ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP REVERSE TRANSCRIPTASE POLYMERASE CHAIN REACTION (RTPCR) ĐỂ PHÁT HIỆN Laem Singh virus TRÊN TÔM SÚ NUÔI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP REVERSE TRANSCRIPTASE
POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR)
ĐỂ PHÁT HIỆN Laem Singh virus
TRÊN TÔM SÚ NUÔI

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: TRẦN THỊ PHƯƠNG TÚ
Niên khóa: 2007 - 2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP REVERSE TRANSCRIPTASE
POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR)
ĐỂ PHÁT HIỆN Laem Singh virus
TRÊN TÔM SÚ NUÔI

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. NGUYỄN VIẾT DŨNG

TRẦN THỊ PHƯƠNG TÚ

Tháng 07 năm 2011


LỜI CẢM ƠN
Con xin kính dâng lên cha mẹ lòng biết ơn sâu sắc, người đã sinh thành, dưỡng
dục để con có được ngày hôm nay!
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi còn nhận được rất nhiều sự ủng hộ
và giúp đỡ từ thầy cô và bạn bè. Nay tôi xin chân thành cảm ơn đến:
-

Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ
Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả thầy cô đã tận tình dạy dỗ,
truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường.

-

Thầy Nguyễn Viết Dũng, người đã hết lòng hướng dẫn về kỹ thuật và nội dung
đề tài trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp tại Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng
Thủy Sản II.

-

Thạc sĩ Cao Thành Trung và các anh chị làm việc tại Trung Tâm Quan Trắc Cảnh
Báo Môi Trường và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ, đã tạo
điều kiện thuận lợi về máy móc thiết bị và hóa chất trong quá trình thực hiện đề
tài tại Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II.

-

Các bạn sinh viên lớp công nghệ sinh học khóa 2007 - 2011 đã luôn đồng hành,
động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài tốt nghiệp.
TP. Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2011

Trần Thị Phương Tú

i


TÓM TẮT
Laem Singh Virus (LSNV) được cho rằng có hiện diện trên các mẫu tôm sú mắc
hội chứng chậm lớn (MSGS) ở Thái Lan và được xem là một trong các nguyên nhân
dẫn đến MSGS. Hội chứng chậm lớn đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho nông dân nuôi
tôm ở Thái Lan. Tại Việt Nam, vẫn chưa công bố nghiên cứu nào về loại virus mới
này. Mục đích của nghiên cứu nhằm áp dụng quy trình RT-PCR một bước trong xét
nghiệm sàng lọc chẩn đoán để phát hiện LSNV trên mẫu tôm sú thu thập tại Việt Nam.
Với hai loại enzyme và thành phần hóa chất được thiết kế đặc biệt, phản ứng RTPCR đã được thực hiện thành công trong một eppendorf duy nhất, bao gồm quá trình
tổng hợp cDNA và quá trình khuếch đại hiệu quả và có tính đặc hiệu cao.
Khi tiến hành kiểm tra tính đặc hiệu, kết quả cho thấy quy trình có tính đặc hiệu
đối với mẫu tôm nhiễm LSNV, không có tín hiệu trên tôm nhiễm các virus khác:
Yellow head virus (YHV), Gill associated virus (GAV), Taura symdrom virus (TSV),
Infectious myonecrosis virus (IMNV).
Kết quả đánh giá độ nhạy với trình tự RNA đích cho thấy, quy trình có thể phát
hiện đến 1000 bản sao trong một phản ứng khuếch đại. Có thể áp dụng quy trình trong
thực tế để phát hiện LSNV trên tôm sú, với hàm lượng tối thiểu là 1000 trình tự RNA
của LSNV trong 1 μl dịch ly trích RNA từ tôm nhiễm LSNV.
Tỷ lệ nhiễm LSNV trên các mẫu thu thập được ghi nhận như sau: 1% ở tôm

giống, 3,7% ở tôm thương phẩm và 22% trên tôm bố mẹ. 3 trong số 6 tỉnh thăm dò đã
có sự hiện diện của LSNV trên tôm sú nuôi gồm : Ninh Thuận, Bình Thuận, Cần Thơ.
Nghiên cứu cho thấy có thể áp dụng quy trình này trong việc chọn lựa con giống
sạch LSNV cũng như phát hiện sớm virus này ở tôm sú nuôi và tôm sú bố mẹ.

ii


SUMMARY
Thesis: Application of reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
method to detect Laem Singh Virus infected black tiger shrimp (Penaeus monodon).
It has been reported that Laem Singh Virus (LSNV) presented in shrimp samples
from shrimp growing areas of Thailand exhibiting monodon slow growth syndrome or
MSGS. In present study, a one-step RT-PCR was applicated for use as a diagnostic
screening test for the detection of LSNV in Vietnam.
With two enzymes and specially developed buffer, the reaction has been
successfully implemented in a single tube, including the efficient, highly specific
reverse transcription and PCR.
The results showed that the assay revealed high specificity for LSNV and no
signal was observed in cases of samples infected with other viruses: TSV, YHV, GAV,
IMNV.
The analysis of sensitivity indicated that the assay could detect 1000 copies of
target RNA sequence.
The prevalence of LSNV infection on shrimp was recorded as follows: 1% in
seed shrimp, 3,7% in commercial shrimp and 22% of the broodstock.
The study suggests that this assay can be applied to the selection of LSNV - free
seed shrimp as well as early detection of LSNV in cultured and broodstock shrimp.
Keywords: Laem Singh Virus, RT-PCR

iii

MỤC LỤC
Lời cảm ơn ..............................................................................................................i
Tóm tắt .................................................................................................................. ii
Summary .............................................................................................................. iii
Mục lục .................................................................................................................iv
Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................. vii
Danh sách các bảng ..............................................................................................ix
Danh sách các hình ................................................................................................ x
Phụ lục .................................................................................................................42
Chương 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1
1.2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................. 2
1.3. Nội dung nghiên cứu.............................................................................................. 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3
2.1. Giới thiệu về tôm sú ............................................................................................... 3
2.2. Một số bệnh thường gặp trên tôm sú ................................................................... 4
2.2.1. Virus gây bệnh đống trắng (WSSV) ............................................................... 4
2.2.2. Virus gây bệnh đầu vàng (YHV) .................................................................... 4
2.2.3. Virus gây kết dính mang (GAV) ..................................................................... 5
2.2.4. Virus gây tôm còi (MBV) ............................................................................... 5
2.2.5. Virus gây hoại tử khối gan tụy (NHP) ............................................................ 6
2.2.6. Hội chứng Taura (TSV) .................................................................................. 6
2.3. Hội chứng tăng trưởng chậm (MSGS) và Laem Singh virus (LSNV)............... 6
2.3.1. Các nghiên cứu ngoài nước ............................................................................. 6
2.3.2. Nghiên cứu trong nước ..................................................................................10
2.4. Các phương pháp dự chuẩn bệnh trên tôm ......................................................10
2.4.1. Quan sát lâm sàng .........................................................................................10
2.4.2. Quan sát mô học ............................................................................................10

2.1.1.1. Mô học truyền thống .............................................................................10
2.1.1.2. Phương pháp hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry)...................11
iv


