THỬ NGHIỆM NUÔI CẤY MÁU HEO TRONG BÌNH KÍN CÓ CHỨA 1,32 G MUỐI NaHCO NHẰM PHỤC VỤ CHO VIỆC NGHIÊN CỨU NHIỄM SẮC THỂ 3

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI - THÚ Y
****************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM NUÔI CẤY MÁU HEO TRONG BÌNH KÍN
CÓ CHỨA 1,32 G MUỐI NaHCO 3 NHẰM PHỤC VỤ CHO
VIỆC NGHIÊN CỨU NHIỄM SẮC THỂ

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ KIM THÙY
Lớp: DH07TA
Ngành: Chăn Nuôi
Niên khóa: 2007 - 2011

Tháng 08/2011


BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y
****************

NGUYỄN THỊ KIM THÙY

THỬ NGHIỆM NUÔI CẤY MÁU HEO TRONG BÌNH KÍN
CÓ CHỨA 1,32 G MUỐI NaHCO 3 NHẰM PHỤC VỤ CHO
VIỆC NGHIÊN CỨU NHIỄM SẮC THỂ
Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư chăn nuôi chuyên
ngành Thức ăn

Giáo viên hướng dẫn
ThS. QUÁCH TUYẾT ANH
ThS. BÙI THỊ TRÀ MI

Tháng 08/2011

i


PHIẾU XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Họ và tên sinh viên thực tập: Nguyễn Thị Kim Thùy
Tên đề tài: “Thử nghiệm nuôi cấy máu heo trong bình kín có chứa 1,32 g muối
NaHCO 3 nhằm phục vụ cho việc nghiên cứu nhiễm sắc thể”.
Đã hoàn thành luận văn theo đúng yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các ý
kiến nhận xét, đóng góp của hội đồng chấm thi tốt nghiệp Khoa Chăn Nuôi Thú Y
ngày...… tháng…… năm ……
Giáo viên hướng dẫn

ThS. Bùi Thị Trà Mi

ii


CẢM TẠ
 Kính dâng lòng biết ơn đến
Những người đã tận tình chăm sóc, dạy bảo, an ủi, động viên và hi sinh suốt
đời cho con có được ngày hôm nay.
 Chân thành cảm tạ

Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
Ban chủ nhiệm khoa Chăn Nuôi Thú Y cùng toàn thể quý thầy cô đã tận tình
giảng dạy và tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt thời gian học tập tại đây.
ThS. Quách Tuyết Anh, ThS. Bùi Thị Trà Mi đã tận tình giảng dạy, hướng
dẫn, động viên, giúp đỡ, tạo mọi điều thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập
và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Thầy, cô và các anh chị trong trại heo khoa Chăn Nuôi Thú Y trường Đại
Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đề tài
Thầy Đoàn Trần Vĩnh Khánh đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong suốt thời
gian làm đề tài

 Cảm ơn
Cảm ơn tất cả bạn bè trong và ngoài lớp Thức ăn 33 đã giúp đỡ và động viên
tôi vượt qua mọi khó khăn. Cảm ơn bạn Tú, Hưng, Hải lớp Chăn nuôi 33
Xin nhận ở tôi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất.

Nguyễn Thị Kim Thùy

iii


TÓM TẮT
Đề tài đã được thực hiện từ tháng 2/2011 đến tháng 7/2011 tại phòng thí
nghiệm Bộ Môn Di Truyền Giống Động Vật và Phòng Nuôi Cấy Vi Sinh thuộc bộ
môn Vi Sinh - Truyền Nhiễm Khoa Chăn Nuôi - Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm
Tp. Hồ Chí Minh với mục tiêu nghiên cứu là thử nghiệm nuôi cấy máu heo trong
bình kín có chứa 1,32 g NaHCO 3 nhằm phục vụ cho việc nghiên cứu nhiễm sắc thể.
Đề tài được thực hiện qua 2 giai đoạn:

•

Giai đoạn 1: Lấy mẫu máu và nuôi cấy mẫu trong vòng 72h. Máu được nuôi

cấy trong môi trường RPMI 1640 có bổ sung các chất giúp cho sự phát triển của tế
bào như huyết thanh phôi bò (FBS), phytohemaglutinin (PHA), kháng sinh
penicillin - streptomycin (1X). Mẫu được nuôi ở 2 môi trường: và môi trường trong
bình kín thể tích 2 l có chứa 1,32 g muối NaHCO 3 và môi trường chuẩn - trong tủ
ấm CO 2 với CO 2 điều chỉnh tự động ở mức 5 %. Ở giai đoạn này quan sát sự phát
triển của mẫu dựa vào mắt thường.

