Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây (codonopsis sp ) trong hệ thống bioreactor

Luận văn Thạc sĩ
Đình Trọng

Nguyễn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan Luận văn này hoàn toàn được hoàn thiện bằng qua trınh
nghiên cứu khoa học của bản thân dưới sự hướng dẫn trực tiếp của PGS. TS. Chu
Hoàng Hà cùng với cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh
học. Các số liệu hình ảnh, kết quả được trình bày trong luận văn này là trung thực,
không sao chép bất cứ tài liệu, công trình nghiên cứu của người khác mà không chỉ
rõ nguồn tham khảo. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình trước hội
đồng khoa hoc.

Hà Nội, tháng 12 năm 2015
Học viên

Nguyễn Đình Trọng

3


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lỏng biết ơn chân thành đến những người đã hướng dẫn,
giúp đỡ tận tịnh tôi hoàn thành luận văn này:
PGS. TS. Chu Hoàng Hà, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, Trưởng phòng
Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Công nghệ sinh học, đã hướng dẫn và hỗ trợ tận
tình, truyền đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực
hiện đề tài.
TS. Phạm Bích Ngọc, Phó trưởng phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện

Công nghệ sinh học, người cô, người chị đã trực tiếp hướng dẫn, luôn theo sát thí
nghiệm của tôi để đưa ra những lời khuyên bổ ích và kịp thời cho tôi ngay từ
những ngày đầu tiên tôi bước vào phòng thí nghiệm.
GS. TS. Lê Trần Bình, PGS. TS. Lê Văn Sơn, TS. Chu Nhật Huy, KS. Nguyễn Khắc
Hưng, CN. Nguyễn Phú Tâm và các cán bộ phòng Công nghệ tế bào thực vật đã
giúp đỡ, chỉ bảo tận tình về chuyên môn.
Trong những năm học tập và nghiên cứu tại phòng Công nghệ tế bào thực
vật, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ, động viên chân thành của
tập thể cán bộ phòng. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô giáo tại cơ sở Viện Sinh thái
và Tài nguyên Sinh vật đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời
gian học tập vừa qua.
Bằng tình cảm chân thành, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã
luôn ở bên, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này.
Hà Nội, tháng 12 năm 2015
Học viên

Nguyễn Đình Trọng

4


MUC LUC
LỜI

CAM

ĐOAN

------------------------------------------------------------------------------------------------------ - LỜI

CẢM

ƠN ------------------------------------------------------------------------------------------ -

MUC LUC------------------------------------------------------------------------------------------------i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT -------------------------------------------------------------------- iii
DANH MỤC BẢNG---------------------------------------------------------------------------------- iv
DANH MỤC HÌNH ----------------------------------------------------------------------------------- v
MỞ ĐẦU -----------------------------------------------------------------------------------------------1
1.1.Đặt
vấn
đề
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------1
1.2.Mục
đích
nghiên
cứu--------------------------------------------------------------------------------------------2
1.2.1.
Mục
tiêu
tổng
------------------------------------------------------------------------------- 2

quát

1.2.2.
Mục
tiêu
cụ
----------------------------------------------------------------------------------- 2

thể

1.3.Nội
dung
nghiên
--------------------------------------------------------------------------------------------3

cứu

1.4.Ý
nghĩa
khoa
-------------------------------------------------------------------------------------------------3

học

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ---------------------------------------------------------- 4
1.1.Tổng
quan
về
cây
Sâm
-----------------------------------------------------------------------------------4
1.1.1.
Giới
thiệu
về
phân
-------------------------------------------------------------------- 4

bố

dây
địa

lý

1.1.2.
loại------------------------------------------------------------------------------------------- 4

Phân

1.1.3. Hình thái------------------------------------------------------------------------------------------4
1.1.4.
Tác
dụng
dược
lý
----------------------------------------------------------- 5

của

cây

Sâm

dây

1.1.5. Tính cấp thiết của việc nghiên cứu, bảo tồn và sản xuất bền vững cây Sâm dây

------11
1.2.Nuôi cấy sinh khối rễ tơ – giải pháp tạo nguồn dược phẩm sạch phục vụ sức
khoẻ
cộng
đồng------------------------------------------------------------------------------------------------------


---------- 12
1.2.1.
Giới
thiệu
về
nuôi
bào-------------------------------------------12

cấy

nuôi

cấy

sinh

khối

tế

1.2.2. Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes – phương pháp tạo rễ tơ ở tế bào
thực vật--------------------------------------------------------------------------------------------------------------13
1.2.3. Cơ chế chuyển các

--------------------------------14

gen

vùng

T-DNA

vào

tế

1.2.4.
Nuôi
cấy
sinh
tơ------------------------------------------------------------------------17

bào

thực

vật

khối

rễ

1.2.5. Ứng dụng hệ thống bioreactor trong nuôi cấy sinh khối rễ tơ
----------------------------22

