nhạt, mọc thành chùm ở đầu cành hay kẽ lá. Quả tròn, vỏ ngoài
màu vàng xám, hầu như nhẵn. Hạt đen nhánh, có áo hạt màu trắng bao bọc. Mùa quả
vào khoảng tháng 7 - 8. Cây nhãn tương đối chịu rét hơn so với các cây cùng họ như
vải, đồng thời cũng ít kén đất hơn ( Nhãn dễ trồng,
mọc nhanh, thích hợp với đất thịt pha cát, nơi có lớp đất canh tác sâu. Có thể trồng
bằng hạt, bằng cành chiết hay ghép cây. Khoảng 4 - 5 năm thì có quả, thời gian cho
quả cũng rất lâu ( />3

2.1.1.2. Nguồn gốc và phân bố
Nhiều nhà nghiên cứu cho rằng cây nhãn có nguồn gốc từ miền Nam Trung
Quốc. Tới nay, Trung Quốc cũng là nước có diện tích trồng nhãn lớn và sản lượng vào
loại hàng đầu. Nhãn còn được trồng nhiều ở Thái Lan, Ấn Độ, Malaysia, Việt Nam,
Philippines, … Đến thế kỉ XIX, nhãn mới được đưa trồng ở châu Mĩ, châu Phi, châu
Đại Dương (Trần Thế Tục, 1999).
2.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ nhãn trên thế giới và tại Việt Nam
Ở Trung Quốc, nhãn được trồng nhiều ở các tỉnh Phúc Kiến, Quảng Tây, Quảng
Đông, Tứ Xuyên, Vân Nam, Quý Châu, Hải Nam, … Diện tích trồng nhãn của Trung
Quốc năm 1995 đã hơn 8 vạn ha. Còn ở Thái Lan, diện tích trồng nhãn là 31.855 ha
với sản lượng hàng năm là 87.000 tấn, trồng chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc, Chieng Mai,
Lam Phun, Prae.
Tại Việt Nam, cây nhãn trồng lâu đời nhất là ở chùa Phố Hiến thuộc xã Hồng
Châu, thị xã Hưng Yên, tỉnh Hưng Yên cách đây chừng 300 năm. Diện tích trồng nhãn
cả nước ước khoảng 60.000 ha, trong đó Đồng Bằng Sông Cửu Long có diện tích
không dưới 30.000 ha, tập trung nhiều ở các tỉnh Vĩnh Long, Bến Tre, Tiền Giang,
Đồng Tháp, Sóc Trăng. Các tỉnh miền Bắc diện tích trồng nhãn cũng xấp xỉ 30.000 ha
tập trung ở các tỉnh Hưng Yên, Sơn La, Yên Bái, Quảng Ninh (Trần Thế Tục, 1999).
Nhãn có cùi thịt (long nhãn) trong suốt, mọng ngọt, nổi tiếng là sản phẩm bổ
dưỡng được ưa chuộng nhất trên thị trường. Cùi nhãn, vỏ quả, rễ, hạt, hoa, lá đều có
giá trị chữa bệnh khá cao. Ngoài việc tiêu thụ nhãn tươi, nhãn còn chế biến khô để lấy
long nhãn làm thuốc trong Đông y. Theo kinh nghiệm lâm sàng của Đông y, long nhãn
là vị thuốc bổ huyết, có hiệu quả điều trị chứng mất ngủ do suy nghĩ, lo lắng quá
nhiều, tâm trạng bứt rứt, hồi hộp. Hạt nhãn tán thành bột gọi là lệ châu, dùng để cầm
máu khi bị vết thương, làm giảm đau, chóng lành da, không để lại vết sẹo. Hiện nay,
nhãn tươi và nhãn chế biến là mặt hàng giá trị có thị trường tiêu thụ cả trong và ngoài
nước ( />Doanh nghiệp tư nhân Ngọc Ngân, huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang mỗi ngày
đóng gói hơn 4 container trái nhãn (tương đương 100 tấn) để xuất khẩu sang thị trường
các nước châu Âu như Anh, Pháp cũng như sang Canada ( />

