Đánh giá tác dụng kháng cholinesterase trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin của cao đan sâm (salvia miltiorrhiza bunge)

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGÔ THỊ DỊU

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG
CHOLINESTERASE TRÊN MƠ HÌNH GÂY
SA SÚT TRÍ NHỚ BẰNG SCOPOLAMIN CỦA
CAO ĐAN SÂM (Salvia miltiorrhiza Bunge)

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2018


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGÔ THỊ DỊU
Mã sinh viên: 1301051

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG
CHOLINESTERASE TRÊN MƠ HÌNH GÂY
SA SÚT TRÍ NHỚ BẰNG SCOPOLAMIN CỦA
CAO ĐAN SÂM (Salvia miltiorrhiza Bunge)
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Đào Thị Vui
2. DS.NCS. Trần Thị Loan

Nơi thực hiện:

Bộ môn Dƣợc lực

HÀ NỘI – 2018


LỜI CẢM ƠN
Với tất cả lịng kính trọng và biết ơn, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS.
Đào Thị Vui và DS.NCS. Trần Thị Loan, hai ngƣời thầy đã ln tận tình hƣớng dẫn,
động viên và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tơi trong suốt q trình thực hiện đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn
Dƣợc lực, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi
để tơi hồn thành đề tài này này.
Tơi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các anh chị trong khoa Hóa phân tích Tiêu chuẩn tại Viện dƣợc liệu đã tạo điều kiện tốt nhất để tơi có thể chiết dƣợc liệu tại
khoa trong thời gian ngắn nhất, kịp tiến độ đề tài.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến tồn thể thầy cơ giáo và cán bộ trong trƣờng Đại
học Dƣợc Hà Nội đã nhiệt tình dạy bảo, trang bị cho tôi nhiều kiến thức cùng kinh
nghiệm quý báu và thực sự đó là những hành trang quý báu giúp tôi thêm vững bƣớc
trên con đƣờng sắp tới của mình.
Tơi xin gửi lời cảm ơn tới các em K69 nghiên cứu khoa học tại bộ môn Dƣợc
lực, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tơi trong suốt thời gian làm
khóa luận.
Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt và ý nghĩa nhất tới gia đình, ngƣời
thân, bạn bè, những ngƣời đã ln chỉ bảo, động viên, chăm sóc, ln sát cánh bên tơi,
là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi những lúc khó khăn, để tơi có đƣợc nhƣ ngày
hơm nay.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 16 tháng 5 năm 2018
Sinh viên

Ngô Thị Dịu

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ............................................................i
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................. ii
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................. iii
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ...........................................................................................3
1.1. Bệnh Alzheimer ....................................................................................................3
1.1.1. Dịch tễ ..........................................................................................................3
1.1.2. Nguyên nhân gây bệnh. .................................................................................3
1.1.3. Cơ chế bệnh sinh ...........................................................................................4
1.1.4. Điều trị ...........................................................................................................6
1.2. Các mơ hình và phƣơng pháp nghiên cứu tác dụng điều trị sa sút trí nhớ trên
thực nghiệm .................................................................................................................9
1.2.1. Phƣơng pháp đánh giá tác dụng kháng enzym acetylcholinesterase in vitro 9
1.2.2. Các mơ hình nghiên cứu ..............................................................................10
1.2.3. Một số phƣơng pháp đánh giá khả năng về trí nhớ của động vật thí nghiệm
...............................................................................................................................12
1.3. Đan sâm ..............................................................................................................14
1.3.1. Tên khoa học ...............................................................................................14
1.3.2. Đặc điểm hình thái.......................................................................................14
1.3.3. Phân bố và bộ phận dùng.............................................................................15
1.3.4. Thành phần hóa học.....................................................................................15
1.3.5. Tác dụng dƣợc lý .........................................................................................16
1.3.6. Các nghiên cứu liên quan đến tác dụng điều trị Alzheimer ........................16
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ..............................................................................................................19
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị .....................................................................................19
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu...............................................................................19

2.1.2. Hóa chất, thuốc thử......................................................................................21
2.1.3. Thiết bị.........................................................................................................21
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................................22
2.2.1. Phƣơng pháp đánh giá tác dụng kháng AChE in vitro của cao rễ Đan sâm.
...............................................................................................................................22


2.2.2. Phƣơng pháp đánh giá tác dụng của Đan sâm trên mơ hình gây sa sút trí
nhớ thực nghiệm bằng scopolamin .......................................................................24
2.2.3. Xử lý số liệu ...............................................................................................30
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .....................................................................31
3.1. Đánh giá tác dụng kháng acetylcholinesterase in vitro của Đan sâm ...............31
3.2. Đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm trên mơ hình gây sa sút trí nhớ thực
nghiệm bằng scopolamin. ..........................................................................................32
3.2.1.Thơng qua các test hành vi ...........................................................................32
3.2.2. Thông qua hoạt độ enzym acetylcholinesterase trong não động vật thí
nghiệm. ..................................................................................................................35
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN ............................................................................................37
4.1. Về tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của cao Đan sâm..............................37
4.2. Tác dụng của cao rễ Đan sâm trên mô hình gây sa sút trí nhớ thực nghiệm bằng
scopolamin .................................................................................................................38
4.2.1. Thông qua các test hành vi ..........................................................................38
4.2.2. Ảnh hƣởng của cao rễ Đan sâm đến hoạt độ enzym acetylcholinesterase
trong não động vật thí nghiệm. ..............................................................................40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................43
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..............................................................................................iv
PHỤ LỤC .......................................................................................................................ix

2

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
AD

Alzheimer (Alzheimer disease)

ACh

Acetylcholin

AChE

Acetylcholinesterase

APOE

Apolipoprotein

APP

Protein tiền chất amyloid (Amyloid precursor protein)

ATCI

Acetylthiocholin iodid

Aβ

Beta-amyloid

BuOH

Butanol

CH2Cl2

Dichloromethan

CTP1

Cao toàn phần Đan sâm nồng độ 600 mg/kg

CTP2

Cao toàn phần Đan sâm nồng độ 1200 mg/kg

CTP3

Cao toàn phần Đan sâm nồng độ 2400 mg/kg

DM

Dung môi

DTNB

Acid 5,5’-Dithiobis-(2-nitrobenzoic)

EtOAc

Ethylacetat

IC50

Nồng độ ức chế 50%

NMDA

N-methyl-D-aspartat

n-hexan 1

Cao phân đoạn n-hexan nồng độ 17,5 mg/kg

n-hexan 2

Cao phân đoạn n-hexan nồng độ 35 mg/kg

i


DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng

Trang

Bảng 2.1 Hỗn hợp phản ứng trong mỗi giếng

23

Bảng 3.1 Hoạt tính ức chế AChE in vitro của cao toàn phần và các cao

31

phân đoạn Đan sâm
Bảng 3.2 Giá trị IC50 của các mẫu

31

Bảng 3.3 Ảnh hƣởng của các cao phân đoạn rễ Đan sâm đến tổng số lần

33

vào các cánh tay của động vật thí nghiệm trên test mê lộ chữ Y
Bảng 3.4 Ảnh hƣởng của cao Đan sâm đến thời gian tiềm tàng vào buồng

34

tối của động vật thí nghiệm trong test né tránh thụ động
Bảng 3.5 Ảnh hƣởng của cao Đan sâm đến hoạt độ enzym
acetylcholinesterase trong não động vật thí nghiệm.
.

ii

35


DANH MỤC CÁC HÌNH
Tên

Trang

Hình 2.1

Quy trình chiết xuất dƣợc liệu.

20

Hình 2.2

Sơ đồ thiết kế nghiên cứu.

