Tinh chế và xác định độ tinh khiết của cleistantoxin phân lập từ quả của cây chà chôi (cleistanthus tonkinensis) làm nguyên liệu thiết lập chuẩn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

ĐÀO TÚ ANH

TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT
CỦA CLEISTANTOXIN PHÂN LẬP TỪ QUẢ
CỦA CÂY CHÀ CHÔI (CLEISTANTHUS
TONKINENSIS) LÀM NGUYÊN LIỆU
THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

ĐÀO TÚ ANH

TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT
CỦA CLEISTANTOXIN PHÂN LẬP TỪ QUẢ
CỦA CÂY CHÀ CHÔI (CLEISTANTHUS
TONKINENSIS) LÀM NGUYÊN LIỆU
THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 8720210
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Đoàn Thị Mai Hƣơng
NCS. ThS. Nguyễn Lâm Hồng

HÀ NỘI 2018


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được luận văn này, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS.
Đoàn Thị Mai Hƣơng - Viện Hóa Sinh Biển Việt Nam và NCS.Ths. Nguyễn Lâm
Hồng - Giảng viên bộ môn Kiểm Nghiệm Thuốc và Độc Chất - Trường Đại học
Dược Hà Nội, người đã trực tiếp hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá
trình thực hiện luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Kiểm Nghiệm Thuốc và Độc
Chất – Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình giảng dạy, truyền đạt tri thức giúp
tôi có thể áp dụng vào thực nghiệm để hoàn thiện luận văn này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Lê Công Vinh và các anh chị ở trung tâm
tiên tiến – Viện Hóa Sinh Biển Viện Hàn Lâm khoa học và công nghệ Việt Nam,
cùng các em Nguyễn Văn Hoàng, Bùi Bích Phương sinh viên K68 – Trường Đại
Học Dược Hà Nội đã hỗ trợ và phối hợp với tôi trong quá trình thực hiện. Những
kinh nghiệm và kỹ năng học hỏi được đã góp phần giúp tôi thực nghiệm chính xác
hơn, thực tế hơn.
Cuối cùng tôi xin kính chúc các thầy, cô và các em dồi dào sức khoẻ và thành công
trong sự nghiệp. Đồng kính chúc các cô chú, anh chị trong Viện Hóa Sinh Biển luôn
mạnh khoẻ, đạt được nhiều thành tựu trong công việc.
Trân trọng!

Hà Nội, ngày 4 tháng 4 năm 2018

Ds. Đào Tú Anh


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..............................................................................................................
MỤC LỤC ....................................................................................................................
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .....................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN .........................................................................................3
1.1. Tổng quan về thực vật của cây Chà Chôi (Cleistanthus tonkinensis) ............3
1.1.1. Vị trí và phân loại ..............................................................................................3
1.1.2. Sơ lược về thực vật họ Thầu Dầu (Euphorbiaceae) .........................................3
1.1.3. Sơ lược về thực vật chi Cách Hoa (Cleistanthus) .............................................3
1.1.3.1. Đặc điểm thực vật.........................................................................................3
1.1.3.2. Thành phần hóa học ....................................................................................4
1.1.3.3. Hoạt tính sinh học ........................................................................................4
1.1.4. Loài Cleistanthus tonkinensis ...........................................................................4
1.2. Hợp chất Cleistantoxin ......................................................................................5
1.2.1. Tính chất............................................................................................................5
1.2.2. Bộ dữ liệu phổ cleistantoxin .............................................................................5
1.2.3. Các nghiên cứu trước đây về cleistantoxin .......................................................6
1.2.4. Một số nghiên cứu xác định tạp chất liên quan trong etoposid.........................7
1.3. Chất chuẩn và quy trình thiết lập chuẩn .........................................................8
1.3.1. Khái niệm về chất chuẩn đối chiếu ...................................................................8
1.3.2. Phân loại chất đối chiếu hóa học .......................................................................9
1.3.2.1. Chất chuẩn đối chiếu hóa học gốc (PCRS- chuẩn gốc).............................9
1.3.2.2. Chất đối chiếu hóa học thứ cấp (SRCS-Chuẩn thứ cấp) ........................10

1.3.3. Tổng quan về thiết lập chất chuẩn ..................................................................10
1.4. Các kỹ thuật phân tích xác định độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập
chất chuẩn. ...............................................................................................................13
1.4.1. Bản chất và nguồn gốc của tạp chất trong hoạt chất .......................................13
1.4.2. Các kỹ thuật xác định tạp chất ........................................................................14
1.4.2.1. Kỹ thuật xác định gián tiếp .......................................................................14
1.4.2.2. Kỹ thuật xác định trực tiếp (phƣơng pháp tuyệt đối) ............................21
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................22
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu.......................................................................................22
2.2.1. Nguyên liệu .....................................................................................................22
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất ..............................................................................22
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................23
2.2.1. Tinh chế và xác định cấu trúc cleistantoxin phân lập được từ quả cây Chà
Chôi (Cleistanthus tonkinensis) ................................................................................23
2.2.2. Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp chất liên quan bằng HPLCDAD………………………………………………………………………………..24
2.2.2.1. Khảo sát điều kiện chạy sắc ký .................................................................24
2.2.2.2. Thẩm định phƣơng pháp ...........................................................................24
2.2.3. Xác định hàm lượng tạp chất bay hơi, xác định hàm lượng tạp chất vô cơ,
xác định độ tinh khiết của chất đối chiếu trong nguyên liệu thiết lập chuẩn ............25
2.2.3.1. Định lƣợng tạp chất bay hơi ......................................................................25
2.2.3.2. Xác định hàm lƣợng tạp chất vô cơ ..........................................................25
2.2.3.3. Xác định độ tinh khiết của chất đối chiếu trong nguyên liệu thiết lập
chuẩn ........................................................................................................................25
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................................27