1632175588/Doanh_nghiep_Tien_Giang_tang_xuat_khau_nhan.html). Ngoài ra doanh
nghiệp đã ký hợp đồng xuất khẩu 100.000 tấn nhãn Việt Nam sang thị trường Trung
Đông với giá thấp nhất là 2 USD/kg. Công ty Fasttrack có trụ sở tại Doha sẽ nhập
khẩu và phân phối nhãn Việt Nam ở sáu nước Trung Đông gồm: Qatar, UAE, Saudi
Arabia, Kuwait, Bahrain và Oman ( />2.1.3. Thành phần hóa học chính của hạt nhãn
Bảng 2.1 Một số thành phần hóa học trong hạt nhãn
Trần Quốc Việt

Phạm Thị Mỹ

Nguyễn Thy

và ctv, 2005

Diện, 2010

Thu Tâm, 2010

Tinh bột

40 - 60%

52,5%

52,4%

Protein thô

9,06%

/

/

Xơ thô

6,96%

/

9%

Chất béo

4,32%

/

/

Ca

0,37%

/

/

P

0,28%

/

/

Tannin

4,44%

4,53%

/

Độ tro

/

2,15%

/

Độ ẩm

/

15%

10,77%

Đường tổng

/

58,3%

/

Đường khử

/

7,28 g/kg

/

Thành phần hóa học

2.1.4. Một số nghiên cứu về hạt nhãn trên thế giới và Việt Nam
Bà Usanee Vinitketkumnuen ở Đại học Chiang Mai, Thái Lan đã phát hiện ra một
chất chiết xuất từ hạt nhãn có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư, đặc biệt là ung thư ruột già.
Nó giúp chống oxy hóa, phục hồi làn da bằng cách giảm nếp nhăn, có khả năng ngăn chặn
hoạt động của enzyme tyrosinase tạo ra sắc tố melanin và enzyme gây hư hại tế bào da,
collagen và elastin. Nghiên cứu này đang thực sự tạo ra giá trị nhiều hơn cho ngành công
nghiệp nhãn ( />
5


Một nghiên cứu ở Trung Quốc dùng ethanol ly trích flavanone tổng số, sau đó

kiểm tra và xác định bằng phương pháp quang phổ, đã cho kết quả hàm lượng
flavanone tổng số trong hạt nhãn là 1,634 mg/ml và tỷ lệ thu hồi là 99,65%. Các
flavanone có khả năng ngăn ngừa lão hóa, bảo vệ mạch máu, thúc đẩy tuần hoàn máu,
chống ung thư, chống viêm, ngăn chặn cơn đau, chống oxy hóa, giảm lượng đường
trong máu, chống virus, chống bức xạ. Cơ thể người có thể hấp thu được các flavanone
tự nhiên do chúng có cấu trúc phân tử nhỏ. Nghiên cứu này đã cho thấy flavanone có
nhiều trong hạt nhãn. Đây là một viễn cảnh tươi sáng trong việc phát triển tài nguyên
thiên nhiên này ( />Tại Việt Nam, năm 2005, Trần Quốc Việt và cộng tác viên đã nghiên cứu xác
định thành phần hóa học, giá trị dinh dưỡng của hạt nhãn và tiềm năng sử dụng chúng
như là nguồn thức ăn cho dê sữa trong điều kiện trang trại nhỏ.
Ông Lều Văn Phát ở xã Hồng Nam, tỉnh Hưng Yên dùng vỏ và hạt nhãn để làm
nguyên liệu trồng nấm. Ông Phát thu gom vỏ và hạt nhãn đem nghiền thành bột, tiếp
đó cho vào lò khử trùng rồi mang ra cấy meo nấm. Kết quả, các loại nấm đều phát
triển rất tốt ( />Vỏ và hạt nhãn còn được dùng sản xuất phân bón hữu cơ tổng hợp . Vỏ và hạt
nhãn sau khi phơi khô bỏ vào máy xay nhuyễn thành bột rồi đem ủ cho hoai để tạo
điều kiện cho vi sinh phát triển. Sau một thời gian, các thành phần trong bột nhãn sẽ
xuất hiện, gồm đạm 1,3%, lân 0,5%, kali 0,9% và chất hữu cơ 75,8%
( />2.2. Kỹ thuật sản xuất rượu ethylic
2.2.1. Giới thiệu chung về rượu ethylic
Ethanol (C2H5OH), còn được biết đến như là rượu ethylic hay cồn, là một hợp
chất hữu cơ, nằm trong dãy đồng đẳng của rượu methylic.
Rượu ethylic là một chất lỏng, không màu, trong suốt, mùi thơm dễ chịu và đặc
trưng, vị cay, nhẹ hơn nước (khối lượng riêng 0,7936 g/ml ở 15oC), dễ bay hơi (sôi ở
nhiệt độ 78,39oC), hóa rắn ở -114,15oC, tan vô hạn trong nước, tan trong ether và
chloroform, hút ẩm, dễ cháy, khi cháy không có khói và ngọn lửa có màu xanh da trời.
6