2.4.3. Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) ................11
2.4.4. Kỹ thuật sinh học phân tử ............................................................................12
2.1.1.3. Lai phân tử ............................................................................................12
2.1.1.4. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ........................................13
2.5. Kỹ thuật dòng hóa ...............................................................................................17
2.6. Kỹ thuật giải trình tự ..........................................................................................18
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................19
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện .........................................................................19
3.2. Máy móc, thiết bị .................................................................................................19
3.3. Hóa chất ................................................................................................................19
3.1.1. Hóa chất cố định vật liệu di truyền ..............................................................19
3.1.2. Hóa chất tách chiết RNA .............................................................................19
3.1.3. Hóa chất RT-PCR ........................................................................................20
3.1.4. Hóa chất điện di gel agarose ........................................................................20
3.1.5. Hóa chất tạo dòng ........................................................................................21
3.4. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................22
3.1.1. Hướng tiếp cận nghiên cứu ..........................................................................22
3.1.2. Phương pháp thu mẫu ..................................................................................22
3.1.3. Phương pháp ly trích RNA tôm bằng trizol .................................................23
3.1.4. RT-PCR phát hiện LSNV ............................................................................23
3.1.5. Phương pháp điện di trên gel agarose ..........................................................24
3.1.6. Phương pháp chụp hình gel .........................................................................25
3.1.7. Phương pháp tinh sạch sản phẩm sau khi PCR và điện di ...........................25
3.1.8. Phương pháp dòng hóa sản phẩm PCR vào vector pGEM-T Easy .............25
3.1.9. Phương pháp chuyển vector pGEM-T Easy mang sản phẩm PCR .............26

3.1.10.Phương pháp kiểm tra dòng tế bào E. coli JM 109 mang vector .................26
3.1.11.Phương pháp nhân sinh khối tế bào E. coli JM 109 chứa vector ................26
3.1.12.Phương pháp tinh sạch vector tái tổ hợp......................................................27
3.1.13.Phương pháp phiên mã ngược DNA_LSNV ...............................................27
3.5. Các bước thực hiện ..............................................................................................28
3.1.1. Phương pháp RT-PCR phát hiện LSNV .......................................................28
3.1.1.1. Thí nghiệm phát hiện LSNV trên mẫu nghi nhiễm ..............................28
v


3.1.1.2. Thí nghiệm dòng hóa giải trình tự ........................................................28
3.1.1.3. Thí nghiệm tối ưu nhiệt độ lai...............................................................29
3.1.1.4. Thí nghiệm xác định giới hạn phát hiện của phương pháp...................29
3.1.1.5. Thí nghiệm xác định tính đặc hiệu của phương pháp ...........................29
3.1.2. Ứng dụng kiểm tra LSNV trên mẫu thực ......................................................30
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................31
4.1. Phương pháp RT-PCR một bước phát hiện LSNV ..........................................31
4.1.1. Phát hiện LSNV trên mẫu nghi nhiễm ..........................................................31
4.1.2. Dòng hóa giải trình tự ...................................................................................31
4.1.3. Tối ưu nhiệt độ lai .........................................................................................32
4.1.4. Giới hạn phát hiện của phương pháp ............................................................33
4.1.5. Xác định tính đặc hiệu của phương pháp ......................................................35
4.2. Ứng dụng quy trình onestep RT-PCR kiểm tra virus LSNV ..........................36
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................37
6.1. Kết luận ................................................................................................................37
6.2. Đề nghị ..................................................................................................................37
Chương 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...............................................................38

vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
bp:

Base pair

ctv:

Cộng tác viên

cDNA:

Complementary Deoxyribonucleotide acid

DEPC:

Diethyl Pyrocarbonate

DNA:

Deoxyribonucleic Acid

DNA/RNA_LSNV:

Trình tự DNA/RNA của Laem Sing virus

dNTP:

Deoxyribonucleoside triphosphate

EDTA:

Ethylendiaminetetraacid acetic

EtBr:

Ethidium Bromide

FAO:

Food and Agriculture Organization

kD:

Kilo Dalton

kb:

Kilo base

LSNV:

Laem Singh virus

LO:

Cơ quan bạch huyết

MSGS:

Hội chứng tăng trưởng chậm

MW:

Khối lượng phân tử

mRNA:

Messenger Ribonucleic acid

NSX:

Nhà sản xuất

PCR:

Polymerase chain reaction

pGEM-LSNV:

Vector pGEM-T Easy mang trình tự DNA của LSNV

RIA II:

Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II

RT-PCR:

Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

rpm:

Vòng/phút

Ta :

Annealing temperature

Taq :

Thermus aquaticus

TBE:

Tris Boric Ethylendiaminetetraacid acetic

Tm:

Melting temperature

UV:

Ultra violet

μl:

Micro lít
vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang
Bảng 3.1 Thành phần dung dịch TBE (Tris/Borate/EDTA) ...............................21
Bảng 3.2 Thành phần dung dịch loading dye......................................................21
Bảng 3.3 Thành phần môi trường LB (Luria-Bertani) chứa ampicilline ...........21
Bảng 3.4 Bảng thống kê số lượng mẫu thực thu tại 6 tỉnh thăm dò....................22
Bảng 3.5 Thành phần phản ứng RT-PCR phát hiện LSNV ................................24
Bảng 4.1 Bảng thống kê chi tiết số lượng mẫu thực và ......................................49

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1

Vòng đời chi Penaeus. ..............................................................................42

Hình 2.2

Dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng (WSSV) Penaeus monodon. ...... 42

Hình 2.3

Biểu hiện chung của bệnh đầu vàng (YHV). ............................................42

Hình 2.4

Penaeus monodon nhiễm GAV.................................................................43

Hình 2.5

Tôm nhiễm MBV. .....................................................................................43

Hình 2.6

Tôm P. vannamei giai đoạn ấu niên bị bệnh NHP. ...................................43

Hình 2.7

Tôm nhiễm TSV........................................................................................43

Hình 2.8

Phân tích trình tự các amino acid có nguồn gốc từ LSNV. ......................44

Hình 2.9

Cây phân loài di truyền Laem Singh virus. ...............................................44

Hình 2.10 Ảnh chụp hiển vi điện tử sau khi lai tại chỗ..............................................45
Hình 2.11 Ảnh chụp vi điện tử kết quả lai tại chỗ mô tim .........................................45
Hình 2.12 Ảnh chụp vi điện tử kết quả lai tại chỗ mô liên kết ..................................45
Hình 2.13 Ảnh chụp vi điện tử kết quả lai tại chỗ .....................................................46
Hình 2.14 Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (TEM)......................................................46
Hình 2.15 Kết quả sau điện di sản phẩm khuyếch đại với ............................................ 47
Hình 2.16

Sơ đồ phản ứng PCR .................................................................................47

Hình 2.17 Nguyên lý RT-PCR. ..................................................................................47
Hình 2.18 Phản ứng ELISA. ......................................................................................48
Hình 2.19 Bản đồ vector pGEM-T Easy và các điểm trình tự tham khảo. ................48
Hình 4.1

Kết quả áp dụng lại quy trình RT-PCR một bước ....................................31

Hình 4.2

Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp pGEM-LSNV đã tinh sạch. ......................... 31

Hình 4.3

Kết quả so sánh trình tự nucleotide một phần ...........................................32