•

Giai đoạn 2: Sau 72h nuôi cấy mẫu được xử lý và nhuộm nhiễm sắc thể bằng

dung dịch Giemsa. Sau đó quan sát trên kính hiển vi dưới độ phóng 400X và 1000X
và chụp hình nhiễm sắc thể.
Kết quả:

• Nuôi cấy mẫu trong bình kín có chứa 1,32 g muối NaHCO 3 cho kết quả khả
quan về sự phát triển của tế bào lympho (80%). Điều này sẽ giúp các phòng
thí nghiệm có thể chủ động nghiên cứu NST bằng quy trình nuôi cấy tế bào
lympho khi không có tủ ấm có CO 2 tự động.
• Điều kiện ngoại cảnh có thể ảnh hưởng rất lớn đến kết quả, do đó khi thí
nghiệm cần chú ý đến vần đề này.
• Trong quá trình nghiên cứu ta có thể loại bỏ mẫu căn cứ vào biểu hiện về
màu sắc, độ đông vón và nhiễm khuẩn.

iv

MỤC LỤC
TRANG
Trang tựa .................................................................................................................. i
Phiếu xác nhận của giáo viên hướng dẫn ................................................................. ii
Lời cảm tạ ................................................................................................................ iii
Tóm tắt .................................................................................................................... iv
Mục lục ..................................................................................................................... v
Danh sách các chữ viết tắt ..................................................................................... viii
Danh sách các bảng ................................................................................................. ix
Danh sách các hình................................................................................................... x
Chương 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ......................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu ............................................................................................................. 2
1.3 Yêu cầu ............................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3
2.1 Tổng quan về heo ............................................................................................... 3
2.1.1 Phân loại .......................................................................................................... 3
2.1.2 Một số đặc điểm sinh lý .................................................................................. 3
2.1.3 Đặc điểm của máu heo .................................................................................... 3
2.2 Nhiễm sắc thể ..................................................................................................... 4
2.2.1 Khái niệm ........................................................................................................ 4
2.2.2 Hình thái kích thước ........................................................................................ 5
2.2.3 Tính đặc trưng của NST .................................................................................. 5
2.2.4 Cấu trúc NST................................................................................................... 5
2.2.4.1 Cấu trúc hiển vi của NST ............................................................................. 5
2.2.4.2 Cấu trúc siêu hiển vi của NST ..................................................................... 7
2.3 Chu kì sống của tế bào ....................................................................................... 9
2.3.1 Gian kì (interphase) ......................................................................................... 9

v

2.3.2 Nguyên phân ................................................................................................. 10
2.3.2.1 Kỳ đầu (prophase) ...................................................................................... 10
2.3.2.2 Kỳ giữa (metaphase) .................................................................................. 10
2.3.2.3 Kỳ sau (anaphase) ...................................................................................... 11
2.3.2.4 Kỳ cuối (telophase) .................................................................................... 11
2.4 Nghiên cứu về kiểu nhân của heo .................................................................... 12
2.5 Kĩ thuật Splash ................................................................................................. 13
2.5.1 Các nguồn nguyên liệu nuôi cấy ................................................................... 14
2.5.2 Chất kích thích tế bào phân chia ................................................................... 15
2.5.3 Chất ức chế nguyên phân .............................................................................. 15
2.5.4 Dung dịch xử lý tế bào .................................................................................. 16
2.6 Vai trò của khí CO 2 trong sự phát triển tế bào nuôi cấy in vitro ..................... 17
2.6.1 Cacbon dioxit (CO 2 ) ..................................................................................... 17
2.6.2 Các thuộc tính hóa lý..................................................................................... 17
2.6.3 Đặc tính sinh học ........................................................................................... 18
2.5.4 Vai trò của CO 2 trong sự phát triển của tế bào ............................................. 19
Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................... 20
3.1 Thời gian và địa điểm...................................................................................... 20
3.2 Đối tượng ........................................................................................................ 20
3.3 Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 20
3.4 Thiết bị và hóa chất ......................................................................................... 20
3.4.1Thiết bị ........................................................................................................... 20
3.4.2 Hóa chất ........................................................................................................ 21
3.4.2.1 Môi trường nuôi cấy tế bào bạch cầu ................................................................21

3.4.2.2 Các dung dịch sử dụng trong quá trình nhược trương, lên tiêu bản và nhuộm
NST .................................................................................................................................. 22
3.5 Phương pháp nuôi cấy ...................................................................................... 22

