Xây dựng công tác xác định một số dược chất nhóm hạ huyết áp trong chế phẩm đông dược bằng HPTLC và HPLC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN LỆ HOA

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
MỘT SỐ DƯỢC CHẤT NHÓM HẠ HUYẾT
ÁP TRỘN LẪN TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG
DƯỢC BẰNG HPTLC VÀ HPLC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN LỆ HOA

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
MỘT SỐ DƯỢC CHẤT NHÓM HẠ HUYẾT
ÁP TRỘN LẪN TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG
DƯỢC BẰNG HPTLC VÀ HPLC
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH : KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ : 8720210

Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh

HÀ NỘI 2018


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng cám ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều
Anh, người đã hướng dẫn và chỉ bảo tôi tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu,
hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ths. Trần Thúy Hạnh – Viện Kiểm Nghiệm
Thuốc Trung Ương đã giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu, thực hiện luận
văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Công ty cổ phần Traphaco đã giúp đỡ tôi trong
quá trình tạo nền mẫu của nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời chân thành cám ơn đến Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau
đại học, Bộ môn Hóa Phân tích – Độc chất, Viện Công nghệ dược phẩm quốc
gia đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập và làm luận văn.
Cuối cùng tôi xin dành lời cám ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn
khích lệ, tạo động lực cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua.
Hà Nội, tháng 3 năm 2018
Học viên
Trần Lệ Hoa


MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
Phần 1 : TỔNG QUAN .................................................................................... 3
1.1. Tình hình trộn các chất tân dược trong các chế phẩm đông dược .............. 3
1.1.1. Trên thế giới ....................................................................................... 3
1.1.2. Tình hình tại Việt Nam ....................................................................... 6
1.2. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu ....................................................... 8
1.2.1. Amlodipin besylat ............................................................................ 8
1.2.2. Nifedipin .......................................................................................... 9
1.2.3. Valsartan ......................................................................................... 10
1.2.4. Felodipin ......................................................................................... 11
1.3. Các nghiên cứu xác định các thuốc hạ huyết áp trộn trái phép vào các chế
phẩm Đông Dược .......................................................................................... 12
1.4. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu .................................................. 14
1.4.1. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao ........................................................ 14
1.4.2. Phương pháp HPLC ......................................................................... 15
Phần 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 19
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu .................................. 19
2.1.1. Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu ............................................ 19
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu ............................................................ 19
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................... 20
2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 20


2.2.1. Chế tạo nền mẫu ............................................................................... 20
2.2.2. Xây dựng phương pháp phân tích ..................................................... 20
2.2.3. Xây dựng quy trình xử lý mẫu .......................................................... 21
2.2.4. Thẩm định phương pháp phân tích ................................................... 22
2.2.5. Ứng dụng phương pháp phân tích mẫu thực lưu hành trên thị trường 22
2.3. Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................... 23

Phần 3 : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ.................................................... 24
3.1. Chuẩn bị nền mẫu ................................................................................... 24
3.2. Xây dựng phương pháp phân tích ........................................................... 25
3.2.1. Xây dựng phương pháp HPLC ......................................................... 25
3.2.2. Xây dựng phương pháp HPTLC ....................................................... 29
3.3. Xây dựng quy trình xử lý mẫu ................................................................ 32
3.4. Thẩm định phương pháp phân tích ......................................................... 36
3.5. Ứng dụng phương pháp phân tích mẫu thực lưu hành trên thị trường ..... 49
3.5.1. Kết quả phân tích mẫu thực bằng HPTLC ........................................ 50
3.5.2. Kết quả phân tích mẫu thực bằng phương pháp HPLC ..................... 52
Chương 4 : BÀN LUẬN ................................................................................. 54
4.1. Tạo nền mẫu ........................................................................................... 54
4.2. Xây dựng phương pháp phân tích ........................................................... 54
4.2.1. Lựa chọn phương pháp phân tích...................................................... 54
4.2.2. Xây dựng phương pháp sắc ký ......................................................... 55
4.2.3. Lựa chọn xử lý mẫu .......................................................................... 56
4.3. Thẩm định phương pháp ......................................................................... 57
4.4. Ứng dụng .............................................................................................. 58


KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................ 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
AML

Amlodipin Besylat

AOAC

Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức (Association
of Official Analytical Chemists)

FEL

Felodipin

HPLC
HPTLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)
Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (High Performance Thin
Layer Chromatography)

ICH

International Conference on Harmonisation

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)

Max

Maximum (Lớn nhất)

Min

Minimum (Nhỏ nhất)

NIF

Nifedipin

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

TB

Trung Bình

TLC

Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

TPBVSK

Thực phẩm bảo vệ sức khỏe

VAL

Valsartan

VKN

Viện Kiểm nghiệm

WHO

Tổ chức Y tế Thế giới


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1: Các nền mẫu nghiên cứu .............................................................. 24
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát thành phần pha động HPLC .............................. 26
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát dung môi chiết (n=3) ......................................... 35
Bảng 3.4: Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống ............................ 36
Bảng 3.5: Kết quả xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của AML,
NIF, VAL, FEL bằng HPLC. ....................................................................... 39
Bảng 3.6: Kết quả đánh giá khoảng nồng độ tuyến tính ................................ 40
Bảng 3.7: Kết quả đánh giá độ đúng và độ lặp lại (phương pháp HPLC) ...... 43
Bảng 3.8: Kết quả đánh giá độ lặp lại khác ngày (phương pháp HPLC) ....... 44
Bảng 3.9: Kết quả xác định LOD của phương pháp HPTLC ........................ 49
Bảng 3.10: Kết quả phân tích mẫu ứng dụng bằng phương pháp HPLC ....... 52