Hình 4.4

Kết quả điện di sản phẩm PCR sau khi tối ưu hóa nhiệt độ lai.................33

Hình 4.5

Kết quả điện di trong thí nghiệm kiểm tra độ nhạy ..................................34

Hình 4.6

Kết quả điện di sản phẩm khuyếch đại mẫu RNA_LSNV........................34

Hình 4.7

Kết quả điện di sản phẩm khuyếch đại trong thí nghiệm ..........................35

ix


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Từ năm 2002, nông dân nuôi tôm ở Thái Lan gặp hàng loạt vấn đề với hiện tượng
chậm lớn ở tôm sú nuôi. Báo cáo sau đó ở hội nghị lần thứ 5 của tổ chức Asia
Regional Advisory Group về lĩnh vực sức khỏe vật nuôi thủy sản (2006) cho thấy hội
chứng chậm lớn (MSGS) đặc biệt tác động nghiêm trọng lên các hộ nuôi tôm sú ở
Thái, và đã làm thiệt hại lớn về sản lượng ( khoảng 1,6 tỷ USD) vào năm 2002.
Trong quá trình điều tra tác nhân gây hội chứng chậm lớn MSGS tác giả
Sritunyalucksana và ctv đã phát hiện ra sự hiện diện của một virus mới từ mẫu bệnh
phẩm có đặc điểm của hội chứng MSGS và đặt tên Laem Singh virus (LSNV)
(Sritunyalucksana và ctv, 2006). Nhóm tác giả Prakasha đã công bố phát hiện được các
mẫu tôm ở Ấn Độ có dương tính với virus LSNV. Như vậy ngoài Thái Lan, Ấn Độ là
nước thứ hai đã khẳng định có sự hiện diện của LSNV (Prakasha và ctv, 2007). Năm
2009, một nghiên cứu khác cũng xác định virus LSNV hiện diện trong các mẫu tôm
nuôi thương phẩm của nhiều nước châu Á, trong đó có Việt Nam.
Hiện tượng tôm sú nuôi chậm lớn là một hiện tượng phổ biến tại các vùng nuôi
tôm sú ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Các ao tôm mắc phải hiện tượng này thường
phải kéo dài thời gian vụ nuôi thành 5 đến 6 tháng thay vì hoàn tất vụ nuôi từ 3,5 đến
4 tháng như trước đây. Hiện tượng tôm chậm lớn làm cho kích thước tôm thu hoạch
cũng bị nhỏ đi chỉ còn khoảng 40 - 50 con/kg (trước đây thường là 30 - 35 con/kg).
PCR là kỹ thuật khuếch đại vật liệu di truyền, giúp phát hiện mầm bệnh ở nồng
độ rất thấp. Kỹ thuật có nhiều ưu điểm: (1) Thời gian thực hiện cực nhanh: chỉ cần mất
3 giờ để khuếch đại một trình tự quan tâm, so với phương pháp tạo dòng của kỹ thuật
tái tổ hợp DNA phải mất cả tuần hoặc lâu hơn; (2) Đơn giản và ít tốn kém: do thực
hiện trong ống nghiệm nhỏ bằng nhựa tổng hợp hoặc eppendorf, chỉ sử dụng những
lượng nhỏ tối thiểu hóa chất (Hoàng Thị Dung, 2006).

RT-PCR là phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu này nhằm phát hiện
Laem Singh virus bằng cách khuếch đại một vùng trình tự RNA của virus.

1


1.2. Mục đích nghiên cứu
Xây dựng quy trình phát hiện đặc hiệu Laem Singh virus (LSNV) tại Việt Nam.
Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của quy trình.
Đánh giá tình hình nhiễm LSNV trên tôm sú giống, tôm sú nuôi và tôm sú bố mẹ
ở các tỉnh Nam Bộ.
1.3. Nội dung thực hiện
Áp dụng quy trình phát hiện Laem Singh virus (LSNV) của tác giả
Sritunyalucksana và ctv (2006) trên các mẫu tôm sú thu được tại Việt Nam.
Kết quả dương tính sẽ được tinh sạch dòng hóa và giải trình tự.
So sánh trình tự bộ gen của Laem Singh virus ở Việt Nam với các loài Laem
Singh virus tại Ấn Độ và Thái Lan.
Thiết kế quy trình RT-PCR phát hiện đặc hiệu LSNV trên tôm sú Việt Nam.
Tiến hành kiểm tra độ nhạy và độ đặc hiệu của quy trình.
Tiến hành chạy trên mẫu thực để xác định mức độ nhiễm LSNV tại một số tỉnh
đã tiến hành thu mẫu.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về tôm sú
Tôm là một trong những nhóm động vật giáp xác theo hệ thống phân loại
Holthius (1980) thì tôm sú thuộc: Ngành: Arthropoda; Ngành phụ: Crustacea; Lớp:
Malacostraca; Bộ: Decapoda (mười chân); Bộ phụ: Macrura natantia (tôm bơi); Họ:

Penaeidae (tôm he); Họ riêng: Penaeus fabricicus; Giống: Penaeus; Loài: Monodon;
tên khoa học: Penaeus monodon fabricius.
Chúng phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (từ vĩ độ 40o Bắc đến
40o Nam, từ kinh độ 30o Đông đến 155o Đông) xung quanh các nước vùng xích đạo,
đặc biệt là Indonesia, Malaixia, Philippines và Việt Nam. Giai đoạn hậu ấu trùng sống
chủ yếu ở nơi có độ mặn cao như vùng biển ven bờ, có giá thể. Tôm trưởng thành di
cư ra biển khơi sinh sản (Lightner, 1983).
Tuổi thọ của tôm sú thay đổi theo giới tính. Tôm sú nuôi thí nghiệm trong ao và
các mẫu thu ngoài tự nhiên là 1,5 năm đối với tôm đực và 2 năm đối với tôm cái. Là
loài ăn tạp thiên về động vật, ấu trùng tôm sú phát triển qua nhiều giai đoạn với các tập
tính ăn khác nhau: Naupll, Zoea, Mysis, Postlarva, Juvenil (Hình 2.1 phần phụ lục)
(Pikul Jiravanichpaisa, 2007).
Tôm là loài giáp xác có vỏ kitin bao bọc bên ngoài cơ thể, sinh trưởng gián đoạn
và đặc trưng bởi sự gia tăng đột ngột về kích thước và trọng lượng. Tôm muốn gia
tăng kích thước (hay sinh trưởng) phải tiến hành lột bỏ lớp vỏ cũ (lột xác). Quá trình
này phụ thuộc vào điền kiện dinh dưỡng, môi trường nước và giai đoạn phát triển của
cá thể. Chu kỳ lột xác là thời gian giữa hai lần lột xác liên tiếp nhau. Sự lột xác thường
xảy ra vào ban đêm. Chu kỳ lột xác sẽ ngắn ở giai đoạn tôm con và kéo dài khi tôm
càng lớn (Chiou, 2007).
Về phương diện kinh tế, tôm sú là loài có hàm lượng dinh dưỡng cao và cũng là
loài thủy sản mang lại giá trị cao nhất trong các sản phẩm của ngành nuôi trồng thủy
sản Việt Nam. Nghề nuôi tôm đã giúp nhiều hộ nông dân Việt Nam thoát được cái
nghèo, góp phần phát triển nền kinh tế đất nước.