3.1. Tinh chế và xác định cấu trúc cleistantoxin phân lập từ cao cồn quả của
cây Chà Chôi (Cleistanthus tonkinensis) ...............................................................27
3.1.1. Tinh chế cleistantoxin phân lập từ cao cồn quả của cây Chà Chôi

(Cleistanthus tonkinensis) .........................................................................................27
3.1.1.1. Giai đoạn 1: Tách phân đoạn cao cồn (168 g) đƣợc chiết xuất từ quả
của cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis, Jabl.) trên cột tổng silicagel. .......27
3.1.1.2. Giai đoạn 2: Phân lập từ phân đoạn 7 (6,5273 g) trên cột silicagel .......28
3.1.1.3. Giai đoạn 3: Phân lập chất cleistantoxin (7B) từ dịch cái trên cột
sephadex ...................................................................................................................29
3.1.1.4. Giai đoạn 4: Quy trình tinh chế cleistantoxin bằng phƣơng pháp kết
tinh ............................................................................................................................31
3.1.2. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng cleistatoxin tinh chế được ...........................31
3.1.2.1. Tính chất: ....................................................................................................31
3.1.2.2. Góc quay cực riêng: ...................................................................................31
3.1.2.3. Xác định nhiệt độ nóng chảy ....................................................................31
3.1.2.4. Dự đoán giá trị pka của cleistantoxin trong nguyên liệu thiết lập chuẩn
bằng phần mềm ChemBioOffice 2014 ...................................................................33
3.1.2.5. Bộ dữ liệu phổ ............................................................................................33
3.2. Xây dựng phƣơng pháp xác định tạp chất liên quan trong nguyên liệu thiết
lập chất chuẩn bằng HPLC-DAD. .........................................................................42
3.2.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký ...............................................................................42
3.2.1.1. Khảo sát và lựa chọn cột và dung môi pha động.....................................42
3.2.1.2. Lựa chọn bƣớc sóng phát hiện ..................................................................45
3.2.1.3. Khảo sát thể tích tiêm ................................................................................47
3.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích .................................................................48
3.2.2.1. Độ đặc hiệu..................................................................................................48


3.2.2.2. Độ phù hợp hệ thống ..................................................................................55
3.2.2.3. Giới hạn định lƣợng (LOQ) ......................................................................57
3.2.2.4. Độ tuyến tính .............................................................................................58
3.2.2.5. Độ chụm ......................................................................................................59
3.2.2.6. Độ ổn định của dung dịch phân tích .........................................................64

3.3. Xác định độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập chuẩn ...............................64
3.3.1. Xác định hàm lượng tạp bay hơi bằng phương pháp mất khối lượng do làm
khô……………...…………………………………………………………………..64
3.4.

Xác định độ tinh khiết bằng phƣơng pháp quét nhiệt vi sai .................67

3.5.

Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở nguyên liệu thiết lập chất chuẩn

cleistantoxin
…………………………………………………………………………….67
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN ......................................................................................70
4.1. Tính mới và ứng dụng: ....................................................................................70
4.2. Quy trình phân lập, tinh chế. ..........................................................................70
4.3. Bộ dữ nhận dạng cleistantoxin ........................................................................70
4.4. Xây dựng phƣơng pháp xác định tạp chất liên quan bằng HPLC-DAD ....70
4.5. Xác định hàm lƣợng tạp bay hơi và tạp chất vô cơ ......................................72
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................73
KẾT LUẬN ..............................................................................................................73


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Một số điều kiện sắc ký xác định tạp chất liên quan trong etoposid ..........7
Bảng 1.2: Ví dụ xác định độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập chuẩn ..................12
Bảng 1.3: Các phương pháp định lượng tạp chất liên quan ......................................14
Bảng 1.4: Các chỉ tiêu cần thẩm định của một số quy trình phân tích ......................17
Bảng 1.5: Các phương pháp định lượng tạp bay hơi ................................................18
Bảng 1.6: Các phương pháp định lượng tạp vô cơ....................................................20

Bảng 2.1: Dung môi hóa chất sử dụng trong nghiên cứu .........................................23
Bảng 3.1: Kết quả xác định nhiệt độ nóng chảy của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn
cleistantoxin bằng DSC và mao quản theo DĐVN V phụ lục 6.7 ............................32
Bảng 3.2: Các đỉnh phổ IR đặc trưng của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn
cleistantoxin ..............................................................................................................34
Bảng 3.3: Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn
so với tài liệu đã công bố [28]. ..................................................................................37
Bảng 3.4: Bộ dữ liệu nhân dạng cleistantoxin ..........................................................41
Bảng 3.5: Chương trình gradient 1............................................................................43
Bảng 3.6: Tối ưu hóa chương trình dung môi (chương trình gradien 2) ..................44
Bảng 3.7: Khảo sát bước sóng 203 nm và 286 nm ...................................................46
Bảng 3.8: Chương trình Gradien 2 ............................................................................48
Bảng 3.9: Kết quả thẩm định độ phù hợp hệ thống ..................................................56
Bảng 3.10: Độ lặp lại tại LOQ ..................................................................................57
Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ tuyến tính ...............................................................58
Bảng 3. 12: Kết quả thẩm định độ lặp lại..................................................................60
Bảng 3.13: Kết quả thẩm định độ chính xác trung gian ............................................61
Bảng 3.14: Kết quả thẩm định độ tái lặp...................................................................62
Bảng 3.15: Kết quả đánh giá sự khác biệt của phương sai giữa 2 phòng thí nghiệm
...................................................................................................................................63
Bảng 3.16: Kết quả khảo sát độ ổn định của dung dịch phân tích ............................64
Bảng 3.17: Kết quả định lượng tạp bay hơi bằng .....................................................65