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1: Công thức cấu tạo của amlodipin besylat ........................................ 8
Hình 1.2: Công thức cấu tạo của nifedipin. ..................................................... 9
Hình 1.3: Công thức cấu tạo của valsartan.................................................... 10

Hình 1.4. Công thức cấu tạo của felodipin .................................................... 11
Hình 1.5: Sơ đồ hệ thống HPLC ................................................................... 16
Hình 3.1: Sắc ký đồ phân tích các chất với pha động MeOH : Dung dịch đệm
phosphat pH 3,0 (55 – 45) ............................................................................ 27
Hình 3.2: Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn cột sắc ký ......................................... 28
Hình 3.3: Phổ hấp thụ UV của các chất nghiên cứu ...................................... 28
Hình 3.4: Sắc ký đồ khảo sát pha động HPTLC............................................ 30
Hình 3.5: Sắc ký đồ lựa chọn hệ pha động HPTLC ...................................... 31
Hình 3. 6: Sắc ký đồ phát hiện ở 366 nm ...................................................... 32
Hình 3.7: Kết quả khảo sát lựa chọn dung môi chiết.................................... 33
Hình 3.8: Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc của phương pháp (238nm) ......... 38
Hình 3.9: Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc của phương pháp (360 nm) ......... 38
Hình 3.10: Sắc ký đồ LOD AML, NIF nồng độ 0,5µg/ml (nền N03)............ 39
Hình 3.11: Đồ thị biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng
độ của AML, NIF, VAL, FEL. ..................................................................... 41
Hình 3.12: Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc của phương pháp HPTLC.......... 46
Hình 3.13: Sắc ký đồ xác định giới hạn phát hiện của phương pháp HPTLC 48
Hình 3.14: Sắc ký đồ analog xác định LOD của phương pháp HPTLC ........ 49
Hình 3.15: Sắc ký đồ phân tích mẫu thực bằng phương pháp HPTLC .......... 51
Hình 3.16: Sắc ký đồ và phổ UV của mẫu chuẩn và mẫu M05 ..................... 53


ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo công bố của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), năm 2000, toàn thế giới có
tới 972 triệu người bị tăng huyết áp (THA) và con số này được ước tính là vào
khoảng 1,56 tỷ người vào năm 2025. Tại Việt Nam, năm 2000 có khoảng 16,3%
người lớn bị THA, đến năm 2009 tỷ lệ THA ở người lớn tuổi là 25,4% và năm
2016 tỷ lệ người lớn tuổi bị THA đang ở mức báo động là 48%, một mức báo
động đỏ trong thời điểm hiện tại [16].
Cùng với tỷ lệ người mắc bệnh tăng huyết áp ngày càng cao thì nhu cầu sử

dụng thuốc hạ huyết áp ngày càng lớn. Phác đồ điều trị bằng thuốc hạ huyết áp
là thường xuyên và liên tục, dẫn đến sự lo ngại của người dùng về những tác
dụng phụ do thuốc hóa dược gây ra. Xu hướng hiện nay người sử dụng thường
tìm về với những sản phẩm có nguồn gốc từ thảo dược. Trên thị trường, có
nhiều chế phẩm đông dược có tác dụng điều trị và hỗ trợ điều trị bệnh tăng huyết
áp cũng như các bệnh liên quan đến tăng huyết áp (tai biến mạch máu não, nhồi
máu cơ tim,…) được lưu hành để đáp ứng nhu cầu của người bệnh. Tuy nhiên,
với mục đích nâng cao lợi nhuận có một số đơn vị sản xuất trộn thuốc tân dược
vào chế phẩm thuốc đông dược hay thực phẩm bảo vệ sức khỏe. Đã có nhiều
công bố trên thế giới phát hiện được một số thuốc hạ huyết áp như amlodipin,
nifedipin, valsartan, hydrochlorothiazid, clonidin,…. thêm bất hợp pháp vào các
chế phẩm đông dược [32], [41], [23],[36]. Sự gian lận này được thực hiện nhằm
tạo ra các khả năng trị liệu không phải từ các thành phần được khai báo. Đây
đang là một trong những vấn đề rất đáng lo ngại.
Tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu phát hiện thuốc hóa dược trộn không
khai báo trong các sản phẩm Đông dược, chủ yếu tập trung vào các nhóm thuốc
như glucocorticoid, thuốc chống viêm không steroid, thuốc giảm hạ glucose
máu, thuốc giảm béo, thuốc ức chế PDE -5,… [2], [9], [10], [13], [15], nhưng
chưa công bố nghiên cứu nào về việc trộn lẫn các nhóm thuốc hạ huyết áp trong
thuốc đông dược và thực phẩm chức năng. Phương pháp hay được sử dụng trong
1


