BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
LƯƠNG THÙY NHUNG
ỨNG DỤNG NHỰA MACROPOROUS
D101 TRONG LÀM GIÀU BACOSID
TỪ RAU ĐẮNG BIỂN
(BACOPA MONNIERI L.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2018
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
LƯƠNG THÙY NHUNG
Mã sinh viên: 1301303
ỨNG DỤNG NHỰA MACROPOROUS
D101 TRONG LÀM GIÀU BACOSID
TỪ RAU ĐẮNG BIỂN
(BACOPA MONNIERI L.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS. TS. Nguyễn Văn Hân
2. TS. Nguyễn Tuấn Hiệp
Nơi thực hiện:
Viện Dược liệu
HÀ NỘI - 2018
LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Văn Hân, người thầy đã
hết lòng giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Đồng thời, em xin gửi lời
cảm ơn chân thành tới TS. Nguyễn Tuấn Hiệp, khoa Công nghệ Chiết xuất, Viện Dược
liệu đã tận tình hướng dẫn em.
Em xin cảm ơn các anh chị nghiên cứu viên thuộc khoa Công nghệ chiết xuất, Viện
Dược liệu: anh Đỗ Quang Thái, chị Đỗ Thị Thùy Linh, anh Đặng Tuấn Anh, anh Mai
Văn Kiên một năm qua đã quan tâm chỉ bảo em.
Em xin cảm ơn các thầy cô, cán bộ, nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội đã
giảng dạy, dìu dắt em suốt năm năm qua.
Em xin cảm ơn Viện Dược liệu đã tạo điều kiện cơ sở vật chất, trang thiết bị và hóa
chất thí nghiệm, giúp em hoàn thành khóa luận này.
Với lòng biết ơn vô hạn, con xin chân thành cảm ơn gia đình, nguồn động lực to lớn
trên mỗi bước đường học tập, lao động.
Tôi cũng xin cảm ơn bạn bè, đặc biệt là tập thể tổ 1 - lớp M2K68 vì đã san sẻ buồn
vui, động viên tôi trong suốt quãng đời sinh viên.
Do thời gian, năng lực và kinh nghiệm còn hạn chế, khóa luận chắc chắn mắc phải
nhiều thiếu sót. Em cũng như nhóm nghiên cứu rất mong nhận được sự chỉ bảo của các
thầy cô và ý kiến đóng góp của bạn bè.
Hà Nội, tháng 5 năm 2018
Sinh viên
Lương Thùy Nhung
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ..................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................................... 2
1.1. Rau đắng biển ........................................................................................................... 2
1.1.1. Tên gọi .............................................................................................................. 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật ............................................................................................ 2
1.1.3. Phân bố ............................................................................................................. 2
1.1.4. Bộ phận dùng .................................................................................................... 2
1.1.5. Công dụng, cách dùng ...................................................................................... 2
1.1.6. Thành phần hóa học .......................................................................................... 3
1.1.7. Tác dụng dược lý .............................................................................................. 6
1.1.8. Một số nghiên cứu chiết xuất và làm giàu (hoặc phân lập) bacosid ................. 8
1.2. Nhựa macroporous và ứng dụng làm giàu hoạt chất từ thực vật ............................. 9
1.2.1. Giới thiệu chung ............................................................................................... 9
1.2.2. Bản chất hóa học ............................................................................................. 10
1.2.3. Ứng dụng trong làm giàu các hoạt chất từ thực vật ........................................ 10
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 15
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................................. 15
2.1.1. Nguyên vật liệu ............................................................................................... 15
2.1.2. Hóa chất, thiết bị, dụng cụ .............................................................................. 15