22

Hình 2.3

Sơ đồ thiết kế nghiên cứu đánh giá tác dụng trên mơ hình

25

Alzheimer thực nghiệm bằng scopolamin của Đan sâm.
Hình 2.4

Minh họa test mê lộ chữ Y

26

Hình 2.5

Minh họa dụng cụ test né tránh thụ động.

28

Hình 3.1

Ảnh hƣởng của các cao phân đoạn rễ Đan sâm đến tỷ lệ

33

chuyển tiếp giữa các cánh tay của động vật thí nghiệm trên
test mê lộ chữ Y
Hình 3.2

Tỷ lệ ức chế enzym acetylcholinesterase trong não động vật
thí nghiệm so với lô chứng bệnh

iii

36


ĐẶT VẤN ĐỀ
Alzheimer là một bệnh thối hóa thần kinh tiến triển, liên quan đến tuổi tác, đặc
trƣng bởi sự suy giảm nhận thức, trí nhớ, rối loạn thần kinh và chết tế bào thần kinh.
Tỷ lệ ngƣời mắc Alzheimer đang tăng lên theo từng thập kỷ của cuộc sống. Hiện chỉ
có hai nhóm thuốc đã đƣợc chấp thuận để điều trị Alzheimer là các thuốc ức chế
acetylcholinesterase nhƣ donepezil, galantamin, rivastigmin và thuốc đối kháng thụ thể
N-methyl-D-aspartat là memantin. Tuy nhiên, các loại thuốc đƣợc đề cập trên có thể
gây ra nhiều tác dụng phụ nhƣ buồn nôn, nôn mửa, tiêu chảy, chóng mặt và giảm cân,

hoặc độc tính với gan. Trƣớc thực tế bệnh nhân mắc Alzheimer ngày càng gia tăng,
bệnh nhân phải sử dụng thuốc lâu dài do đây là bệnh mạn tính và chƣa có cách chữa
khỏi hồn tồn, việc tìm kiếm các thuốc mới đặc biệt là các dƣợc liệu có hiệu quả và
an tồn để điều trị Alzheimer là rất cần thiết.
Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) là cây thuốc mọc tự nhiên và đƣợc trồng ở
nhiều nơi ở nƣớc ta nhƣ Sapa, Bắc Hà (Lào Cai), Tam Đảo, Hà Nội, Phú Thọ, Thanh
Hóa đã đƣợc sử dụng rộng rãi để điều trị bệnh tim mạch và mạch máu não. Trong
những năm gần đây, Đan sâm trở thành đối tƣợng tiềm năng trong điều trị các bệnh lý
liên quan đến thần kinh nhƣ bệnh Alzheimer. Một số nghiên cứu cho thấy Đan sâm có
tác dụng ức chế acetylcholinesterase trong dịch nghiền đồng thể não chuột [46] và trên
in vitro [36],[45], đồng thời nhiều nghiên cứu cũng cho thấy tác dụng của Đan sám
trong việc cải thiện trí nhớ của trên mơ hình gây sa sút trí tuệ động vật thí nghiệm
[37],[39], [42].
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Đánh giá tác dụng kháng
cholinesterase trên mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin của cao Đan sâm
(Salvia miltiorrhiza Bunge)” với hai mục tiêu chính sau:
1. Đánh giá ảnh hƣởng của cao rễ Đan sâm đến hoạt độ enzym cholinesterase in
vitro.
2. Đánh giá tác dụng của cao rễ Đan Sâm trên mơ hình gây sa sút trí nhớ thực
nghiệm bằng scopolamin.
Để đạt đƣợc các mục tiêu nghiên cứu đã đặt ra, các nội dung nghiên cứu của đề
tài nhƣ sau:

1




Thực hiện mục tiêu 1
Đánh giá ảnh hƣởng của cao toàn phần và các cao phân đoạn từ cao rễ Đan sâm

đến hoạt độ enzym cholinesterase in vitro từ đó lựa chọn cao và phân đoạn ƣu thế cho
nghiên cứu tiếp theo.


Thực hiện mục tiêu 2
- Đánh giá tác dụng của Đan sâm trên mơ hình gây sa sút trí nhớ thực nghiệm

bằng scopolamin thông qua các test hành vi.
- Đánh giá ảnh hƣởng của Đan sâm đến hoạt độ enzym acetylcholinesterase trong
não chuột nhắt trắng.

2


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Bệnh Alzheimer
1.1.1. Dịch tễ
Alzheimer là một dạng sa sút trí tuệ thƣờng gặp nhất, chiếm tỷ lệ 50-60% tổng số
các trƣờng hợp sa sút trí tuệ [25]. Đây là một dạng sa sút trí tuệ có liên quan tới sự
thiếu hụt nghiêm trọng các tế bào cholinergic [33]. Năm 1906, một bác sỹ ngƣời Đức
Alois Alzheimer đã ghi nhận trƣờng hợp bệnh nhân đầu tiên bị Alzheimer. Năm 1910,
nhà tâm thần học Kraepelin đã lấy tên Alzheimer để đặt cho tên bệnh trong một cuốn
sách của mình [21].
Theo báo cáo của tổ chức Alzheimer thế giới năm 2015, số ngƣời mắc Alzheimer
và các hình thức sa sút trí tuệ trên tồn thế giới ƣớc tính là 46,85 triệu ngƣời; số lƣợng
này sẽ tăng gấp đôi vào năm 2030 và có thể sẽ tăng gấp ba lần mức hiện tại vào năm
2050. Mỗi năm có khoảng 7,7 triệu trƣờng hợp mắc bệnh sa sút trí tuệ đƣợc báo cáo
[35]. Tại những nƣớc phát triển, tỷ lệ mắc sa sút trí tuệ khoảng 8% đối với ngƣời từ 65
tuổi trở lên [5]. Số ngƣời trên 65 tuổi sống với Alzheimer dự kiến sẽ đạt 6,7 triệu

ngƣời vào năm 2025 [26]. Với tuổi cao hơn (85 trở lên), tỷ lệ này ở nhiều nƣớc có thể
lên đến 50%, có nghĩa là cứ 2 ngƣời thì sẽ có 1 ngƣời mắc [5].
Vấn đề trở lên nghiêm trọng hơn khi ta biết trong tƣơng lai, số ngƣời già ngày
càng nhiều và suy giảm trí tuệ, nhất là thể Alzheimer, loại nặng, hủy hoại tồn bộ hoạt
động tâm thần, hiện chƣa có cách chữa trị khỏi hoàn toàn. Trong điều kiện nhƣ vậy, sự
khó khăn đối với ngƣời cao tuổi cũng nhƣ gánh nặng do Alzheimer gây ra cho gia đình
và xã hội là hết sức nặng nề [5].
1.1.2. Nguyên nhân gây bệnh.
Nguyên nhân chính xác của Alzheimer chƣa đƣợc xác định rõ. Tuy nhiên, hiện
nay đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới đƣa ra giả thuyết về nguyên nhân gây ra
Alzheimer có liên quan đến một số yếu tố di truyền và yếu tố mơi trƣờng. Trong đó,
các yếu tố di truyền đã đƣợc cho là có liên kết với Alzheimer cả thể khởi phát sớm và
muộn [9], [32].
Yếu tố di truyền, đến nay đã đƣợc xác nhận là một trong các nguyên nhân gây
Alzheimer. Yếu tố di truyền đƣợc thấy ở 5% các bệnh nhân Alzheimer và là
Alzheimer khởi phát sớm. Tuy nhiên, trong gia đình ngƣời mang các biến dị nhiễm sắc
thể gây bệnh Alzheimer vẫn có sự khác nhau về tuổi khởi phát bệnh cũng nhƣ biểu
3