các nghiên cứu này là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và sắc ký lớp mỏng
(TLC). Với khả năng tách tốt, vừa định tính định lượng đồng thời các mẫu thử
có nền phức tạp như chế phẩm đông dược, nên HPLC và TLC là những lựa chọn
hàng đầu của các nhà phân tích. TLC có thể phân tích nhiều mẫu cùng một lúc,
quy trình xử lý mẫu đơn giản, thường dùng trong giai đoạn sàng lọc. Còn HPLC
với detector DAD có độ nhạy, độ chọn lọc cao, có khả năng tự động hóa, cùng
với tính phổ biến trong các phòng phân tích, rất phù hợp trong hầu hết các phép

phân tích thuốc.
Với mục đích góp phần vào công tác kiểm tra phát hiện các chất cấm trộn
lẫn trong chế phẩm đông dược, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Xây
dựng phương pháp xác định một số dược chất nhóm hạ huyết áp trộn
lẫn trong chế phẩm đông dược bằng HPTLC và HPLC”. Với mục tiêu:
1. Xây dựng phương pháp xác định amlodipin besylat, nifedipin, valsartan,
felodipin trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng HPTLC và HPLC.
2. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng được để xác định amlodipin
besylat, nifedipin, valsartan, felodipin trộn lẫn trong một số chế phẩm
đông dược (nếu có).

2


Phần 1 : TỔNG QUAN
1.1. Tình hình trộn các chất tân dược trong các chế phẩm đông dược
1.1.1. Trên thế giới
Trong những năm gần đây, xu hướng chọn sử dụng các sản phẩm có nguồn
gốc tự nhiên để phòng, hỗ trợ và điều trị bệnh ngày càng được ưa chuộng hơn
bởi người ta cho rằng các sản phẩm này ít có những tác động có hại và phù hợp
với sinh lý của cơ thể. Theo WHO và cục quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ
cho rằng các thuốc từ thảo dược bao gồm các vitamin, khoáng chất, thảo dược,
sản phẩm thực vật, acid amin, các chất dinh dưỡng. Các chế phẩm từ thảo dược
thường được bán hoặc mua qua đơn thuốc qua quầy thuốc (OTC) hoặc là người
dùng tự sử dụng. Mặc dù các loại thảo dược đã sử dụng từ lâu, nhưng người sử
dụng có rất ít kiến thức về an toàn và hiệu quả của nó. Chế phẩm từ thảo dược
chưa được quy định và được tự do mua bán từ các cửa hàng thực phẩm sức
khỏe, trong siêu thị, và trên internet. Do quy định ít chặt chẽ, thuốc thảo dược dễ
bị kém chất lượng và pha trộn với thuốc tổng hợp (tân dược) không khai báo.
Các nhóm thuốc tân dược hay được trộn vào là nhóm thuốc giảm glucose

máu, thuốc glucocorticoid, thuốc giảm đau không steroid, thuốc hạ huyết áp,
thuốc giảm béo, thuốc ức chế phosphodiestarase-5, thuốc kháng histamin, chất
kích thích tăng khả năng thi đấu trong thể thao, ...
Nhóm dược chất hay bị trộn nhất là glucocorticoid. Ở Anh đã phát hiện
nhiều trường hợp người bệnh nhập viện điều trị do tác dụng phụ khi dùng kem
dược liệu có trộn lẫn hydrocortison, clobetason butyrat, betamethason valerat,
clobetason propopnat [38]. Tại Ả Rập Xê Út, Maciej Bogus và cộng sự đã tiến
hành khảo sát 80 loại thuốc tân dược thuộc nhiều nhóm dược lý khác nhau,
thường được trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng phương pháp LCMS/MS, kết quả phát hiện bột dược liệu “Jamu Ragel” từ Indonesia với chỉ định
giảm đau thấp khớp chứa tân dược giảm đau chống viêm phenylbutazon và
dipyron [26]. Tại Ấn Độ, Savaliya và cộng sự đã tiến hành định tính 25 dược
3


chất gồm cả giảm đau, chống viêm steroid và không steroid bằng LC-MS/TOF
và phát hiện mẫu đông dược chứa các thuốc giảm đau chống viêm như
diclofenac, dexamethason, piroxicam [40]. Tại Singapore, năm 2003 Aik-Jiang
Lau và cộng sự đã phát hiện phenylbutazon, oxyphenylbutazon trộn lẫn trong
chế phẩm đông dược bằng sắc ký hai lần khối phổ (LC-MS/MS) [34].
Một nhóm dược chất cũng hay bị trộn vào chế phẩm đông dược là thuốc
chống đái tháo đường. Mei Cui sử dụng sắc ký lỏng cặp ion pha đảo (RP-IPC)
kết hợp với DAD để xác định đồng thời 14 loại thuốc chống đái tháo đường tổng
hợp trong các thuốc cổ truyền của Trung Quốc. Kết quả có 7 loại thuốc chống
đái tháo đường tổng hợp (glibenclamid, metformin, phenformin, rosiglitazon,
gliclazid, glimepirid và mitiglinid) được tìm thấy từ 9 trong số 26 mẫu thuốc cổ
truyền thu thập được [27]. Ning Li sử dụng phương pháp UPLC-MS/MS để phát
hiện và định lượng 14 loại thuốc chống đái tháo đường tổng hợp bổ sung bất
hợp pháp trong thuốc cổ truyền và thực phẩm chức năng của Trung Quốc. Kết
quả có 9 loại thuốc chống đái tháo đường tổng hợp (glibenclamid, metformin,
rosiglitazon, glimepirid, phenformin, gliclazid, chlorpropamid, nateglinid và

