Chế tạo và bước đầu đánh giá sự hình thành phức hợp oxytocin peg bằng các phương pháp hóa sinh

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ NHUNG

CHẾ TẠO VÀ BƢỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ SỰ
HÌNH THÀNH PHỨC HỢP
OXYTOCIN-PEG BẰNG CÁC PHƢƠNG
PHÁP HÓA SINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2018


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ NHUNG
Mã sinh viên: 1301305

CHẾ TẠO VÀ BƢỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ
SỰ HÌNH THÀNH PHỨC HỢP
OXYTOCIN-PEG BẰNG CÁC PHƢƠNG
PHÁP HÓA SINH
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn
1. PGS. TS. Nguyễn Văn Rƣ
2. HVCH. Lê Quang Nghị
Nơi thực hiện
1. Bộ môn Hóa sinh

2. Đại học Y Dƣợc Thái Nguyên

HÀ NỘI – 2018


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận
được rất nhiều sự quan tâm, động viên và giúp đỡ tận tình từ các thầy cô, gia
đình và bạn bè. Nhờ sự giúp đỡ quí báu đó mà tôi mới có thể nghiên cứu và
hoàn thành tốt khóa luận của mình.
Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo PGS.TS
Nguyễn Văn Rƣ và học viên cao học Lê Quang Nghị, những người thầy đáng
kính đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và giúp đỡ tôi trong quá trình thực
hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn Hóa Sinh –
trường Đại học Dược Hà Nôi cùng với các thầy cô giáo bộ môn Hóa sinhTrường Đại học Y Dược Thái Nguyên đã tạo điều kiện để tôi thực hiện đề tài.
Tôi trân trọng gửi lời cảm ơn tới Ban Giám Hiệu, Phòng đào tạo Đại học
và các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã giảng dạy và tạo mọi điều
kiện thuận lợi cho tôi trong suốt năm học tập và nghiên cứu tại trường.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn
bên cạnh và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn
thành đề tài này.

Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2018
Sinh viên
Nguyễn Thị Nhung


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN............................................................................... 2
1.1. Oxytocin ..................................................................................................... 2
1.1.1. Đặc điểm cấu tạo của Oxytocin. ........................................................... 2
1.1.2. Tính chất hóa lý của Oxytocin .............................................................. 3
1.1.3. Tác dụng dược lý của Oxytocin ............................................................ 4
1.3. Phƣơng pháp tăng độ bền Oxytocin ........................................................ 5
1.3.1. Tạo ra các chất có cấu trúc tương tự với Oxytocin............................... 5
1.3.2. Kỹ thuật liên kết vào cầu nối disulfid trên Oxytocin ............................ 6
1.3.3. Tạo hệ đệm chứa ion kim loại. ............................................................. 7
1.3.4. Bột khô công thức ................................................................................. 8
1.3.5. Các phương pháp liên hợp với Oxytocin. ............................................. 8
1.4. Phƣơng pháp pegyl hóa ............................................................................ 9
1.4.1. Polyethylen glycol ................................................................................ 9
1.4.2. Đại cương về phương pháp pegyl hóa protein dược dụng ................... 9
1.4.3. Pegyl hóa Oxytocin. ............................................................................ 11
1.5. Sự phát triển của các sản phẩm thuốc protein-PEG hiện nay ........... 15
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM ......... 18
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ...................................................................... 18
2.1.1. Nguyên vật liệu ................................................................................... 18
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ ............................................................................. 19
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 19
2.3. Phƣơng pháp thực nghiệm ..................................................................... 20
2.3.1. Chế tạo Oxytocin-PEG ....................................................................... 20
2.3.2. Xác định sự hình thành của hợp chất liên hợp Oxytocin-PEG bằng
phương pháp điện di...................................................................................... 21

2.3.3. Tách chiết và xác định khối lượng phân tử hợp chất Oxytocin đã được
pegyl hóa bằng sắc ký đồ lọc gel .................................................................. 23
2.3.4. Xác định hiệu suất thu hồi Oxytocin-PEG trong các mẫu phản ứng ở
hai pH sau sắc ký lọc gel............................................................................... 25
2.3.5. Xác định ảnh hưởng của lượng mPEG aldehyd tham gia phản ứng đến
hiệu suất thu hồi hợp chất Oxytocin-PEG có trong dung dịch rửa giải sau sắc
ký lọc gel ....................................................................................................... 27
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU........................................................ 28
3.1. Chế tạo Oxytocin-PEG ........................................................................... 28
3.2. Xác định sự hình thành của hợp chất liên hợp bằng phƣơng pháp
điện dị .............................................................................................................. 28
3.3. Tách chiết và xác định khối lƣợng phân tử của hợp chất liên hợp
trong phản ứng pegyl hóa bằng sắc ký lọc gel ............................................. 30
3.3.1. Kết quả pick sắc ký của Oxytocin và sản phẩm tạo thành trong quá
trình pegyl hóa .............................................................................................. 30
3.3.2. Xây dựng đường chuẩn về khối lượng phân tử .................................. 32
3.4. Xác định hiệu suất thu hồi Oxytocin-PEG trong các mẫu phản ứng ở
hai pH sau sắc ký lọc gel ................................................................................ 36
3.5. Đánh giá ảnh hƣởng của lƣợng mPEG aldehyd tham gia phản ứng tới
hiệu suất thu hồi Oxytocin-PEG trong dung dịch sau sắc ký lọc gel ........ 37
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN ................................................................................ 41
4.1. Về phản ứng pegyl hóa Oxytocin ........................................................... 41
4.2. Về khối lƣợng phân tử của protein sau phản ứng liên hợp ................ 43
4.3. Về đánh giá hiệu suất thu hồi Oxytocin-PEG trong dung dịch sau sắc
ký lọc gel .......................................................................................................... 44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

TÊN VIẾT TẮT

Ý NGHĨA

Asp

Asparagin

Cys

Cystein

DCC

Dicyclohexylcarbodiimid

DTT

Dithiothreitol

EDC

1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid

Gln

Glutamin

Gly

Glycin

Ile

Isoleucin

Leu

Leucin

mPEG aldehyd

Methoxyl polyethylenglycol propionaldehyd

NaCNBH3

Natri cyanoborohydrid

NHS

N- hydroxy succinid

PEG

polyethylen glycol

PHEA

α,β-poly (N-2-hydroyethyl)-DL-aspartamid.

pI

Điểm đẳng điện.