3.5.1 Phương pháp lấy máu heo ............................................................................. 22
3.5.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào ........................................................................ 23

vi


3.6. Kĩ thuật xử lý nhược trương, lên tiêu bản và nhuộm NST ............................. 26
3.6.1 Xử lí mẫu bằng dung dịch nhược trương và dung dịch cố định ................... 26
3.6.2 Chuẩn bị lame và nhuộm NST ...................................................................... 27
3.6.3 Chụp hình kì giữa và làm karyotype ............................................................. 27
3.7 Các chỉ tiêu khảo sát ........................................................................................ 27
3.8 Xử lý số liệu và hình ảnh ................................................................................. 28
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 29
4.1 Độ đông vón của mẫu ở 2 điều kiện nuôi cấy qua các mốc thời gian ............. 29
4.2 Tình trạng nhiễm khuẩn của mẫu ..................................................................... 32
4.3 Màu sắc của các mẫu ở 2 điều kiện nuôi cấy qua các mốc thời gian............... 33
4.4 Kết quả nhuộm NST ở 2 điều kiện nuôi cấy .................................................... 35
4.5 Tình trạng bạch cầu .......................................................................................... 37
4.6 Kiểu nhân của heo ............................................................................................ 41
4.7 Một số nguyên nhân ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy và nhuộm NST ........... 42
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................ 48
5.1 Kết luận ............................................................................................................ 48
5.2 Đề nghị ............................................................................................................ 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...............................................................................................49
PHỤ LỤC..........................................................................................................................51

vii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NST

Nhiễm sắc thể

ADN

Acid Deoxirybonucleic

ARN

Acid Ribonucleic

IUPAC

International Union of Pure and Applied Chemistry

RPMI

Roswell Park Memorial Institute

FBS

Fetal Bovine Serum

PHA

Phytohaemagglutinin

Hb

Hemogobin

BC

Bạch cầu

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
TRANG
Bảng 2.1 Số lượng NST của một số loài ................................................................. 5
Bảng 3.1 Môi trường nuôi cấy 1 ml máu ............................................................... 22
Bảng 4.1 Độ đông vón của mẫu ở 2 điều kiện nuôi cấy qua các mốc thời gian.... 29
Bảng 4.2 Số lượng mẫu bị nhiễm khuẩn ............................................................... 32
Bảng 4.3 Màu sắc của các mẫu ở 2 điều kiện nuôi cấy qua các mốc thời gian ..... 34
Bảng 4.4 Tỉ lệ thành công ở 2 điều kiện nuôi cấy ................................................. 35
Bảng 4.5 Tỉ lệ tình trạng bạch cầu ở hai điều kiện nuôi cấy ................................. 39

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH
TRANG
Hình 2.1 Nhiễm sắc thể .......................................................................................... 4
Hình 2.2 Các dạng nhiễm sắc thể ............................................................................ 6
Hình 2.3 Cấu trúc NST ............................................................................................ 7
Hình 2.4 Cấu trúc siêu hiển vi và phân tử của nhiễm sắc thể ................................. 8
Hình 2.5 Chu kỳ tế bào ............................................................................................ 9
Hình 2.6 Kỳ đầu của quá trình nguyên phân ......................................................... 10

Hình 2.7 Kỳ giữa quá trình nguyên phân ............................................................. 11
Hình 2.8 Kỳ sau quá trình nguyên phân ............................................................... 11
Hình 2.9 Kỳ cuối quá trình nguyên phân .............................................................. 12
Hình 2.10: Kiểu nhân của heo đực (Gustavsson, 1972) ..................................... 13
Hình 3.1 Phương pháp lấy máu tĩnh mạch cổ ....................................................... 23
Hình 3.2 (a) Chai Rough chứa môi trường nuôi cấy, (b) Chai Rough sau khi cho
thêm 1ml máu vào môi trường nuôi cấy ................................................................ 23
Hình 3.3 Mẫu nuôi cấy trong bình kín có chứa 1,32 g muối NaHCO 3 ................. 25
Hình 3.4 Mẫu nuôi cấy trong tủ ấm CO 2 .............................................................. 25
Hình 4.1 Mẫu bị đông vón thành cục máu đông ................................................... 30
Hình 4.2 Mẫu bị đông vón thành từng mảng, máu bị nhạt màu ............................ 31
Hình 4.3 Mẫu bị đông vón bám trên thành bình nuôi cấy ..................................... 31
Hình 4.4 Mẫu bị nhiễm khuẩn trong bình kín có chứa 1,32 g muối NaHCO 3 ..... 33
Hình 4.5 Màu sắc của mẫu nuôi cấy tốt sau 72 h (a) Mẫu nuôi cấy ở tủ ấm CO 2 , (b)
Mẫu nuôi cấy ở môi trường bình kín chứa 1,32 g muối NaHCO 3 ......................... 35
Hình 4.6 NST bung đều khi trong tủ ấm CO 2 (1000X) ........................................ 36
Hình 4.7 NST bung đều khi mẫu nuôi cấy trong bình kín có chứa 1,32 g muối
NaHCO 3 (1000X) .................................................................................................. 36
Hình 4.8 Bốn loại bạch cầu trong mẫu nuôi cấy tủ ấm CO 2 (400X) .................... 37