mitiglinid) được tìm thấy từ 14 mẫu trong số 30 mẫu thu thập từ thị trường [37].
Đặc biệt, chất có tác dụng tăng cường sinh lý nam giới cũng là một trong
những nhóm thuốc có tỷ lệ trộn rất cao thông qua nhiều nghiên cứu đã phát hiện
ra. Ở Hàn Quốc, một nghiên cứu tiến hành trong 4 năm (2009 - 2012) trên 164
mẫu thực phẩm chức năng được quảng cáo tăng cường sinh lý nam giới cho
thấy 77 mẫu phát hiện có chứa chất ức chế PDE-5 gồm có 55 mẫu phát hiện
tadalafil, 36 mẫu phát hiện sildenafil, 17 mẫu phát hiện đồng phân của
tadalafil (aminotadalafil, chloropretadalafil, octylnortadalafil), 17 mẫu phát hiện
đồng

phân

sildenafil

(dimethylsildenafil,

dimethylthiosildenafil,

hydroxyhomosildenafil, …), một số mẫu phát hiện vardenafil cùng đồng
phân (hydroxyvardenafil) và Icariin [31], [35]. Khảo sát gần đây được tiến
hành bởi một nhóm người Pháp phát hiện ra rằng 61% trong số 150 thực phẩm
4


chức năng đã được pha trộn với các chất ức chế PDE-5 (27% sildenafil, tadalafil
và vardenafil; 34% từ các chất có cấu trúc tương tự) [29].
Khaled Al-Tahami sử dụng phương pháp HPLC và TLC để phát hiện
sildenafil, tadalafil và vardenafil trộn trong các thực phẩm chức năng. Kết quả
đã phát hiện ra 21 mẫu sản phẩm có chứa sildenafil trong đó có 1 sản phẩm chứa
sildenafil và tadalafil và 1 sản phẩm chứa đồng thời cả ba chất sildenafil,

tadanafil và vardenafil [25].
Tiên T.K. Do và cộng sự đã sử dụng HPTLC và HPTLC- ESI/MS để phát
hiện 3 chất ức chế PDE -5 (sildenafil, vardenafil, tadalafil) và 8 chất tương tự
chúng trong viên nén, viên nang, cafe, kẹo nhai. Kết quả thu được cho thấy
trong 45 mẫu được kiểm tra thì có 31 mẫu có chứa ít nhất 1 trong các chất
sildenafil, tadalafil, propoxyphenyl, dimethyl sildenafil hydroxyhomosildenafil
[28].
Reni Septiani và Sophi Damayanti đã sử dụng HPTLC để phát hiện caffein,
acetaminophen, sildenafil citrat, tadalafil và vardenafil HCl trong các thuốc cổ
truyền của Indonesia [39].
Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các thuốc điều trị cao huyết áp cũng là
nhóm thuốc thường được trộn trái phép. Julie Regitze Kesting và cộng sự đã sử
dụng LC–HRMS và LC–MS–SPE/NMR phân tích viên nang mềm Gold Night
một thuốc thảo dược của Trung Quốc dùng để điều trị cao huyết áp, kết quả phát
hiện ba chất amlodipine, indapamin, valsartan được trộn trái phép trong viên
nang với hàm lượng amlodipine, indapamin và valsartan trong mỗi viên lần lượt
khoảng 1,3 mg; 1,3 mg và 30,8 mg [32]. Rui Zhang và cộng sự sử dụng phương
pháp quang phổ cận hồng ngoại (NIR) để phát hiện nifedipin, diclofenac,
metformin trong các thực phẩm bổ sung. Trong số các mẫu mua được trên thị
trường phát hiện 38 mẫu dương tính với nifedipin, 13 mẫu dương tính với
diclofenac, 35 mẫu dương tính với metformin. Phương pháp này được kiểm tra
lại bằng HPLC và 100% không có kết quả dương tính giả [41].
5


1.1.2. Tình hình tại Việt Nam
Tại Việt Nam, tỷ lệ thuốc không đạt chất lượng theo tiêu chuẩn đăng ký
chiếm khoảng 1,59% trong tổng số mẫu lấy để kiểm tra chất lượng [14]. Trong
đó tỷ lệ thuốc đông dược, dược liệu không đạt chất lượng cao hơn nhiều so với
các thuốc hóa dược. Do nhận thức được tính an toàn của các sản phẩm có