hiện các triệu chứng. Hơn một nửa các trƣờng hợp di truyền chủ yếu đƣợc phát hiện
sớm có thể là do sự thay đổi nhiễm sắc thể số 1, 14 và 21. Sự gắn kết về di truyền đối
với Alzheimer khởi phát muộn chủ yếu liên quan đến kiểu gen apolipoprotein E
(APOE) [32].
Ngồi ra, các yếu tố mơi trƣờng cũng góp phần làm tăng nguy cơ mắc
Alzheimer, bao gồm tuổi tác, giảm khả năng lƣu trữ não bộ (giảm kích thƣớc não bộ,
trình độ học vấn thấp, giảm hoạt động tinh thần và thể chất trong cuộc sống), chấn
thƣơng đầu, hội chứng Down, trầm cảm, suy giảm nhận thức nhẹ (MCI), và các yếu tố
nguy cơ cho bệnh mạch máu (tăng cholesterol máu, tăng huyết áp, xơ vữa động mạch,
bệnh mạch vành, hút thuốc, tăng homocystein, béo phì, hội chứng chuyển hóa và đái

tháo đƣờng). Những yếu tố này góp phần vào việc gây ra các triệu chứng của
Alzheimer [32].
1.1.3. Cơ chế bệnh sinh
Alzheimer là bệnh thối hóa thần kinh tiến triển, là nguyên nhân hàng đầu gây sa
sút trí tuệ của ngƣời lớn tuổi. Tuy nhiên cơ chế bệnh sinh của Alzheimerchƣa đƣợc
khẳng định chính xác. Có rất nhiều giả thuyết đƣợc đƣa ra nhƣ: giả thuyết cholinergic,
giả thuyết amyloid beta, giả thuyết protein tau, giả thuyết glutamat,… Trong đó giả
thuyết cholinergic là giả thuyết đƣợc hình thành đầu tiên và hiện nay vẫn là cơ sở cho
hầu hết các thuốc điều trị Alzheimer [25].
Giả thuyết cholinergic
Hệ thống cholinergic đƣợc cho là bị ảnh hƣởng nhiều nhất và tƣơng quan với
mức độ nghiêm trọng của bệnh lý Alzheimer [35]. Cụ thể hơn, sự thối hóa và suy
giảm chức năng của các tế bào thần kinh cholinergic ở nhân nền vùng vỏ não trƣớc đã
đƣợc báo cáo đóng một vai trò quan trọng trong sự suy giảm nhận thức và trí nhớ của
Alzheimer [32],[35]. Do đó, ngƣời ta cho rằng cải thiện chức năng các tế bào thần kinh
cholinergic sẽ cải thiện các triệu chứng mất trí nhớ trong Alzheimer [32]. Acetylcholin
- một chất chủ vận trong hệ cholinergic, là một trong những chất dẫn truyền thần kinh
chính mà nhờ đó xung điện đƣợc truyền giữa các tế bào thần kinh với nhau hoặc từ tế
bào thần kinh tới cơ vân và cơ trơn [11], nó đƣợc coi là có vai trị cơ bản trong rối loạn
sinh hóa não, gây suy giảm nhận thức và trí nhớ ở bệnh nhân Alzheimer. Sự suy giảm
lƣợng acetylcholin này tƣơng ứng với mức độ trầm trọng của sa sút trí tuệ trên lâm
sàng [4],[31]. Acetylcholin là chất kém bền, bị mất hoạt tính rất nhanh dƣới tác dụng
4


thủy phân của acetylcholinesterase, dễ bị phân hủy ở đƣờng tiêu hóa, khó thấm qua
hàng rào sinh học và khơng vào đƣợc tế bào thần kinh nên acetylcholin ít dùng để điều
trị [11]. Chính vì vậy xu hƣớng điều trị hiện nay trong Alzheimer là sử dụng các chất
ức chế enzym acetylcholinesterase nhằm làm tăng nồng độ acetylcholin ở nhân nền
vùng vỏ não trƣớc, cải thiện chức năng của hệ cholinergic và ngăn ngừa thối hóa thần

kinh, từ đó cải thiện đƣợc khả năng nhận thức và trí nhớ [45].
Giả thuyết amyloid
Hiện nay, giả thuyết về cơ chế bệnh sinh của Alzheimer đƣợc quan tâm hơn cả là
giả thuyết amyloid, mặc dù chƣa có thuốc điều trị Alzheimer theo cơ chế này. Theo giả
thuyết amyloid, sự thối hóa thần kinh trong Alzheimer bắt nguồn từ thối hóa bất
thƣờng của protein tiền amyloid (APP) và dẫn đến sự hình thành, tập hợp và lắng đọng
của các peptid Aβ độc. APP là một protein màng tế bào nằm xuyên qua màng tế bào
thần kinh, đƣợc tổng hợp trong lƣới nội chất vận chuyển qua các túi tiết và đƣợc phân
tách trong phức hợp Golgi. Trong phức hợp Golgi, APP đƣợc phân tách bằng các
enzym α, β và γ- secretase. Sự phân cắt APP bởi α-secretase ở giữa Lys16 và Leu17
tạo ra một phức hợp hịa tan của APP (sAPPα), có tác dụng bảo vệ thần kinh. Trong
khi đó, β và γ-secretase phân tách APP tạo ra các đoạn β-peptide khác nhau và khơng
tan. Những đoạn peptide này đã đƣợc thấy đóng vai trò lớn trong việc tạo ra các mảng
bám amyloid ở gian bào các tế bào thần kinh,đặc trƣng của bệnh lý Alzheimer. Các
mảng chủ yếu hình thành là Aβ1-40 và Aβ1-42. Aβ1-40 tan, ít độc thần kinh và chủ
yếu đƣợc tìm thấy trong não khỏe mạnh, trong khi Aβ1-42 có độc tính thần kinh cao
và chủ yếu đƣợc tìm thấy trong não mang bệnh lý Alzheimer [35]. Sự lắng đọng, kết
tập Aβ-42 sẽ tạo ra các mảng không tan, lắng đọng tại vùng hải mã và vỏ não tạo điều
kiện cho các các phản ứng viêm xảy ra, từ đó dẫn đến chết neuron, mất synap, tổn
thƣơng và chết tế bào thần kinh [4],[35].
Giả thuyết protein tau
Protein tau là thành phần chính của đám rối sợi trong tế bào thần kinh đƣợc tìm
thấy trong não của bệnh nhân mắc Alzheimer. Tau là một protein hịa tan có trong các
tế bào thần kinh, đóng vai trị chủ đạo trong sự phát triển của sợi trục và sự phát triển
thần kinh bằng cách ổn định việc hình thành các vi ống thần kinh. Trong điều kiện
bình thƣờng, cân bằng giữa enzym phosphatase và kinase duy trì cả hai trạng thái
phosphoryl hóa và de-phosphoryl hóa của tau. Trong điều kiện bệnh lý, sự mất cân
5