Sở dĩ rượu ethylic tan vô hạn trong nước và có nhiệt độ sôi cao hơn nhiều so với ester
hay aldehyde có khối lượng phân tử xấp xỉ là do sự tạo thành liên kết hydro giữa các

phân tử rượu với nhau và với nước ( />Quy trình sản xuất rượu ethylic:
Nguyên liệu

Xử lý nguyên liệu
Nấu nguyên liệu
Dịch hóa
Đường hóa
Lên men
Chưng cất và tinh chế

Rượu
ethylic

Hình 2.2 Quy trình sản xuất rượu ethylic từ nguyên liệu tinh bột.
2.2.2. Cellulose và quá trình thủy phân cellulose bằng cellulase
Cellulose là polysaccharide cấu tạo nên tế bào thực vật. Đây là hợp chất hữu cơ
có nhiều nhất trong tự nhiên. Cellulose có cấu trúc mạch thẳng, dạng sợi, được cấu tạo
từ các glucose liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4-glycoside do đó trong không gian nó
vẫn ở mạch thẳng.
7


Các chuỗi cellulose có chứa hàng chục nghìn gốc glucose. Các chuỗi này được
xếp song song với nhau tạo thành sợi có đường kính khoảng 3,5 nm. Các sợi này lại
liên kết với nhau thành bó sợi có đường kính 20 nm. Giữa các chuỗi phân tử có rất
nhiều gốc -OH tự do và chúng tạo nên liên kết hydro giúp ổn định cấu trúc của
cellulose khiến cho nó trở nên bền, khó bị thủy phân (Đàm Sao Mai, 2009).
Việc thủy phân cellulose bằng H 2SO4 tuy có hiệu quả nhưng lại gây ô nhiễm môi
trường. Do vậy, việc sử dụng cellulase ngày càng nhiều. Quá trình enzyme cellulase
thủy phân cellulose rất phức tạp với sự tham gia của 3 nhóm enzyme: cellulase Ci cắt

bên ngoài (exocellulase), cellulase Ce cắt bên trong phân tử cellulose (endocellulase)
và β-glucosidase.
Cellulose

Ci

Cellulase hoạt hóa

Ce

β-glucosidase
Cellobiose
Glucose

Hình 2.3 Quá trình thủy phân cellulose bằng cellulase.
Mỗi năm khoảng 70 - 80 tấn cellulase được sản xuất từ Aspergillus niger và
Tricoderma viride. Sản xuất cellulase bằng phương pháp lên men chìm bắt đầu được
áp dụng ở Nhật từ năm 1964. Cellulase được sản xuất cả ở dạng bột và dạng nước.
Dạng nước chứa 100 - 1500 CU/ml, dạng bột chứa 200 - 4000 CU/g (CU: cellulase
unit) (Nguyễn Tiến Thắng, 2009).
2.2.3. Tinh bột và quá trình thủy phân tinh bột bằng enzyme
2.2.3.1. Tinh bột và cấu trúc của tinh bột
Tinh bột gồm hai thành phần amylose và amylopectin.
Amylose được cấu tạo nên từ các phân tử D - glucose tại nối α-1,4-glycoside.
Kích thước của polysaccharide này phụ thuộc vào nguồn gốc của nó. Các amylose có
thể được tạo nên từ hàng ngàn phân tử glucose, khối lượng phân tử của nó dao động từ
150.000 - 600.000 dalton. Phần cuối của cấu trúc có chứa một nhóm -OH glycoside do
đó nó có tính khử. Tuy nhiên trong các cấu trúc giữa thì không có. Trong không gian
các amylose sẽ tạo thành cấu trúc xoắn tương tự như cấu trúc alpha helix của
polypeptide. Amylose tác dụng với iode tạo thành màu xanh.