nguồn gốc từ tự nhiên nên nhu cầu về sản xuất và sử dụng các chế phẩm có
nguồn gốc thảo dược trong nước ngày càng tăng. Mặt khác, nguồn tài
nguyên cây thuốc dồi dào và nền y học cổ truyền lâu đời của nước ta cũng là
một trong những yếu tố thuận lợi cho thuốc có nguồn gốc từ thảo dược ngày
càng tăng. Hiện nay, các chế phẩm có nguồn gốc từ thảo dược được phát
triển theo nhiều hướng khác nhau như các bài thuốc gia truyền được sản
xuất tại các cơ sở sản xuất của các lương y, lương dược; các chế phẩm thuốc
đông dược, thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ thảo dược. Các chế phẩm
này thường được sử dụng để điều trị hoặc hỗ trợ phòng và điều trị các bệnh
gan, thận, tim-mạch…
Tại Việt Nam, chế phẩm đông dược có mặt trên thị trường trong nước hiện
nay rất đa dạng, nhiều thành phần, khó kiểm soát vì được bán qua nhiều kênh
khác nhau như trong hiệu thuốc, cửa hàng bán các sản phẩm chăm sóc sức khỏe,
qua mạng internet, đa cấp, siêu thị, … nên có nguy cơ cao các sản phẩm này
được làm giả gây ra nhiều tác dụng không muốn khi sử dụng cho người dùng.
Năm 2009, VKN thuốc Trung ương phát hiện thuốc Giải Biểu Hoàn của một
lương y ở Bắc Giang và thuốc Chỉ Thống của một lương y ở Bắc Ninh có trộn
paracetamol. Năm 2010 đã phát hiện cơ sở sản xuất thuốc Y học cổ truyền Hinh
Hòa có mẫu Khu Phong Tê Thấp Thủy và Truy Phong Tê Thấp Thủy bị trộn
betamethason. Một số mẫu thuốc đông dược điều trị gút cũng bị phát hiện có
paracetamol, indomethacin hay dexamethason acetat [15]. Trịnh Thị Quy đã tiến
hành

phân

tích

ba

glucocorticoid

(dexamethason,

prednislon

acetat,

dexamethason acetat) trộn trái phép trong thuốc đông dược bằng phương pháp
6


HPLC với detector DAD. Trong 12 mẫu khảo sát phát hiện có 3 mẫu trộn trái
phép dexamethason và dexamethason acetat [13].
Năm 2016, nhóm nghiên cứu của Đào Thị Cẩm Minh và cộng sự tại trường
đại học Dược Hà Nội đã thực hiện xây dựng phương pháp phân tích
paracetamol, piroxicam, diclofenac, indomethacin trộn lẫn trong chế phẩm đông
dược bằng HPTLC và phát hiện 1 mẫu thuốc đông dược chứa paracetamol trong
29 mẫu thu thập trên thị trường [9].
Tiếp tục những nghiên cứu về các chất không khai báo được trộn trong các
chế phẩm đông dược nhóm nghiên cứu Đào Thị Cẩm Minh và cộng sự đã sử
dụng phương pháp HPTLC để phát hiện và định lượng 2 loại thuốc chống đái
tháo đường tổng hợp metformin và glibenclamid trộn trái phép trong 41 mẫu chế
phẩm đông dược và TPCN. Các mẫu ở các dạng: viên nén, viên nang, thuốc
viên, thuốc tán, trà túi lọc. Kết quả, 41 mẫu âm tính với metformin;
glibenclamid được tìm thấy từ 8 trong số 41 mẫu thu thập được. Hàm lượng
glibenclamid được trộn lẫn thay đổi 0,18 mg/viên tới 2,21 mg/viên, lượng này
tính theo liều dùng với 1 số mẫu là từ 1,8 mg/liều đến 2,2 mg/liều [12].
Năm 2010, VKN thuốc Trung ương phát hiện chế phẩm đông dược “Viên
Bổ Thận Hà Thành”, là thực phẩm chức năng, dùng để bổ thận tráng dương,
tăng cường sinh lý, có trộn trái phép sildenafil (một chất ức chế men

phosphodiestarase -5, có tác dụng cương dương) có hàm lượng lên tới 98 mg/
viên. Năm 2014, Cục an toàn thực phẩm cũng có quyết định thu hồi và tiêu hủy
toàn bộ sản phẩm thực phẩm chức năng Kim thận bảo 1 New của Công ty
TNHH Thương mại dược phẩm Nam Á do có chứa chất tadalafil (36 mg/viên)
và sildenafil (123 mg/viên). Gần đây, sản phẩm “Avena plus” của công ty
TNHH MTV đầu tư và thương mại xuất nhập khẩu Việt Nam Canoves và
sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe Uy Mãnh Nang của Công ty TNHH Xuất
Nhập khẩu Thiết bị Y tế Minh Bang Việt Nam đã bị Viện kiểm nghiệm an

7


toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia phát hiện có chứa sildenafil và cục An toàn
thực phẩm đã có quyết định tạm dừng lưu thông, thu hồi lô 2 sản phẩm trên.
Một số nghiên cứu trên đã chỉ rõ nhưng nhóm thuốc tổng hợp gồm nhóm
thuốc giảm đau, chống viêm, thuốc giảm glucose máu, thuốc ức chế PDE-5,
nhóm thuốc giảm béo, nhóm thuốc hạ huyết áp và lợi tiểu nhau thường xuyên
được trộn lẫn trái phép trong các chế phẩm đông dược, thực phẩm chức năng
điều trị hoặc hỗ trợ điều trị các bệnh xương khớp, gout, bệnh tiểu đường, bệnh
liệt dương, bệnh tim mạch và bệnh béo phì. Việc trộn các tân dược vào đông
dược rất khó phát hiện, vì trong đông dược có chứa nhiều thành phần, nền mẫu
phức tạp. Các thuốc này ngày càng được làm giả một cách khéo léo và tinh vi,
do đó cần phải áp dụng các kỹ thuật phân tích hiện đại có tính chọn lọc và độ
nhạy cao mới có thể phát hiện được các chất giả mạo này.
1.2.