3


2.2. Một số bệnh thường gặp trên tôm sú
2.2.1. Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV)
Vật chất di truyền của virus đốm trắng là phân tử DNA mạch đôi, siêu xoắn, dạng

vòng. Protein vỏ, VP28, có đích là các tế bào của tôm và có vai trò quan trọng trong sự
tương tác giữa virus và tế bào (Chou và ctv, 1995).
Tế bào tôm bị bệnh đốm trắng có hiện tượng trương nhân. Gan tụy trương nhân
có màu trắng vàng và trở nên giòn hơn. Dấu hiệu đặc trưng về mô bệnh học là sự xuất
hiện của các thể vùi Crowdry type A trong nhân trương (Lightner, 1996). Tôm bị bệnh
đốm trắng thường xuất hiện ở tầng mặt và dạt vào bờ, bỏ ăn, hoạt động kém, các phần
phụ bị tổn thương, nắp mang phồng lên và vỏ có nhiều sinh vật bám. Tôm nhiễm bệnh
xuất hiện dấu hiệu đỏ thân cùng với đốm trắng bên trong lớp vỏ đầu ngực (Hình 2.2
phần phụ lục), các đốm trắng có kích thước từ 0,5 đến 2 mm xuất hiện đầu tiên trên
lớp vỏ đầu ngực và ở đốt đuôi cuối cùng. Tôm bị bệnh đốm trắng dễ dàng phát hiện ở
tôm nhỏ (juvenile) và sắp trưởng thành (Chou và ctv, 1995; Lightner, 1996). Khi tôm
có dấu hiệu sức khỏe yếu đồng thời các đốm trắng xuất hiện, tỷ lệ tôm phát bệnh trong
vòng 3 - 10 ngày lên đến 100% và tôm chết hầu hết ở ao nuôi.
Có thể làm giảm rủi ro của hội chứng đốm trắng bằng cách: kiểm tra sú postlarva
trước khi thả nuôi bằng kỹ thuật Nest-PCR, thay nước thường xuyên, xử lý nhanh ao
nuôi có hội chứng đốm trắng bằng vôi bột (CaO) với nồng độ 25 ppm, tuy nhiên
phương pháp này vẫn đang được nghiên cứu (Melba, 2005).
2.2.2. Virus gây bệnh đầu vàng (YHV)
Vật chất di truyền của virus gây bệnh đầu vàng là RNA có kích thước 22 kb. Cấu
trúc gồm có một nucleocapsid hình khối 6 mặt được bao bởi một vỏ bên ngoài. Khi
phân tích các phân tử YHV, có ít nhất 4 protein cấu trúc có trọng lượng phân tử lần
lượt là 170, 135, 67, 22 Kda (Walker, 1999).
Biểu hiện đầu tiên tôm phát triển rất nhanh và ăn nhiều hơn mức bình thường.
Đột ngột tôm dừng ăn, sau một hai ngày tôm dạt vào gần bờ và chết. Mang và gan tuỵ
có màu vàng nhạt (Hình 2.3), toàn thân có màu nhợt nhạt. Bệnh có thể gây ra tỷ lệ chết
nghiêm trọng đến 100% trong vòng 3 - 5 ngày. Khi tôm nhiễm bệnh đầu vàng kiểm tra
tiêu bản máu thấy có dấu hiệu bất thường: Nhân tế bào hồng cầu thoái hoá, kết đặc lại
hoặc bị thủy phân như ở: hệ bạch huyết (Lymphoid viết tắt là LO), tế bào mang, tế bào
4

kẽ gan tuỵ, tế bào biểu bì ruột (Cowley và ctv, 2000). Kiểm tra mô bệnh học tế bào có
hiện tượng hoại tử ở nhiều cơ quan và xuất hiện các thể vùi trong tế bào chất.
Hiện vẫn chưa có các biện pháp chữa trị tôm bị bệnh đầu vàng. Tuy nhiên, có thể
giảm lây lan bằng cách: sử dụng bố mẹ sạch bệnh, lọc và điều chỉnh pH nước thường
xuyên. Nếu xảy ra bùng phát bệnh thì phải xử lý ao bị bệnh bằng dung dịch chlorine
30 ppm (Melba, 2005).
2.2.3. Virus gây kết dính mang (GAV)
Virus gây kết dính mang (GAV) là virus RNA sợi đơn có liên quan với họ virus
Coronaviridae. Là một thành viên của tổ hợp virus đầu vàng. GAV có thể xuất hiện ở
tôm khoẻ hoặc tôm bệnh, trước đây được gọi là virus cơ quan bạch huyết (LOV) khi
được tìm thấy trong tôm khoẻ mạnh (OIE, 2000).
Tôm bị nhiễm GAV cấp tính có biểu hiện lờ đờ, kém ăn, bơi lâu trên mặt nước
hoặc quanh bờ ao. Thân tôm màu đỏ sẫm (Hình 2.4 phần phụ lục), đặc biệt ở các phụ
bộ, cánh, đuôi và miệng. Mang biến sang vàng-hồng. Có giun hình ống và con hà bám
trên mang bẩn. Quan sát mô học với các mang của tôm bệnh thấy có biểu hiện hủy hại
về cấu trúc: gắn kết các đầu tơ mang, hoại tử toàn bộ và mất lớp biểu bì của các lá
mang sơ cấp và thứ cấp (Cowley và ctv, 2000). Các tế bào bị phá vỡ, không có nhân
hoặc tế bào rõ ràng với nhân phình to, ngưng kết hoặc tạo ra không bào (Cowley và
ctv, 2000).
Ngăn ngừa sự lan truyền của GAV đến các vùng chưa hề bị lây nhiễm là một biện
pháp đang được khuyến nghị. Phơi khô các ao bị nhiễm bệnh cũng là một biện pháp có
hiệu quả để ngăn chặn sự tồn lưu của virus.
2.2.4. Virus gây tôm còi (MBV)
Tác nhân gây bệnh là virus type A Monodon Baculovirus. MBV có vật chất di
truyền là DNA mạch vòng, hình que, vỏ đơn thuộc nhóm Bacuvirus. Virus xâm nhập ở
dạng tự do hoặc dưới dạng các thể ẩn đa diện có protein vào nhân (Alcivar Warren,
1997). Tôm nhiễm chậm phát triển, ăn ít, cơ thể chuyển sang màu xanh xám (Hình 2.5
phần phụ lục), chết 100% sau 2 tuần khi có biểu hiện lâm sàng. Biểu hiện mô học: tổn
thương gan tụy và biểu mô ruột ở Larvae và Postlarvae. Nhân tế bào lệch ra ngoại vi,

gan tụy teo lại có màu trắng hơi vàng, thối rất nhanh. Giai đoạn trứng, Zoae không bị
nhiễm MBV, Postlarvae và tôm thương phẩm là giai đoạn nhiễm MBV cao nhất
(Belcher và Yo ung, 1998).
5