2.2. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 16
2.2.1. Nghiên cứu quá trình hấp phụ bacosid từ dịch chiết lên hạt nhựa
macroporous D101 .................................................................................................... 16
2.2.2. Nghiên cứu quá trình giải hấp phụ bacosid từ hạt nhựa macroporous
D101 .......................................................................................................................... 16
2.2.3. Đề xuất và đánh giá tính ổn định của quy trình làm giàu bacosid ứng
dụng hạt nhựa macrporous D101 .............................................................................. 16
2.2.4. Nghiên cứu làm giàu bacosid bước 2 bằng than hoạt ..................................... 17
2.3. Phương pháp nghiên cứu........................................................................................ 17
2.3.1. Phương pháp định lượng................................................................................. 17
2.3.2. Phương pháp xử lý dịch chiết ......................................................................... 18
2.3.3. Phương pháp xử lý hạt nhựa ........................................................................... 18
2.3.4. Phương pháp nghiên cứu quá trình hấp phụ bacosid từ dịch chiết lên hạt
nhựa macroporous D101 ........................................................................................... 18
2.3.5. Phương pháp nghiên cứu quá trình giải hấp phụ bacosid từ hạt nhựa
macroporous D101 .................................................................................................... 19
2.3.6. Đề xuất và đánh giá tính ổn định của phương pháp làm giàu bacosid
trong dịch chiết RĐB ứng dụng nhựa macroporous D101 ....................................... 23
2.3.7. Phương pháp làm giàu bước 2 bằng than hoạt ............................................... 24
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ......................................... 25
3.1. Kết quả nghiên cứu quá trình hấp phụ bacosid từ dịch chiết lên hạt nhựa
macroporous D101 ........................................................................................................ 25
3.1.1. Kết quả khảo sát tốc độ hấp phụ ..................................................................... 25
3.1.2. Kết quả xác định điểm dừng hấp phụ ............................................................. 25
3.2. Kết quả nghiên cứu quá trình giải hấp phụ bacosid từ hạt nhựa macroporous
D101 .............................................................................................................................. 26
3.2.1. Kết quả khảo sát dung môi giải hấp phụ......................................................... 26
3.2.2. Kết quả khảo sát thể tích dung môi giải hấp phụ tạp ...................................... 27
3.2.3. Kết quả khảo sát thể tích dung môi giải hấp phụ bacosid .............................. 28
3.2.4. Kết quả khảo sát tỉ lệ chiều cao/ đường kính cột ............................................ 30
3.3. Kết quả xây dựng quy trình làm giàu bacosid trong dịch chiết RĐB ứng dụng
nhựa macroporous D101 được đề xuất ......................................................................... 30
3.3.1. Đề xuất quy trình làm giàu bacosid trong dịch chiết RĐB ứng dụng nhựa
macroporous D101 .................................................................................................... 30
3.3.2. Kết quả khảo sát tính ổn định của quy trình đề xuất ...................................... 32
3.4. Kết quả làm giàu bacosid bước 2 bằng than hoạt .................................................. 33
3.5. Bàn luận ................................................................................................................. 33
3.5.1. Bàn luận về kết quả nghiên cứu quá trình hấp phụ bacosid từ dịch chiết
lên hạt nhựa macroporous D101 ............................................................................... 33