x


Hình 4.9 Bốn loại bạch cầu trong bình kín chứa 1,32 g muối NaHCO 3 (400X) .. 38
Hình 4.10 Các dạng nhiễm sắc thể (1000X) ......................................................... 38
Hình 4.11 Bộ NST của heo cái ............................................................................. 41
Hình 4.12 Bộ NST của heo đực............................................................................. 42
Hình 4.13 NST bung đều, nhưng bị co ngắn khi nuôi cấy trong bình kín (1000X) ..
................................................................................................................................ 43
Hình 4.14 NST bị co ngắn do ủ colcemid lâu khi nuôi cấy ở tủ ấm CO 2 (1000X) ..

................................................................................................................................ 44
Hình 4.15 NST chưa bung màng nhân (1000X) ................................................... 44
Hình 4.16 NST bị xử lý KCl quá mức nên bị tách rời ra (1000X) ........................ 45
Hình 4.17 NST bị rạn, nứt do ủ KCl lâu (1000X) ................................................. 45
Hình 4.18 Hai NST nằm cạnh nhau, chưa bung đều (1000X) .............................. 46
Hình 4.19 NST bị văng ra xa, khó phân biệt toàn bộ bộ NST (1000X) ................ 46
Hình 4.20 NST bung đều, đẹp (1000) ................................................................... 47

xi


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Nhân tế bào là bào quan tối quan trọng trong tế bào sinh vật nhân chuẩn. Nó
chứa các nhiễm sắc thể (NST) là vật liệu di truyền ở cấp độ tế bào, NST có khả
năng tái bản, mang vật liệu di truyền là các phân tử acid deoxyribonucleic (ADN)
và acid ribonucleic (ARN) mang gen quy định kiểu hình của cơ thể. Sự biến đổi về
cấu trúc, hoặc số lượng NST có thể dẫn đến những biến đổi ở kiểu hình bên ngoài
lẫn những tác động bên trong cơ thể gây ra những dị tật di truyền, kém phát triển,
mất khả năng sinh sản hoặc chết.
Ở nước ta, việc nghiên cứu NST trên người rất được quan tâm, tuy nhiên trên
vật nuôi thì vấn đề này chưa nhận được sự quan tâm nhiều. Trong khi nó lại rất cần
thiết trong công tác giống gia súc, gia cầm nhất là khi sử dụng thụ tinh nhân tạo và
kiểm tra đời sau. Trong chọn giống, nếu phát hiện sớm những bất thường ở NST thì
có thể làm giảm bớt mức thiệt hại về kinh tế. Theo 1 nghiên cứu ở Pháp (Ducos và
cộng sự, 2008), ước tính mức thiệt hại kinh tế nếu sử dụng 1 con heo nọc mang
NST bất thường để làm giống trong ít nhất 4 tháng là khoảng 20.000 euros.
Để tiến hành nghiên cứu NST, đòi hỏi các phòng thí nghiệm phải được trang
bị đầy đủ các thiết bị hiện đại như tủ ấm CO 2 , buồng cấy vô trùng…, tuy nhiên

không phải phòng thí nghiệm nào cũng đáp ứng được yêu cầu này.
Dựa trên những điều kiện sẵn có và được sự phân công của khoa Chăn Nuôi
Thú Y, dưới sự hướng dẫn của ThS. Quách Tuyết Anh và ThS. Bùi Thị Trà Mi
chúng tôi thực hiện đề tài: “Thử nghiệm nuôi cấy máu heo trong bình kín có
chứa 1,32 g muối NaHCO 3 nhằm phục vụ cho việc nghiên cứu nhiễm sắc thể”.
Nhằm định hướng, mở rộng phương pháp nuôi cấy tế bào, phục vụ cho việc nghiên
cứu NST trong các điều kiện khác nhau.