1.2.6. Ảnh hưởng của elicitor
cấp--------------------------24

đến khả năng tích luỹ các chất thứ

1.3.Một số phương pháp tách chiết, phương pháp định tính và định lượng
saponin --26
1.3.1.
Phương
pháp
------------------------------------------------------------------------26
1.3.2.
Một
số
phương
pháp
------------------------------------------------------27

định

tách

chiết
tnh

saponin

1.3.3. Ứng dụng phương pháp quang phổ trong định lượng saponin tổng
số------------------28
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU -------------------------- 29

2.1.Vật
liệu
nghiên
-------------------------------------------------------------------------------------------- 29

cứu
i


Luận văn Thạc sĩ
Đình Trọng

Nguyễn

2.2.Thiết bị và hoá chất nghiên
cứu-------------------------------------------------------------------------- 29
2.3.Phương pháp nghiên cứu
----------------------------------------------------------------------------------- 29
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
--------------------------------------------------29
2.3.2. Đánh giá các dòng chuyển gen bằng phương pháp PCR
----------------------------------30
2.3.3. Đánh giá khả năng tăng sinh của các dòng rễ tơ Sâm dây
--------------------------------31
2.3.4. Xác định kích thước mẫu cấy phù hợp cho nuôi cấy
--------------------------------------32
2.3.5. Xác định loại môi trường thích hợp cho nuôi cấy rễ tơ trên môi trường
thạch.--------32
2.3.6. Xác định loài môi trường lỏng thích hợp cho nuôi cấy rễ tơ
-----------------------------33

2.3.7. Ảnh hưởng của salicylic acid (SA) lên sinh trưởng và tích luỹ chất khô trong rễ
tơ
Sâm dây-------------------------------------------------------------------------------------------------33
2.3.8. Lựa chọn mô hình nuôi cấy bioreactor phù hợp
--------------------------------------------34
2.3.9. Phương pháp nuôi cấy sinh khối rễ tơ trong hệ thống bioreactor
------------------------34
2.3.10.Phương pháp tách chiết saponin từ sinh khối rễ tơ
---------------------------------------35
2.3.11.Phương pháp bán định lượng hàm lượng saponin trong sinh khối rễ tơ
---------------35
2.3.12.Phương pháp tính toán
------------------------------------------------------------------------36
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN --------------------------------------------------- 37
3.1. Kiểm tra đánh giá các dòng rễ tơ chuyển gen bằng phương pháp
PCR--------------- 37
3.2. Đánh giá tốc độ sinh trưởng của các dòng rễ tơ Sâm dây
----------------------------------- 39
3.3. Xác định kích thước mẫu phù hợp cho nuôi
cấy------------------------------------------------- 41
ii


3.4.Xác định loại môi trường thích hợp cho nuôi cấy rễ tơ trên môi trường đặc
-------- 42
3.5.Kết quả nuôi cấy rễ tơ trên các môi trường lỏng khác nhau
-------------------------------- 43
3.6.Ảnh hưởng của salicylic acid (SA) lên sinh trưởng và tích luỹ hợp chất thứ
cấp trong rễ tơ Sâm
dây------------------------------------------------------------------------------------------------- 45

3.7.Lựa chọn mô hình nuôi cấy bioreactor phù hợp với điều kiện cơ sở vật chất
tại
Viện Công nghệ sinh học
----------------------------------------------------------------------------------------- 47
3.8.Kết quả nuôi cấy rễ tơ sâm dây trên các mô hình bioreactor
------------------------------- 49
3.9.Kết quả bán định lượng hàm lượng saponin tổng số trong sinh khối rễ tơ,
so sánh với sâm tự
nhiên----------------------------------------------------------------------------------------------------- 52
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ --------------------------------------------------- 55
1.1.Kết
luận------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 55
1.2.Kiến nghị
----------------------------------------------------------------------------------------------------------55
TÀI LIỆU THAM KHẢO ------------------------------------------------------------------------- 56

ii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
A. rhizogenes :

Agobacterium rhizogenes

A. tumefaciens :

Agrobacterium tumefaciens

Aux

:

Auxin

B5

:

Gamborg B5, 1968

bp

:

Base pair

DNA

:

Desoxyribonucleic acid

GusA

:

β-glucuronidase

kp

:

Kilobase pair LB

:

Left border

MS

:

Murashige and Skoog, 1962

MeOH

:

Methanol

RB

:

Right border

Ri-plasmid

:

Root induction plasmid

Rol

:

Root locus

SA

:

Salicylic acid

SH

:

Schenk và Hildebrandt, 1972

sp

:

Species

ss T-DNA

:

Single strain T-DNA

vir

:

Virulence genes

JA

:

Jasmonic acid

WPM

:

McCown’s Woody Plant, 1981

iii


DANH MỤC BẢNG
Bang 1.1. Câu truc hoa hoc 7 saponin trong Codonopsis lanceolata ------------------- 6
Bảng 1.2. Khả năng ức chế khối u ở chuột của CPPW1 và CPPW1B------------------ 8
Bảng 1.3. Một số loài thực vật được nuôi cấy rễ tơ để thu hoạt chất sinh học ------ 20
Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu --------------------------------------- 30
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR nhân gen rolA, rolB, rolC--------------------- 31
Bảng 3.1. Sự phát triển của các đoạn rễ tơ sâm dây có kích thước khác nhau ------ 41

Bảng 3.2. Sự phát triển của rễ tơ sâm dây trên các loại môi trường khác nhau ----- 42
Bảng 3.3. So sánh thành phần của các môi trường cơ bản MS, B5, WPM, SH ----- 43
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của SA đến sự sinh trưởng của rễ tơ Sâm dây----------------- 45
Bảng 3.5. Kết quả nuôi cấy rễ tơ sâm dây trên các hệ thống bioreactor khác nhau sau
4 tuần nuôi cấy ------------------------------------------------------------------------------- 51
Bảng 3.6. Kích thước củ Sâm dây 1 -3 tuổi thu thập ở Kon Tum --------------------- 52
Bảng 3.7. Kết quả xác định hàm lượng saponin tổng số ------------------------------- 53

iv


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây Sâm dây ------------------------------------------------------------------------ 4
Hınh 1.2. Câu truc hoa hoc saponin trong sâm dây (Ichikawa et al., 2009) ----------- 6
Hình 1.3. Cơ chế chuyển gen chung của Agrobacterium------------------------------- 15
Hình 1.4. Các hệ thống rễ tơ Sâm dây được nuôi cấy tại Viện Công nghệ sinh học 19
Hình 1.5. Hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu ----------------------------------------- 24
Hình 3.1. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen rolA, rolB, rolC bằng kỹ thuật PCR
-------------------------------------------------------------------------------------------------- 38
Hình 3.2. Kết quả khảo sát tốc độ sinh trưởng của các dòng rễ tơ Sâm dây --------- 40
Hình 3.3. Sự phân nhánh và kéo dài của các mẫu rễ tơ sau 2 tuần nuôi cấy trên các
môi trường khác nhau.----------------------------------------------------------------------- 42
Hình 3.4. Đường cong sinh trưởng của rễ tơ sâm dây trên các môi trường khác nhau
-------------------------------------------------------------------------------------------------- 44
Hình 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của SA đến sinh trưởng rễ tơ Sâm dây ----- 46
Hình 3.6. Hệ thống bioreactor mà TS. Nguyển Hữu Hổ sử dụng tại Viện Sinh học
nhiệt đới --------------------------------------------------------------------------------------- 48
Hình 3.7. Hệ thống bioreactor PGS. TS. Dương Tấn Nhựt sử dụng tại Viện Sinh học
Tây Nguyên ----------------------------------------------------------------------------------- 48
Hình 3.8. Hệ thống bioreactor trong ngành công nghiệp dược phẩm ở Hàn Quốc - 48

Hình 3.9. Hệ thống bioreactor đang được sử dụng tại Viện Công nghệ sinh học --- 49
Hình 3.10. Rễ tơ thu được sau 4 tuần nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 5 lít ------- 50
Hình 3.11. Các mẫu củ Sâm dây thu thập tại Kon Tum -------------------------------- 52

v


Luận văn Thạc sĩ

Nguyễn Đình Trọng

1


Luận văn Thạc sĩ

Nguyễn Đình Trọng

MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Sâm dây hay Đẳng sâm có danh pháp khoa học là Codonopsis sp., một loài thực
vật lâu năm thuộc họ Hoa chuông (Campanulaceae). Chúng có nguồn gốc từ khu vực
Đông Bắc châu Á và bán đảo Triều Tiên. Rễ của đẳng sâm được sử dụng trong y học cổ
truyền từ xa xưa với tác dụng bổ ngũ tạng, tăng sức dẻo dai, tăng cường khả năng
miễn dịch cho cơ thể, có tác dụng bổ huyết, chống mệt mỏi, giảm stress. Trong sâm
dây chứa các hoạt chất chủ yếu như saponin, polysaccharide, triterpen, steroid… Do
có nhiều công dụng trong y dược nên sâm dây có nguy cơ bị khai thác quá mức làm
giảm khả năng tái sinh và phát triển. Cây Sâm dây đã được đưa vào chương trình
bảo tồn các loài cây quí hiếm và được đưa vào sách đỏ vào năm 1996 ( theo Sách đỏ
Việt Nam – phần Thực vật, NXB KHTNCN, 2007).