3.5.2. Bàn luận về kết quả nghiên cứu quá trình giải hấp phụ bacosid từ hạt
nhựa macroporous D101 ........................................................................................... 34
3.5.3. Bàn luận về quy trình làm giàu bacosid bằng macroporous D101 đã đề
xuất ............................................................................................................................ 35
3.5.4. Bàn luận về kết quả làm giàu bước 2 bằng than hoạt ..................................... 36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .............................................................................................. 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 38
PHỤ LỤC .......................................................................................................................... 42
DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
RĐB
rau đắng biển
EtOH
ethanol
MeOH
methanol
EtOAc
ethyl acetat
BuOH
n-butanol
ACN
acetonitril
BV
bed volume
DVB
divinyl benzen
SPE
chiết pha rắn
SEM
kính hiển vi điện tử quét
DEN
N-nitroso diethylamin
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1
Một số saponin trong RĐB
3
Bảng 1.2
Một số loại nhựa macroporous và đặc tính
12
Bảng 1.3
Một số đặc tính lý hóa của hạt nhựa Macroporous D101
13
Bảng 2.1
Danh sách hóa chất sử dụng
15
Bảng 2.2
Thời gian lưu tương đối và hệ số quy đổi (so với chất chuẩn bacosid A3)
của 5 saponin trong mẫu định lượng
17
Bảng 3.1
Ảnh hưởng của tốc độ nạp dịch lên dung lượng hấp phụ
24
Bảng 3.2
Khảo sát dung môi giải hấp phụ tạp và bacosid
25
Bảng 3.3
Kết quả khảo sát thể tích EtOH 70% giải hấp phụ bacosid
27
Thể tích các dung môi rửa tạp
Bảng 3.4
(theo thứ tự: nước, EtOH 10%, EtOH 30%)
27
Bảng 3.5
So sánh lượng tạp và bacosid được giải hấp phụ ở từng dung môi
28
Bảng 3.6
Kết quả khảo sát tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột
29
Bảng 3.7
Bảng 3.8
Kết quả khảo sát tính ổn định của quy trình làm giàu bacosid bằng nhựa
macroporous D101
Kết quả khảo sát tỷ lệ than hoạt/ cao giàu (% kl/tt)
32
33
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Trang
Hình 1.1
Bacopa monnieri
2
Hình 1.2
Aglycon của bacosid
4
Hình 1.3
Bốn saponin trong bacosid A
5
Hình 1.4
Bacopasid I
5
Hình 1.5
Một phần mạng lưới polyme polystyrene liên kết chéo
10
Hình 1.6
Sơ đồ các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình làm giàu (phân tách) hoạt
chất bằng phương pháp SPE
14
Hình 2.1
Nguyên liệu RĐB
15
Hình 2.2
Hạt nhựa macroporous D101
15
Hình 3.1
Đường cong hấp phụ
26
Hình 3.2
Khảo sát dung môi giải hấp phụ tạp và bacosid
27
Khảo sát thể tích các dung môi rửa tạp
Hình 3.3
Hình 3.4
Hình 3.5
(theo thứ tự: nước, EtOH 10%, EtOH 30%)
Đường cong giải hấp phụ bacosid bằng EtOH 70%
Sơ đồ quy trình làm giàu bacosid trong dịch chiết RĐB sử dụng
nhựa macroporous D101
27
29
31
Hình 3.6
Cao RĐB sau phun sấy
32
Hình 3.7
Nguyên tắc rửa giải theo gradient nồng độ
35
ĐẶT VẤN ĐỀ
Rau đắng biển, Bacopa monnieri từ lâu đã được sử dụng trong Y học cổ truyền Ấn
Độ với công dụng cải thiện trí nhớ, sự tập trung và tỉnh táo. Nhiều nghiên cứu tiền lâm
sàng và lâm sàng cũng cho thấy tác dụng tăng cường trí nhớ [9], [10], chống tăng động
giảm chú ý [21], [22], chống oxy hóa [16], bảo vệ gan [24],… của dược liệu này. Thành
phần hóa học được cho là tạo nên tác dụng trên trí nhớ và nhận thức của rau đắng biển là
saponin, được gọi là bacosid [50]. Nhiều sản phẩm với hàm lượng bacosid cao (khoảng
50%) đang được lưu hành trên thị trường.
Tới nay, đã có nhiều nghiên cứu làm giàu bacosid từ dịch chiết rau đắng biển.
Các dung môi hữu cơ như n-butanol, aceton, ethyl acetat,… được sử dụng trong những
phương pháp này gây ra mối lo ngại về môi trường và sức khỏe con người. Trong khi đó,
với các ưu điểm về khả năng tinh chế, chi phí vận hành, giảm lượng dung môi hữu cơ sử
dụng, hạt nhựa macroporous đang ngày càng được ứng dụng rộng rãi để làm giàu các hợp
chất thiên nhiên.