Tổng quan về đối tượng nghiên cứu

1.2.1. Amlodipin besylat
Công thức cấu tạo

-

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của amlodipin besylat
Công thức phân tử: C20H25ClN2O5.C6H6O3S

-

Khối lượng phân tử: 567, 05

-

Tên khoa học: 3-Ethyl 5-methyl (±) 2 [(2-aminoethoxy)methyl] – 4 - (o -

chlorophenyl)-1,4-dihydro-6-methyl-3,5-pyridinedicarboxylate=,
monobenzensulfonate [18].
8


-

Tính chất: Dễ tan trong MeOH, khó tan trong nước và 2-propanol [1], [17].

-

Đặc tính phổ hấp thụ UV: Dung dịch AML trong dung dịch HCL 0,1N trong

MeOH có cực đại hấp thụ tại 360 nm (quét phổ từ 300nm đến 400nm) [1].
-

Nhiệt độ nóng chảy: 209,98oC.

-

Công dụng: AML thuộc nhóm phong bế kênh calci làm hạ huyết áp. Chỉ

định trong tăng huyết áp và phòng cơn đau thắt ngực.
-

Loại thuốc: Chẹn kênh calci.

-

Tác dụng không mong muốn: Giãn mạch gây hạ huyết áp quá mức khi

không có điều chỉnh liều, nhất là khi phải dùng thuốc kéo dài; hoa mắt, chóng
mặt, đau đầu, phù ngoại vi [4], [8].
-

Dạng thuốc và hàm lượng: Viên nén 2,5 mg, 5 mg, 10 mg. Viên nang 5 mg,

10 mg.
-

Liều lượng: Để điều trị tăng huyết áp và đau thắt ngực, liều phải phù hợp

cho từng người bệnh. Nói chung, khởi đầu với liều bình thường là 5 mg, 1 lần
cho 24h. Liều có thể tăng đến 10 mg cho 1 lần trong 1 ngày [7].
1.2.2. Nifedipin
Công thức cấu tạo

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của nifedipin.
-

Công thức phân tử: C17H18N2O6

-

Khối lượng phân tử: 346,34

9


-

Tên khoa học: dimethyl 2,6-dimethyl-4-(2-nitrophenyl)-1,4-dihydropyridin-

3,5-dicarboxylat.
-

Tính chất: Bột kết tinh màu vàng. Thực tế không tan trong nước, dễ tan

trong aceton. Dưới ánh sáng ban ngày hoặc ánh sáng nhân tạo ở bước sóng nhất
định, chế phẩm dễ dàng chuyển thành dẫn chất nitrosophenylpyridin. Dưới ánh
sáng tử ngoại chế phẩm chuyển thành dẫn chất nitrophenylpyridin. Các dung
dịch chế phẩm phải được pha ngay trước khi sử dụng, pha trong tối hoặc dưới
ánh sáng có bước sóng dài (> 420 nm) và bảo quản tránh ánh sáng thường hoặc
ánh sáng tử ngoại [1], [17].
-

Loại thuốc: Thuốc chẹn kênh calci

-

Chỉ định: Chống tăng huyết áp

-

Tác dụng không mong muốn: Làm chậm nhịp tim, nghẽn nhĩ thất, rối loạn

tiêu hóa…[1].
-

Dạng thuốc và hàm lượng: viên nang 5 mg, 10 mg và 20 mg. Viên nén tác

dụng kéo dài 30 mg, 60 mg và 90 mg.
-

Liều lượng: Dùng loại thuốc tác dụng chậm và kéo dài 10 – 40 mg/lần, ngày

uống 2 lần. Hoặc 30 – 90 mg ngày uống 1 lần tùy theo chế phẩm [7].
1.2.3. Valsartan
Công thức cấu tạo

-

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của valsartan
Công thức phân tử: C24H29N5O3
10

-

Khối lượng phân tử: 435,52

-

Tên khoa học: N-[p-(o-1H-Tetrazol-5-yl phenyl) benzyl]-N-valeryl-Lvaline

[18].
-

Tính chất vật lý – hóa học: Bột màu trắng hoặc gần như trắng, dễ hút ẩm.

Không tan trong nước, tan tự do trong ethanol khan, hơi tan trong methylen
clorid.
-

Chỉ định: Điều trị tăng huyết áp, điều trị suy tim.

-

Loại thuốc: Đối kháng thụ thể angiotensin II.

-

Tác dụng không mong muốn: Hạ kali máu, suy thận cấp, phù mạch thần

kinh…[8]
-

Dạng dùng: Viên nang 40, 80 mg.

-

Liều lượng: Uống 40 – 80 mg/ ngày [4].

1.2.4. Felodipin
Công thức cấu tạo:

-

Hình 1.4. Công thức cấu tạo của felodipin
Công thức phân tử: C18H19Cl2NO4

-

Khối lượng phân tử: 384,523

-

Tên khoa học: 5-O-ethyl 3-O-methyl 4-(2,3-dichlorophenyl)-2,6-dimethyl-

1,4-dihydropyridin-3,5-dicarboxylat
-

Tính chất vật lý, hóa học: Bột màu trắng hoặc gần như trắng. Khó tan trong

nước và 2-propanol, tan nhiều trong MeOH [17].
11

-

Chỉ định: Điều trị tăng huyết áp.