2.2.5. Virus gây hoại tử khối gan tụy (NHP)
Vi khuẩn NHP Gram âm, chỉ gây bệnh trong nội bào, là một giống mới trong
nhóm vi khuẩn phân giải protein nhóm α và có liên hệ mật thiết với vi khuẩn nội cộng
sinh khác ở động vật nguyên sinh (Frelier, 1992). NHP chỉ được tìm thấy trên khối gan
tụy, làm hồng cầu bị sưng phồng, các tuyến gan tụy bị hóa đen và mất các giọt lipid,
mô tuyến gan tụy bị teo rõ rệt, dẫn đến phù thũng nặng (Hình 2.6 phần phụ lục). Hiện
đã có kit thử phát hiện chấm vết để kiểm tra NHP do Diagxotics cung cấp (Wilton, CT,
Mỹ).
2.2.6. Hội chứng Taura (TSV)
Virus gây hội chứng Taura tạm thời được xếp vào họ Picornaviridae dựa trên
hình thái học của nó, bộ gen sợi đơn thẳng ssRNA chiều thuận dài khoảng 10,2 kb.
Biểu hiện lâm sàng giai đoạn cấp tính của hội chứng Taura: tôm lờ đờ, vỏ mềm
và đuôi đỏ rõ rệt, lớp biểu mô vỏ kitin ở các náng đuôi có ổ hoại tử trên biểu mô (Hình
2.7 phần phụ lục) (Lightner, 1996). Trong giai đoạn này tôm chết nhiều nhất, nếu sống
sót, chúng sẽ chuyển qua giai đoạn mãn tính vẫn có thể duy trì lây nhiễm (Dixon và
Dorado, 1997).
Khả năng loại trừ bệnh phụ thuộc vào việc loại bỏ hoàn toàn nguồn tôm lây
nhiễm, việc tiệt trùng cơ sở nuôi, tránh tái nhiễm virus, và thả lại tôm giống mới sạch
virus hội chứng Taura từ nguồn tôm bố mẹ sạch virus hội chứng Taura. Hiện đã có kit
thử lai tại chỗ cho virus hội chứng Taura của DiagXotics (Wilton, CT, Mỹ).
2.3. Hội chứng tăng trưởng chậm (MSGS) và Laem Singh virus (LSNV)
2.3.1. Các nghiên cứu ngoài nước
Hội chứng tăng trưởng chậm (MSGS) được nông dân phát hiện lần đầu tiên trên
tôm sú nuôi vào năm 2002 và được xem là kết quả của một tác nhân gây bệnh chưa

từng biết đến trước đó (Chayaburakul và ctv, 2004). Tình trạng tôm bị MSGS tương tự
cũng đã tìm thấy trên tôm sú nuôi ở Đông Phi (Anantasomboon và ctv, 2006). Khi
Withyachumnarnkul tiến hành tiêm dịch chiết lymphoid từ tôm bị MSGS đã loại vi
khuẩn sang tôm bình thường thì các triệu trứng tương tự cũng xuất hiện trên nhóm bị
tiêm (trích dẫn bởi Kallaya Sritunyalucksana, 2006 ). Cho tới năm 2004, vẫn chưa tìm
thấy mối liên hệ nào giữa MSGS với các nhân tố gây bệnh đã biết trước đó
(Chayaburakul và ctv, 2004). Tại Thái Lan, một nghiên cứu dịch tễ học đã được thực
hiện (). Các nhà nghiên cứu đã định nghĩa hội chứng MSGS với
6


các biểu hiện như sau: (1) Tối màu bất thường, (2) Tăng cân trung bình ít hơn
0,1g/ngày trong 4 tháng, (3) Sáng màu vàng bất thường, (4) “Bamboo-shaped” bụng
thân đoạn, (5) Dòn râu. Những đặc điểm này giúp phân biệt MSGS gây ra bởi MBV
hoặc các virus khác đã biết trước đó.
Trong quá trình điều tra tác nhân gây bệnh MSGS tác giả Sritunyalucksana và ctv
đã đi thu mẫu từ các ao nuôi sú có triệu chứng MSGS ở huyện Laem-Singh, tỉnh
Chantaburi, Thái Lan, nhóm tác giả đã phát hiện ra sự hiện diện của một virus mới từ
mẫu bệnh phẩm có đặc điểm của bệnh MSGS và đặt tên Laem Singh virus (LSNV)
(Sritunyalucksana và ctv, 2006). Sự hiện diện của LSNV được xác định bằng kỹ thuật
tạo dòng Shot-Gun. Kết quả tạo ra 22 dòng DNA cho kết quả âm tính, một dòng trong
số đó mang tên 20A (mã truy cập trên GenBank: DQ127905). Kết quả phân tích dòng
20A cho thấy nó tương đồng với trình tự amino acid bảo tồn của enzyme RNA
dependent RNA polymerases thuộc họ virus Luteovirida nhiễm trên thực vật và rệp
(Gray and Gildow, 2003) (Hình 2.8 phần phụ lục). Tuy nhiên, khi phân tích phát sinh
di truyền (Hình 2.9) cho thấy LSNV không thể xếp LSNV vào họ Luteovirida. Theo
thông lệ, virus mới được đặt tên theo khu vực, nơi nó lần đầu tiên được thu thập như
Laem Singh virus (LSNV).
Theo nghiên cứu của tác giả Pratoomthai các cá thể tôm có kích thước nhỏ hay
bình thường ở ao bị nhiễm MSGS đều có sự hiện diện của thể virus hình lập phương

25 nm LSNV (Hình 2.14 phần phụ lục) (Pratoomthai và ctv, 2008). Bằng các phương
pháp khác nhau Reverse Transcriptase Polymerase chain reaction (RT-PCR), kính hiển
vi điện tử (TEM), lai tạo chỗ với mẫu dò đặc hiệu in situ hybridization (ISH) và
phương pháp mô học các tác giả đã xác định LSNV có mặt ở cơ quan bạch huyết
(LO), mang, mô thần kinh và các mô khác, ngoài ra các tác giả còn phát hiện LSNV
hiện diện tại cơ quan Bellonci ở mắt tôm.
Một điều tra liên quan đến sự hiện diện của vài tác nhân gây bệnh ở ao có MSGS
lẫn ao bình thường. Theo đó các mẫu tôm có biểu hiện chậm lớn được kiểm tra sự hiện
diện của một số tác nhân virus gây bệnh: Monodon baculovirus (MBV),
Hepatopancreatic parvovirus (HPV) và Infectious hypodermal and hematopoietic
necrosis virus (IHHNV) bằng phương pháp PCR. Kết quả cho thấy trong nhiều trường
hợp, các ao bị nhiễm 2 hoặc nhiều hơn một virus cùng lúc (Chayaburakul và ctv,
2004). Tuy nhiên, không có mối tương quan giữa các tác nhân gây bệnh này với sự
7