Pro

Prolin

SDS – PAGE

Natri dodecyl sulfat

TC DĐVN IV

Tiêu chuẩn dược điển Việt Nam IV

TEMED

Tetramethylethylenediamin

Tris

Tris(hydroxymehtyl)methylamin

Tyr

Tyrosin

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. 1. Các sản phẩm pegyl hóa đã sử dụng trên thị trường ......................... 15
Bảng 2. 1. Các hóa chất dùng trong nghiên cứu ................................................. 18
Bảng 2. 2. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu ................................................... 19
Bảng 3. 1. Tổng hợp kết quả rửa giải các protein bằng phương pháp lọc gel .... 33
Bảng 3. 2. Lượng sản phẩm liên hợp thu được trong dung dịch sau lọc gel ...... 36
Bảng 3. 3. Ảnh hưởng của lượng mPEG aldehyd tham gia phản ứng tới hiệu suất
thu hồi Oxytocin-PEG hình thành trong các phân đoạn sau lọc gel ................... 40


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1. 1. Công trúc không gian của Oxytocin .................................................... 2
Hình 1. 2. Sự hình thành disulfid từ Oxytocin ..................................................... 3
Hình 1. 3. Cấu trúc của Desamino-Oxytocin và Carbetocin................................. 6
Hình 1. 4. Các chất tương tự Oxytocin liên kết vào cầu nối disulfid của
Oxytocin ................................................................................................................ 7
Hình 1. 5. Công thức cấu tạo của polyethylen glycol. .......................................... 9
Hình 1. 6. Phương pháp pegyl hóa. ..................................................................... 10
Hình 1. 7. Cấu trúc của mPEG và một số dẫn xuất mPEG có nhóm chức năng. 10
Hình 1. 8. Quá trình khử amin qua trung gian tạo bazơ Schiff ........................... 11
Hình 1. 9. Phản ứng của NHS ester và một peptid. ............................................ 12
Hình 1. 10. Liên hợp với các nhóm Cacboxylic. ................................................ 12
Hình 1. 11. Gắn hợp chất dibromo và dithiomaleimid tạo cầu nối cacbon
sulfid. ................................................................................................................... 13
Hình 1. 12. Liên hợp vào cầu nối ba nguyên tử cacbon...................................... 14
Hình 1. 13. Phản ứng Thiol-en ............................................................................ 15
Hình 1. 14. Pegyl hóa vào nhóm hydroxyl trên phân tử Oxytocin ..................... 15
Hình 2. 1. Cơ chế của phản ứng liên hợp ............................................................ 20
Hình 3. 1. Sơ đồ phản ứng pegyl hóa Oxytocin .................................................. 28

Hình 3. 2. Kết quả điện di ở pH 4,5 .................................................................... 28
Hình 3. 3. Kết quả điện di ở pH 7,5 .................................................................... 29
Hình 3. 4. Đồ thị tương quan mật độ quang và các phân đoạn rửa giải dung dịch
Oxytocin. ............................................................................................................. 30
Hình 3. 5. Đồ thị tương quan mật độ quang và các phân đoạn rửa giải dung dịch
sau phản ứng liên hợp Oxytocin và mPEG aldehyd ở pH 4,5. ........................... 31
Hình 3.6. Đồ thị tương quan mật độ quang các phân đoạn rửa giải dung dịch sau
phản ứng liên hợp Oxytocin và mPEG aldehyd với pH 7,5 ............................... 32
Hinh 3.7. Đồ thị tương quan mật độ quang và các phân đoạn rửa giải dung dịch
Insulin…………………………………………………………………………..32


Hinh 3.8. Đồ thị tương quan mật độ quang và các phân đoạn rửa giải dung dịch
Casein…………………………………………………………………………..33
Hình3.9. Đồ thị tương quan mật độ quang và các phân đoạn rửa giải dung dịch
Chymotrysin……………………………………………………………………33
Hình 3. 10. Đồ thị hồi quy tuyến tính giữa logMW và Ve ................................. 35
Hình 3. 11. Đồ thị tương quan giữa mật độ quang và các phân đoạn ................. 37
rửa giải của mẫu M1. ........................................................................................... 37
Hình 3. 12. Đồ thị tương quan giữa mật độ quang và các phân đoạn rửa giải ... 38
của mẫu M2. ......................................................................................................... 38
Hình 3. 13. Đồ thị tương quan giữa mật độ quang và các phân đoạn rửa giải ... 38
của mẫu M3. ......................................................................................................... 38
Hình 3. 14. Đồ thị tương quan giữa mật độ quang và các phân đoạn rửa giải ... 39
của mẫu M4. ......................................................................................................... 39
Hình 4. 1. Cơ chế phản ứng khử imin trung gian................................................ 41


ĐẶT VẤN ĐỀ
Oxytocin là một hormon nonapeptid vòng tiết ra từ thùy sau tuyến yên.