Những giá trị y dược quý của cây Sâm dây hiện nay đã được trong và ngoài nước
công nhận, do đó việc khai thác, sử dụng và quản lý bền vững nguồn tài nguyên này
cần được quan tâm triệt để. Những năm gần đây, cùng với xu hướng chung trên thế
giới, ở nước ta hướng nghiên cứu công nghệ sinh khối tế bào thực vật để sản xuất các
sản phẩm thứ cấp đã bắt đầu được quan tâm đầu tư phát triển. Tuy nhiên trong quá
trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật để làm giảm hoặc mất tnh biệt hoá ở các
mô tế bào nuôi cấy cần bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng vào trong môi trường
nuôi cấy. Vấn đề này là một trong những trở ngại lớn nhất do tồn dư của các chất
điều hoà sinh trưởng trong sinh khối tế bào nuôi cấy. Điều này đã ảnh hướng trực tiếp
đến sản phẩm cũng như sức khoẻ người tiêu dùng. Việc này hoàn toàn có thể khắc
phục trong nuôi cấy sinh khối từ rễ tơ.
Rễ tơ là một loại bệnh xuất hiện ở thực vật bậc cao do sự xâm nhiễm của vi
khuẩn Agrobacterium rhizogenes gây ra. Đặc biệt, rễ tơ có thể sinh trưởng và phát
triển tốt trên môi trường không có chứa chất điều hòa sinh trưởng. Do khả năng sinh
trưởng nhanh, kỹ thuật nuôi cấy đơn giản kết hợp hệ thống bioreactor, rễ tơ

2


đã và đang được ứng dụng nhằm thu nhận các hợp chất thứ cấp từ các loài thực vật
có giá trị dược liệu cao. Các dược chất của sâm dây chủ yếu được tích lũy ở rễ nên
rất thích hợp cho việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy sinh khối rễ tơ. Hướng nghiên cứu
này cho khả năng thu nhận lượng lớn sinh khối rễ sâm dây tạo nguồn nguyên liệu ốn
định đáp ứng nhu cầu làm thuốc hay thực phẩm chức năng. Bên cạnh đó còn góp
phần bảo tồn đa dạng sinh học của loài Sâm dây ngoài tự nhiên.
Nuôi cấy rễ tơ trong hệ thống bioreactor gặp một số vấn đề đó là hình thái rễ
tơ của các loài thực vật khác nhau là hoàn toàn khác nhau, đặc điểm như độ dày,
độ dài, độ phân nhánh của rễ bị ảnh hưởng bởi các loài thực vật và các chủng A.
rhizogenes sử dụng cho cảm ứng tạo rễ tơ. Ngoài ra, sự tăng trưởng tế bào và sản
xuất chất chuyển hóa là không đồng nhất trong rễ tơ đã làm khó khăn trong việc tối

ưu hóa hệ thống bioreactor.
Xuất phát từ các ưu điểm trên của hệ thống nuôi cấy rễ tơ và những tác dụng
dược lý quý của cây Sâm dây, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nuôi cấy
sinh khối rễ tơ Sâm dây (Codonopsis sp.) trong hệ thống bioreactor”. Công trình
này được thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
1.2. Mục đích nghiên cứu
1.2.1. Mục tiêu tổng quát: Nghiên cứu cơ sở khoa học và thực nghiệm của việc tạo
sinh khối cây Sâm dây làm nguyên liệu sản xuất dược phẩm và thực phẩm chức năng
bằng công nghệ nuôi cấy rễ tơ.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể:
-

Lựa chọn dòng rễ tơ sâm dây sinh trưởng và phát triển ổn định.

-

Tối ưu môi trường nuôi cấy rễ tơ sâm dây.

-

Nuôi cấy nhân sinh khỗi rễ tơ trên các hệ thống bioreactor.

-

Bước đầu định lượng hàm lượng saponin trong sinh khối rễ tơ so với dược liệu tự

nhiên.

1.3. Nội dung nghiên cứu
- Phân tích các dòng rễ tơ bằng phương pháp PCR
- Đánh giá sinh trưởng của các dòng rễ tơ
- Tối ưu môi trường nuôi cấy rễ tơ sâm dây trên môi trường đặc
- Tối ưu môi trường nuôi cấy rễ tơ sâm dây trên môi trường lỏng
- Nuôi cấy sinh khối rễ tơ trong hệ thống bioreactor
- Tách chiết hoạt chất
- Bước đầu định lượng saponin tổng số.
1.4. Ý nghĩa khoa học
Làm cơ sở cho việc sản xuất quy mô công nghiệp sinh khối rễ tơ cây Sâm dây
cho mục đích làm nguyên liệu dược phẩm và thực phẩm chức năng.