hiện diện của MSGS. Các kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng có thể có một tác nhân gây
bệnh mới gây ra hiện tượng MSGS.
Trong nghiên cứu của B. K. Prakasha và ctv (2007) một quy trình Nest RT-PCR
hai bước phát hiện LSNV tại Ấn Độ đã được xây dựng. Đầu tiên RNA virus được dịch
mã thành cDNA thông qua phản ứng phiên mã ngược. PCR bước một sử dụng hai mồi
20AF (5’ TTG CCT TCT CCC GAG TGG TC 3’) và 20AR (5’ CCG GCT GAG GTA
GCT GCT TG 3’) (Kallaya Sritunyalucksana và ctv, 2006), sản phẩm khuếch đại dài
200 bp. Mồi bước hai (Nest mồi) được thiết kế dựa vào sản phẩm bước một (GenBank
số DQ127905) gồm LSNVnF 5‘GCG CAA GAG TTC TCA GGC TT 3’ và LSNVnR
5’ATC ACC GCA GGC TAA TAT AG 3’, sản phẩm bước hai là một phần trình tự
của sản phẩm bước một dài 140 bp. Nhóm tác giả đã tìm thấy sự hiện diện của LSNV
trên 3 mẫu tôm sú có dấu hiệu của “hội chứng lỏng vỏ” (LSS). Mắc LSS tôm có vỏ
cứng, thịt đuôi teo lại tạo ra một khoảng trống giữa vỏ và cơ, tôm biếng ăn, vết thương
sưng, bên trong có chứa chất lỏng màu trắng tạo cơ hội cho vi khuẩn nấm bệnh và tảo

bám bên ngoài, tôm bệnh di chuyển đến gần bờ và chết. Tuy nhiên, vẫn chưa tìm được
mối liên hệ giữa LSNV và LSS.
Nghiên cứu gần đây nhất tại Thái Lan về LSNV được thực hiện bởi Ekapol
Chomchay và ctv (2010). PmRab7 là một tiểu phần của protein GTPase trên tôm sú,
có liên quan đến sự xâm nhập và nhân lên của virus trong cơ thể tôm. Trong nghiên
cứu này, công nghệ RNA interference (RNAi) được áp dụng, sợi RNA bổ sung
(dsRNA) tương ứng với gen đích là PmRab7 (dsRNA-PmRab7) sẽ ngăn cản sự biểu
hiện của RNA mã hóa PmRab7 và ức chế quá trình nhân lên của LSNV trong cơ thể
tôm. Các sợi đôi RNA (dsRNA-PmRab7, dsRNA-GFP và các dsRNA không liên
quan) được sản xuất bằng hệ thống biểu hiện bên trong tế bào vi khuẩn. Cả hai
dsRNAs bị cắt bởi ribonuclease III (RNase III) nhưng không bị cắt bởi ribonuclease A
(RNase A). Khi tiêm dsRNA-PmRab7 vào tôm, gen PmRab7 không biểu hiện và ức
chế hoàn toàn sự nhân lên của LSNV trong cơ thể tôm. Trong quá trình nghiên cứu,
Ekapol Chomchay và ctv đã thiết kế ra cặp mồi mới LSNV (5' GCT CTT TGC GCC
TAT GAA TG 3' và 5' GCC CCA GAA ACG TAT TGG CAC 3') để phát hiện LSNV
bằng phản ứng RT-PCR, sản phẩm khuếch đại dài 859 bp.
Năm 2009, Nusra Sittidilokratna và ctv đã tiến hành nghiên cứu thăm dò tình
hình nhiễm LSNV trong một số nước khu vực Ấn Độ và Thánh Bình Dương. Sử dụng
8


quy trình Nest RT-PCR hai bước với cặp mồi bước 1 là BLF (5’-CGT TGC CTT CTC
CCG AGT GGT-3’) và LR1 (5’-AAT CTC ACC ATG AAG CTC CTC AC-3’) cho
sản phẩm dài 357 bp; cặp mồi bước 2 là LF2 (5’-AGA TGC TCA TTG TGC ATA
TGC C-3’) và LR2 (5’-GTG TAG ATT GGT TGC ATG GCG-3’) cho sản phẩm
khuếch đại cuối cùng dài 205 bp. Quy trình thiết lập đã có đủ độ nhạy để phát hiện
LSNV trên tôm không mắc MSGS. 326 mẫu tôm thu thập từ năm 1998 đến năm 2007
ở các nước trong khu vực Ấn Độ-Thái Bình Dương đã được thử nghiệm gồm: tôm
postlarvae nguyên con; Mang, cơ quan bạch huyết, cơ của tôm đang trong giai đoạn
juvenile, subadult và thành thục (trung bình 47,4 ngày tuổi). Không tìm thấy LSNV

hiện diện trong 96 mẫu (P. monodon, P. japonicus và P. merguiensis) thu tại Australia
và 16 mẫu (P. monodon) thu tại Fiji, Philippines, Sri Lanka và Mozambique, 73 mẫu
P. vannamei khỏe mạnh trong giai đoạn juvenile thu tại 9 điểm khác nhau ở Thái Lan
năm 2006 cũng cho kết quả âm tính. Tuy nhiêm đã phát hiện LSNV trên 6 mẫu sú
khỏe mạnh từ Malaysia và Indonesia, 2 trong 6 mẫu sú khỏe mạnh thu tại Việt Nam và
39 trong 40 mẫu sú bị MSGS thu tại Thái Lan cũng cho kết quả dương tính với LSNV.
56,8% mẫu sú ở Andhra Pradesh, Ấn Độ bị nhiễm LSNV nhưng không có dấu hiệu
của hội chứng chậm lớn. Trình tự nucleotidethu được tại Ấn Độ, Việt Nam, Malaysia
và Thái Lan tương đồng hơn 98% (GenBank: FJ811829 đến FJ811836 và DQ127905)
và không giống bất kỳ virus gây bệnh nào đã biết trước đó. Dữ liệu thu được cho thấy
LSNV tồn tại độc lập và phổ biến trên tôm sú ở một số khu vực Châu Á.
Nghiên cứu gần đây nhất về LSNV và MSGS vừa hoàn thành vào tháng 5 năm
2011, do tác giả Wattana Panphut và ctv thực hiện. Năm 2008, Laem Singh virus
(LSNV) được cho là một nguyên nhân cần thiết nhưng chưa đủ để gây ra MSGS, và
điều này đã kích thích tìm kiếm những nguyên nhân bổ sung với hy vọng sẽ tìm được
các biện pháp phòng ngừa để khôi phục kinh tế ngành nuôi tôm. Sử dụng quy trình
nhân dòng phổ quát (universal shotgun cloning protocol), nhóm tác giả đã tìm ra nhân
tố ICE (integrase - containing element) trên các mẫu sú MSGS nhiễm LSNV. Trong
nghiên cứu này, tác giả sử dụng quy trình Nest RT-PCR để phát hiện LSNV. Hai cặp
mồi đặc hiệu cho LSNV gồm: LSNV-Fr 5’ CGT TCG CTT CTC CCG AGT GGT 3’
và LSNV-Rv 5’ TTG CCC CAG AAA CGT ATT GGC A 3’ cho sản phẩm khuếch đại
600bp; LSNV-NFr 5’ TTG CCT TCT CCC GAG TGG TC 3’ và LSNV-NRv 5’ CCG
GCT GAG GTA GCT GCT TG 3’ cho sản phẩm khuếch đại 195 bp.
9


2.3.2. Nghiên cứu trong nước
Tại Việt Nam vẫn chưa có cơ quan nghiên cứu nào xác định được nguyên nhân
gây bệnh chính của hiện tương tôm chậm lớn ngoài tác nhân là virus MBV và HPV.
Do vậy việc nghiên cứu thăm dò sự hiện diện của virus LSNV là rất cần thiết cho

ngành nuôi tôm ở Việt Nam.
2.4. Các phương pháp dự chuẩn bệnh trên tôm
2.4.1. Quan sát lâm sàng
Bằng mắt thường, ta có thể quan sát trực tiếp những thay đổi bất thường về vận
động, màu sắc của tôm bệnh từ đó dự đoán tác nhân gây bệnh. Tuy nhiên phương pháp
này không cho kết quả chính xác, cần kết hợp thêm nhiều phương pháp phân tử khác
mới có thể dự chuẩn nguyên nhân gây bệnh.
2.4.2. Quan sát mô học
Mô bệnh học là phương pháp xác định các tổn thương ở các mô tế bào dựa trên
các thủ thuật nhuộm tế bào và quan sát bằng kính hiển vi. Phương pháp này cho phép
người phân tích kết luận tính chất của các vùng tổn thương.
2.4.2.1.