Oxytocin đã được tổng hợp để sử dụng làm thuốc. Trên lâm sàng, Oxytocin là
thuốc lựa chọn đầu tiên để chỉ định khởi phát chuyển dạ và ngăn ngừa xuất
huyết tử cung. Ngoài ra, Oxytocin được dùng để kích thích tiết sữa mẹ cho con
bú, điều trị bệnh tự kỷ ở trẻ, điều trị rối loạn chức năng sinh dục [22]. Trong cơ
thể, Oxytocin bị phá hủy bởi enzym peptidase nên thời gian bán thải rất ngắn.
Khi sử dụng đường uống, Oxytocin cũng dễ bị phá hủy bởi enzym tiêu hóa. Do
đó, Oxytocin chủ yếu được bào chế dưới dạng thuốc tiêm hoặc dạng xịt mũi.
Một vấn đề lớn trong sử dụng các chế phẩm dạng lỏng chứa Oxytocin là kém ổn
định trong bảo quản. Đặc biệt ở các nước có khí hậu nhiệt đới, thường có nhiệt
độ ban ngày vượt quá 40°C, Oxytocin dễ mất hoạt tính sinh học [54].
Để khắc phục nhược điểm trên, các nhà khoa học đã tìm ra các giải pháp
cho vấn đề bảo vệ cấu trúc Oxytocin. Một trong số đó là kỹ thuật pegyl hóa: gắn
polyethylen glycol (PEG) vào phân tử protein. Pegyl hóa mang lại nhiều ưu
điểm cho Oxytocin như: làm tăng độ ổn định, tăng cường tác dụng điều trị, tăng
thời gian bán thải, giảm tính sinh miễn dịch của thuốc protein đối với cơ thể.
Hiện nay, kỹ thuật pegyl hóa thật sự đã chứng minh được tính ưu việt của nó,
thể hiện ở số lượng chế phẩm protein dược dụng được gắn PEG đang không
ngừng gia tăng trên thị trường dược phẩm [11].
Nhằm mục đích ứng dựng để bào chế dạng dùng đường uống, tăng cường
độ bền phân tử, đồng thời triển khai được kỹ thuật pegyl hóa vào việc cải biến
một số protein dược dụng ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành đề tài “Chế tạo và
bước đầu đánh giá hiệu quả hình thành phức hợp Oxytocin-PEG để làm
thuốc bằng các phương pháp hóa sinh” với các mục tiêu sau:
1. Chế tạo được Oxytocin với polyehthylen glycol tạo phức hợp OxytocinPEG.
2. Bước đầu xác định hiệu quả hình thành phức hợp Oxytocin-PEG bằng
các phương pháp hóa sinh.

1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Oxytocin
1.1.1. Đặc điểm cấu tạo của Oxytocin.
Oxytocin là một peptid gồm 9 aminoacid trong chuỗi cystein-tyrosinisoleucin-glutamin-asparagin-cystein-prolin-leucin-glycin-amid, có một cầu nối
disulfid nối các phân tử cystein, có công thức phân tử C43H66N12O12S2, khối
lượng phân tử là 1007,193 Da [23].
S

S

H2N-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2

Hình 1. 1. Công trúc không gian của Oxytocin [23].
Cấu trúc bậc I của Oxytocin là trình tự sắp xếp của acid amin trong chuỗi
polypeptid, có chứa các liên kết peptid của các acid amin và một cầu nối disulfid
trong phân tử. Trình tự acid amin trong chuỗi polypeptid thể hiện sự tương tác
các phần trong chuỗi, quyết định cấu trúc không gian và tính chất sinh học của
Oxytocin. Cấu trúc bậc II của phân tử Oxytocin có sự sắp xếp đều đặn của chuỗi
polypeptid, chúng xoắn lại tạo nên cấu trúc gồm xoắn α và nếp gấp β, được cố
định bởi các liên kết hydro của các acid amin gần nhau. Cấu trúc bậc II uốn
khúc lại, các xoắn α và nếp gấp β cuộn lại với nhau thành từng búi tạo nên cấu
trúc không gian bậc III, có quyết định chức năng của Oxytocin [23].
Một số vị trí trên cấu trúc Oxytocin dễ bị suy thoái là các acid amin Cys1,
Gln4, Asn5 và Gly9 dễ bị oxy hóa, thủy phân trong môi trường acid, nhiệt độ và
2


ánh sáng thông qua sự hình thành các chất trung gian [24]. Do các acid amin này
có chứa N bậc một dễ tham gia phản ứng hóa học và thủy phân trong môi trường
phân ly và điều kiện không phù hợp [34]. Ngoài ra, liên kết disulfid Cys1-Cys6 là

vị trí hay gây ra sự suy thoái, đa số các quá trình suy thoái cấu trúc xảy ra sau
khi loại bỏ liên kết ở cacbon β ở Cys1, tạo ra enamin N và cystein persulfid. Tạo
điều kiện cho sự hình thành trisulfid và tetrasulfid Oxytocin hoặc thúc đẩy sự
hình thành dimer Oxytocin và các sản phẩm khác [24].

Hình 1. 2. Sự hình thành disulfid từ Oxytocin [24]
1.1.2. Tính chất hóa lý của Oxytocin [5],[10], [23].
- Oxytocin là bột vô định hình, màu trắng hoặc gần như trắng.
- Dễ hút ẩm, rất dễ tan trong nước, acid acetic, butanol và ethanol.
- Khi nung nóng dễ phân huỷ, nó phát ra hơi độc của sulfur oxid và nitric
oxid.
- Điểm đẳng điện của Oxytocin là pI = 5,51.
- Để định tính và định lượng Oxytocin dùng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao với detector UV ở 280 nm.
- Một số tính chất hóa học của protein: Phản ứng của nhóm –COOH, NH2, phản ứng tạo màu đặc trưng của liên kết peptid như phản ứng biure cho
màu tím, phản ứng với Ninhydrin cho phức hợp màu tím xác định nhóm α-amin,
phản ứng Fohl cho tủa màu đen xám xác định trong acid amin có lưu huỳnh,…
- Sự biến tính của protein: Dưới tác dụng của các tác nhân vật lý như tia
cực tím, sóng siêu âm, khuấy cơ học... hay tác nhân hóa học như axit, kiềm
mạnh, muối kim loại nặng,... gây phá hủy cấu trúc không gian (các liên kết bên
trong phân tử trừ liên kết peptid) và làm giảm hay mất những tính chất ban đầu
3