1


1.2 Mục tiêu
Thử nghiệm nuôi cấy máu heo trong bình kín có chứa 1,32 g muối NaHCO 3
nhằm phục vụ cho việc nghiên cứu nhiễm sắc thể.
1.3 Yêu cầu
• Nuôi cấy tế bào lympho đến giai đoạn trung kỳ trong bình kín trong 2 điều
kiện:
o Trong điều kiện có chứa 1,32 g muối NaHCO 3
o Trong điều kiện chuẩn - trong tủ ấm CO 2 với CO 2 điều chỉnh tự động
ở mức 5 %.
• Đánh giá sự phát triển của tế bào lympho khi nuôi cấy ở hai điều kiện trên.
• Tiến hành nhuộm NST bằng phương pháp nhuộm Giemsa và sắp xếp bộ
NST của heo.

2


Chương 2
TỔNG QUAN
2.1 Tổng quan về heo

Heo nhà có nguồn gốc từ heo rừng Châu Âu (Sus scrofa) và heo rừng Châu
Á (Sus cristatus và Sus vittatus). Heo được thuần hóa nhiều trên thế giới. Các giống
heo ở Đông Nam Á được thuần hóa ở Ấn Độ. Có tài liệu cho rằng heo còn được
thuần hóa ở vùng Siberi và Châu Âu, ở vùng ven biển Ban Tích hay ở vùng núi
Alpes (Phạm Trọng Nghĩa, 2008).
2.1.1 Phân loài
Giới (regnum):

Animalia

Ngành (phylum):

Chordata

Lớp (class):

Ma mmalia

Bộ (ordo):

Artiodactyla

Họ (familiar):

Suidae

Chi (genus):

Sus

2.1.2 Một số đặc điểm sinh lý
Thân nhiệt: 39,2 oC (khoảng biến động 38,8 oC - 39,8 oC)
Tần số hô hấp: 20 - 30 lần/phút
Nhịp đập tim: heo con 100 - 110 lần/phút, heo lớn 60 - 80 lần/phút
Tần số hô hấp: 8 - 18 lần/phút
Nhiệt độ môi trường thích hợp: 20 - 25 oC
2.1.3 Đặc điểm của máu heo
Ở heo khối lượng máu chiếm khoảng 7 - 8 % trọng lượng cơ thể. Lấy máu
chống đông rồi cho vào ống nghiệm ly tâm, ta thấy máu phân thành 2 lớp rõ rệt.
Phần trên là huyết tương trong và vàng nhạt chiếm 55 - 60 % thể tích, phần dưới là

3


tế bào máu, đặc và đỏ thẫm, chiếm 40 - 45 % thể tích.
Tế bào máu có ba loại tế bào là hồng cầu, tiểu cầu và bạch cầu. Số lượng
hồng cầu khoảng 6 - 8 triệu trong 1 mm3, chiếm hơn 90 % tế bào máu.
Hồng cầu có vai trò vận chuyển O 2 , CO 2 và tham gia điều hòa pH máu.
Số lượng tiểu cầu khoảng 150.000 - 600.000 trong 1 mm3, khi mạch máu vỡ,
tiểu cầu gắn vào bề mặt vết thương, giải phóng enzym thrombokinase có tác dụng
làm đông máu. Khi nuôi cấy tế bào máu, người ta dùng heparin để chống đông máu.
Số lượng bạch cầu của heo 12.000 trong 1 mm3 có nhiệm vụ bảo vệ cơ thể.
Có 5 loại bạch cầu chia làm 2 nhóm: bạch cầu có hạt và bạch cầu không hạt. Bạch
cầu có hạt có ba loại: trung tính, ưa acid và ưa base. Bạch cầu không hạt có hai loại:
đơn nhân lớn và lympho. Trong đó, bạch cầu lympho có khả năng phân chia nhanh
và nhiều nhất trong nuôi cấy in vitro.
2.2 Nhiễm sắc thể
2.2.1 Khái niệm
Là những cấu trúc nằm trong nhân tế bào, có khả năng nhuộm màu đặc trưng
bằng thuốc nhuộm màu kiềm tính. NST tồn tại trong tế bào thành từng cặp, được

xem là cơ sở vật chất của hiện tượng di truyền ở cấp độ tế bào, có những biến đổi
hình thái và hoạt động mang tính chu kỳ trong quá trình phân bào.