bằng giữa các các enzym này dẫn đến sự phosphoryl hóa quá mức của protein tau tạo
ra các sợi xoắn kép và các đám rối sợi thần kinh khơng hịa tan bên trong tế bào thần
kinh, đƣợc gọi là NFT [35]. Điều này đầu tiên sẽ làm mất các chức năng liên lạc hóa
sinh giữa các neuron, rối loạn chức năng synap thần kinh, sau đó thối hóa và gây chết
tế bào thần kinh [22]. NFT xuất hiện trong tế bào thần kinh trong suốt quá trình hình
thành Alzheimer và là phức hợp protein khơng hịa tan, tồn tại ngay cả khi các tế bào
thần kinh đã chết. Trong Alzheimer, NFT thƣờng đƣợc tìm thấy trong vùng hồi hải
mã, vỏ não, hạch nền Meynert,… [35].
Giả thuyết glutamat
Glutamat, một chất dẫn truyền thần kinh quan trọng trong hệ thống thần kinh
trung ƣơng. Trong trạng thái sinh lý, glutamat đóng vai trị then chốt trong các chức
năng thần kinh khác nhau nhƣ truyền tín hiệu giữa các synap, tăng trƣởng các tế bào
thần kinh, trong học tập và trí nhớ. Tuy nhiên, trong điều kiện bệnh lý, kích thích thụ
thể NMDA quá mức đóng vai trị quan trọng trong sự phát triển của Alzheimer. Nhiều
bằng chứng cho thấy rằng quá mức glutamat qua q trình kích hoạt qua mức các thụ
thể NMDA dẫn đến việc hình thành các mảng amyloid, dẫn đến mất các tế bào thần
kinh. Trong Alzheimer, sau khi Aβ lắng đọng và hình thành NFT, thụ thể NMDA
đƣợc kích hoạt quá mức và dẫn đến giải phóng Ca2+ quá mức vào tế bào chất. Dòng
Ca2+ này gây rối loạn chức năng ty thể và kích hoạt enzym trong chu trình CREB
(protein liên kết phản ứng AMP vịng) loại bỏ tín hiệu, dẫn đến sự giảm mức phosphoCREB. Sự giảm phospho-CREB làm giảm sự sản sinh các phân tử quan trọng nhƣ
BDNF (yếu tố thần kinh có nguồn gốc từ não), do đó các tế bào trở nên dễ bị rối loạn
chức năng, gây stress oxy hóa và gây chết tế bào thần kinh [35].
1.1.4. Điều trị
1.1.4.1. Mục tiêu điều trị
Triệu chứng lâm sàng của bệnh Alzheimer gồm triệu chứng thuộc về nhận thức
và triệu chứng không thuộc về nhận thức. Một số triệu chứng thuộc về nhận thức nhƣ
mất trí nhớ, mất khả năng ngơn ngữ, mất phƣơng hƣớng (nhận thức suy giảm về thời
gian và không thể nhận ra những ngƣời quen thuộc), suy giảm chức năng điều khiển
hành động của bản thân,… Một số triệu chứng không thuộc về nhận thức nhƣ trầm
cảm, triệu chứng tâm thần (ảo giác và ảo tƣởng), rối loạn hành vi, không có khả năng

tự chăm sóc bản thân (mặc quần áo, tắm rửa, vệ sinh và ăn uống),.. Các thuốc hiện nay
6


khơng điều trị khỏi bệnh. Chính vì vậy, mục tiêu chính của điều trị Alzheimer là làm
chậm tiến triển của bệnh, điều trị những triệu chứng khó khăn nhận thức, điều trị các
di chứng tâm thần, hành vi và duy trì các chức năng của bệnh nhân bình thƣờng càng
lâu càng tốt [32].
1.1.4.2. Các thuốc điều trị
Từ mục tiêu điều trị, hiện nay có hai nhóm thuốc lớn trong điều trị Alzheimer là
thuốc điều trị rối loạn nhận thức và thuốc điều trị rối loạn không thuộc nhận thức.
1.1.4.2.1. Thuốc điều trị rối loạn nhận thức
Hiện nay, các thuốc điều trị Alzheimer đƣợc nghiên cứu dựa trên cơ chế bệnh
sinh của bệnh. Các thuốc điều trị Alzheimer bao gồm hai nhóm thuốc chính: chất ức
chế enzym acetylcholinesterase (AChE) và chất đối kháng thụ thể N-methyl-Daspartat (NMDA). Bốn chất ức chế AChE đã đƣợc Cục Quản lý Thực phẩm và Dƣợc
phẩm Hoa Kỳ (FDA) phê duyệt là tacrin, donepezil, rivastigmin và galantamin [26],
[29]. Tuy nhiên tacrin hiện đã khơng cịn đƣợc sử dụng tại Hoa Kì do tác dụng phụ
trên gan phụ thuộc liều quá lớn [32].
 Chất ức chế enzym acetylcholinesterase
Sự thiếu hụt chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin đã đƣợc quan sát thấy trong
não của bệnh nhân Alzheimer [20]. Các tế bào thần kinh cholinergic tổng hợp ra
acetylcholin, chất đóng vai trị quan trọng trong việc học tập và trí nhớ [35]. Do vậy
việc ức chế enzym acetylcholinesterase, enzym xúc tác cho phản ứng thủy phân
acetylcholin, sẽ duy trì nồng độ và thời gian hoạt động của acetylcholin tại các khe
synap [20], [45]. Do đó những chất có tác dụng ức chế AChE sẽ kéo dài thời gian tồn
tại và thời gian tác dụng của acetylcholin, cải thiện chức năng của các synap thần kinh
cholinergic trung tâm và ngăn ngừa thối hóa thần kinh, từ đó cải thiện đƣợc khả năng
nhận thức và trí nhớ [11], [45].
Donepezil là chất ức chế AChE thứ 2 đã đƣợc phê duyệt năm 1996 để điều trị
Alzheimer từ mức độ nhẹ đến trung bình. Thuốc đƣợc hấp thu tốt và đƣợc chuyển hóa

bởi cytochrom P-450 và bài tiết qua thận. Thuốc có thời gian bán thải dài khoảng 72
giờ, không bị thay đổi ở ngƣời cao tuổi hoặc ở những bệnh nhân có rối loạn chức năng
gan thận. Một số tác dụng phụ của thuốc thƣờng biểu hiện nhẹ, phổ biến nhất là buồn
nôn, tiêu chảy, mất ngủ, mệt mỏi và chuột rút cơ bắp [4].

7


Rivastigmin là 1 chất trung gian, tác dụng chậm ức chế có hồi phục
cholinesterase, đồng thời ức chế cả butyrylcholinesterase. Trong đó hoạt động của
AChE làm giảm tiến triển của Alzheimer. Rivastigmin có thời gian bán thải tƣơng đối
ngắn (1,5 giờ), nhƣng tác dụng trên lâm sàng kéo dài. Rivastigmin khơng chuyển hóa
qua cytochrom P-450. Một số tác dụng phụ liên quan với rivastigmin bao gồm nôn,
buồn nôn, tiêu chảy và chán ăn [4], [32].
Galantamin là một chất ức chế acetylcholinesterase đảo ngƣợc và cũng cạnh
tranh với thụ thể nicotinic acetylcholin. Kết quả kích thích thụ thể nicotinic làm tăng
giải phóng acetylcholin có tác dụng bảo vệ có thể chống lại Aβ gây độc thần kinh, hiệu
quả có thể mang lại lợi ích trong điều trị Alzheimer. Galantamin đƣợc chuyển hóa bởi
enzym cytochrom P-450 (CYP2D6 và CYP3A4) ở gan, do đó có nguy cơ bị những
thuốc khác gây ra thay đổi nồng độ thuốc trong huyết thanh. Thời gian bán thải của
galantamin là 5-7 giờ [4].
 Chất đối kháng thụ thể N-methyl-D-aspartat
Glutamat là một chất dẫn truyền thần kinh kích thích có thể đóng một vai trị
quan trọng trong việc phát triển và tiến triển của bệnh thối hóa thần kinh. Một giả
thuyết cho rằng vai trò của glutamat là phát quá mức xung động thần kinh dẫn để kích
thích quá mức thụ thể glutamat NMDA gây phá hủy các neuron. Các tác nhân ngăn
cản các thụ thể NMDA về mặt lý thuyết sẽ làm giảm thối hóa trong não [4].
Memantin là loại thuốc duy nhất trong nhóm và đƣợc coi là một chất đối kháng
NMDA không cạnh tranh, tác động trung bình đối với các thụ thể. Memantin đƣợc phê
duyệt và sử dụng tại Hoa Kì vào năm 2003 cho thể bệnh AD từ mức độ nhẹ đến trung

bình[4], [26]. Memantin đƣợc hấp thu tốt qua đƣờng uống, không bị ảnh hƣởng bởi
thức ăn và dễ dàng đi qua hàng rào máu não. Thuốc chủ yếu thải trừ qua thận và không
ảnh hƣởng đến hoạt động của enzym gan. Nồng độ của memantin không bị thay đổi
bởi tác động của các enzym CYP tại gan. Các tác dụng phụ của thuốc thƣờng nhẹ và
bao gồm tăng huyết áp, đau đầu [4].
1.1.4.2.2. Thuốc điều trị triệu chứng không thuộc nhận thức
Hầu hết các bệnh nhân mắc Alzheimer trong một số thời điểm bị bệnh xuất hiện
các triệu chứng rối loạn khơng thuộc nhận thức. Những triệu chứng này có thể đƣợc
chia thành ba loại: triệu chứng tâm thần, rối loạn hành vi và trầm cảm. Quản lý hiệu