của protein. Trong những điều kiện nhất định, protein bị biến tính có thể trở về
trạng thái ban đầu tùy mức độ. Hiện tượng đó được gọi là sự biến tính thuận
nghịch.
- Tính chất hòa tan và kết tủa: Protein có khả năng hòa tan trong dung
dịch muối loãng. Khi hòa tan, protein tạo thành các dung dịch keo do protein có
lớp áo nước bao quanh và do protein mang điện tích cùng dấu nên đẩy nhau. Khi

làm mất 2 yếu tố hòa tan trên, protein sẽ tích tụ lại và gây tủa.
1.1.3. Tác dụng dược lý của Oxytocin
- Trên cơ tử cung: làm tăng co bóp cơ trơn tử cung theo nhịp, tần số và
cả biên độ (co bóp sinh lý). Tính cảm thụ của cơ trơn tử cung với Oxytocin tăng
dần trong suốt thời kỳ có thai, phụ thuộc nhiều vào sự có mặt của Estrogen [2].
Khi gắn với Oxytocin, các receptor sẽ hoạt hóa phospholipase C làm giải phóng
Ca++ nội bào đồng thời gây khử cực kênh Ca++ nhạy cảm với điện thế, làm tăng
nhập Ca++ vào tế bào. Do đó, Oxytocin thể hiện tác dụng đôi là điều hòa sự co
bóp của các tế bào cơ tử cung và kích thích tế bào nội mạc, tế bào màng rụng
sản xuất prostaglandin. Oxytocin gây co thắt trong giai đoạn sau của chuyển dạ,
rất cần thiết đối với sự giãn nở cổ tử cung trước khi sinh. Việc phóng thích
Oxytocin trong thời gian cho con bú gây ra những cơn co thắt nhẹ nhưng thường
đau trong vài tuần đầu của chu kỳ sữa. Điều này cũng giúp phục hồi tử cung với
tác dụng ngăn ngừa xuất huyết sau sinh [18]. Khi Oxytocin được sử dụng với
liều quá mức, kích thích quá mức tử cung, với các cơn co cứng hoặc kéo dài, có
thể dẫn đến vỡ tử cung, sẹo cổ tử cung, rò rỉ âm đạo, xuất huyết sau sinh, lưu
lượng máu tử cung bị suy giảm, thuyên tắc nước ối và chấn thương bào thai bao
gồm xuất huyết nội sọ, các rối loạn nhịp tim khác, tổn thương thần kinh trung
ương hoặc tổn thương não và tử vong do ngạt [18].
- Ở những bà mẹ đang cho con bú sữa mẹ, Oxytocin hoạt động ở tuyến
vú, Oxytocin gây co bóp tế bào cơ biểu mô quanh nang tuyến sữa, làm sữa từ
các nang tuyến sữa dồn vào các ống dẫn lớn hơn, làm tăng bài xuất sữa [42].

4


- Do Oxytocin tương tự như Vasopressin, có thể làm giảm bài tiết nước
tiểu nhẹ. Ở một số loài, Oxytocin có thể kích thích bài tiết natri từ thận. Ở
người, liều cao có thể dẫn đến nồng độ natri thấp (hạ natri máu) [18].
- Trên hệ tim mạch: Ở mức liều gây co bóp tử cung chưa đủ ảnh hưởng

đến huyết áp. Ở mức liều cao gây giãn mạch rõ ràng và làm hạ huyết áp tạm
thời, tăng nhịp tim do phản xạ và nóng mặt. Oxytocin và thụ thể của nó cũng
được tìm thấy trong tim ở một số loài gặm nhấm, và hormon này có thể đóng
một vai trò quan trọng trong sự phát triển phôi của tim bằng cách thúc đẩy sự
phân hóa tế bào cơ tim [29], [39]. Tuy nhiên, sự vắng mặt của Oxytocin hoặc
thụ thể của nó ở chuột nhắt không gây ra tình trạng thiếu máu tim [46].
- Điều hòa hoạt động của trục dưới đồi - tuyến yên - tuyến thượng thận:
Oxytocin gián tiếp ức chế sự giải phóng hormon adrenocorticotropic và cortisol,
trong trường hợp đó có thể coi nó là một chất đối kháng của Vasopressin [26].
- Với một số nghiên cứu cho thấy Oxytocin có liên quan đến nguyên
nhân tự kỷ, những trẻ bị chứng rối loạn phổ tự kỷ có nồng độ Oxytocin trong
máu thấp, khi điều trị với Oxytocin cải thiện đáng kể [28], [52].
1.3. Phƣơng pháp tăng độ bền Oxytocin
1.3.1. Tạo ra các chất có cấu trúc tương tự với Oxytocin
Các chất này đã được đánh giá liên quan đến việc duy trì hoạt động tử
cung trong khi tăng cường độ ổn định [21]. Các nhà khoa học đã tìm ra hai chất
phổ biến là Desamino-oxytocin và Carbetocin.Desamino-oxytocin và Carbetocin
khác với Oxytocin là trong cấu trúc thiếu nhóm amino tự do ở cuối. Desaminooxytocin tương tự Oxytocin trong đó cystein ví trí đầu được thay thế bằng βmercaptopropionic acid. Phân tử Carbetocin cũng thay thế một trong số các
sulfur tại cầu disulfid bằng nhóm CH2. Cả hai đều có ái lực trên cùng mô thụ thể
với Oxytocin và gây ra cơn co thắt cùng một cơ chế. Đặc biệt thời gian bán thải
trong máu của hai chất này dài hơn so với Oxytocin [41].