Amylopectin có cấu trúc phân nhánh. Trong cấu trúc phân tử có chứa cả liên kết
α-1,4-glycoside và α-1,6-glycoside. Cấu trúc phân tử bao gồm một mạch trung tâm
8


thẳng chứa liên kết α-1,4-glycoside, từ mạch này phát ra các nhánh phụ dài chừng vài
chục gốc glucose. Khối lượng phân tử của amylopectin nằm trong khoảng 500.000 đến
1.000.000 dalton. Các amylopectin thường phân bố ở bên ngoài hạt tinh bột.
Amylopectin tác dụng với iode tạo thành màu tím đỏ.

Hình 2.4 Amylose và amylopectin ( />Tinh bột có khả năng bị thủy phân bởi amylase hoặc acid. Trước tiên các dextrin
hình thành (đây là oligosaccharide có khoảng 8 glucose với ít nhất một nối α-1,6glycoside), sau đó chất này có thể bị thủy phân tận cùng đến glucose. Tùy theo độ lớn của
phân tử mà các dextrin sẽ có phản ứng màu khác nhau với iode (Đàm Sao Mai, 2009).
2.2.3.2. Các phương pháp thủy phân tinh bột
Để thủy phân tinh bột, từ lâu người ta sử dụng acid vô cơ như HCl và H2SO4.
Thủy phân acid rất khó kiểm soát, hiệu suất thủy phân thấp, dung dịch sau thủy phân
bị nâu hóa mạnh, tạo nhiều sản phẩm phụ và gây ô nhiễm môi trường. Do vậy việc ứng
dụng enzyme để thủy phân tinh bột là kết quả tất yếu của sự phát triển, nhờ ưu điểm

9


năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, hiệu suất biến đổi tinh
bột cao, giảm chi phí quá trình tinh sạch dịch đường (Nguyễn Tiến Thắng, 2009).
Phương pháp thủy phân tinh bột bằng enzyme gồm hai giai đoạn: dịch hóa và
đường hóa. Enzyme thường được sử dụng là amylase.
- Dịch hóa tinh bột: mục đích là chuyển hệ huyền phù các hạt tinh bột thành
dạng dung dịch hòa tan chứa các dextrin có chiều dài mạch ngắn hơn. Trước khi dịch
hóa phải hồ hóa tinh bột. Hồ hóa là quá trình tinh bột hút nước và nở khi được đun
nóng. Để đảm bảo loại bỏ hoàn toàn các phức lipid-amylose, nhiệt độ hồ hóa tinh bột

phải vượt quá 100oC. Trong quá trình dịch hóa, α-amylase phân cách các liên kết α1,4-glycoside nằm ở phía bên trong phần tử cơ chất. Một số phân tử cơ chất bị thủy
phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột
giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh). α-amylase không chỉ
thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc độ rất
chậm. Trong quá trình dịch hóa, pH của dịch tinh bột cần phải được điều chỉnh về
vùng trung tính, thêm Ca2+ để tăng độ bền của enzyme, sau đó pH lại được điều chỉnh
về vùng acid phù hợp với pH tối ưu của quá trình đường hóa, do đó sẽ làm tăng chi phí
tinh sạch sản phẩm bằng sắc kí trao đổi ion để loại bớt các ion kim loại.
- Đường hóa tinh bột: dịch thu được sau quá trình dịch hóa tiếp tục được thủy
phân tới oligosaccharide, maltose, glucose. Cơ chất tối ưu cho quá trình đường hóa là
các dextrin DP 8 - 12 (DP: degree of polymerisation, chỉ mức độ polymer hóa của các
đường oligo). Các dextrin bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho
màu với iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide
và monosaccharide. Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh
thành oligosaccharide gồm 6 - 7 gốc glucose. Các chất này tiếp tục bị phân giải chậm
đến maltotetrose, maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm
thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Để đường hóa tiếp tục
bằng glucoamylase, pH của dịch được giảm xuống 4,2 - 4,5. Glucoamylase không chỉ
có khả năng phân cắt nối α-1,4-glucoside mà còn phân cắt được cả nối α-1,6-glucoside
và trên lý thuyết sẽ biến 100% tinh bột thành đường glucose. Khi thủy phân liên kết α1,4-glucoside trong chuỗi polysaccharide, glucoamylase tách lần lượt từng phân tử
glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose. Chúng không thủy phân
10