8


quả các vấn đề này là rất quan trọng vì các biểu hiện này gây khó khăn cho cả bệnh
nhân và ngƣời chăm sóc, địi hỏi sự giám sát và kiên nhẫn của ngƣời chăm sóc [32].
Một số nhóm thuốc hiện nay đang đƣợc sử dụng:
- Thuốc chống trầm cảm: giai đoạn đầu của Alzheimer thƣờng kèm theo triệu
chứng trầm cảm và có thể đáp ứng với thuốc điều trị. Giải quyết tình trạng này là cải
thiện tính khí, khả năng chức năng và nhận thức. Thuốc chống trầm cảm ức chế chọn
lọc thu hồi serotonin có hiệu quả và đƣợc ƣa chuộng sử dụng trong Alzheimer [4].
- Thuốc chống loạn thần đƣợc chỉ định để điều trị các triệu chứng tâm thần rõ
ràng nhƣ ảo tƣởng, đặc biệt là sự nghi ngờ hoặc khủng bố, ngồi ra cịn có triệu chứng
hoang tƣởng và kích động. Việc bổ sung một số thuốc chống loạn thần liều thấp có thể
là đủ kiểm soát các triệu chứng tâm thần và cho phép bệnh nhân có thể điều trị tại nhà.
Một số thuốc hay đƣợc sử dụng là haloperidol, risperridol,…[4]
- Thuốc duy trì tâm trạng ổn định nhƣ valproic acid,…
- Ngồi ra cịn có một số thuốc điều trị hỗ trợ nhƣ vitamin E làm chậm tiến triển
của bệnh, cerebrolysin có tác dụng dƣỡng thần kinh, Ginkgo biloba bảo vệ tế bào thần
kinh,…[4]
1.2. Các mơ hình và phƣơng pháp nghiên cứu tác dụng điều trị sa sút trí nhớ trên

thực nghiệm
1.2.1. Phương pháp đánh giá tác dụng kháng enzym acetylcholinesterase in vitro
Có 2 phƣơng pháp thƣờng sử dụng để đánh giá tác dụng kháng enzym AChE in
vitro là phƣơng pháp sử dụng thuốc thử Ellman và phƣơng pháp sử dụng thuốc thử
muối Fast Blue B.
1.2.1.1. Phƣơng pháp sử dụng thuốc thử Ellman.
Trong số những phƣơng pháp đƣợc sử dụng để đánh giá tác dụng kháng enzym
AChE in vitro thì phƣơng pháp sử dụng thuốc thử Ellman đƣợc xây dựng và ứng dụng
sớm nhất, hiện nay vẫn đƣợc sử dụng phổ biến ở nhiều nghiên cứu cùng hƣớng. Trong
đó phƣơng pháp đo quang đƣợc sử dụng nhiều hơn là phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng
sinh học.
Nguyên tắc của phản ứng: Cơ chất acetylthiocholin iodid (ATCI) bị thủy phân
nhờ xúc tác của enzym acetylcholinesterase tạo ra thiocholin. Sản phẩm thiocholin
phản ứng với thuốc thử acid 5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) tạo thành hợp chất
acid 5-thio-2-nitrobenzoic có màu vàng. Lƣợng hợp chất màu đƣợc tạo thành trong
9


một đơn vị thời gian tỷ lệ thuận với hoạt tính AChE. Dựa vào xác định độ hấp thụ
(cƣờng độ màu) của mẫu thử ở bƣớc sóng 412nm để đánh giá hoạt tính của AChE [24]
1.2.1.2. Phƣơng pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B
So với phƣơng pháp sử dụng thuốc thử Ellman, số lƣợng nghiên cứu sử dụng
phƣơng pháp này để đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro khá hạn chế. Phƣơng
pháp này sử dụng cơ chất là α-naphthyl acetat và thuốc thử là muối Fast Blue B (muối
O-dianisidin bis(diazotized) zinc double).
Nguyên tắc của phƣơng pháp: cơ chất α-naphthyl acetat bị thủy phân bởi enzym
esterase giải phóng chất α-naphthol. Chất này sau đó phản ứng với thuốc thử muối
Fast Blue B tạo thành sản phẩm màu diazo. Hợp chất này đƣợc xác định bằng cách đo
độ hấp thụ của dung dịch ở bƣớc sóng 600 nm [18]
1.2.2. Các mơ hình nghiên cứu

1.2.2.1. Mơ hình gây suy giảm trí nhớ bằng hóa chất.
Các mơ hình này tác động tới các con đƣờng truyền tin trên TKTW thông qua
các chất dẫn truyền thần kinh. Trong đó mơ hình scopolamin gây suy giảm trí nhớ
đƣợc sử dụng rộng rãi nhất. Nhiều tài liệu đã ghi nhận hệ cholinergic đóng vai trị quan
trọng trong việc duy trì trí nhớ. Sự suy giảm chức năng hệ cholinergic có thể ảnh
hƣởng tới suy giảm trí nhớ nhƣ mất trí nhớ và mất phƣơng hƣớng đƣợc nhìn thấy ở
Alzheimer. Sự thối hóa các neuron cholinergic thƣờng xảy ra ở các khu vực trên não
có liên quan tới học tập và trí nhớ nhƣ: vùng hồi hải mã, các hạch nền Meynert và vỏ
não trƣớc, vì vậy ƣớc tính số lƣợng và hoạt tính của các neuron cholinergic bằng kỹ
thuật nhuộm màu cresyl tím trên các mơ hình động vật gây suy giảm trí nhớ là vô cùng
quan trọng đối với các nghiên cứu đang đƣợc tiến hành trong lĩnh vực này [19], [38].
Nguyên tắc:
Scopolamin, một thuốc kháng cholinergic, thƣờng đƣợc sử dụng gây suy giảm
nhận thức trên thực nghiệm. Scopolamin làm bất hoạt vị trí gắn của acetylcholin trên
receptor muscarinic ở vùng vỏ não trƣớc làm suy giảm khả năng học tập và trí nhớ với
ảnh hƣởng phụ thuộc vào liều trên chuột [38].
Tiến hành: Scopolamin thƣờng đƣợc tiêm phúc mạc động vật thí nghiệm 30 phút
trƣớc khi thực hiện các test [27], [39].
Ƣu điểm: Mơ hình sử dụng scopolamin gây suy giảm trí nhớ đƣợc sử dụng rộng
rãi nhất bởi khơng u cầu các kỹ thuật phẫu thuật phức tạp [38]. Đồng thời, các chất
10