Hình 2.1 Nhiễm sắc thể
(Nguồn: />
4


2.2.2 Hình thái và kích thước
NST của các loài có nhiều hình dạng khác nhau: dạng hạt, que, hình chữ V,
hình móc. Điển hình là NST có hình chữ V với 2 cánh kích thước bằng nhau hoặc
khác nhau. Chiều dài của NST từ 0,2 - 50 mm, đường kính 0,2 - 2 mm. Kích thước
các NST sai khác nhau rất lớn. Giữa các loài khác nhau sự sai khác này có thể lên
tới hơn 100 lần, trong khi một số NST trong một loài có kích thước hơn kém nhau
khoảng 10 lần.
2.2.3 Tính đặc trưng của NST
- Mỗi loài sinh vật có bộ NST đặc trưng về số lượng, hình dạng, kích thước.
- Đặc trưng về số lượng, thành phần, trình tự phân bố các gen trên mỗi NST.
- Đặc trưng bởi các tập tính hoạt động của NST tái sinh, phân li, tổ hợp, trao
đổi đoạn, đột biến về số lượng, cấu trúc NST.
Bảng 2.1: Số lượng NST của một số loài
Người (Homo Sapiens)

2n = 46

Gà (Gallus gallus)

2n = 78

Heo (Sus scrofa domesticus)

2n = 38

Chó (Canis familiaris)

2n = 78

Mèo (Felis cantus)

2n = 38

Thỏ (Otyctolagus cuniculus)

2n = 44

Vịt (Anas platyrhyncha)

2n = 80

Ngựa (Equus asinus)

2n = 62

2.2.4 Cấu trúc NST
2.2.4.1 Cấu trúc hiển vi của NST
a) Tâm động
Tâm động (centromere) được gọi là eo thắt sơ cấp. Ở kỳ giữa, quan sát thấy
tâm động vì nó là nơi hai nhiễm sắc tử đính kết với nhau và giúp nhiễm sắc tử phân
ly tách về hai cực tế bào nhờ thoi vô sắc. Thể kèm hay eo thắt thứ cấp: trên NST
còn thấy có các eo thắt thứ cấp. Nếu eo thắt thứ cấp đủ sâu và dài thì bộ phận do eo

thắt đó tách biệt ra được gọi là thể kèm hay vệ tinh.

5


Tâm động chia thể nhiễm sắc thành hai vai, chiều dài của hai vai phụ thuộc
vào vị trí tâm động. Người ta thành lập chỉ số tâm động (tâm động index - Ic) để xác
định vị trí của tâm động và các kiểu hình NST. Ta có:
Ic = P / (P + Q)

Trong đó:
P: chiều dài vai ngắn
Q: chiều dài vai dài
Tùy theo vị trí tâm động và độ dài của vai do nó quy định mà có các kiểu NST sau:
Kiểu tâm mút (Tolocentric): tâm động nằm ở cuối NST.
Kiểu tâm cận mút (Acrocentric): tâm động nằm gần một đầu mút NST
Kiểu tâm lệch (Submetacentric): tâm động nằm lệch về một phía của NST
Kiểu tâm giữa (Metacentric): tâm động ở chính giữa NST.

Hình 2.2 Các dạng nhiễm sắc thể
(Nguồn: %20of
%20chromosomes.JPG)
b) Tolomere (thể mút)
Từ những năm 1930, hai nhà khoa học Hermann Muller (giải Nobel năm
1946) và Barbara McClintock (giải Nobel năm 1983) đã phát hiện thấy ở động vật
có vú, các đầu tận cùng của NST được bảo vệ bằng các telomere (theo tiếng Hy
Lạp, “telo” có nghĩa là cuối, còn “mere” là phần), tức là những cấu trúc đặc biệt

6

được hình thành bởi các chuỗi TTAGGG lặp lại kế tiếp nhau. Ở người các chuỗi lặp
lại của telomere có từ 5.000 đến 15.000 base.
Khi nghiên cứu trên NST của ngô Barbara McKlintock đã chứng minh là các
NST bị đứt gãy thể mút có xu thế dính kết với các đoạn NST khác bị mất thể mút và
như vậy thể mút có vai trò giữ cho các NST trong bộ không dính kết với nhau. Do
đó, thể mút có cấu trúc đặc biệt. Những dẫn liệu về cấu trúc phân tử đã chứng minh
là thể mút có ba chức năng quan trọng: (1) ngăn cản không cho enzym
deoxiribonucleaza phân giải đầu tận cùng của phân tử ADN, (2) ngăn cản không
cho các NST trong bộ dính kết với nhau và (3) tạo thuận lợi cho sự tái bản ADN ở
phần đầu cuối của phân tử.