5


Hình 1. 3. Cấu trúc của Desamino-Oxytocin và Carbetocin [41].
Đối với Carbetocin, tăng thời gian bán thải là 4 - 10 lần so với Oxytocin,
nên chỉ dùng một lần tiêm thay vì truyền kéo dài. Carbetocin được chấp thuận sử
dụng cho y tế và thú y ở nhiều quốc gia khác nhau [27]. Cả hai chất tương tự
Oxytocin này đều có thời gian bán hủy kéo dài với sự duy trì một số hoạt động

co bóp tử cung cho thấy nhóm amino trong Oxytocin không cần thiết cho hoạt
động sinh học.
1.3.2. Kỹ thuật liên kết vào cầu nối disulfid trên Oxytocin
Cầu nối disulfid là vị trí hay xảy ra thoái hóa trên peptid, do đó các nghiên
cứu đã tạo ra các chất tương tự Oxytocin khác nhau bằng cách được thay thế
bằng một phần ở liên kết này với các nguyên tử khác. Nhằm mục đích để tránh
loại bỏ liên kết trong cacbon β ở Cys1 và vì liên kết disulfid Cys1- Cys6 không
phải là một trong những vị trí liên quan trực tiếp đến thụ thể và tác dụng sinh
học của Oxytocin [47]. Điều này đã được đánh giá vào những năm 1960 và
1970, người ta thấy rằng khi thay đổi một trong hai hoặc cả hai thiol ở liên kết
disulfid như trong Carbetocin, tác dụng sinh học vẫn được quan sát mặc dù đã
thay đổi kích cỡ vòng peptid. Điều này cho thấy cầu nối disulfid không phải là
một điều kiện tiên quyết cho việc duy trì hoạt động sinh học [44].
Các nghiên cứu của Alewood và các đồng nghiệp đã nghiên cứu thay thế
disulfid bằng các cầu thioether, selenylsulfid, diselenid và ditellurid, và sự tổng
hợp của nhiều chất tương tự Oxytocin có chứa các liên kết disulfid đã làm thay
đổi (hình 1.4).

6


Hình 1. 4. Các chất tương tự oxytocin liên kết vào cầu nối disulfid của Oxytocin
[44].
Kết quả nghiên cứu tác dụng trên thụ thể và sự ổn định huyết tương của
các chất tương tự Oxytocin - với sự thay thế cầu nối disulfid của Alewood cho
thấy sự giảm kích thước vòng ([-S] - OT) làm giảm đáng kể ái lực với thụ thể do
đó làm giảm hoat động sinh học. Mặc dù việc thay thế nguyên tử S trong cystein
với một nhóm CH2 ([CH2 - S] - OT) vẫn duy trì ái lực và hoạt tính. Thay thế
cystein với selenocystein hoặc tellurocystein không có ảnh hưởng lớn đến hoạt
động chức năng, mặc dù giảm ái lực kết hợp 10 lần đã được quan sát khi thay

thế cả hai cystein. Đồng thời cho thấy sự ổn định trong huyết tương của con
người ở nhiệt độ cao (550C) [38].
1.3.3. Tạo hệ đệm chứa ion kim loại.
Oxytocin ổn định nhất ở pH hơi acid (pH ~ 4.5). Ở pH có tính axit cao
(pH < 3), peptid có thể chịu sự thủy phân, trong khi ở pH trung tính thì Oxytocin
sẽ dimer hóa hoặc trimer hóa dẫn đến mất hoạt tính.
Nghiên cứu của Avanti đánh giá độ ổn định của Oxytocin trong nước
bằng cách sử dụng hệ đệm để lưu trữ (citrat, axetat hoặc aspartat, pH 4,5) kết
hợp với các ion kim loại hóa trị I (Na+, K+ ) hoặc các in kim loại hóa trị II (Ca2+,
Mg2+ và Zn2+). Kết quả cho thấy rằng khi bảo quản dung dịch có chứa Ca2+ (50
mM) và Zn2+ (2-50 mM) , sự ổn định được tăng lên từ 60 % đến 100 % ở 40C,
tuy nhiệt ở nhiệt đô cao không cải thiện được. Sử dụng kim loại hóa trị II và
7


dung dịch đệm citrat, aspartat thì cải thiện đáng kể ở nhiệt độ cao (550C), với
nồng độ ion kim loai là 2mM [38]. Người ta chứng minh rằng ở 700C, việc phân
hủy liên kết disufid giảm từ 20% - 70 % trong dung dịch chứa ion kim loại Zn
và đệm aspartat. Các chứng minh trên cho thấy liên kết disulfid Cys 1- Cys6 được
bảo vệ ở dung dịch đệm chứa ion kim loại [12], [13], [14].
1.3.4. Bột khô công thức
Tạo ra các chế phẩm Oxytocin dạng bột khô để sử dụng qua đường hô hấp
hoặc đường truyền tĩnh mạch. Bằng phương pháp phun sấy, đông khô, hoặc kỹ
thuật nano tạo ra Oxytocin dạng bột siêu mịn hoặc kích thước nano. Việc sử
dụng qua đường hô hấp giúp cho việc hấp thu tốt hơn đồng thời giải quyết sự
kém bền trong dung dịch. Nghiên cứu của Mc Intosh xác định thành phần chế
phẩm gồm hỗn hợp glycin, leucin và manitol tạo ra các hạt kích thước từ 1 đến 5
. Công thức đã chứng minh hiệu quả tương đương dạng bột phun sấy so với
peptid tự nhiên và không gây tác dụng co bóp ở mô khí quản. Công thức này
duy trì nhiệt độ thử nghiệm khá cao (500C) [30], [40].