ức chế AChE là cho thấy có tác dụng tốt nhất trong việc cải thiện sự suy giảm trí nhớ
gây ra bởi scopolamin ở động vật gặm nhấm [44]. Do đó, trong nghiên cứu này chúng
tối sử dụng mơ hình gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin.
Ngồi ra một số mơ hình hóa học khác cũng đƣợc áp dụng gây suy giảm trí nhớ
nhƣ mơ hình tiêm streptozotocin vào gian não thất gây suy giảm trí nhớ, rƣợu gây suy
giảm trí nhớ, Amyloid β-peptid (Aβ) gây suy giảm trí nhớ, L-methionin gây suy giảm
trí nhớ, colchicin gây suy giảm trí nhớ, Okadaic acid gây suy giảm trí nhớ, excitoxins,

neurotoxins và cholinotoxins gây suy giảm trí nhớ, benzodiazepin gây suy giảm trí
nhớ, các kim loại nặng gây suy giảm trí nhớ,…[38].
1.2.2.2. Suy giảm trí nhớ do tuổi tác
Những động vật đã già thƣờng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu phát triển thuốc
bởi tuổi tác có liên quan tới sự suy giảm nhận thức và thay đổi hành vi bắt chƣớc sự
thay đổi các chất dẫn truyền thần kinh, sự thay đổi về hình thái học mà cịn về sự suy
giảm hệ cholinergic tƣơng đồng với cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer. Các báo
cáo cũng chỉ ra rằng sự suy giảm hệ dopaminergic và glutamateric có đóng góp trong
sự gây ra suy giảm trí nhớ do tuổi [38].
1.2.2.3. Mơ hình lão hóa cấp tốc ( SAMs )
Các chuột theo mơ hình SAMP8 (senescence-accelerated prone 8) mang rất
nhiều đặc điểm của bệnh Alzheimer. Các mơ hình này đã đƣợc thiết lập thơng qua sự
lựa chọn kiểu hình từ một nguồn gen chung của chủng chuột AKR / J. Các báo cáo chỉ
ra rằng trong số các chủng này, chủng SAMP8 là mô hình động vật gặm nhấm đƣợc
tin tƣởng nhất và có nhiều tƣơng quan với bệnh suy giảm trí nhớ bởi các đặc trƣng mà
bị thiếu hụt trong học tập và trí nhớ khơng tƣơng đồng với sự thay đổi trong các chủng
khác. Các báo cáo cũng chỉ ra rằng chủng SAMP8 có sự thay đổi trong kiểu gen và
protein liên quan trực tiếp tới sự sản sinh các gốc oxy hóa tự do ( reactive oxygen
species), tới các cơ chế bảo vệ thần kinh, các con đƣờng truyền tin tế bào, đáp ứng
miễn dịch và tới sự thoái giáng protein (protein folding/degradation) [38].
1.2.2.4. Một số mơ hình khác
- Các mơ hình động vật biến đổi gen: các mơ hình liên quan tới Amyloid beta
peptid, mơ hình PDAPP, mơ hình Tg2576, mơ hình APP23, mơ hình liên quan tới sự
thay đổi về đám rối thần kinh và protein tau, mơ hình JNLP3, mơ hình R406W, mơ
hình liên quan tới thay đổi ApoE.
11


- Mơ hình gây thiếu oxy máu làm giảm trí nhớ: gây thiếu oxy máu bằng việc sử
dụng hóa chất, gây thiếu oxy máu bằng phẫu thuật, gây thiếu oxy máu do gián đoạn

dẫn truyền hệ glutamatergic.
- Một số mô hình khác: mơ hình tổn thƣơng não gây suy giảm trí nhớ, mơ hình
shock điện (electroshock), mơ hình gây suy giảm trí nhớ bằng chế độ ăn giàu chất béo,
mơ hình gây thiếu hụt Thiamin gây suy giảm trí nhớ [38].
1.2.3. Một số phương pháp đánh giá khả năng về trí nhớ của động vật thí nghiệm
1.2.3.1. Test né tránh thụ động
- Mục đích: Test né tránh thụ động đƣợc sử dụng để đánh giá trí nhớ dài hạn của
động vật thí nghiệm [30].
- Nguyên tắc: Test này dựa trên sự mâu thuẫn giữa bản năng sợ hãi vùng không
gian mở, có ánh sáng của các lồi gặm nhấm với phản xạ trốn tránh có điều kiện vùng
khơng gian nguy hiểm đã đƣợc nhận diện trƣớc đó. Chuột là lồi động vật gặm nhấm,
ƣa hoạt động trong tối, tránh ánh sáng. Dựa trên đặc điểm sinh học này, ngƣời ta thiết
kế buồng tối (khu vực ƣa thích của chuột) trở thành vị trí nguy hiểm (bị điện giật),
trong khi buồng sáng lại là vị trí an tồn (khơng bị điện giật) [30].
- Tiến hành: Trong test này, chuột đƣợc đƣa vào buồng sáng là khu vực khơng ƣa
thích nên chúng sẽ tự đi vào buồng tối, tại đây chúng sẽ bị điện giật. Sau một số lần
tập luyện, chuột sẽ hạn chế vào buồng tối [8].
- Chỉ số đánh giá: Các chỉ số đánh giá ở test này là thời gian từ khi cho chuột vào
buồng sáng đến khi chuột sang buồng tối.
- Ƣu nhƣợc điểm: test này bị ảnh hƣởng khi chuột ít vận động [8].
1.2.3.2. Test mê lộ chữ Y
- Mục đích: Đánh giá trí nhớ khơng gian ngắn hạn của động vật thí nghiệm [9].
- Nguyên tắc: Test mê lộ chữ Y xuất phát từ việc động vật thí nghiệm có xu
hƣớng thay đổi sự lựa chọn cánh trong mê lộ trong các cơ hội liên tiếp [9]. Động vật
thƣờng đƣợc đánh giá trong khoảng 8-10 phút trong mê lộ chữ Y đối xứng [9].
- Tiến hành: Mê lộ chữ Y là một dụng cụ hình chữ Y, cấu tạo gồm 3 cánh (ABC),
trong đó 3 cánh đối xứng nhau và tách ra ở 120°. Quy trình bài tập cơ bản cho phép
chuột đƣợc tự do tiếp cận với 3 cánh tay của mê lộ trong vài phút trong thời gian đó
trình tự đi vào các cánh của mê lộ đã đƣợc ghi lại [9]. Chuột đƣợc tự do tiếp cận tới 3

12


cánh của mê lộ trong vài phút, trong thời gian dó trình tự đi vào các cánh của mê lộ đã
đƣợc ghi lại [9].
- Chỉ số đánh giá: Sự chuyển tiếp (alternation) đƣợc định nghĩa là động vật di
chuyển vào 3 cánh liên tiếp tức là động vật di chuyển theo trình tự ABC, CBA, ACB
mà khơng phải là ACA, CBC [9].
Ngoài ra chỉ số về số lần động vật đi vào các cánh tay cũng ảnh hƣởng đến kết
quả về số lần chuyển tiếp. Một số nghiên cứu đã sử dụng chỉ số tỷ lệ chuyển tiếp (%
Alternation) = [số lần chuyển tiếp/(tổng số lần vào các cánh tay– 2)] × 100% [9]
1.2.3.3. Test mê lộ nƣớc Moris
- Mục đích: Đánh giá khả năng học tập và trí nhớ không gian của chuột [15].
- Nguyên tắc: Dựa vào bản năng sinh tồn và khả năng nhớ vị trí khơng gian của
chuột, khi cho vào nƣớc chuột sẽ bơi để tìm bến đỗ và nhớ vị trí của bến đỗ ở các lần
tiếp theo [15].
- Tiến hành: Trong bài tập này, chuột đƣợc cho vào một hồ bơi có đặt một bến đỗ
ngập dƣới nƣớc, nƣớc trong hồ bơi đƣợc làm đục để động vật khơng nhìn thấy cũng
nhƣ khơng thể dựa vào mùi để tìm thấy bến đỗ mà phải dựa vào các dấu mốc bên
ngoài (một số tranh ảnh hoặc vật mốc cố định trong buồng thực nghiệm) để định
hƣớng [15].
- Chỉ số đánh giá là thời gian tìm thấy bến đỗ, quãng đƣờng tìm thấy bến đỗ, vận
tốc bơi trung bình, thời gian lƣu lại góc có bến đỗ [15].
1.2.3.4. Test nhận diện đồ vật
- Mục đích: Trong test nhận diện đồ vật, các lô chuột sau khi đƣợc điều trị với
thuốc sẽ đƣợc đánh giá khả năng cải thiện trí nhớ tạm thời (short term memory) (trí
nhớ ngắn hạn khơng liên quan tới vị trí khơng gian tƣơng ứng với trí nhớ phân đoạn
của con ngƣời) bằng mơ hình thử nghiệm nhận dạng vật thể (ORT – Object
recognition task) vào ngày thứ 14 sau khi tiến hành thắt động mạch cảnh [3].
- Tiến hành: Một ngày trƣớc khi làm test, chuột đƣợc đặt vào hộp cho phép tự do