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Tổng quan về cây Sâm dây

1.1.1. Giới thiệu về phân bố địa lý
Cây Sâm dây hay Đảng sâm có tên khoa học là Codonopsis sp. là loài cây dược
liệu sử dụng củ. Cây thân leo, sống lâu năm, thường phân bố tại các vùng núi cao có
khí hậu mát mẻ quanh năm. Cây sâm dây thuộc họ Hoa chuông (Campanulaceae).
Đảng sâm phân bố nhiều ở vùng Đông Bắc Á. Ở Việt Nam, trong thời gian
1961-1985 viện Dược liệu đã phát hiện Đảng sâm ở 14 tỉnh vùng núi phía Bắc; còn ở
phía Nam chỉ thấy xuất hiện ở vùng Tây Nguyên. Vùng phân bố tập trung nhất ở các
tỉnh Lai Châu, Sơn La, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Gia Lai, Kon Tum, Quảng
Nam, Đà Nẵng, Lâm Đồng.
1.1.2. Phân loại
Giới

: Plantae

Phân giới

: Tracheobionta

Nhóm lớn

: Spermatophyta

Nhóm

: Magnoliopsida

Bộ

: Campanulales


Họ

: Campanulaceae

Loài

: Codonopsis sp.

Hình 1.1. Cây Sâm dây
(Nguồn:
)

1.1.3. Hình thái
Sâm dây là cây thảo sống lâu năm, có xu hướng leo bằng thân quấn, phân nhánh
nhiều, phía dưới hơi có lông, phía ngọn nhẵn (Hình 1.1). Toàn thân có mủ trắng. Lá
mọc đối, ít khi mọc so le; gốc lá hình tim; đầu lá nhọn, phiến lá mỏng hình trứng rộng,
dài 3 - 8 cm, rộng 2 – 4 cm; mép nguyên lượn sóng hoặc hơi


khía răng cưa; mặt trên màu lục nhạt; mặt dưới màu trắng xám, nhẵn hoặc có lông rải
rác. Hoa mọc riêng ở kẽ lá. Có cuống dài 2 – 6 cm. Đài có 5 phiến hẹp; tràng hình
chuông, màu trắng hoặc hơi vàng, có vân tím ở họng; chia 5 thuỳ, nhị 5, chỉ nhị hơi
dẹt; bao phấn dính gốc; bầu hình cầu có 5 ô. Quả nang hình cầu, có 5 cạnh mờ, đầu
bẹt, phía trên có một núm nhỏ hình nón, đường kính 1 – 2 cm, có đài tồn tại; khi chín
màu tím hoặc đỏ; hạt nhiều, màu vàng nhạt, bóng. Rễ hình trụ dài, đường kính có thể
đạt 1 – 1,7 cm. Đầu rễ phình to, trên có nhiều vết sẹo lồi của thân cũ, phía dưới
thường phân nhánh; mặt ngoài màu vàng nhạt, khi khô màu vàng xám (Đỗ Tất Lợi,
2005).
1.1.4. Tác dụng dược lý của cây Sâm dây
Tác dụng dược lý của cây Sâm dây đã được công bố rộng rãi trên thế giới thông
qua nhiều đề tài nghiên cứu khoa học về điều trị bệnh tiểu đường, khả năng tăng
cường sức khoẻ, tác dụng với hệ tiêu hoá, tác dụng với hệ tm mạch, tác dụng đối với
máu và hệ thống tạo máu, đối với điều hoà huyết áp, chống mệt mỏi, chống oxy
hoá, kháng ung thư, kháng khuẩn và tăng cường hệ thống miễn dịch (Ueda et al.,
2002; Li et al., 2004; Chan et al., 2009; Wang et al., 1996; Luo et al., 2007; Liu et al.,
1988; Yongxu et al., 2008; He et al., 2015; He et al., 2014). Các dược tnh của
Codonopsis sp. có thể là do các thành phần hợp chất có trong cây có khả năng cải
thiện

sức

khoẻ

con

người,

bao

gồm:

cacbohydrates, glycosides, steroids,

alkaloids, terpenes… Theo C. G. Fu và cs (2007) ở loài Codonopsis lanceolata có 6
flavonoids, 4 alkaloids, 12 triterpenes và sterol, 10 loại hợp chất dễ bay hơi, 12 nguyên
tố vi lượng và 17 acid amin (Fu et al., 2007). Dịch chiết Codonopsis sp. có thể ngăn
ngừa và bảo vệ tế bào gan chống lại tổn thương do rượu (Bai et al., 2008; Zhang et
al., 2007), và có tác dụng chống đột biến, chống oxy hoá, chống lão hoá, cải thiện
khả năng miễn dịch, chống mệt mỏi, buồn ngủ, giảm đau , hạ huyết áp… (Peng et al.,
2009).