1.3.5. Các phương pháp liên hợp với Oxytocin.
Đây là phương pháp gắn Oxytocin với các đại phân tử, nhằm mục đích
tăng độ bền của phân tử, tăng tác dụng của Oxytocin và giảm liều sử dụng
Oxytocin.
Cavallaro và cộng sự tiến hành gắn kết N-succinnyl-oxytocin đã được
chức năng hóa ở amin N - cuối với α, β-poly (N-2-hydroyethyl)-DL-aspartamidpoly(ethylen glycol) 2000 ( PHEA-PEG2000) kết quả tổng hợp được PHEAPEG2000-Oxytocin-succinyl. Nghiên cứu thử nghiệm thủy phân trên in vitro
cho thấy hợp chất trên ổn định ở pH 7,4 và trong huyết tương. Đồng thời đánh
giá hoạt tính sinh học trên in-vitro cho thấy ái lực kết hợp của Oxytocin với thụ
thể cải thiện đáng kể [20].
Với hướng nghiên cứu sử dụng β-cyclodextrin, olihosaccharid cyclic liên
hợp với Oxytocin qua cầu nối cacboxyl (kích hoạt bằng 1-hydrobenzotriazol và
dicyclohexylcarbodiimid). Kết quả cho thấy việc liên hợp vẫn có hiệu lực trên

8


cơ tử cung tuy nhiên tác dụng giảm so với Oxytocin và có tác dụng phụ gây ra
cơn hen. Do đó được sử dụng với các chỉ định khác [15].
Nghiên cứu của Hudnut và Cook sáng chế vào năm 2004 kết hợp
Oxytocin ( một số chất tương tự) vào vi nang poly( lactic-co-glycolid), được
đánh giá làm tăng độ bền phân tử [22] .
Như vậy, các phương pháp làm tăng độ bền vững và tác dụng của
Oxytocin đang được quan tâm nhiều và đạt được một số thành tựu nhất định ,tuy
nhiên còn gặp một số nhược điểm nên chưa được ứng dụng trong điều trị lâm
sàng.
1.4. Phƣơng pháp pegyl hóa
1.4.1. Polyethylen glycol
Polyethylen glycol (PEG) là hợp chất cao phân tử có công thức cấu tạo

Hình 1. 5. Công thức cấu tạo của polyethylen glycol [23]

PEG được tạo ra bằng cách liên kết nối nhiều tiểu đơn vị ethylen oxid.
PEG có đặc điểm là polymer trơ, có thể chất từ lỏng đến rắn tùy vào khối lượng
phân tử, hòa tan trong nước, không gây độc, không gây đáp ứng miễn dịch khi
vào cơ thể, khác nhau về hình thể (ở dạng thẳng hoặc phân nhánh) và trọng
lượng phân tử (thường từ 500 Da - 20.000 Da) [47], [48]. Với những đặc tính
quan trong này, PEG là chất lý tưởng để sử dụng trong y học và công nghệ dược
phẩm với nhiều ứng dụng khác nhau. Tuy nhiên, nếu chỉ sử dụng đơn thuần
PEG trong cơ thể thì những tính chất không được ứng dụng. Chỉ khi PEG được
kết hợp với chất khác thì hiệu quả mới được bộc lộ.
1.4.2. Đại cương về phương pháp pegyl hóa protein dược dụng
Năm 1977, Frank Davies, Abraham Abuchowsky và các đồng nghiệp
nghiên cứu sự kết hợp PEG với albumin huyết thanh, catalase thành công đã mở
ra cho khoa học thế giới một kỷ thuật mới để bảo vệ cấu trúc protein [51]. Từ đó
công nghệ pegyl hóa được thiết lập và phát triển.
9


Pegyl hóa là quá trình gắn các phân tử PEG với các phân tử khác như các
peptid, protein và những đoạn kháng thể để cải thiện đặc tính và hiệu quả điều
trị của thuốc [50]. Bản chất của quá trình pegyl hóa là tạo liên kết đồng hóa trị
của phân tử PEG với phân tử tham gia liên kết [19].

Hình 1. 6. Phương pháp pegyl hóa [23].
Quá trình pegyl hóa được quyết định bởi trung tâm ái điện tử của dẫn chất
PEG. Để gắn kết PEG với một phân tử, cần thiết phải hoạt hóa PEG bằng cách
tạo ra các dẫn chất có một nhóm chức năng ở một hoặc cả hai đầu của phân tử
PEG. Việc chọn nhóm chức năng dựa trên loại nhóm có khả năng phản ứng sẵn
có trên phân tử sẽ pegyl hóa. Đối với pegyl hóa protein, các acid amin thường có
khả năng phản ứng gồm: lysin, cystein, histidin, arginin, acid aspetic, acid
glutamic, serin, thronin, tyrosin, các vị trí protein dễ tham gia phản ứng là đầu

N-tận (α-NH2), đầu C-tận (-COOH), nhóm thiol (gốc Cys) và nhóm hydroxyl
[36]. Một số dẫn xuất PEG có nhóm chức năng thể hiện hình 1.7.

Hình 1. 7. Cấu trúc của mPEG và một số dẫn xuất mPEG có
nhóm chức năng [23].
10


Quá trình gắn kết đó làm phân tử thay đổi các đặc tính lý hóa bao gồm các
thay đổi về cấu tạo , liên kết, tính tan,...Ngoài ra, nó có thể ảnh hưởng đến ái lực
liên kết với các thụ thể tế bào và có thể thay đổi hấp thụ và phân bố. Peyl hóa,
bằng cách tăng trọng lượng phân tử của một phân tử , có thể đem lại một số lợi
ích đáng kể như tăng độ hòa tan, tính linh động của protein trong máu và dịch
sinh lý, độ ổn dịnh protein được cải thiện, tăng cường tác dụng của protein, tăng
thời gian bán thải, giảm tính sinh miễn dịch của protein…Nhưng nhược điểm
của kỹ thuật này là trong một số trường hợp sẽ che kín vị trí trung tâm hoạt động
của protein và ví trí liên kết thụ thể làm giảm tác dụng của thuốc. Ngoài ra, PEG
không phân hủy sinh học trong cơ thể, điều này có thể dẫn đến tích lũy trong
gan, thận và các cơ quan quan trọng khác. Hơn nữa, các sản phẩm PEG có thể
gây ra phản ứng miễn dịch của hệ thống miễn dịch [36].
1.4.3. Pegyl hóa Oxytocin.
 Pegyl hóa vào đầu N-tận trong phân tử Oxytocin.
- Sử dụng dẫn chất do alkyl hóa mPEG
Dẫn chất aldehyd của PEG là dẫn chất hay sử dụng
Phản ứng amin khử với amin bậc I thành amin bậc II dưới tác động của
tác nhân khử hóa. Ban đầu là sự ngưng tụ của aldehyd với N-tận aicd amin của
protein hình thành các sản phẩm của imin (Schiff base). Các bazơ Schiff có khả
năng đảo ngược dễ dàng thành các amin bậc hai ổn định trong dung dịch có một
tác nhân khử như natri borohydrid (NaBH4) hoặc natri cyanoborohydrid
(NaCNBH3) [16], [17].