Bảng 3.18: Kết quả định lượng tạp chất vô cơ bằng phương pháp tro sulphat .........66
Bảng 3.19: Kết quả xác định độ tinh khiết của cleistantoxin trong nguyên liệu thiết
lập chuẩn. ..................................................................................................................66
Bảng 3.20: Tiêu chuẩn cơ sở nguyên liệu thiết lập chuẩn cleistantoxin ...................67

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Công thức cấu tạo của cleistantoxin ...........................................................5
Hình 1.2: Dữ liệu NMR của cleistantoxin (1H: 500 MHz, 13C: 125 MHz, CDCl3) ..6
Hình 1.3: Cấu trúc của Cleistantoxin và Etoposid….……………………………….8
Hình 3.1: Quy trình phân lập và tinh chế cleistantoxin ............................................30
Hình 3.2: Độ tinh khiết sắc ký cleistantoxin trước tinh chế......................................30
Hình 3.3: Độ tinh khiết sắc ký cleistantoxin sau tinh chế .........................................31
Hình 3.4: Giản đồ nhiệt DSC xác định nhiệt độ nóng chảy của nguyên liệu thiết lập
chất chuẩn cleistatoxin ..............................................................................................32
Hình 3.5: Kết quả dự đoán hằng pka của cleistantoxin .............................................33
Hình 3.6: Phổ IR của cleistantoxin trong tài liệu đã công bố [28]............................33
Hình 3.7: Phổ IR của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin .......................34
Hình 3.8: Phổ UV-VIS của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin ..............35
Hình 3.9: Phổ HR-MS của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin...............35
Hình 3.10: Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500MHz) của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn
cleistantoxin ..............................................................................................................36
Hình 3.11: Phổ 13C-NMR (CDCl3, 500MHz) của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn
cleistantoxin. .............................................................................................................36
Hình 3.12: Phổ 1H-1H COSY của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin ....39
Hình 3.13: Phổ HMBC của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin .............39
Hình 3.14: Phổ NOESY của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin ............40
Hình 3.15: Phổ CD của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistantoxin ....................41
Hình 3.16: SKĐ khảo sát tách tạp liên quan tách khỏi cleistantoxin trên cột phenyl
và hệ pha động ACN: đệm acetat pH 4 theo chương trình gradient 1 ......................43
Hình 3.17: SKĐ khảo sát tách tạp liên quan khỏi cleistantoxin trên cột C18 và hệ
pha động ACN: Acid formic : Triethylamin : nước theo chương trình gradient 1 ...43
Hình 3.18: SKĐ khảo sát tách tạp liên quan khỏi cleistantoxin trên cột C18 và hệ
pha động ACN: nước theo chương trình gradient 1 ..................................................44
Hình 3.19: SKĐ khảo sát tách tạp liên quan khỏi cleistantoxin trên cột C18 và hệ
pha động ACN: nước theo chương trình gradient 2 ..................................................45

Hình 3.20: Phổ UV của cleistantoxin và các tạp chất liên quan ...............................46
Hình 3.21: Kết quả khảo sát thể tích tiêm .................................................................47
Hình 3.22: Sắc ký đồ dung dịch mẫu trắng và cleistantoxin 1000 ppm ...................50
Hình 3.23: Xác định độ tinh khiết pic cleistantoxin 1000 ppm. ...............................50
Hình 3.24: Phổ 3D của dung dịch cleistantoxin 1000 ppm ......................................51
Hình 3.25: Sắc ký đồ dung dịch phân giải cleistonkinensis B - cleistantoxin cleistonkinensis A .....................................................................................................52


Hình 3.26: Sắc ký đồ dung dịch cleistantoxin 1000 ppm phân hủy trong môi trường
acid/base. ...................................................................................................................53
Hình 3.27: Chồng phổ pic tạp phân hủy trong H2SO4 với cleistonkinensis B ..........54
Hình 3.28: Sắc ký đồ dung dịch cleistantoxin 1000 ppm phân hủy trong các môi
trường khắc nghiệt.....................................................................................................54
Hình 3.29: Sắc ký đồ dung dịch phân giải ................................................................56
Hình 3.30: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn cleistantoxin 0,05 ppm xác định LOQ. .......57
Hình 3.31: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ.59
Hình 3.32: Kết quả xác định độ tinh khiết bằng phương pháp quét nhiệt vi sai .......67


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Nuclear Magnetic Resonance, phổ cộng hưởng từ hạt nhân
C-NMR Carbon
13
C
1
H-NMR Proton nuclear Magnetic resonance, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H
13

ACN

Atomic Absorption Spectrophotometric, phương pháp phổ hấp thụ
nguyên tử
Acetonitril