-

Loại thuốc: Chẹn kênh calci.

-

Tác dụng không mong muốn: Chậm nhịp tim, nghẽn nhĩ thất, rối loạn tiêu

hóa.
-

Chế phẩm và liều dùng: Viên nén 2,5 mg, 5 mg, 10 mg tác dụng kéo dài.

Liều khởi đầu 2,5 mg. Thường dùng 5 – 10 mg/lần/ngày [4].
1.3. Các nghiên cứu xác định các thuốc hạ huyết áp trộn trái phép vào
các chế phẩm Đông Dược
Ana P. L. Moreira và cộng sự xây dựng phương pháp UHPLC-ESI-MS/MS
định lượng đồng thời 13 thuốc nhóm hạ huyết áp (β-block, angiotensin II, ức chế
men chuyển angiotensin và lợi tiểu). Thời gian phân tích 6 phút, triển khai trên
cột Zorbax SB - C18 với hệ dung môi gồm MeOH và dung dịch acid acetic
0,1%. Các chất trong mẫu thử được chiết bằng dung môi là MeOH. Giới hạn
phát hiện từ 0,02 đến 2,52 mg/L; độ chính xác từ 80,56% đến 111,28% đối với
các chất nghiên cứu. Các chất hydrochlorothiazid và furosemid được khai báo
trong 5/34 mẫu được phân tích. Tuy nhiên hàm lượng được tìm thấy lại thấp

hoặc cao hơn liều dùng được khuyến cáo. Hydrochlorothiazid phát hiện với liều
từ 5,24 – 39,98 mg/liều/ngày, với liều dùng được khuyến cáo từ 12,5 – 25
mg/ngày. Furocemid được tìm thấy với mức 38,44 - 92,7 mg/liều ngày, với liều
được khuyến cáo là 20 – 40 mg/ngày [33].
Trong nghiên cứu của mình, Julie Regitze Kesting và cộng sự đã sử dụng
LC–HRMS và LC–MS–SPE/NMR phân tích viên nang mềm Gold Night một
thuốc thảo dược của Trung Quốc dùng để điều trị cao huyết áp. Mẫu được chiết
bằng hỗn hợp ACN : H2O ( 1: 1) và phân tích trên thiết bị LC -HRMS với cột
ZORBAX Eclipse Plus (C-18; 1,8 m) 3,0 mm×50 mm), pha động ACN : nước
: dung dịch acid formic 0,1% chạy theo chế độ gradient, tốc dòng 1 mL/phút.
Thiết bị LC–MS–SPE/NMR sử dụng cột Phenomenex Max-RP (C-12; 4 m) 4,6
mm×250 mm), pha động ACN : nước : dung dịch acid formic 0,1% chạy theo
12


chế độ gradient, tốc dòng 0,75 mL/phút. Nghiên cứu phát hiện ba chất
amlodipin, indapamin, valsartan được trộn trái phép trong viên nang với hàm
lượng amlodipin, indapamin và valsartan trong mỗi viên lần lượt khoảng 1,3 mg,
1,3 mg và 30,8 mg. Độ chính xác của phương pháp khá cao với độ thu hồi
amlodipin 97,79 ± 3,4%, indapamin 100,08 ± 5,47% và valsartan 105,81%.
Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng một phần valsartan được hấp thu vào vỏ nang
gelatin [32].
Để xác định 18 loại thuốc dùng để điều trị cao huyết trong các thực phẩm
chức năng và các thuốc cổ truyền Trung Quốc, Nhật Bản, Y.L. Lu và cộng sự sử
dụng phương pháp LC/MS với cột XtimateTM 5 µm; 250 x 4,6 mm. Pha động
là MeOH : ACN ( kênh A) và dung dịch đệm amoni format 20mM chạy theo
chế độ gradient. Mẫu được chiết bằng dung môi MeOH : H2O, siêu âm 30 phút,
ly tâm thu được dịch sắc ký. Giới hạn phát hiện từ 6,5 – 86 µg/kg. Độ thu hồi
của phương pháp từ 71 – 109%. Trong số các mẫu được kiểm tra
hydroclorothiazid, clonidin được tìm thấy trong 9/35 mẫu thuốc được tìm được

với tỷ lệ khoảng 1,1% - 1,3 % với hydrochlorothiazid và 0,11% - 6,5% đối với
clonidin [36].
Tại Hàn Quốc Seok Heo và cộng sự đã sử dụng phương pháp UPLC – UV
để phát hiện đồng thời 25 chất có tác dụng điều trị cao huyết áp trong thực phẩm
bổ sung. 25 chất được xác định là amlodipin, atenolol, candesartan, cilexetil,
carteolol, celiprolol, diltiazem, doxazosin, felodipin, irbesartan, lercanidipin,
losartan, minoxidil, nadolol, nilvadipin, nisoldipin, nitrendipin, olmesartan,
penbutolol, phentolamin, pindolol, prazosin, propranolol, telmisartan, terazosin
và valsartan. Hệ thống UPLC của Waters, sử dụng cột Waters UPLC HSS C18
(2,1 mm × 150 mm, 1,8 µm). Sử dụng pha động gồm A là dung dịch natri 1hexanesulfonat 0,5 mM và B là ACN 95%. Mẫu được chiết siêu âm bằng MeOH
trong 30 phút. Trong số 97 mẫu được kiểm tra phát hiện 2 mẫu chứa atenolol có
hàm lượng 16,81 – 28,07 µg/kg [30].
13