khám phá không gian mới. Ngày tiếp theo, test ORT đƣợc tiến hành. Test ORT gồm 2
giai đoạn, bao gồm giai đoạn mẫu (sample phase) và giai đoạn kiểm tra (test phase).
Trong giai đoạn mẫu, mỗi chuột đƣợc đặt vào hộp ngày hơm trƣớc có thêm hai đồ vật
là O1 và O2. Chuột đƣợc phép khám phá tự do hai đồ vật này trong vòng 5 phút. Giai
đoạn kiểm tra đƣợc tiến hành sau giai đoạn luyện tập 30 phút. Ở giai đoạn này, một
13


trong hai đồ vật O1 hoặc O2 đƣợc thay thế bởi đồ vật O3. Chuột cũng đƣợc phép
khám phá những đồ vật này trong 5 phút, giống ở giai đoạn mẫu.
- Chỉ số đánh giá: Thời gian chuột khám phá vật thể đƣợc định nghĩa là khoảng
thời gian tinh từ lúc chuột bắt đầu hƣớng mũi về phía vật thể cách vật thể 2 cm, khám
phá vật thể cho tới lúc chuột dời đi [3].
1.2.3.5. Một số phƣơng pháp đánh giá khả năng về trí nhớ của động vật thí nghiệm
khác
.- Bài tập tìm thức ăn trong mê lộ: Trong bài tập này, chuột bị bỏ đói đƣợc cho
vào một mê lộ có cấu tạo bởi nhiều đƣờng chữ chi, có nhiều ngõ cụt và chỉ có một
đƣờng duy nhất dẫn đến ơ đích chứa thức ăn. Chuột sẽ đƣợc hƣớng dẫn đi đến ơ đích
để lấy thức ăn. Sau một số lần luyện tập, chuột có thể tự chạy tới ơ đích và thời gian
tìm thấy thức ăn sẽ nhanh hơn. Trong một số trƣờng hợp, ngƣời ta sẽ mở toàn bộ hoặc
một số cửa dẫn tới các ngõ cụt để đánh giá mức độ mắc lỗi (đi sai đƣờng) của động vật
thí nghiệm. Các chỉ số đánh giá trong bài tập này là thời gian tìm thấy thức ăn, số lần
hƣớng dẫn để tìm đƣợc thức ăn, tỷ lệ mắc lỗi. [8]
- Một số test khác nhƣ vận động tự nhiên, mê lộ hình chữ thập,vận động trong
rotarod,...[9]
Ngồi các phƣơng pháp đánh giá hành vi, ngày nay trên thế giới các nghiên cứu
còn sử dụng một số phƣơng pháp đánh giá thông qua đo lƣờng các chất dẫn truyền
thần kinh nhƣ phƣơng pháp đánh giá khả năng ức chế enzym acetylcholinesterase ex
vivo [3], đánh giá sự peroxy hóa lipid ( lipid peroxidation), đánh giá lƣợng protein
carbonyl, đánh giá sự giảm glutathion, đánh giá hoạt tính enzym glutathion

peroxidase, đánh giá hoạt tính enzym superoxid dismutase, đánh giá hoạt tính enzym
catalase…[16]
1.3. Đan sâm
1.3.1. Tên khoa học
Đan sâm có tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge, thuộc họ Hoa môi
(Lamiaceae). Đan sâm cịn đƣợc gọi là huyết sâm, xích sâm, huyết căn [6], [14].
1.3.2. Đặc điểm hình thái
Cây thảo lâu năm, cao chừng 40-80 cm; rễ nhỏ dài hình trụ, đƣờng kính 0,5-1,5
cm màu đỏ nâu (nên cịn gọi là Xích sâm, Huyết sâm, Hồng căn). Lá kép mọc đối,
thƣờng gồm 3-7 lá chét; là chét giữa thƣờng lớn hơn, mép lá chét có răng cƣa tù; mặt
14


trên lá chét màu xanh tro, có lơng. Hoa mọc thành chum ở đầu cành dài 10-15 cm, với
6 vòng hoa; mỗi vịng 3-10 hoa, thơng thƣờng là 5 hoa, màu đỏ tím nhạt. Tràng hoa 2
mơi, mơi trên cong hình lƣỡi liềm, mơi dƣới xẻ ba thùy; 2 nhị ở mơi dƣới; bầu có vịi
dài. Quả nỏ, dài 3 mm, rộng 1,5 mm [2].
Cây đƣợc nhập trồng, thích nghi với môi trƣờng sáng và ẩm, sinh trƣởng tốt ở
nƣớc ta. Ra hoa tháng 4-8, kết quả tháng 7-10 [2].
1.3.3. Phân bố và bộ phận dùng
Salvia L. là một chi lớn trong họ Lamiaceae, phân bố chủ yếu ở vùng ơn đới ẩm
và cận nhiệt đới. Chỉ có ít lồi ở vùng nhiệt đới. Ở Việt Nam có 4-5 lồi, trong đó Đan
sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) là cây nhập nội, có nguồn gốc từ Trung Quốc [14].
Cây đƣợc trồng ở: Sapa, Bắc Hà (Lào Cai), Tam Đảo, Hà Nội, Phú Thọ, Thanh
Hóa [7]. Cịn có ở Trung Quốc, Nhật Bản [2].
Dƣợc liệu Đan sâm là bộ phận rễ của cây, đƣợc thu hoạch vào mùa đông. Rễ
đƣợc đào, rửa sạch, cắt bỏ cây và rễ con, đem phơi hoặc sấy khơ.
1.3.4. Thành phần hóa học
Theo đặc điểm cấu trúc, các thành phần chính của S. miltiorrhiza có thể đƣợc
phân thành hai nhóm chính. Nhóm đầu tiên chứa các diterpenoid hay các tanshinon tan