APG

Angiosperm Phylogeny Group, Hệ thống phân loại thực vật

ARS

Chất chuẩn chính thức khu vực ASEAN

BP

British Pharmacopoeia, Dược Điển Anh

CD

Circular dichroism, phổ CD

CDCl3

Cloroform

COSY

Correlation spectroscopy, phổ COSY

d

Doublet

DSC

Differential scanning calorimetry, quét nhiệt vi sai

HĐDĐ

Hội đồng Dược điển

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Correlation, phổ HMBC

HPLC
HR-MS

High-performance liquid chromatography, Sắc ký lỏng hiệu năng
cao
High-Resolution Mass Spectrometry, phổ khối phân giải cao

HT29

Tế bào ung thư Đại tràng

IC50

Nồng độ ức chế 50% số lượng cá thể

ICH

International Council for Harmonisation

ICP

Inductively coupled plasma, quang phổ phát xạ plasma

ICRS

International Chemical Reference Substances, chất chuẩn quốc tế

AAS

IUPAC

International Union of Pure and Applied Chemistry, Liên minh
Quốc tế về Hóa học thuần túy và Hóa học ứng dụng

KB

Tế bào biểu mô

KTN

Khoa thử nghiệm

LC-MS

Liquid chromatography–mass spectrometry, Sắc ký lỏng ghép đầu
dò khối phổ

LOQ

Limit of quantification, giới hạn định lượng

m/z

Mass/charge, Khối lượng/điện tích

MCF7

Tế bào ung thư vú

MCF7R

Tế bào ung thư vú kháng thuốc

MeOH

Methanol

NMR

Nucleur Magnetic Resonance, phổ cộng hưởng từ hạt nhân

NOESY

Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy, phổ NOESY.

PCRS

Primary chemical reference substances, chất chuẩn sơ cấp

ppm

parts per million, phần triệu.

RSD

Relative standard deviation, độ lệch chuẩn tương đối

s

Singlet

S/N

Signal to noice ratio, tín hiệu/ nhiễu nền

SD

Standard deviation, độ lệch chuẩn

SRCS

Secondary chemical reference substances, chất chuẩn thứ cấp

TGA

Thermal gravimetric analysis, phân tích nhiệt trọng lượng

TLC

Thin Layer Chromatography, Sắc kí bản mỏng

USP

United States Pharmacopeia, Dược Điển Mỹ

VNRS

Chất chuẩn quốc gia Việt Nam

WHO

World Health Organization, Tổ chức Y Tế Thế giới

ᵟ H, ᵟ C

ᵟ H, ᵟ C: Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon


ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), ung thư là nguyên nhân dẫn đến tử vong
đứng thứ hai trên toàn cầu với 8,8 triệu người chết trong năm 2015 [30]. Nhiều liệu
trình điều trị đã được áp dụng như: hóa trị, xạ trị, can thiệp xâm lấn... tuy nhiên kết
quả vẫn chưa như mong đợi. Chính điều này đã thúc đẩy nhiều nhà khoa học tập
trung vào nghiên cứu các phương pháp cũng như các loại thuốc mới để chống lại
căn bệnh này và tạo ra một xu thế chung trên toàn cầu.

Cùng bắt nhịp với xu thế chung tại Việt Nam, một hướng nghiên cứu đang rất
được quan tâm là phát triển các thuốc điều trị ung thư có nguồn gốc từ dược liệu.
Năm 2009, dự án "Phòng thí nghiệm hợp tác Pháp - Việt, nghiên cứu hóa thực vật
của hệ thực vật Việt Nam" đã được khởi động, dịch chiết ethyl acetat của hơn 2500
loài thực vật ở Việt Nam đã được đem thử tác dụng trên dòng ung thư KB để sàng
lọc hoạt tính kháng ung. Một trong những kết quả nổi bật nhất đó là dịch chiết
ethylacetat từ quả của cây Cách Hoa Đông Dương (Cleistanthus indochinensis) đã
cho phần trăm ức chế dòng tế bào ung thư KB đạt khoảng 88,40 - 95,17%. Từ dịch
chiết quả của cây Cách Hoa Đông Dương, nhóm nghiên cứu đã phân lập, tinh chế
và xác định cấu trúc được 9 hợp chất tinh khiết nhóm aryltetralin lignan, trong đó
cleistantoxin có hoạt tính ức chế mạnh nhất trên các dòng tế bào ung thư thử
nghiệm (KB, MCF7, MCF7R, HT29) với giá trị IC50 trong khoảng 14 - 36 nM
(tương đương với khoảng 0,006 - 0,014 μg/ml) [6]. Bên cạnh đó, các hợp chất
glycosid của cleistantoxin phân lập được từ quả của cây Cách Hoa Đông Dương có
bộ khung phân tử rất giống như etoposid và teniposid hiện đang được sử dụng làm
thuốc điều trị ung thư phổi. Dựa trên các kết quả này, nhóm tác giả tiếp tục nghiên
cứu chiết xuất, phân lập, tinh chế phân đoạn giàu cleistantoxin và các aryltetralin
lignan được chiết xuất từ quả của cây Chà Chôi (một cây cùng chi với Cách Hoa
Đông Dương) để phát triển thành nguyên liệu làm thuốc điều trị ung thư.
Nhằm mục tiêu tìm kiếm nguồn dược liệu để chiết xuất và phân lập các hoạt
chất có tác dụng hóa trị liệu ung thư này, các chất chuẩn rất cần được thiết lập để