Mô học truyền thống

So sánh và đối chiếu với các kết quả quan sát bên ngoài là công việc rất cần thiết
để có được một chẩn đoán đúng. Nếu chỉ dựa vào những hình thái tổn thương bên
ngoài mà không có các dữ kiện khác có liên quan đến cá tôm bệnh thì thường có
những kết luận sai lầm vì những hình thái tổn thương của vài bệnh có thể giống nhau
và gây nhầm lẫn trong chẩn đoán.
Phương pháp mô học nghiên cứu cấu trúc mô ở mức độ hiển vi và mô bệnh học
là một chuyên môn hẹp của phương thức mô học đề cập tới quá trình phát triển bệnh.
Mô bệnh học là một kỹ thuật rất quan trọng trong nghiên cứu bệnh tôm và nhiều
trường hợp bệnh chỉ có thể chẩn đoán được bằng phương pháp này. Tuy nhiên, nó có
những hạn chế nhất định, chẳng hạn, thao tác tương đối chậm và trong nhiều trường
hợp bệnh tôm phải được xử lý ngay trước khi có được kết quả xét nghiệm mô học.
Phương pháp mô học chỉ nên sử dụng kết hợp với tất cả các dữ liệu về môi trường và
sức khỏe tôm để xác định tác nhân gây bệnh
Trước khi quan sát dưới kính hiển vi, mẫu phải được cố định để tránh bị hư thối,
loại bỏ thức ăn và đúc khối sáp. Cắt mẫu thành từng lát mỏng khoảng 5 micromet, rồi

đặt lên lam, nhuộm màu và đậy bằng lam kính. Thịt tôm bị phân hủy cực kỳ nhanh sau
10


khi tôm chết, vì thế cần phải cố định chúng. Tôm chết dù được giữ trong nước đá hay
đông lạnh cũng đều vô ích đối với phương pháp mô học do những biến đổi xảy ra
trong cơ. Dung dịch cố định tôm tốt nhất là dung dịch Davidson’s và formaline đệm
trung tính (Lightner, 1996).
2.4.2.2.

Phương pháp hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry)

Kỹ thuật hoá mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) cho phép phát hiện
kháng nguyên trên tiêu bản mô bằng cách sử dụng kháng thể có tính đặc hiệu với
kháng nguyên qua phản ứng kháng nguyên - kháng thể. Kháng thể dùng cho phản ứng
có thể được đánh dấu bằng thuốc nhuộm phát huỳnh quang , enzyme, chất phóng xạ…
để có thể nhận biết khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử, kính hiển vi huỳnh quang
hay những loại kính hiển vi khác (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2008). Hóa mô miễn dịch
được tiến hành qua các bước cơ bản sau: Bước 1: Kháng thể ban đầu gắn với kháng
nguyên chuyên biệt. Bước 2: Phức hợp kháng thể - kháng nguyên được gắn với kháng
thể thứ hai, kháng thể này có gắn enzyme. Bước 3: Với sự hiện diện của cơ chất và
chất tạo màu, enzyme hình thành nên một dạng màu sắc ở vị trí gắn kết giữa kháng thể
và kháng nguyên ().
Quan sát mô học là phương pháp sử dụng phổ biến nhất trong chẩn đoán bệnh
thủy sản (Bell và Lightner, 1984). Ngoài vấn đề thời gian thì kỹ thuật không đủ nhạy
để phát hiện giai đoạn sớm, thường chỉ cho kết quả chính xác khi tôm nhiễm bệnh
nặng, cũng như dấu hiệu bệnh lý tế bào của một số bệnh giống nhau, dễ nhầm lẫn.
Kính hiển vi điện tử được áp dụng để chẩn đoán song rất đắt tiền.
2.4.3. Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
Đây là kỹ thuật khá nhạy và đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên hoặc

kháng thể ở nồng độ rất thấp (0,1 ng/ml) (Huỳnh Vĩnh Khang, 2006). So với với các
kỹ thuật miễn dịch khác thì kỹ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ
chính xác. ELISA được dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn,
nấm, kí sinh.
Nguyên tắc của kỹ thuật này cũng dựa trên sự gắn kết đặc hiệu giữa kháng
nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ
chất thích hợp (thường là p-nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy
phân cơ chất thành một chất có màu (S. Leng và ctv, 2008). Sự xuất hiện màu chứng
tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường
11


độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Hai kỹ thuật
ELISA thường dùng là ELISA trực tiếp (direct Double Antibody Sandwich - ELISA)
(Hình 2.18) và ELISA gián tiếp (Indirect ELISA). Các enzyme thường dùng là βgalactosidaze, glucosidaze, peroxidaze và phosphataze kiềm (Vũ Triệu Mân, 2003).
Sau đây là một số ứng dụng phương pháp ELISA trong chẩn đoán bệnh đốm
trắng trên tôm: Nhóm nghiên cứu của tác giả Okumura đã phát triển thành công hệ
thống kháng thể đa dòng của thỏ kháng WSSV được đánh dấu bằng hạt latex. Theo đó,
tại hiện trường mẫu bệnh phẩm (mô dạ dày) sau khi nghiền trong dịch ly trích sẽ được
trộn với kháng thể nêu trên và quan sát phản ứng ngưng kết nếu có sự hiện diện của
WSSV (Okumura và ctv, 2004). Một nhóm nghiên cứu khác đã phát triển hệ thống
dot-immunogold filtration assay (DIGFA), với hệ thống này, kháng thể đơn dòng đặc
hiệu WSSV được đánh dấu bằng hạt vàng, dịch nghiền mẫu bệnh phẩm được làm khô
và cố định trên một màng lai nitrocellose, sau đó kháng thể đã đánh dấu bằng hạt vàng
được thêm vào để thực hiện phản ứng tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể, nếu
có hiện diện của kháng nguyên WSSV thì kháng thể sẽ được giữ lại trên màng lai và
hình thành một chấm màu đỏ (Wang và ctv, 2006)
2.4.4. Kỹ thuật sinh học phân tử
Trở ngại lớn trong việc tạo ra vaccine phòng bệnh và thuốc đặc trị cho virus gây
bệnh trên động vật thủy sản vẫn chưa được giải quyết. Trong gần hai thập niên trở lại

đây, hướng giải quyết cho bệnh do virus và vi khuẩn gây ra trên động vật thủy sản vẫn
là phát triển các chiến lược quản lý và các kỹ thuật xác định mầm bệnh ở nhiều cấp độ
khác nhau, nhằm kiểm soát an toàn sinh học đối với mầm bệnh ở nguồn tôm sú giống
và tôm nuôi thương phẩm. Các kỹ thuật chẩn đoán trong phòng thí nghiệm nói chung
và kỹ thuật sinh học phân tử nói riêng đã đóng vai trò quan trọng trong việc xác định
sớm mầm bệnh ở qui mô phòng thí nghiệm.
2.4.4.1.