Thanh phân saponin đã lam nên công dung chınh cua Đang sâm cung như cac
vi thuôc sâm khac. Theo Ichikawa và cs (2009) khi phân tıch HPLC pha đao kêt hơp đâu
do khôi phô ion hoa tia điên phat hiên trong rê Codonopsis lanceolata chưa 7 saponin
gôm: lancemaside A, lancemaside B, lancemaside C, lancemaside E, lancemaside G,
Foetdissimoside A va aster saponin Hb. Ham lương lancemaside A thay đôi tư 2,65
đên 3,64 mg/g rê khô đôi vơi mâu Codonopsis Han Quôc, nhưng chı đat 0,101 mg/g
đôi vơi mâu co nguôn gôc tư Nhât Ban (Ichikawa et al., 2009)

Hınh 1.2. Câu truc hoa hoc saponin trong sâm dây (Ichikawa et al., 2009)

Bang 1.1. Câu truc hoa hoc 7 saponin trong Codonopsis lanceolata
(Ichikawa et al., 2009)
Hơp chất

Aglycone

R1

R2

Lancemaside A

I

β-GlcA

β–Xyl-(13)-β–Xyl-(14)-α- Rha(12)-α-Ara

Lancemaside B

I

β-GlcA

β-Xyl-(13)-β–Xyl-(14)-α- Rha(12)-α-Ara-(13)-Glc-β

Lancemaside C

I

β-GlcA

β-Xyl-(14)-α-Rha-(12)-α- Ara(13)-Glc-β


βGlc(13)β-GlcA

β-Xyl-(13)-β-Xyl-(14)-αRha-(12)-α-Ara-(13)

Lancemaside E

I

Lancemaside G

II

β-GlcA

β-Xyl-(13)-β-Xyl-(14)-α- Rha(12)-α-Ara-(13)

Foetidissimoside A

I

β-GlcA

β-Xyl-(14)-α-Rha-(12)-α-Ara aster

saponin Hb

I

β-GlcA

α-Rha-(12)-α-Ara


Joh và cs (2010) cho thấy Lancemaside A có khả năng tăng tnh kháng viêm gây ra
bởi các lipopolysaccharide ở trên chuột thử nghiệm. Lancemaside A làm giảm sự hoạt
động của các tác nhân gây viêm, bên cạnh đó, nhóm tác giả cho thấy hoạt chất này có
khả năng kháng viêm dựa trên cơ chế kết hợp với tác nhân gây viêm là lipopoly
saccharide và TLR4 (một protein tham gia vào quá trình phát hiện tác nhân gây bệnh ở
người và động vật) (Joh et al., 2010). Kim và cs (2014) cho thấy Lancemaside A tách
chiết từ rễ cây Codocopsis lanceolata có khả năng điều khiển cơ chế đáp ứng viêm
gián tiếp qua bạch cầu và đại thực bào (Kim et al., 2014). Ngoài khả năng, tăng khả
năng kháng viêm ở động vật thử nghiệm, năm 2013 Hyam và cs cho thấy
Lancemaside A có khả năng gây ức chế đối với
TNBS- một tác nhân gây viêm ruột kết ở chuột thí nghiệm (Hyam et al., 2013).
Bên cạnh các saponin, rễ Codonopsis sp. còn chứa các polysaccharide có dược
tính quý trong điều trị một số bệnh ở người, tnh gây độc đối với các khối u, tăng
cường khả năng miễn dịch ở người.
Hoạt động chống khối u: Polysaccharide từ C. pilosula có thể ức chế sự hoạt động
của các tế bào ung thư dạ dày người và các tế bào ung thư gan (Yang et al.,
2011). Một pectic polysaccharide ở rễ Codonopsis sp. có khả năng gây độc với tế bào
ung thư phổi người (Yang et al., 2013). Một nghiên cứu in vitro sử dụng tế bào HO8910 (ung thư buồng trứng) cho thấy một polysaccharide có tnh axit có nguồn gốc từ
rễ C. pilosula có thể làm giảm sự xâm nhập và di căn của các tế bào khối u thông qua
việc giảm biểu hiện CD44 (Xin et al., 2012). Khả năng gây ức chế sự phát triển khối u
đã được ghi nhận ở những con chuột được tiêm tế bào khối u và uống 50 hoặc
100mg/kg một trong hai polysaccharides của C. pilosula sẽ làm ức chế khoảng 22,86 56,73 % sự phát triển của khối u (Xu et al., 2012).

Bảng 1.2. Khả năng ức chế khối u ở chuột của CPPW1 và CPPW1B
(Xu et al., 2012)


TT

Trọng lượng
khối u (g)

NC

2,45 ± 0,24

Tỷ lệ ức chế
(%)