1


tiến hành định tính và định lượng các chất đã phân lập trên. Chính vì vậy, chúng tôi
tiến hành đề tài: "Tinh chế và xác định độ tinh khiết của cleistantoxin phân lập từ
quả của cây Chà Chôi (Cleistanthus tonkinensis) làm nguyên liệu thiết lập chất
chuẩn" được thực hiện với các mục tiêu:
1) Tinh chế và xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng cleistatoxin phân lập được từ quả

cây Chà Chôi (Cleistanthus tonkinensis).
2) Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hàm lượng tạp chất liên quan
trong nguyên liệu thiết lập chuẩn cleistantoxin bằng HPLC-DAD.
3) Xác định hàm lượng tạp chất bay hơi bằng mất khối lượng do làm khô, xác định
hàm lượng tạp chất vô cơ bằng phương pháp tro sulfat, xác định độ tinh khiết
của nguyên liệu thiết lập chuẩn cleistantoxin.

2


Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về thực vật của cây Chà Chôi (Cleistanthus tonkinensis)

1.1.1. Vị trí và phân loại
Theo APG III [10], cây Chà Chôi (Cleistanthus tonkinensis) được xếp loại như
sau: Thực vật có hoa (Angiosperms), thực vật hai lá mầm (Eudicots), nhánh hoa
hồng (Rosids), bộ Sơ-ri (Malpighiales), họ Thầu Dầu (Euphorbiaceae), chi Cách
Hoa (Cleistanthus).
1.1.2. Sơ lƣợc về thực vật họ Thầu Dầu (Euphorbiaceae)
Họ Thầu Dầu (Euphorbiaceae) hay còn gọi là họ Đại Kích là một họ lớn của
thực vật có hoa với 240 chi và khoảng 6000 loài. Trước đây chia thành 5 phân họ
bao gồm Acalyphoideae, Crotonoideae, Euphorbioideae, Oldfieldioideae và
Phyllanthoideae. Ba phân họ đầu tiên là các phân họ một lá mầm trong khi hai phân
họ sau là hai lá mầm [24]. Phần lớn là thân cây thảo, ở khu vực nhiệt đới cũng tồn
tại các loài cây bụi hoặc cây thân gỗ, phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới [3].
1.1.3. Sơ lƣợc về thực vật chi Cách Hoa (Cleistanthus)
1.1.3.1.

Đặc điểm thực vật

Là cây gỗ hay nhỡ, lá mọc so le xếp hai dãy, nguyên. Cụm hoa ở nách lá, thành
xim đơn hoặc bông, nhiều hoa hoặc ít hoa; lá bắc thường ngắn hơn hoa; hoa không
cuống hoặc có cuống, cùng gốc hoặc khác gốc; đài hợp ở gốc. Hoa đực có 4-6 lá
đài, thường là 5, xếp van. Cánh hoa 5 nhỏ, thường nguyên. Đĩa mật phẳng hay lồi.
Bầu không lông hoặc có lông nhung. Quả nang có 3 mảnh vỏ tròn ở lưng; hạt hình
trứng - 3 góc [24]. Chi Cleistanthus gồm tới 140 loài mọc tự nhiên từ châu Phi, Ấn
Độ đến Australia. Ở nước ta theo sách “Cây cỏ Việt Nam” của tác giả Phạm Hoàng
Hộ thì chi Cleistanthus có 14 loài [4]. Trong đó, một số loài đã được sử dụng trong
dân gian với nhiều mục đích khác nhau phục vụ cuộc sống [2], [3].

3


1.1.3.2.

Thành phần hóa học

Các nghiên cứu hóa học về chi Cleistanthus ở trên thế giới còn rất hạn chế. Các
hợp chất được phân lập từ các cây thuộc chi Cleistanthus có thể được phân loại như
sau: Các hợp chất lignan, các hợp chất terpen và một vài hợp chất khác.
Năm 2012, Trịnh Thị Thanh Vân và cộng sự đã tiến hành phân lập dịch chiết
quả của cây Cách Hoa Đông Dương (cùng chi với Chà Chôi) và xác định được cấu
trúc của 11 hợp chất, trong đó có 9 hợp chất mới gồm cleistantoxin,
demethoxycleistantoxin, podocleistantoxin, cleindosid A, cleindosid B, cleindosid
C, cleindosid D, cleindosid E, cleindosid F, và hai hợp chất đã biết là acid gallic và
amentoflavon. Các hợp chất mới là thành phần chính của quả, đều có khung cơ sở là
aryl tetralin lignan và các dẫn xuất glycosid của chúng [6].
1.1.3.3.