trong dầu nhƣ tanshinon I, tanshinon IIA, cryptotanshinon và dihydrotanshinon. Nhóm
thứ hai chứa các hợp chất polyphenolic tan trong nƣớc nhƣ salvianolic acid B (Sal B),
salvianolic acid A (Sal A) và danshensu [14], [45]. Một số thành phần khác nhƣ βsitosterol, tannin, vitamin E, tinh dầu [14], [41].
Các nghiên cứu hóa học và dƣợc lý đã chỉ ra rằng các diterpenoid và hợp chất
polyphenolic tan trong nƣớc là các thành phần hoạt tính sinh học chính trong Đan sâm.
Trong đó, diterpenoid đƣợc phân loại thành hai nhóm, nhóm có cấu trúc furan-10,11dion [1,2-b] furan-10,11-dion và nhóm có cấu trúc phenanro [3,2-b] furan-7, 11-dion.
Các hợp chất polyphenolic đƣợc coi là dẫn xuất ngƣng tụ của acid caffeic với các dạng
liên kết khác nhau [41].Hai loại hợp chất trên chủ yếu đƣợc phân lập từ rễ, trong khi
các loại tinh dầu chủ yếu đƣợc chiết xuất từ hoa [41]. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng rễ
càng dày thì hàm lƣợng tanshinon càng thấp [43].
Một nghiên cứu của TS. Nguyễn Hữu Tùng và cộng sự về thành phần triterpen
khung ursan đƣợc phân lập từ rễ cây Đan sâm trồng ở Việt Nam. Kết quả cho thấy
nhóm nghiên cứu đã phân lập xác định cấu trúc phân tử của 2 hợp chất triterpen 5
15


vịng khung ursan đó là acid ursolic và acid 2β-hydroxypomolic [13]. Ngồi ra cịn
một số nghiên cứu về phân lập và định lƣợng thành phần tanshinon IIA và
cryptotanshinon của cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge ) đƣợc thu hái tại trạm
dƣợc liệu Sa Pa (Lào Cai), kết quả thu đƣợc hàm lƣợng tanshinon theo khối lƣợng
trong dƣợc liệu thô là 0,297%, và trong cao chiết ethanol là 1,141%; hàm lƣợng
cryptotanshinon theo khối lƣợng trong dƣợc liệu thô là 0,022% và trong cao chiết
ethanol là 0,091% [1], [10].
Năm 2015, 49 quiteron diterpenoid, 36 acid phenolic ƣa nƣớc, và 23 thành phần
tinh dầu đã đƣợc phân lập và xác định từ Đan sâm [41].
1.3.5. Tác dụng dược lý
Trong thập kỷ 70 của thế kỉ XX, các nghiên cứu tại Trung Quốc đã cho thấy các
tanshinon trong Đan sâm là thành phần có tác dụng trong hoạt động kháng khuẩn và
điều trị bệnh mạch vành. Trong số này, cryptotanshinon là hợp chất kháng khuẩn
chính, trong khi tanshinon IIA là hợp chất chính trong điều trị bệnh động mạch vành

[43]. Bên cạnh đó, một số lƣợng lớn các nghiên cứu về tác dụng sinh học và cơ chế
của các thành phần tan trong nƣớc của Đan sâm đã đƣợc tiến hành,tất cả chúng đều
cho thấy hoạt tính chống oxy hóa, chống lipid mạnh và các hoạt động chống huyết
khối. Trong số này, acid phenolic và acid salvianolic A và B là những chất có tác dụng
mạnh nhất [43].
Tại Trung Quốc, Nhật Bản, Mỹ và Châu Âu, Đan sâm đã đƣợc sử dụng rộng rãi
trong điều trị các bệnh mạch máu, bao gồm xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, tăng
lipid máu và đột quỵ. Ngồi ra Đan sâm cịn đƣợc sử dụng trong một số bệnh khác nhƣ
bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson, suy thận, hepatocirrhosis, bệnh mạch máu não, ung
thƣ và loãng xƣơng [41].
Tại nƣớc ta, Đan sâm đƣợc biết đến với tác dụng chữa bệnh mạch máu não, phụ
nữ kinh nguyệt không đều, đau bụng, tử cung xuất huyết, đau khớp xƣơng, hòn bang
do khí huyết tích tụ, phong tê, ung nhọt sƣng đau, đơn độc, ghẻ lở. Cũng dùng làm
thuốc bổ máu cho phụ nữ và trẻ xanh xao vàng vọt, ăn uống thất thƣờng [2].
1.3.6. Các nghiên cứu liên quan đến tác dụng điều trị Alzheimer
1.3.6.1. Trên thế giới
Chi Salvia, thuộc họ Lamiaceae, có các tính chất sinh học đa dạng, chủ yếu do
các thành phần diterpen của chúng. Trong số Salvia diterpens, tanshinon IIA và
16


cryptotanshinon phát huy tác dụng có giá trị đối với Alzheimer thông qua các cơ chế
khác nhau, bao gồm ức chế AChE, ngăn ngừa mảng bám Aβ, tích tụ rối loạn thần kinh,
và các đặc tính chống oxy hóa và chống chết tế bào theo chu trình của hợp chất.
Về khả năng ức chế enzym acetylcholinesterase, tại Trung Quốc, Lin.H.Q và CS
đã tiến hành nghiên cứu in vitro và tìm ra IC50 của cao nƣớc và cao ethanol của Đan
sâm lần lƣợt là 50 µg/ml và 5 µg/ml. Tiến hành phân tích sâu hơn chiết xuất ethanol
của rễ Salvia miltiorrhiza và thấy rằng sự ức chế AChE là do sự hiện diện của hai
triterpenoids. Hai hợp chất này gần đây đang đƣợc nghiên cứu về hiệu quả in vivo
trong kiểm tra trí nhớ ở động vật gặm nhấm. Kết quả của nghiên cứu này chỉ ra rằng

thảo dƣợc này có tiềm năng lớn trong điều trị Alzheimer [36]. Bên cạnh đó, Yuhao
Ren và CS cũng tiến hành nghiên cứu in vitro cao rễ Đan sâm, với giá trị IC50 của cao
aceton là 24,7 µg/ml, dihydrotanshinon và cryptotanshinon là những chất trong cây ức
chế enzym AChE mạnh nhất với giá trị IC50 là 1,0 x 10-6 M và 7 x 10-6. Trong khi đó,
tanshinon I và tanshinon IIA có tác dụng ức chế enzym này yếu hơn [40].
Về khả năng kháng enzym acetylcholinesterase trong dịch nghiền đồng thể não
động vật thí nghiệm, Yongqiang Zhou và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tác dụng
này với cao nƣớc và cao ethanol của rễ Đan sâm. Kết quả cho thấy, cao ethanol của
Đan sâm có tác dụng ức chế đáng kể hoạt tính enzym AChE với kết quả ở nồng độ 2
mg/ml hoạt động của enzym giảm xuống cịn 73%. Trong khi đó, cao nƣớc của Đan
sâm ở nồng độ 1 mg/ml chỉ cho thấy 1 ít tác dụng ức chế hoạt động của
acetylcholinesterase ở cùng nồng độ đƣợc thử nghiệm [46]. Nghiên cứu của
Ozarowski và CS (2017) đã chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về nồng độ enzym
acetylcholinesterase ở vỏ não và vùng hồi hải mã giữa lô sử dụng cao tồn phần Đan
sâm (200 mg/kg) và lơ chứng bệnh. Sử dụng cao toàn phần Đan sâm (200 mg/kg) gây
ức chế đáng kể enzym AChE ở não chuột cống, tỷ lệ ức chế 47% (p <0,01)) ở vỏ não
trƣớc và 55% (p <0,01) ở vùng hồi hải mã [39].
Về tác dụng cải thiện trí nhớ của Đan sâm thông qua các test hành vi, Ozarowski
và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu đánh giá ảnh hƣởng của việc sử dụng cao toàn
phần của Salvia miltiorrhiza Bunge (200 mg/kg) trên hành vi và trí nhớ của chuột
thơng qua các test né tránh thụ động, test nhận diện đồ vật, test vận động tự nhiên, và
test phối hợp vận động. Kết quả nghiên cứu chỉ ra cao toàn phần của rễ Đan sâm liều
200mg/kg khơng có tác dụng cải thiện trí nhớ dài hạn trên chuột cống trong test né
17