Lai phân tử

Các phân tử DNA sợi kép có một tính chất đặc biệt là khả năng biến tính (phân
tách thành hai mạch đơn) và hồi tính (hai mạch đơn có trình tự bổ trợ có xu hướng liên
kết trở lại khi vắng mặt các tác nhân gây biến tính). Khả năng liên kết bổ trợ giữa các
bazơ nitơ cũng cho phép hai mạch DNA có nguồn gốc khác nhau nhưng có trình tự bổ
sung liên kết với nhau trong điều kiện phù hợp (về nhiệt độ, độ pH, ion hóa P) để tạo
nên một phân tử DNA mới. Hiện tượng liên kết như vậy cũng có thể xảy ra giữa hai
12


mạch DNA với nhau, hoặc giữa hai mạch ARN hoặc giữa DNA và RNA. Phân tử
nucleotide sợi kép mới hình thành được gọi là phân tử lai và quá trình kết cặp giữa các
bazơ thuộc hai mạch đơn nucleotide có nguồn gốc khác nhau theo nguyên tắc bổ sung
như vậy được gọi là quá trình lai phân tử. P32 và S35 là hai nguyên tố phóng xạ được sử
dụng phổ biến để dánh dấu DNA mẫu dò.
Lai tại chỗ (Insitu hybridization)
Là một trong những phương pháp lai phân tử. Trình tự nucleotide cần tìm (trình
tự đích) nằm ngay trong tế bào hay trên mô. Lai tại chỗ cho phép nghiên cứa
nucleotide mà không cần qua giai đoạn tách chiết chúng ra khỏi tế bào.
Phương pháp này đã được phát triển và ứng dụng chẩn đoán bệnh thủy sản
(Durand và ctv, 1996; Kiatpathomchai và ctv, 2005). Trong chẩn đoán bệnh IHHNV

(Mari và ctv, 1993, Jimenez và ctv, 1999), phát hiện IHHNV ngay trên mẫu mô mà
không cần li trích DNA. Mẫu dò đặc hiệu với virus IHHNV được đánh dấu và đem lai
trực tiếp với DNA virus trên mô đích trong điều kiện nghiêm ngặt. Phương pháp này
mang tính đặc hiệu cao, cung cấp những thông tin hữu ích về các cơ quan, các mô đích
và thời gian lây nhiễm (Durand và ctv, 1996) nhưng công phu tốn thời gian (2 đến 3
ngày mới có kết quả) và có độ nhạy không cao như PCR.
2.4.4.2.

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction-PCR) do Karl
Mullis và ctv phát minh năm 1985. Thực chất đây là một phương pháp tạo dòng DNA
in vitro không cần có sự hiện diện của tế bào (Đặng Thị Hoàng Oang, 2008).
Nguyên tắc: Phản ứng xảy ra trong một máy luân nhiệt có khả năng lặp lại 3
bước ủ ở các nhiệt độ khác nhau. 3 bước (Hình 2.16) trên gồm:
1. Biến tính (Denaturation): Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành
phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt
độ nóng chảy (Tm) của chúng, thường là ở 94 - 95ºC trong vòng 30 giây đến 1 phút.
Đây là giai đoạn mạch đôi tách thành 2 mạch đơn.
2. Bắt cặp (Annealing): Nhiệt độ dược hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các
mồi bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 70ºC tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng mà thời gian bắt cặp khác nhau và kéo dài từ
30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn quyết định tính đặc hiệu của phản ứng.
13


3. Kéo dài (Extension): Nhiệt độ được tăng lên đến 72ºC. Đó là điều kiện tốt nhất
để cho Taq polymerase hoạt động tổng hợp kéo dài mạch theo nguyên tắc bổ sung từ 2
đầu sợi khuôn ban đầu. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại,
thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Theo Geifand và White (1990), khả năng
tổng hợp của Taq là 150 nucleotide/giây ở nhiệt độ 75oC - 80oC; 60 nucleotide/giây ở

70oC; 24 nucleotide/giây ở 5oC; 1,5 nucleotide/giây ở 37oC và ở nhiệt độ 22oC chỉ còn
0,25 nucleotide/giây.
Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một phân tử DNA khuôn được nhân
lên thành hai, các đoạn DNA vừa được nhân trong chu kỳ lại làm khuôn cho chu kỳ
nhân bản tiếp theo vì hai đầu tận cùng của sản phẩm bổ sung với mồi. Do đó sau mỗi
chu kỳ số lượng đoạn DNA được tổng hợp sẽ tăng lên gấp đôi và như vậy sau n chu kỳ
nhân bản sẽ tạo ra 2n bản DNA từ một khuôn ban đầu. Sau 30 chu kỳ khuếch đại sẽ đạt
106 bản sao của lượng bản mẫu DNA ban đầu.
Ngày nay kỹ thuật PCR được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực: Phân loại
học, tiến hóa, y học, sinh thái học, giám định pháp y... Trong lĩnh vực thủy sản, nhiều
quy trình PCR đã được phát triển cho phép phát hiện bệnh do tác nhân virus đặc biệt là
virus WSSV trên cơ sở xác định vật liệu di truyền đặc trưng của virus này với độ nhạy
cao (Lo và ctv, 1996; Kiatpathomchai và ctv, 2001; Hossain và ctv, 2004). Các kỹ
thuật này cho phép xác định nhanh virus gây bệnh đốm trắng trong vòng vài giờ.
Phương pháp thực hiện một phản ứng PCR:
1. Ly trích DNA hay RNA từ vật chủ để sử dụng làm mạch khuôn: trong phòng
thí nghiệm DNA hoặc RNA được ly trích từ mẫu bệnh phẩm. Mô cơ thể được ly trích
tùy thuộc vào nơi mà mầm bệnh muốn chẩn đoán thường tấn công.
2. Chuẩn bị: thành phần của một phản ứng PCR (reaction mix) bao gồm DNA
khuôn, tức là đoạn trình tự DNA cần được nhân lên; 2 đoạn mồi, mỗi mồi dài khoảng
18 - 24 nucleotide; DNA polymerase (thường hiện nay sử dụng là Taq polymerase - là
một loại enzyme chịu nhiệt); bốn loại deoxyribonucleotide triphosphat (dATP, dGTP,
dTTP, dCTP) và dung dịch đệm và ion Mg2+.
Phản ứng PCR tối ưu khi DNA khuôn tinh sạch, nhưng một ưu điểm lớn của
phương pháp PCR là cho phép nhân cả những mẫu DNA không được bảo quản tốt, đã
bị phá hủy từng phần như những vết máu để lâu ngày, tinh dịch đã khô, hoá thạch, tóc,
móng tay của người đã chết...
14