Hoạt tính sinh học

Ở chi Cleistanthus, người ta mới chỉ biết đến hoạt tính chống ung thư từ dịch
chiết cồn của loài Cleistanthus collinus kháng lại ung thư biểu mô nuôi cấy trong
mũi hầu người [22]. Năm 2012, trong khuôn khổ Dự án hợp tác Pháp - Việt về sàng
lọc hoạt tính sinh học của thảm thực vật Việt Nam, hợp chất cleistantoxin đã lần
đầu tiên được phân lập từ quả của cây Cách hoa Đông Dương (Cleistanthus
indochinensis Merr. ex Croiz) bởi Trịnh Thị Thanh Vân và các cộng sự. Kết quả
cho thấy hợp chất cleistantoxin cho hoạt tính ức chế rất mạnh trên các dòng tế bào
thử nghiệm (KB, MCF7, MCF7R, HT29) với giá trị IC50 trong khoảng 14 - 36 nM
[6].
1.1.4. Loài Cleistanthus tonkinensis
Cây gỗ nhỏ cao 1 - 3 m. Phiến lá tròn dài, to 7 - 13 x 2 - 5 cm, chót có mũi nhọn,
đáy tròn, mỏng, cứng, láng, gân phụ 7 - 8 cặp; cuống 1 cm, lá bẹ 2 - 3 mm. Chùm
hoa cao 1 - 1,5 cm; hoa nhỏ, không cọng; cánh hoa 5, to 1 mm, tiểu nhụy 5, nhụy
cái lép; hoa cái không cọng, cánh hoa 2 mm, đĩa mật quanh noãn sào có ít lông.
Nang (quả) xoan, cao 1,3 cm, nở làm 3 mảnh; cao 7 mm. Cây phân bố ở khu vực
rừng trên đá vôi từ Cao Bằng, Lạng Sơn đến Nghệ An, Hà Tĩnh [4].

4


Từ năm 2009, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam phối hợp với Viện Hóa học các hợp chất tự nhiên (Cộng hòa Pháp) đã thu hái,
định danh khoa học và thử sàng lọc hoạt tính sinh học dịch chiết ethyl acetat của
hơn 2500 loài thực vật Việt Nam trong đó có cây Chà Chôi về hoạt tính kháng tế
bào ung thư trên dòng ung thư KB. Kết quả cho thấy dịch chiết từ Cleistanthus
tonkinensis thể hiện khả năng ức chế mạnh sự phát triển của tế bào ung thư, cụ thể,
nó cho phần trăm ức chế dòng tế bào ung thư KB lên tới 88,40 - 95,17%. Đây là

tiền đề cho các nghiên cứu phân lập và tinh chế các hợp chất từ cây Chà chôi,
hướng tới mục tiêu phát triển một thuốc có nguồn gốc từ dược liệu để điều trị ung
thư.
1.2.

Hợp chất Cleistantoxin

Danh pháp IUPAC:
(7R,8R,7’R,8’R)-7-hydroxy-6-methoxy-3',4':4,5-bis(methylenedioxy)-2,7'-cyclo
lignan-9',9-olid
Công thức phân tử: C21H18O8. Khối lượng phân tử: 398,0 Da. Công thức cấu tạo:

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của cleistantoxin
1.2.1. Tính chất
Tinh thể rắn, màu trắng. Tan tốt trong dicloromethan, aceton và ACN, kém tan
trong MeOH. Nhiệt độ nóng chảy: 195 - 196ºC (aceton). Độ quay cực [α]30D -148,0
(c 0,5; CHCl3) [28].
1.2.2. Bộ dữ liệu phổ cleistantoxin
Bộ dữ liệu phổ đã được công bố trong các nghiên cứu bao gồm [28]
5


-

Phổ khối HRESI pic [M+Na]+ cho tín hiệu m/z 421.0888 phù hợp với công
thức phân tử C21H18O8Na.

-

Phổ UV (CHCl3) λmax nm (log ε): 207,3 (3,39); 240,0 (4,18); 286,7 (3,83)

-

Phổ IR (KBr) cho các đỉnh hấp thụ đặc trưng νmax 3565, 3466, 2931, 1773,
1617, 1483, 1297, 1230, 1142, 1047 cm-1

-

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và

13

C-NMR trong dung môi CDCl3

biểu diễn dưới hình 1.2

Hình 1.2: Dữ liệu NMR của cleistantoxin (1H: 500 MHz, 13C: 125 MHz, CDCl3)
1.2.3. Các nghiên cứu trƣớc đây về cleistantoxin
Một số cây thuộc chi cleistanthus: C. indochinensis, C. tonkinensis, C.
eberhardtii là các loài đặc thù ở Việt Nam. Trên thế giới có một số nghiên cứu về
các cây thuộc chi này, nhưng chưa có nghiên cứu nào công bố về định lượng hoạt
chất cleistantoxin. Tại Việt Nam các nhà khoa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa Học
6


và Công nghệ Việt Nam đã phát hiện ra hoạt chất cleistantoxin được phân lập từ
quả của một số loài thuộc chi cleistanthus có tác dụng kháng tế bào ung thư. Vì thế,
dịch chiết từ quả cây thuộc chi cleistanthus đang được nghiên cứu, phát triển thành
cao định chuẩn chứa hàm lượng cleistantoxin trên 50% làm nguyên liệu thuốc điều
trị ung thư trong pha tiền lâm sàng. Xuất phát từ thực tế trên rất cần có chất chuẩn

để định lượng cleistantoxin trong cao và tìm nguồn dược liệu để chiết xuất cao định
chuẩn này. Vì vậy chúng tôi cần thiết lập chất chuẩn cleistantoxin.
1.2.4. Một số nghiên cứu xác định tạp chất liên quan trong etoposid
Do phân tử cleistantoxin có cấu trúc khá giống etoposid là một thuốc đang được
điều trị ung thư nên chúng tôi tiến hành tìm kiếm các tài liệu liên quan đến việc
định lượng và xác định tạp chất liên quan của etoposid. Kết quả thu thập được một
số thông tin liên quan đến điều kiện sắc ký, được trình bày dưới bảng 1.1 và hình
1.1
Bảng 1.1: Một số điều kiện sắc ký xác định tạp chất liên quan trong etoposid
Tài liệu