được các dextrin vòng. Việc thay đổi pH có hai mục đích: ngừng phản ứng của αamylase để giữ chiều dài mạch tối ưu và đưa pH về giá trị tối ưu của enzyme đường
hóa. Dịch thu được sau quá trình dịch hóa cũng cần được làm nguội tới nhiệt độ tối ưu
của enzyme đường hóa (đối với glucoamylase là 60oC) (Hoàng Kim Anh và ctv, 2005;
Đàm Sao Mai, 2009; Đàm Thị Hải Yến, 2007).
2.2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme
a. Nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất

Trong phản ứng có enzyme làm xúc tác, coi như các điều kiện khác được giữ cân
bằng, ta có tốc độ phản ứng (v) phụ thuộc vào nồng độ enzyme và nồng độ của cơ
chất. Do lượng enzyme thường sử dụng quá nhỏ nên không phải lúc nào cũng xác định
được nồng độ enzyme. Vì vậy thường xác định đơn vị hoạt động (ĐVHĐ) của
enzyme.
1UI (1 ĐVHĐ) = 1 lượng enzyme làm xúc tác cho sự biến đổi của 1 µmol cơ
chất trong 1 phút dưới những điều kiện quy định.
Trong các phản ứng enzyme, muốn đạt tới tốc độ cực đại, thì nồng độ của cơ chất
phải cao hơn nồng độ của enzyme hàng triệu lần và luôn ở trạng thái thừa. Tuy nhiên,
tốc độ của phản ứng enzyme thường rất nhanh nên khi phản ứng tiến hành thì nồng độ
cơ chất sẽ giảm xuống một cách nhanh chóng theo thời gian, đồng thời nồng độ sản
phẩm tăng lên.
Sau một thời gian phản ứng, pH, nhiệt độ của môi trường cũng thay đổi do đó
cũng sẽ làm ảnh hưởng đến tốc độ của phản ứng.
b. Tác dụng của nhiệt độ
Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng mạnh đến tốc độ phản ứng. Dưới tác dụng của nhiệt
độ, tốc độ phản ứng sẽ tăng nhanh, nhưng đến một giới hạn nào đó enzyme sẽ bị biến
tính. Các loại enzyme khác nhau sẽ có mối liên quan đến nhiệt độ khác nhau. Điểm
nhiệt độ mà enzyme có hoạt tính cao nhất được gọi là nhiệt độ tối ưu. Điểm nhiệt độ
này cũng bị thay đổi theo điều kiện của môi trường bên ngoài.
Điểm nhiệt độ mà tại đó enzyme bị mất hoạt tính được gọi là nhiệt độ tới hạn.
Mỗi loại enzyme có nhiệt độ tới hạn khác nhau.
11


c. Tác dụng của pH môi trường
pH ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng. Đa số enzyme bền ở pH trong khoảng 5 - 9. Mức
độ ảnh hưởng của pH còn phụ thuộc vào cơ chất, tính chất dung dịch đệm, nhiệt độ, …
Bảng 2.2 Nhiệt độ và pH tối ưu của một số chế phẩm enzyme thương mại sử dụng
trong đề tài

Enzyme

Nhiệt độ (oC)

pH

Celluclast 1,5L (cellulase)

40 - 50

4,5

Termamyl 120L (α-amylase)

95 - 105

5,5 - 7

AMG 300L (glucoamylase)

50 - 60

4,5

Tài liệu hướng dẫn kỹ thuật của công ty Nam Giang.
d. Tác dụng của ion kim loại
Có một số enzyme không bị ảnh hưởng rõ rệt với sự có mặt hay không có mặt các ion
kim loại. Tuy nhiên cũng có những enzyme lại chịu ảnh hưởng của nồng độ và bản chất ion
kim loại như Ag+, Hg+, Pb2+, Ca2+. Ví dụ như α-amylase cần 1 nguyên tử gam Ca2+ cho 1
mol enzyme để ổn định cấu trúc phân tử (Nguyễn Tiến Thắng, 2009). Chế phẩm enzyme