Trọng lượng
lá lách tương
đối (mg/g)
6,01

Trọng lượng
tuyến ức
tương đối
(mg/g)
2,16

PC

1,90

0,89b

63,67

5,12

CL

1,64b

33,06

7,34b

2,45a CH

1,06b

56,73

8,46b

2,61b CBL

1,89a

22,86

6,14

2,24
CBH

1,56b

36,33

6,35

2,31

NC: Đối chứng âm; PC: đối chứng dương; CL: CPPW1 (50 mg/kg); CH: CPPW1 (100
mg/kg); CBL: CPPW1B (50 mg/kg); CBH: CPPW1B (100 mg/kg); aP<0,05 và bP<0,01.
Tác dụng trên hệ miễn dịch, chống viêm: Zhang và Wang thấy rằng 6 ngày uống
polysaccharide (800 mg/kg/ngày) từ C. pilosula có tác dụng trên chuột suy giảm miễn
dịch gây ra bởi cyclophosphamide, bao gồm tăng cường hoạt động các tuyến ức, lách
và các hoạt động thực bào của các đại thực bào phúc mạc và phục hồi hoạt động của α
- naphthyl - acetate esterase trong tế bào lympho ngoại vi. Trong một nghiên cứu
miễn dịch in vitro, một polysaccharide tan trong nước ở liều 50, 100 và 200
mg/mL có thể tăng sinh tế bào lympho kích thích bởi concanavalin A- hoặc
lipopolysaccharide (LPS) (Sun, 2009). Ngoài ra, chiết xuất methanol của C. pilosula gây
ức chế cảm ứng nitric oxide synthase và oxy hóa protein trong quá trình kích thích
LPS ở dòng tế bào đại thực bào chuột RAW
264.7 (Yoo et al., 2013). Một nghiên cứu in vitro khác cho thấy, một
polysaccharide từ C. pilosula có thể kích thích sự biệt hóa của tế bào lách trong chống
viêm kích thích bởi LPS (Yongxu et al., 2008). Vai trò chống viêm còn được chứng
minh khi một polysaccharide từ C. pilosula biểu hiện tăng sản xuất kháng nguyên khi
dùng chung với một loại vắc-xin, cho thấy polysaccharide này có thể được sử dụng

như một chất bổ trợ (Sun, 2009). Một nghiên cứu đánh giá


hoạt động của các đại thực bào thực bào cho thấy một polysaccharide có khả năng
tăng hoạt động thực bào, sau khi uống 50 hoặc 100mg/kg dịch chiết C. pilosula mỗi
ngày, có thể làm tăng khả năng thực bào tương ứng là 15,6% và 28,7% (Xu
et al., 2012).
Trong kết quả nghiên cứu về hiệu quả tác dụng chống oxi hóa của dịch chiết các
cây Panax quinquefolium, Panax notoginseng, Codonopsis pilosula, Pseudostellaria
heterophylla và Glehnia litoralis của nhóm tác giả T.B. Ng và cs (2004) cho thấy dịch
chiết từ cây Codonopsis pilosula và Glehnia littoralis có tác dụng cao nhất trong việc
ức chế hiện tượng huyết tán. Các kết quả cũng cho thấy nếu chỉ quan tâm đến hoạt
động chống oxi hóa thì các cây Panax notoginseng, Codonopsis pilosula,
Pseudostellaria heterophylla và Glehnia litoralis là các đối tượng thay thế rẻ hơn cây
nhân sâm.
Nghiên cứu của Chen và cs (2013) cho thấy dịch chiết từ cây Codonopsis javanica
có khả năng làm giảm dần hiện tượng insulin cao và quá trình peroxide hóa ở những
con chuột kháng insulin được nuôi bằng fructose. Yang và cs (2013), đã tách chiết và
xác định được cấu trúc một pectic polysaccharide (CPP1b) từ cây Codonopsis
pinocuda. Theo nghiên cứu này, CPP1b được tách chiết bằng phương pháp sắc kí cột
cellulose DEAE, phân tử này có khối lượng khoảng 1,45x 105 Da. Pectic CPP1b có khả
năng kháng khối u do pectc này thể hiện tính gây độc với
các tế bào ung thư phổi A549 (Yang et al., 2013).
Khi thử nghiệm đánh giá hiệu quả chống lại bệnh béo phì của cây Codonopsis
lanceolata ở những con chuột bị béo phì. Các kết quả nghiên cứu gợi ý rằng cây
Codonopsis lanceolata có một tiềm năng lớn để ứng dụng trong việc chống lại bệnh
béo phì vì nó giảm sự hình thành và tích lũy quá mức các chất béo. Cây Codonopsis
lanceolata có tiềm năng là thực phẩm chức năng có thể sử

dụng trong kiểm soát và điều trị bệnh béo phì (Choi et al., 2013)
Các nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như dược tính của các loài
Codonopsis được thực hiện chủ yếu trên đối tượng rễ củ tự nhiên. Hiện chỉ có
9