Điều kiện

Chƣơng trình sắc ký

Cột phenyl 3,9 mm x 300 mm,
đường kính trong < 5μm

Dung dịch A: ACN: đệm = 20:80
Dung dịch B: ACN: đệm = 60:40

USP40
(Etoposid) [27]

Pha động ACN: đệm Acetat pH
4 (26:74)

Thời gian
(phút)

%A

%B

Tốc độ dòng: 1 ml/phút

0

100

0

Thể tích tiêm V= 20μl

15

100

0

30

40

60

40

40

60

42

0

100

45

0

100

47

100

0

50

100

0

Detector UV λ = 254nm

7

Cột C18 125 mm x 4,6 mm x 5
μm, nhiệt độ 400C

Pha động A: acid formic:
trimethylamin: nước
(1 : 1 : 998)

BP 2016 [12]
(Etoposid)

Pha động A: acid formic:
trimethylamin: nước

Pha động B: acid formic:
trimethylamin : ACN

(1 : 1 : 998)

( 1 : 1 : 998)

Pha động B: acid formic :
trimethylamin : ACN

Thời gian
(phút)

%A

%B

Tốc độ dòng: 1 ml/phút

0

75

25

Thể tích tiêm V= 10μl

7

75

25

Detector UV λ = 285nm

23

27

73

(1 : 1 : 998)

Hình 1.3: Cấu trúc của Cleistantoxin và Etoposid
1.3.

Chất chuẩn và quy trình thiết lập chuẩn

1.3.1. Khái niệm về chất chuẩn đối chiếu
Thuật ngữ “chất chuẩn đối chiếu” còn có nhiều cách gọi khác như “chất đối
chiếu hóa học” hay “chất chuẩn đối chiếu hóa học”. Theo Tổ chức Y tế Thế giới
(WHO), chất đối chiếu hóa học là nguyên liệu đồng nhất đã được chứng thực, được
sử dụng cho các mục đích cụ thể: phép thử vật lý và hóa học, trong đó tính chất của

8


nó được so sánh với các đối tượng kiểm tra và có độ tinh khiết phù hợp với mục
đích sử dụng [31].
1.3.2. Phân loại chất đối chiếu hóa học
1.3.2.1.

Chất chuẩn gốc (PCRS)

Chất chuẩn gốc là chất đối chiếu hóa học có phẩm chất phù hợp với từng mục
đích sử dụng và đặc tính của nó được chấp nhận mà không cần phải so sánh với
chất hoá học nào khác [7], [9], [11], [31]. Các PCRS có thể tìm được tại trung tâm
hợp tác về chất chuẩn đối chiếu của WHO; Hội Đồng Dược Điển Châu Âu; các
phòng thí nghiệm trực thuộc Hội Đồng Dược điển Anh [9], [14].
Một số chất chuẩn gốc chính thức:
-

Chất đối chiếu hóa học quốc tế (ICRS) là các chất đối chiếu hoá học được thành
lập theo khuyến cáo của ủy ban chuyên gia thuộc Tổ chức Y tế Thế giới về tiêu
chuẩn chất lượng Dược phẩm [31].

-

Chuẩn Dược Điển Mỹ: Được thiết lập và phân phối bởi Hội Đồng Chất Đối
Chiếu Dược điển Mỹ (USP Reference Standard Committee) [26].

-

Chuẩn Dược Điển Châu Âu được thiết lập và cung cấp bởi Ban Thư Ký Kỹ
thuật Thuộc Hội đồng Dược điển Châu Âu (Technical Secretariat of the
European Pharmacopoeia Commission) [20].

-

Chuẩn Dược Điển Anh được các phòng thí nghiệm trực thuộc Hội Đồng Dược
Điển Anh thiết lập [20].
Ngoài ra trong trường hợp chưa có chất chuẩn gốc chính thức, nhà sản xuất có

thể được xây dựng chất chuẩn gốc cơ sở (in-house primary reference standard).
Chất chuẩn gốc cơ sở là các chất được sản xuất và thiết lập bởi cơ sở hay nhà sản
xuất theo các quy trình và các tiêu chí của cơ sở. Chất chuẩn gốc cơ sở được tinh
chế, mô tả đầy đủ và xác định rõ cấu trúc (IR, UV, NMR, MS…), thường được sử
dụng cho các chất hóa học mới (New Chemical Entity - NCE) chưa có chuyên luận.

9


1.3.2.2.

Chất chuẩn thứ cấp (SRCS)

Là chất đối chiếu hóa học mà các đặc tính của nó được đánh giá và/hoặc hiệu
chuẩn theo chất cguaanr gốc [7], [9], [20], [31]. Mức độ tinh khiết và hiệu lực kiểm
tra của một chuẩn thứ cấp có thể thấp hơn đối với một chất chuẩn sơ cấp [9], [31].
Chất đối chiếu hóa học thứ cấp có hai loại:
-

SRCS “chính thức” là chất đối chiếu hóa học chính thức của khu vực hay quốc
gia.