Nhận thức được ý nghĩa của bacosid và các ưu điểm của hạt nhựa macroporous,
nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài “Ứng dụng nhựa macroporous D101 trong làm giàu
bacosid từ rau đắng biển, Bacopa monnieri L.” với những mục tiêu sau:
1. Khảo sát được một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hấp phụ và giải hấp phụ
bacosid lên hạt nhựa macroporous D101.
2. Xây dựng được quy trình ứng dụng hạt nhựa macroporous D101 trong làm
giàu bacosid từ dịch chiết rau đắng biển.
1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Rau đắng biển
1.1.1. Tên gọi
Tên khoa học: Bacopa monnieri L.
Tên đồng nghĩa: Bacopa monnieri Wettst., Moniera cuneifolia Michx., Herpestis
monniera H.B. & K., Herpestis spathulata Blume., Gratiola monniera Linn.,
Lysimachia monniera Linn [34].
Tên gọi khác: rau đắng, rau sam trắng, rau sam đắng, ba kích thiên [2].
Họ: Hoa mõm sói, Scrophulariaceae [2]
1.1.2. Đặc điểm thực vật [1], [4]
Cây thảo, sống lâu năm, cao 10-20 cm. Thân
nhẵn, phần gốc mọc bò, bén rễ ở những mấu, phần
trên mọc đứng. Lá mọc đối, không cuống, hình trái
xoan, mọng nước, dài 0,8-1,2 cm; rộng 3-5 mm, gốc
thuôn, đầu tù, hai mặt nhẵn, chỉ gân giữa rõ.
Hoa màu trắng, mọc đơn độc ở kẽ lá trên một
cuống dài; lá bắc dạng lá, lá bắc con hình sợi, dài 5
răng không bằng nhau, 3 cái hình trái xoan, 2 cái
Hình 1.1. Bacopa monnieri [4]
hình chỉ; tràng dài gấp 2 lần, 5 cánh gần bằng nhau; nhị 4, chỉ nhị nhẵn.
Quả nang, hình trứng nhẵn, có đài tồn tại; hạt nhỏ, có cạnh.
Mùa hoa quả: tháng 4-9.
1.1.3. Phân bố
RĐB được coi là cây liên nhiệt đới, đồng thời cũng có thể thấy ở vùng cận nhiệt
đới. Ở châu Á, RĐB phân bố rộng rãi từ vùng Nam Trung Quốc, Việt Nam, Lào đến
các nước khác ở Đông Nam châu Á. Ở Việt Nam, RĐB phân bố ở khắp các vùng đồng
bằng và trung du miền Bắc, miền Nam. Cây ưa sáng, thường mọc trên đất ẩm, pha cát
lẫn với các loại cỏ thấp ở bờ ruộng, bãi sông, bờ kênh mương [1], [4].
1.1.4. Bộ phận dùng
Toàn cây; thu hái quanh năm, rửa sạch, dùng tươi hay phơi khô [1].
1.1.5. Công dụng, cách dùng
Theo các tài liệu y học cổ truyền Việt Nam, RĐB được dùng chữa xích bạch lỵ,
mắt đỏ sưng đau, da sưng đỏ, nhức mỏi tê bại, viêm gan vàng da, ho. Một số địa
2
phương dùng RĐB ăn sống hay nấu ăn. Một số người dùng cây này sắc uống chữa ho,
làm thuốc lợi tiểu và bổ thận. Ngày dùng 6 đến 12 g cây khô dưới dạng thuốc sắc. Có
thể dùng ngoài, nấu nước tắm hoặc dùng cây tươi giã nhỏ lấy nước trộn với dầu hỏa
dùng xoa chỗ đau [1], [2].
Ở Ấn Độ, RĐB có trong các bài thuốc: chữa động kinh, thao cuồng, suy nhược
thần kinh, mất tiếng, khản tiếng; chữa khản tiếng do lao phổi; chữa rắn cắn [1].
Ở Xri Lanca, toàn cây dùng làm thuốc xổ và đun nước nóng rửa để chữa bệnh
nhọt độc sưng ngoài da như da voi [1].