Termamyl 120L hoạt động ổn định ở nhiệt độ 95 - 105oC nếu trong dịch chế phẩm có
khoảng 50 - 70 ppm Ca2+ (tài liệu hướng dẫn kỹ thuật của công ty Nam Giang).
Quá trình này rất phức tạp bao gồm cả tác dụng của ion kim loại tới phân tử
protein của enzyme và cả tác dụng của ion kim loại đến trung tâm hoạt động và cơ chế
xúc tác của enzyme.
e. Tác dụng của chất hoạt hóa
Các chất hoạt hóa có khả năng làm tăng hoạt động xúc tác của enzyme, hoặc làm
cho enzyme không hoạt động trở thành hoạt động. Ví dụ như Cl- hoạt hóa α-amylase.
Tác dụng hoạt hóa chỉ ở những nồng độ xác định, vượt quá giới hạn này có thể
làm giảm hoạt động của enzyme.
Các chất hoạt hóa có thể tác dụng trực tiếp hoặc tác dụng gián tiếp.
f. Tác dụng của chất ức chế
Các chất ức chế là những chất làm giảm hoạt tính của enzyme. Có thể là phân tử
vô cơ, hữu cơ, protein, …
12


Dựa theo tính chất, các chất ức chế được chia ra làm hai loại:
- Chất ức chế không đặc hiệu: làm biến tính phân tử enzyme bất kỳ.
- Chất ức chế đặc hiệu: tác động vào các trung tâm phản ứng đặc biệt của
enzyme làm giảm tốc độ phản ứng (Đàm Sao Mai, 2009).
2.2.4. Quá trình lên men dịch đã thủy phân
2.2.4.1. Nấm men Saccharomyces cerevisiae
Nấm men Saccharomyces cerevisiae là vi sinh vật đơn bào thuộc nhóm
Eukaryote. Chúng có hình cầu, kích thước thay đổi trong khoảng 2,5 - 10 μm × 4,5 21 μm, sinh sản chủ yếu bằng phương pháp nảy chồi. Sac. cerevisiae là vi sinh vật kỵ
khí tùy tiện. Trong môi trường có oxy, nó tổng hợp năng lượng theo con đường hô hấp
hiếu khí, chuyển đường glucose thành nước và CO2, sinh khối phát triển mạnh mẽ.
Trong môi trường không có oxy, Sac.cerevisiae có thể lên men 95% đường glucose, có
thể sử dụng nhiều loại đường như galactose, maltose, saccharose nhưng không đồng
hóa được lactose. Nó có khả năng chịu được độ acid cao, hoạt tính lên men cực đại ở

pH 4,5 - 5, đặc biệt chịu được thuốc sát trùng Na2SF với nồng độ 0,02% - 0,025%,
không đồng hóa được nitrogen dưới dạng nitrate. Sac. cerevisiae có khả năng lên men
rượu từ các nguồn nguyên liệu gạo, ngô, khoai, sắn thủy phân thành dung dịch có 12 18% đường. Năng lượng nấm men tạo ra thấp, chỉ đủ để nấm men duy trì sự sống, sinh
khối phát triển rất yếu (Nguyễn Đức Lượng, 2006).

Hình 2.5 Nấm men Saccharomyces cerevisiae ( />13


2.2.4.2. Quá trình lên men
Lên men rượu là một quá trình sinh hóa phức tạp, tác nhân của quá trình lên men
rượu trong sản xuất là các loài nấm men thuộc giống Saccharomyces. Thực chất của
quá trình lên men rượu chính là quá trình trao đổi chất nhờ tác dụng của các enzyme
tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học (được sinh ra từ sự trao đổi chất để duy trì sự
sống của nấm men). Trong quá trình lên men rượu, nguyên liệu là tinh bột cần phải
qua quá trình đường hóa bằng hệ enzyme amylase để chuyển tinh bột thành đường
glucose, sau đó tiếp tục lên men yếm khí để chuyển hóa glucose thành C2H5OH (rượu
ethylic), khí CO2 và đồng thời giải phóng năng lượng (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Phương trình tổng quát về quá trình lên men rượu như sau:
C6H12O6