 SRCS ASEAN là chất đối chiếu hóa học “chính thức” (của khu vực ASEAN),
do các phòng thí nghiệm của các Hội Đồng Dược Điển, viện kiểm nghiệm quốc
gia thiết lập nếu trong quá trình thiết lập chuẩn có sử dụng PCRS so sánh [19].
 Chuẩn quốc gia (VNRS) [7].
 Được thiết lập tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương – Bộ Y tế hoặc Viện
Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh – Bộ Y tế.
 Được đánh giá bởi ít nhất hai khoa thử nghiệm (KTN): khoa Thiết lập chất
chuẩn

chất đối chiếu và một khoa thử nghiệm khác trong Viện.

 Đu ợc liên kết với chất chuẩn gốc.
-

Chuẩn làm việc là một chất chuẩn đối chiếu hóa học thứ cấp do một nhà sản
xuất hoặc một phòng thí nghiệm cung cấp.

 Được đánh giá tại khoa Thiết lập chất chuẩn & chất đối chiếu.
1.3.3. Tổng quan về thiết lập chất chuẩn
 Tình hình nghiên cứu thiết lập chuẩn gốc trên thế giới
Hiện nay, trên thế giới việc nghiên cứu và phân phối chất chuẩn gốc chủ yếu

phát triển mạnh ở các nước có nền công nghiệp dược phẩm tiên tiến như Anh, Mỹ,
Đức, Nhật Bản, Trung Quốc ... các chất chuẩn được thiết lập được theo hướng dẫn
của Dược Điển hoặc WHO với các bước cơ bản sau:

10


Bước 1: Đánh giá nhu cầu thiết lập các chất chuẩn sơ cấp
Bước 2: Tìm kiếm nguồn nguyên liệu
Bước 3: Đánh giá nguyên liệu theo mục đích sử dụng
Bước 4: Đánh giá nguyên liệu dùng thiết lập chất đối chiếu hóa học
Bước 5: Xác định giá ấn định
Bước 6: Phê duyệt
Bước 7: Đóng gói, bảo quản, phân phối, kiểm tra định kỳ
Khi tiến hành đánh giá nguyên liệu thiết lập chất chuẩn, độ tinh khiết được tính
thông qua việc xác định hàm lượng các loại tạp chất bằng cách sử dụng các phương
pháp phân tích phù hợp và áp dụng nguyên tắc bảo toàn khối lượng [11], [31].
Độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn được tính theo công thức sau
[25], [32]
[%] HL = (100 – [%] tạp liên quan) x (100 – [%] tạp bay hơi – [%] tạp vô cơ)/100
= [%] HL (chuẩn hóa diện tích) x (100 – [%] tạp bay hơi – [%] tạp vô cơ)/100
Trong đó:
[%] HL: là độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập chuẩn (%).
[%] HL (chuẩn hóa diện tích): là độ tinh khiết sắc ký (%).
[%] tạp liên quan: hàm lượng tổng tạp chất liên quan tính theo chuẩn hóa
diện tích (%).
[%] tạp bay hơi: hàm lượng tạp bay hơi (%).
[%] tạp vô cơ: hàm lượng tạp vô cơ (%).
Một ví dụ minh họa cho việc xác định độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập
chất chuẩn theo hướng dẫn của WHO được trình bày dưới bảng 1.2 [32]

11


Bảng 1.2: Ví dụ xác định độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập chuẩn
Thành
phần

Tạp chất đối liên quan

Hàm lượng

2 tạp x 0,75% / mỗi tạp
( xác định bằng HPLC)

Độ
khiết

Nƣớc

Tạp đối quang

2,0% (chuẩn độ 1,0% (xác định bằng
Karl Fisher)
HPLC đối quang)

tinh %HL = 100% - 2% - (2 x 0,75% + 1,0%) x 0,98 = 95,55%
(Áp dụng khi sử dụng phương pháp chọn lọc với đồng phân đối
quang)
%HL = 100% - 2% - (2 x 0,75%) x 0,98 = 96,53%

(Áp dụng khi phương pháp không chọn lọc với đồng phân đối
quang)

 Tình hình nghiên cứu thiết lập chất chuẩn trong nước.
Hiện nay, Việt Nam gần như chưa có nghiên cứu nào được công bố về thiết lập
chất chuẩn gốc. Việc thiết lập chất chuẩn trong nước chủ yếu thực hiện bằng cách
nối chuẩn với chất chuẩn gốc được nhập từ nước ngoài, nhưng giá thành cao và
thường phải chờ đợi lâu. Thực trạng này đặt ra vấn đề cấp thiết phải tự chủ về
nguồn chất chuẩn.
Mặt khác tình hình quản lý chất lượng các sản phẩm thuốc đông dược lưu hành
trên thị trường cũng đang gặp rất nhiều khó khăn do thiếu chất chuẩn có nguồn gốc
dược liệu. Hiện nay, có hai đơn vị phân phối chất chuẩn chính thức là Viện Kiểm
nghiệm thuốc Trung ương (10 chất chuẩn dược liệu) và Viện Kiểm nghiệm thuốc
TP. HCM (18 chất chuẩn dược liệu), tuy nhiên số lượng này vẫn chưa đáp ứng được
nhu cầu thị trường. Do vậy, cần phải bổ sung thêm nguồn chất chuẩn đặc biệt là các
chất chuẩn dược liệu để đảm bảo việc kiểm soát chất lượng thuốc.
Từ những lý do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm tiếp cận với
hướng nghiên cứu thiết lập chất chuẩn gốc nhằm chủ động nguồn chất chuẩn phục
vụ cho công tác kiểm tra và quản lý chất lượng thuốc có nguồn gốc dược liệu.

12