1.1.6. Thành phần hóa học
1.1.6.1. Saponin
RĐB chứa hỗn hợp các saponin triterpenoid nhóm với agylcon: jujubogenin hoặc
pseudojujubogenin [34].
Bảng 1.1: Một số saponin trong RĐB [9], [27]
STT
Tên
Cấu tạo
Jujubogenin
1
Bacopasid N1
2
Bacopasid IV
3
Bacosid A3
4
Bacopasid X
3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl]
jujubogenin
3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-arabinopyranosyl]
jujubogenin
3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)-O-{α-L-arabinofuranosyl(1→2)}-O-(β-D-glucopyranosyl)] jujubogenin
3-O-[α-L-arabinofuranosyl-(1→2)-{β-D-glucopyranosyl(1→3)}-(α-L-arabinopyranosyl)] jujubogenin
3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)-{α-L-arabinofuranosyl-
5
Bacopasid E
(1→2)}-(α-L-arabinopyranosyl)]-20-O-(α-Larabinopyranosyl) jujubogenin
3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)-{α-L-arabinofuranosyl-
6
Bacopasaponin F
(1→2)}-(β-D-glucopyranosyl)]-20-O-(α-Larabinopyranosyl) jujubogenin
Pseudojujubogenin
7
Bacopasid N2
8
Bacopasid V
3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl]
pseudojujubogenin
3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-arabinopyranosyl]
3
pseudojujubogenin
9
Bacosid II
10
Bacopasaponin C
3-O-[α-L-arabinofuranosyl-(1→2)-O-{β-D-glucopyranosyl(1→3)}-O-(β-D-glucopyranosyl)] pseudojujubogenin
3-O-[α-L-arabinofuranosyl-(1→2)-{β-D-glucopyranosyl(1→3)}-(α-L-arabinopyranosyl)] psedojujubogenin
3-O-[α-D-arabinofuranosyl-(1→2)-{6-O-sulphonyl-β-D-
11
Bacopasid I
glucopyranosyl-(1→3)-α-L-aranopyranosyl]
pseudojujubogenin
12
Bacopasid III
3-O-[{6-O-sulfonyl-β-D-glucopyranosyl-(1→3)}-α-Larabinopyranosyl] pseudojujubogenin
Trong đó, bacosid A và B đã được biết đến từ những năm 1960. Cho đến nay,
nhiều nghiên cứu đã chỉ ra, bacosid A là một hỗn hợp 4 triglycosid saponin: bacopasid
A3, bacopasid II, bacopasid X, bacopasaponin C (công thức cấu tạo biểu diễn ở hình
1.3). Bacosid B được xác định gồm 4 diglycosid saponin: bacopasid N1, bacopasid
N2, bacopasid IV và bacopasid V [9], [23].
Tài liệu [9] cũng cho thấy có khả năng chuyển đổi bacosid A3, bacosid II (thành
phần của bacosid A) lần lượt thành bacosid N1, bacosid N2 (thành phần của bacosid
B) bằng phản ứng thủy phân cắt một gốc đường. Xét về độ ổn định hóa học, bacopasid
I và bacosid A3 phân hủy nhanh hơn trong cao lỏng so với cao rắn và bán rắn. Đồng
thời, quá trình chiết RĐB được đề xuất thực hiện ở nhiệt độ dưới 60oC để tránh sự
phân hủy này [30].
Pseudojujubogenin
Jujubogenin
Hình 1.2. Aglycon của bacosid
4
Theo một nghiên cứu, hàm lượng tổng của 12 saponin (xác định được bằng
HPLC) trong mẫu dược liệu RĐB khô là 5,1-6,0%; trong đó có 5 saponin (gồm 4
saponin trong bacosid A và bacopasid I) chiếm hơn 93% (kl/kl) [27]. Công thức cấu
tạo của bacopasid I được biểu diễn ở hình 1.4.