Hình 2.3 Cấu trúc NST
(Nguồn: />mosome.jpg)
2.2.4.2 Cấu trúc siêu hiển vi của NST
Trong NST, ADN liên kết với protein tạo nên cấu trúc sợi xoắn nhiều cấp
được gọi là sợi nhiễm sắc (chromonema). Sợi nhiễm sắc cơ bản có đường kính 11
nm là chuỗi hạt cườm được gọi là sợi nucleosome (nucleosome fiber).
Mỗi hạt cườm là một nucleosome có kích thước 11 nm dạng khúc giò gồm
lõi được cấu tạo bởi 8 phân tử histon (2H2A, 2H2B, 2H3 và 2H4); sợi xoắn kép
ADN cuốn xung quanh lõi histon với một 3/4 vòng, chứa khoảng 146 đôi
nucleotide. Các nucleosome nối với nhau qua sợi xoắn kép ADN dài khoảng 60

7


nucleotide. Các sợi nucleosome 11 nm gấp khúc, cuộn lại nhờ các histon H1 để tạo
thành các sợi nhiễm sắc lớn hơn có đường kính 30 nm được gọi là sợi solenoid.
Sợi nhiễm sắc 30 nm sẽ gấp khúc tạo nên sợi có cấp độ đường kính lớn hơn
(khoảng 300 nm) chứa các vòng bên (looped domains). Mỗi vòng bên chứa khoảng

20.000 - 80.000 cặp nucleotide. Các sợi 300 nm sẽ cuộn lại tạo nên các sợi nhiễm
sắc ở cấp độ lớn hơn từ 700 - 1400 nm tức là các nhiễm sắc tử và nhiễm sắc thể thấy
rõ ở trung kỳ của phân bào.

Hình 2.4 Cấu trúc siêu hiển vi và phân tử của nhiễm sắc thể
(Nguồn: />af4g.jpg)

8


2.3 Chu kỳ sống của tế bào
Chu kỳ sống của tế bào là thời gian diễn ra kể từ thời điểm tế bào được hình
thành nhờ phân bào của tế bào mẹ và kết thúc bởi sự phân bào để hình thành tế bào
mới. Một chu kỳ tế bào bao gồm hai giai đoạn chính: gian kỳ và kỳ phân bào
(mitosis: M).

Hình 2.5 Chu kỳ tế bào
(Nguồn: />pg)
2.3.1 Gian kỳ (interphase)
Là thời kỳ nằm giữa hai lần phân chia liên tiếp, đây là giai đoạn tế bào diễn
ra các hoạt động chuyển hóa cao độ, tổng hợp và tái bản vật chất di truyền - ADN,
chuẩn bị tích cực cho tế bào bước vào nguyên phân. Tuỳ theo đặc điểm chức năng
người ta chia gian kỳ ra ba pha:
Pha G1: kéo dài từ sau khi tế bào phân chia đến khi bắt đầu sao chép vật chất
di truyền. Sự tích lũy vật chất nội bào đến một lúc nào đó đạt điểm tới hạn thì tế bào
bắt đầu tổng hợp ADN.
Pha S: là pha tổng hợp ADN. Cuối pha này số lượng ADN tăng gấp đôi.
Pha G2: là giai đoạn được nối tiếp sau pha S đến bắt đầu phân chia tế bào.
Khoảng thời gian gồm G1, S và G2 tế bào không phân chia và được gọi là kỳ trung

9


gian. Trong kỳ này tế bào thực hiện các hoạt động sống chủ yếu khác và sao chép
bộ máy di truyền. Ví dụ, thời gian tương ứng với bốn giai đoạn G1, S, G2 và M đối
với các tế bào máu trắng của người đang phân chia là 11, 7, 4 và 2 giờ.
Một số tế bào trưởng thành, như tế bào thần kinh và tế bào cơ vẫn giữ
nguyên ở kỳ trung gian, thực hiện các chức năng đã được biệt hóa cho đến lúc chết
và không phân chia nữa, gọi là pha G0. Tuy nhiên, một số tế bào có thể từ pha G0
quay lại đi vào chu kỳ tế bào. Mặc dù hầu hết các tế bào lympho trong máu người ở
pha G0, nhưng khi có kích thích phù hợp, chúng có thể quay lại chu kỳ tế bào. Pha
G0 chỉ ra sự vắng mặt của các tín hiệu cho nguyên phân và còn là một sự ức chế
hoạt tính của các gene cần thiết cho nguyên phân. Các tế bào ung thư không thể đi
vào pha G0 và được định trước để lặp lại chu kỳ tế bào một cách vô hạn.
2.3.2 Nguyên phân
2.3.2.1 Kỳ đầu (prophase)
Các trung thể chuyển động về 2 cực của nhân, các NST co lại thành sợi. Mỗi
NST gồm 2 sợi chromatid gắn nhau nhờ tâm động. Các sợi vô sắc tỏa ra từ tâm
động và trung thể. Màng nhân và hạch nhân biến mất dần.