Hình 1. 8. Quá trình khử amin qua trung gian tạo bazơ Schiff [17]
pH là yếu tố rất quan trọng trong quá trình tổng hợp, điều chỉnh pH đến
điều kiện acid nhẹ (pH 4-5) là điều kiện phản ứng xảy ra tốt nhất [17].
Ngoài ra, có thể dử dụng dẫn chất PEG- tresylated, và dẫn chất PEG –
epoxyd thực hiện pegyl hóa ở nhóm amin [49].
11


- Sử dụng dẫn chất do acyl hóa mPEG
Dẫn chất este của N- hydroxyl succinimid với các mPEG carboxylic acid
(PEG-NHS)- đây là dẫn chất tiêu biểu để pegyl hóa bằng cách este hóa gốc amin
của Oxytocin. Các thuốc thử NHS este phản ứng với các nucleophil (như amin
nucleophil), với việc giải phóng N-hydroxy succinimid dẫn đến liên kết amid ổn
định [32].

Hình 1. 9. Phản ứng của NHS ester và một peptid [32].
Phản ứng được tiến hành dưới điều kiện kiềm nhẹ chẳng hạn đệm
bicarbonat pH từ 8,5 đến 9,5 và ở nhiệt độ thấp (4-250C) trong thời gian ngắn
1h.
Tuy nhiên, chất phản ứng NHS bị thủy phân nhanh trong nước dẫn đến
khó khăn trong hình thành nhóm succinimidyl ester, bằng cách thêm một nhóm
sulfonat làm tăng khả năng hòa tan trong nước, bền vững hơn, cho phép phản
ứng ghép được thực hiện trong điều kiện nước tạo sulfonat NHS este [32], [48].
- Sử dụng dẫn chất acid carboxylic của PEG.
Sự liên kết của các nhóm carboxylat với các amin để tạo thành các liên
kết

amid.

Sử

dụng

các

hợp

chất

carbodiimid

như

1-ethyl-3-(3-

dimethylaminopropyl)carbodiimid.HCl (EDC) hoặc dicyclohexylcarbodiimid
(DCC) kích hoạt các nhóm carboxyl để thay thế bằng các amin phản ứng. Phản
ứng xảy ra trong pH acid làm giảm độ bền của protein nên hiệu suất thấp cũng
như ảnh hưởng tới chất lượng sản phẩm sau phản ứng tổng hợp [49].

Hình 1. 10. Liên hợp với các nhóm Cacboxylic [49].
 Pegyl hóa vào cầu nối disulfid của Oxytocin
12


Việc tác động vào cầu nối disulfid không phải lúc nào cũng thuận lợi để
bảo vệ cấu trúc Oxytocin. Đã có một báo cáo về phương pháp liên hợp cho phép
bảo tồn được cầu nối disulfid với cầu nối 2 hoặc 3 nguyên tử cacbon và ít gây ra
những thay đổi trong cấu trúc của protein và peptid.

- Sử dụng dibromo hoặc dithiophenolmaleimid tạo cầu nối cacbon sulfid
Dibromomaleimid là chất để tạo phức hợp với Oxytocin tại cầu nối
disulfid, bằng cách chèn thêm một cầu nối vào disulfid. Phức hợp làm tăng độ
bền của phân tử Oxytocin. Sử dụng dibromomaleimid để pegyl hóa là một chất
phản ứng thuận lợi nhưng khó khăn trong giải phóng disulfid từ phức hợp PEG
với của protein. Phản ứng được tiến hành ở pH 7,5-8,5. Khi ở pH cao hơn, bên
cạnh phản ứng ở cầu nối disulfid còn xảy ra ở các amin [43], [45].

Hình 1. 11. Gắn hợp chất dibromo và dithiomaleimid tạo cầu nối
cacbon sulfide [43].
Phương pháp tạo cầu nối disulfid của Oxytocin được mở rộng khi tạo
phức với hợp chất dithiophenolmaleimid, phản ứng xảy ra tương tự với quá trình
tạo phức hợp của dibromomaleimid với Oxytocin [31].
- Phức hợp disulfid với các hợp chất Asen
Phương pháp được phát triển gần đây là sử dụng các phân tử PEG có chứa
Asen làm các chất kết nối với cầu disulfid. Phản ứng dựa vào ái lực của nhóm
Asen với cầu nối disufid tạo thành phức chelat bền vững. Làm tăng lực liên kết
ở cầu disulfid và tăng độ bền phân tử Oxytocin. Đây là phương pháp thay thế
cho phương pháp tạo phức với các hợp chất cầu nối dibromo/ dithiomaleimid.
Các phức hợp Arsen này đã được chứng minh là có thể đảo ngược trong sự hiện
diện của các dithiol khác để tạo chelat chéo, như giảm oxi hóa cấu trúc, cho
phép cơ chế giải phóng Oxytocin được dễ dàng. Tuy nhiên, tác dụng của các
hợp chất Asen giải phóng trong cơ thể chưa được đánh giá [53].
- Liên hợp cầu nối ba nguyên tử cacbon vinyl sulfon/ bis-sulfon
13