một số ít nghiên cứu thành phần hoạt chất trên đối tượng là sinh khối tế bào
Codonopsis sp.
Trong nghiên cứu sự cảm ứng tạo rễ bất định và tách chiết chất Codonopside từ
Codonopsis lanceolata của Krishna và cs (2007). Theo nhóm tác giả này việc tạo rễ
trực tiếp từ mẫu lá của cây Codonopsis lanceolata trên môi trường MS với
30 g/L sucrose và các nồng độ khác nhau của các chất điều hòa sinh trưởng IAA, IBA
thì môi trường cơ bản với 3 mg/L IBA đạt được kết quả mọc rễ tối đa là
100%. Các rễ này tiếp tục được nuôi trên các môi trường lỏng B5, SH, MS để thiết
lập môi trường nuôi cấy rễ tối ưu. Kết quả là môi trường B5 với nồng độ IBA 0,5
mg/L có hiệu quả lớn nhất đối với sự sinh trưởng của rễ bất định trong bình nuôi cấy
250 ml cũng như nuôi cấy bioreactor. Trọng lượng rễ tươi là 6,19 gam tương đương
với 0,81 gam trọng lượng khô ở bình nuôi cấy thể tích 250 ml, ở bình nuôi cấy
bioreactor thể tích 2 lít là 48,56 gam trọng lượng tươi và 8,26 trọng lượng khô, sau
thời gian nuôi cấy một tháng. Các rễ thu được trong điều kiên nuôi cấy này cũng dày
hơn, cứng cáp hơn rễ tơ và phát triển được trong môi trường có sục khí mạnh. Thành
phần saponin ở các rễ nuôi cấy này được tách chiết và phân tích bằng dự liệu phổ,
dữ liệu này khớp với các dữ liệu đã được công bố trước đó. Nhóm tác giả cũng đã
phát triển được một phương pháp đơn giản và hiệu quả để sản xuất được các
Codonopside từ rễ bất định của Codonopsis lanceolata

(Krishna et al., 2007).

Codonopside có tác dụng cảm ứng chết theo chương trình của các tế bào bạch cầu
hạt non trong điều trị bệnh ung thư máu ở người (Lee et al., 2005). Do đó, việc nuôi

cấy rễ tơ cây Codonopsis lanceolata trong bioreactor có thể coi là nguồn nguyên liệu
thay thế cho việc tách chiết hoạt chất sinh học có giá trị cao.
Theo các nghiên cứu khoa học ở Việt Nam, sâm dây có tác dụng tăng cường sức
khoẻ, chống mệt mỏi và tăng sự thích nghi của động vật thử nghiệm trong môi
trường nhiệt độ cao. Đối với hệ tiêu hóa, sâm dây có tác dụng tăng cường trương lực
của hồi tràng và cường độ co bóp càng tăng nếu tăng nồng độ thuốc.

10
10


Đối với hệ tim mạch, sâm dây làm tăng cường độ co bóp của tim, tăng lượng máu cho
não, chân và nội tạng, còn đối với máu và hệ thống máu: sâm dây có tác dụng làm tăng
số lượng hồng cầu, huyết sắc tố, làm giảm số lượng bạch cầu. Ngoài ra, sâm dây còn
có tác dụng hạ huyết áp, tăng cường miễn dịch của cơ thể, có tác dụng kháng viêm,
hóa đàm, giảm ho, kháng khuẩn...
Công trình “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của vị thuốc Đảng sâm
Việt Nam” của Hoàng Minh Chung và cs (2002) là nghiên cứu lần đầu tiên công bố các
thành phần hóa học của cây Đảng sâm Việt Nam. Bằng một số phương pháp định tính
và định lượng trên các mẫu củ sâm tươi và cao sâm, nhóm tác giả này đã đưa ra một
số kết luận về đặc điểm thực vật của cây sâm dây mọc ở Sapa; các thành phần có
trong rễ sâm dây khô và tươi: đường khử, acid amin, chất béo và saponin; thành phần
và hàm lượng của các loại acid amin có trong rễ sâm dây. Nhóm tác giả này cũng đã
công bố kết quả những nghiên cứu về hợp chất saponin có trong sâm dây. Loại
saponin chủ yếu là saponin triterpenoid, hàm lượng saponin vào khoảng 3,12 ± 0,08 %.
Các nghiên cứu trong nước trên cây Sâm dây còn rất hạn chế, mới chỉ dừng lại ở
phân tích thành phần hóa học, các tác dụng dược lý và nhân nhanh giống cây sâm dây
bằng phương pháp nuôi cấy mô.
1.1.5. Tính cấp thiết của việc nghiên cứu, bảo tồn và sản xuất bền vững cây
Sâm dây

Do giá trị y dược quý của cây Sâm dây hiện nay đã được nhiều người biết đến
và giá trị kinh tế cao nên sâm dây bị khai thác quá mức làm giảm khả năng tái sinh và
phát triển của cây, dẫn đến cạn kiệt và có nguy cơ tuyệt chủng. Cây sâm dây đã
được đưa vào chương trình bảo tồn các loài cây quý hiếm ở Việt Nam.
Trước tình hình trên, bên cạnh việc nghiên cứu giá trị của cây Sâm dây ở Việt
Nam, phân tích dược tính để đưa ra những hướng dẫn chiết xuất, sử dụng tốt nhất
phục vụ sức khoẻ cộng đồng, cần sớm nghiên cứu áp dụng nuôi cấy sinh

11
11