Hình 2.6 Kỳ đầu của quá trình nguyên phân
(Nguồn: />sisDiagram2.jpg)
2.3.2.2 Kỳ giữa (metaphase)
Tâm động của mỗi NST kép gắn với thoi vô sắc và xếp ở mặt phẳng xích đạo
của tế bào. Kỳ giữa chấm dứt khi mỗi tâm động của mỗi chromatid bắt đầu tách ra.

10


Như vậy tâm động là điểm chia cuối cùng của NST. Điều này có ý nghĩa rất quan

trọng, nhờ đó chất di truyền được chia đều và đồng bộ cho các tế bào con

Hình 2.7 Kỳ giữa của quá trình nguyên phân
(Nguồn: />sisDiagram2.jpg)
2.3.2.3 Kỳ sau (anaphase)
Hai NST đơn tách nhau, và chuyển động về một cực tế bào. Các sợi vô sắc
co ngắn lại kéo các NST. Sự phân chia tế bào chất thường bắt đầu ở kì này.

Hình 2.8 Kỳ sau của quá trình nguyên phân
(Nguồn: />sisDiagram2.jpg)
2.3.2.4 Kỳ cuối (telophase)
Các nhiễm sắc thể bắt đầu tháo xoắn, nhân và màng nhân xuất hiện trở lại,
quá trình phân bào bắt đầu, nếp gấp bắt đầu xuất hiện.

11


Hình 2.9 Kỳ cuối của quá trình nguyên phân
Nguồn: />isDiagram2.jpg
2.4 Nghiên cứu về kiểu nhân của heo
NST được quan sát đầu tiên bởi Nageli năm 1842, nhưng đến năm 1888,
NST mới được Waldeyer đặt tên là “chromosome” (“chromo” có nghĩa là bắt màu
còn “ some” có nghĩa là một thể ).
NST heo được nghiên cứu hoàn thiện trong thế kỉ XIX (Wodsedalek, 1913).
Số lượng NST heo 2n = 38 được nghiên cứu từ năm 1931 nhưng không được công
nhận cho mãi đến những năm 50 khi có nhiều công trình nghiên cứu hơn và kĩ thuật
nuôi cấy mô được giới thiệu.
Kiểu nhân băng biết đến đầu tiên vào năm 1972 (Gustavsson và cộng sự,
1972; Hansen, 1972). Từ đó nhiều kĩ thuật nhuộm băng đã được áp dụng trên NST
heo. Bằng kỹ thuật nhuộm như: nhuộm giemsa, nhuộm huỳnh quang, nhuộm màu

kết hợp với xử lý bằng enzyme, hoặc bằng nhiệt sẽ làm xuất hiện các băng vạch trên
NST, kỹ thuật này được gọi là “banding”. Các kỹ thuật banding thường dùng là:
băng G, băng R, băng C, băng Q, băng T… Những kĩ thuật này làm tăng khả năng
xác định từng NST cũng như thực hiện các nghiên cứu về số lượng, cấu trúc NST.
Ở heo, kỹ thuật nhuộm bạc (Silver staining), dùng AgNO 3 cũng phát hiện ra.
ở Việt Nam, đã tiến hành nhuộm băng G nhiễm sắc thể và kiểu nhân heo Móng Cái,
heo Đại Bạch, và heo lai Đại Bạch x Móng Cái.
Dựa theo vị trí của tâm động chia NST heo ra làm bốn dạng là metacentric,
submetacentric, acrocentric và tolocentric. Mỗi nhóm được sắp xếp theo kiểu hình
và chiều dài giảm dần.

12


Hình 2.10 Kiểu nhân của heo đực (Gustavsson, 1972)
2.5 Kĩ thuật splash
Kĩ thuật này được sử dụng từ lâu. Nguyên tắc kĩ thuật splash là cố định những
tế bào nằm trên lame kính. Kĩ thuật này làm nhân bung ra, NST thoát ra và gắn chắc
trên lame kính sau khi dung dịch cố định khô đi. Cho đến nay, đã có nhiều thay đổi
trong kĩ thuật này nhưng phần lớn phụ thuộc vào mức độ yêu cầu để làm bung nhân
và tạo ra một NST nằm rời rạc không chồng chéo lên nhau. Kĩ thuật này có ưu điểm
là đơn giản, nhanh và là một phương pháp đáng tin cậy được dùng để nghiên cứu
NST.

13