1.4. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu
1.4.1. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
HPTLC là một hình thức tân tiến của TLC. HPTLC được điều khiển
bởi phần mềm thích hợp đảm bảo tính ứng dụng và độ tin cậy, độ lặp lại cao
nhất các số liệu đưa ra. Trong đó, các thông số của quá trình phân tích được
ghi lại và kiểm soát chặt chẽ, do đó có độ lặp lại cao. Các bước của quá trình
phun mẫu, khai triển mẫu, nhận diện vết được tiến hành bằng thiết bị tự
động hoặc bán tự động, giảm thiểu tối đa sai số có thể gặp trong quá trình
phân tích. Quá trình phun mẫu được tiến hành tự động hoặc bán tự động,
đảm bảo chính xác thể tích mẫu phun, đồng thời có sấy bằng khí nitơ do đó
giảm sự oxy hóa đối với chất phân tích dễ bị oxy hóa. Trong quá trình khai
triển, điều kiện về nhiệt độ, độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ, đảm bảo độ lặp
lại của kết quả khi tiến hành giữa các lần phân tích khác nhau và tại các
phòng thí nghiệm khác nhau. Hệ thống đèn UV tích hợp máy ảnh và hệ
thống phần mềm giúp phân tích số liệu ứng dụng trong định tính và định

lượng.
Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10-30µm được rải đều và
kết dính thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250µm trên giá đỡ làm bằng
thuỷ tinh, nhôm hoặc chất dẻo. Một số chất thường dùng làm pha tĩnh là
silica, dẫn chất siloxan, cellulose, nhôm oxyd, gel sephadex…trong đó được
dùng phổ biến nhất là silica (SiO 2 ) và nhôm oxyd. Các hạt trong pha tĩnh
làm nhiệm vụ tách có thể theo cơ chế: phân bố, hấp phụ, trao đổi ion. Hiện
nay để tăng cường độ tin cậy của kết quả phân tích, trong HPTLC người ta
sử dụng bản mỏng hiệu năng cao (high performance plates). Bản này được
tráng lớp pha tĩnh mỏng hơn TLC (dày khoảng 100µm) với bột mịn có kích
thước hạt 5µm độ đồng đều cao hơn. Khi dùng bản mỏng này, hiệu quả cao
hơn do kích thước hạt mịn hơn, độ nhạy và độ phân giải được tăng cường vì

14


vết sắc ký nhỏ, thời gian sắc ký ngắn hơn và lượng dung môi ít hơn so với
TLC[22].
❖ Ưu điểm của HPTLC
-

Phù hợp với cả phân tích định tính và định lượng.

-

Trong một lần khai triển sắc ký có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu

cùng lúc, tiết kiệm thời gian và chi phí cho hóa chất, vật tư tiêu hao.
-

Các mẫu phân tích và các mẫu chuẩn được chấm trên cùng một bản

mỏng sắc ký, khai triển cùng lúc trong cùng điều kiện dung môi, nhiệt độ,
độ ẩm nên cho độ lặp lại cao, hạn chế sự tác động của môi trường giữa các
lần phân tích.
-

Chuẩn bị mẫu đơn giản, không cần xử lý trước khi cho các dung môi như

lọc và khử khí, lượng tiêu thụ pha động thấp cho mỗi mẫu.
1.4.2. Phương pháp HPLC
HPLC là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên
một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất
cao [3].
Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai
pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của chất này với pha tĩnh và pha động.
Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào yếu tố đó.
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector. Nếu ghi quá
trình sắc ký của hỗn hợp nhiều thành phần, ta sẽ có một sắc ký đồ gồm nhiều
pic. Quá trình tách sắc ký tốt thì hỗn hợp có bao nhiêu thành phần sẽ có bấy
nhiêu pic riêng biệt được tách ra trên sắc đồ [3]. Cấu tạo chung của một máy
HPLC được trình bày trong hình 1.4.

15


Hình 1.5:Sơ đồ hệ thống HPLC
Trong đó:
1: Bình chứa pha động.

5: Cộ sắc ký (pha tĩnh)

2: Bộ phận khử khí

6: Đầu dò

3: Bơm cao áp
4: Bộ phận tiêm mẫu

7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín
hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống.
8: In dữ liệu.

❖ Có nhiều loại detector khác nhau, tùy thuộc bản chất lý hóa của chất
phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp
Detector UV-VIS: Detector này thực chất là một máy đo quang phổ UV –

-

VIS. Hạn chế của detector này là chỉ sử dụng được bước sóng đã lựa chọn. Đối
với các chất không hấp thụ quang tại bước sóng đã chọn thì không phát hiện
được. Đối với các chất hấp thụ quang yếu tại bước sóng đã chọn thì cho độ nhạy
thấp.
-

DAD (phosphodior array detector): Có khả năng quét và chồng phổ để định

tính các chất dựa trên phổ hấp thụ của các chất và phổ của nó so với chuẩn.
-

Detector huỳnh quang: Sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát

huỳnh quang. Đối với các chất không phát huỳnh quang cần phải dẫn xuất hóa
phân tích để tạo sản phẩm có khả năng phát huỳnh quang.
16