2C2H5OH + 2CO2 + 674 Kcal

Môi trường lên men sau khi được khử trùng, kiểm tra độ đường đạt 90 - 120 g/l
và pH = 4,5 - 4,8, có thể cấy giống vào.
Thời gian lên men từ 65 - 72 giờ. Trong đó, 10 giờ đầu có sục khí để nấm men
sinh sôi nảy nở, sau đó cho lên men tĩnh (yếm khí).
Ta có thể giải thích cơ chế của quá trình lên men rượu xảy ra như sau: đường và
các chất dinh dưỡng của môi trường lên men được hấp thụ và khuếch tán vào trong tế
bào nấm men qua màng tế bào. Trong khi nước ra vào tự do qua màng tế bào nấm men
thì đường và các chất dinh dưỡng khác được màng tế bào chỉ cho đi vào mà không cho

quay ra. Trong tế bào nấm men, nhờ hoạt động sống của tế bào, nhờ hoạt động xúc tác
của hàng loạt men mà những phản ứng sinh hóa phức tạp xảy ra và dẫn đến tổng hợp
chất này, phân hủy chất kia. Ethanol và CO2 tạo thành liền thoát ra khỏi tế bào.
Ethanol tan tốt trong nước, do vậy nó khuếch tán rất nhanh vào môi trường lên men.
Trong quá trình lên men, cần phải định kì lấy mẫu để kiểm tra vi sinh vật tạp
nhiễm, trạng thái của tế bào nấm men.
Nấm men trong lên men phải thuần khiết và đạt các chỉ số sau:
- Số lượng tế bào nảy chồi: 10 - 15%
- Lượng tế bào chết không quá 2%. Số tế bào chết tăng chứng tỏ có những tác
động gây kìm hãm hoạt động của nấm men
14


- Số tế bào chứa glycogen không ít hơn 70%
- Số tế bào nấm men trong 1ml dịch men giống phải đạt 120 - 140 triệu (Trần
Thị Thanh, 2009).
2.2.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
a. Nhiệt độ
Nấm men Saccharomyces cerevisiae có nhiệt độ tối thích vào khoảng 28 - 32oC.
Nhiệt độ lên men cao thì sự bắt đầu tích tụ rượu ethylic càng sớm, tốc độ lên men
nhanh và kết thúc sớm, nhưng không lên men được hết đường. Lượng đường sót lại
khá lớn có thể được vi khuẩn lactic sử dụng để tạo thành acid lactic, làm chua dịch lên
men, làm ảnh hưởng đến mùi vị sản phẩm. Lên men ở nhiệt độ cao cũng làm cho các
vi khuẩn tạp nhiễm phát triển nhanh, dễ sinh và tích tụ các sản phẩm phụ.
Hoạt tính hô hấp của nấm men bị giảm khi nhiệt độ xuống thấp. Cường độ hô
hấp của nấm men ở 5oC có thể chỉ bằng 1/5 so với ở nhiệt độ 30oC.
b. Oxy hòa tan - độ hiếu khí
Quá trình lên men rượu thường được thực hiện trong điều kiện yếm khí, nhưng
trong giai đoạn nhân giống thì nhất thiết phải có một lượng oxy nào đó để nấm men sử
dụng. Trong thực tế sản xuất, đây là thời điểm duy nhất trong quá trình lên men rượu

oxy có ích cho nấm men. Sau đó phải loại bỏ hoàn toàn oxy trong tất cả các công đoạn
tiếp theo vì nếu sự có mặt của oxy trong môi trường quá lượng cho phép sẽ kéo dài
pha sinh trưởng, giảm tốc độ lên men của tế bào nấm men và làm tăng hàm lượng
đường sót lại trong sản phẩm.
c. pH của môi trường
pH của môi trường lên men hay môi trường nuôi vi sinh vật nói chung có ảnh
hưởng tới đời sống vi sinh vật rất lớn. Mỗi chủng vi sinh vật hay mỗi nhóm vi sinh vật
có khoảng pH tối thích cho sinh trưởng và phát triển.
Đối với men rượu và men bia thuộc giống Saccharomyces, pH ban đầu thích hợp
cho lên men là khoảng 5,5. Trong quá trình lên men, pH giảm xuống 4,4 - 4,5 rồi lại
tăng dần lên. Nguyên nhân giảm pH hay là tăng độ chua của môi trường được giải
thích bằng sự tạo thành CO2 và các axit hữu cơ trong quá trình lên men.
15