Vinyl sulfon là một nhóm các chất phản ứng ở các vị trí đặc biệt. Phản
ứng cộng hợp vào các nhóm sulfyhydryl lần lượt ở pH kiềm theo kiểu phản ứng
Michael, tạo ra các liên kết β-thioether ổn định [25], [35]. Năm 2006 một

phương pháp chọn lọc dựa trên các phản ứng của thiols với vinyl sulfon để
nhắm mục tiêu và tạo ra liên kết giữa mạch ba carbon [37] .
Một chất phản ứng bis-sulfon được tổng hợp có thể được sử dụng để cải
tiến peptid tại một vị trí đặc hiệu, theo cách tương tự như dibromo/
dithiophenolmaleimid. Sau khi giảm lực liên kết disulfid, việc thêm β'monosulfon α, β không bão hòa được thực hiện với chất thiol đầu tiên. Điều này
tạo ra một liên kết đôi thứ hai mà có thể trải qua bổ sung khác với thiol thứ hai.
Sự liên hợp này tạo ra một cây cầu ba cacbon qua vị trí của disulfid giữ lại cấu
trúc của peptid và ngăn ngừa làm mất hoạt tính của Oxytocin [57].

Hình 1. 12. Liên hợp vào cầu nối ba nguyên tử cacbon [57].
- Sử dụng các dẫn chất vinyl PEG tạo sulfid alkyl
Nhóm thiol qua phản ứng với các liên kết không bão hòa-hay còn gọi là
phản ứng Thiol-en. Phản ứng thông qua cơ chế phản ứng cộng hợp Michael.
Trong nghiên cứu của Jones và cộng sự , sử dụng phospho để khử cầu nối
disulfid, sau đó thiol phản ứng với vinyl PEG acrylat, không bão hòa tạo sản
phẩm sulfid alkyl [33].

14


Hình 1. 13. Phản ứng Thiol-en [33].
 Pegyl hóa vào nhóm hydroxyl trên phân tử Oxytocin
PEG – epoxid phản ứng với nhóm hydroxyl ở môi trường kiềm (8,5- 9,5).
Cầu nối được hình thành trong khoảng 14-25 h tại 4-250C [49].

Hình 1. 14. Pegyl hóa vào nhóm hydroxyl trên phân tử Oxytocin [49]
1.5. Sự phát triển của các sản phẩm thuốc protein-PEG hiện nay
Các nghiên cứu về sự gắn kết pegyl hóa protein khác nhau và ứng dụng
trong điều trị. Phương pháp pegyl hóa đã có thể cải thiện một loạt các đặc tính
cho phân tử sinh học bao gồm cả tác dụng dược lý. Kết quả là một số protein

pegyl hóa nhận được sự chấp thuận của Tổ chức Thực phẩm và Dược phẩm
(FDA) Mỹ. Hiện nay đang có nhiều nghiên cứu khác và các thử nghiệm lâm
sàng tìm kiếm sự chấp thuận của FDA. Thống kê đến năm 2011 về các sản phẩm
pegyl hóa được FDA cho phép sử dụng trên thị trường, cho thấy triển vọng của
lĩnh vực pegyl hóa protein [11].
Bảng 1. 1. Các sản phẩm pegyl hóa đã sử dụng trên thị trường [51]
Biệt dƣợc

Đặc điểm

Nơi sản xuất
năm phê
duyệt

Adynovate

Pegyl hóa antihemophilic factor VIII để điều

Baxalta, 2015

trị bệnh nhân bị bệnh ưa chảy máu A.
Plegridy

Pegyl hóa interferon beta-1a trong điều trị
15

Biogen, 2014


Biệt dƣợc

Đặc điểm

Nơi sản xuất
năm phê
duyệt

bệnh nhân tái phát bệnh đa xơ cứng.
Naloxegol

Pegyl hóa naloxol trong điều trị táo bón do

AstraZeneca,

opioid gây ra với cơn đau không do ung thư

2014

mạn tính.
Pegloticase

Pegyl hóa uricase trong điều trị bệnh gút.

Savient, 2010

Mircera

Pegyl hóa của erythropoietin để chống thiếu

Roche, 2007

máu liên quan đến bệnh thận mãn tính.
Peginterferon

Pegyl hóa α- interferon dùng trong điều

Hoffmann-La

α-2a

trị viêm gan C mạn tính và viêm gan B.

Roche, 2001

Doxil

Pegyl hóa liposome chứa doxorubicin trong

Ortho Biotech,

điều trị ung thư.

2001

Peginterferon

Pegyl hóa α-interferon dùng trong điều

Enzon, 2000

α-2b

trị viêm gan C mãn tính và viêm gan B .

Pegaspargase

Pegyl hóa L-asparaginase trong điều trị bệnh

Enzon, 1994

bạch cầu lympho cấp tính.
Adagen

Pegyl hóa adenosine deaminase dung trong

Enzon, 1990

điều trị bệnh suy giảm miễn dịch kết hợp nặng.
Tại Việt Nam gần đây đã có một số nghiên cứu quan tâm đến vấn đề pegyl
hóa các protein. Thầy Nguyễn Văn Rư (2017) đã nghiên cứu tổng hợp sản phẩm
pegyl hóa từ Insulin tụy lợn và mPEG-CHO với điều kiện thích hợp (tỷ lệ tối ưu,
xúc tác NaCNBH3, pH 4,5 và 300C), xây dựng được qui trình kỹ thuật đơn giản
thực hiện ở qui mô phòng thí nghiệm, cho hiệu suất gắn đạt 96,9 %. Đồng thời
tinh chế và xác định khối lượng phân tử là 17,8 kDa, tức một phân tử mPEG
aldehyd 12 kDa gắn vào vị trí –NH2 ở đầu chuỗi B của Insulin. Khảo sát độ bền
protein trong 3 môi trường: dịch nước bọt, dịch vị và dịch tụy nhân tạo, sau 3

16