1.1.6.2.1. Các thành phần khác: [34], [42]
- Alcaloid: brahmin, herpestin
- Flavonoid: luteolin, apigenin và các glycosid của chúng…
- Sterol: stigmasterol, β-sitosterol, stigmastanol, bacosterol glycosid, bacosterol…
- Ngoài ra còn có: d-manitol, hersaponin, betulic acid, …
STT
1
2
3
4
𝐑𝟏
H
CH=C(CH3)2
H
CH=C(CH3)2
𝐑𝟐
CH=C(CH3)2
H
CH=C(CH3)2
H
𝐑𝟑
CH2OH
CH2OH
H
H
𝐑𝟒
H
H
OH
OH
𝐑𝟓
OH
OH
H
H
Aglycon
Jujubogenin
Pseudojujubogenin
Jujubogenin
Pseudojujubogenin
Hình 1.3. Bốn saponin trong bacosid A
Hình 1.4. Bacopasid I
5
Saponin
Bacosid A3
Bacopasid II
Bacopasid X
Bacopasaponin C
1.1.7. Tác dụng dược lý
1.1.7.1. Tác dụng trên tâm thần kinh
1.1.7.1.1. Chống sa sút trí tuệ
Cao RĐB (chế phẩm BacoMind, KeenMind, MediHerb) cho thấy khả năng cải
thiện trí nhớ (đánh giá bằng free call test) trên những người không có vấn đề tâm thần
hay nhận thức với độ tuổi trung bình trong 6 thử nghiệm được lựa chọn vào phân tích
là 39 – 74 [25]. Thử nghiệm lâm sàng mù đôi tại Úc trên 98 người tình nguyện khỏe
mạnh (không dưới 55 tuổi), sử dụng BacoMind (chứa 40-50% bacosid, liều
300mg/ngày, 12 tuần) cho thấy sự cải thiện đáng kể trên trí nhớ ngôn ngữ (đánh giá
bằng bài trắc nghiệm học lời nói qua thính giác Rey) ở nhóm thử so với nhóm đối
chứng (p<0,05) [7].
Nghiên cứu in vitro chứng minh khả năng bảo vệ tế bào thần kinh của cao RĐB
(chứa 5% bacosid) khỏi sự chết tế bào liên quan đến Aβ – 30,35 [22].
Các báo cáo lâm sàng chỉ ra rằng những bệnh nhân với sự tăng cao các cytokin
gây viêm ở hệ thần kinh trung ương sẽ tăng khả năng phát triển bệnh thoái hóa thần
kinh liên quan đến tuổi tác như Alzheimer. Thử nghiệm trên chuột, sử dụng cao RĐB
(chaứ 29% bacosid), liều 200mg/kg làm giảm đáng kể (p<0.05) các cytokin gây viêm
IL-1b, TNF-a trong vỏ não chuột già [24].
1.1.7.1.2. Chống oxy hóa
Trên tế bào: Cao RĐB (5% bacosid) làm giảm số lượng gốc tự do nội tế bào ở tế
bào thần kinh nuôi cấy [22]. Bacosid A3 làm giảm khả năng oxy hóa của tế bào bạch
cầu hạt lớn hơn nhiều so với bacopasaponin C (IC50 là 10,22 mcg/ml so với 54,16
mcg/ml) và gấp 1,4 lần acid ascorbic [32].
Trên mô hình chuột bơi cưỡng bức: cao RĐB chống lại sự cạn kiệt các enzyme
chống oxy hóa như: SOD, catalase [37].
1.1.7.1.3. Chống động kinh
Cao RĐB (55% bacosid), bacosid A đều làm tăng số lượng receptor GABA ở hệ
vân; tăng cường lực liên kết giữa GABA và các thụ thể ở chuột động kinh, giảm hoạt
động của glutamate dehydrogenase [18]. Một số thuốc chống động kinh trên thị trường
hiện nay (như pilocarpine) gây ra các tác dụng không mong muốn: giảm khả năng học
tập (ở mô hình chuột trong mê cung nước), giảm khả năng vận động (ở mô hình chuột
bơi cưỡng bức), trong khi bacosid A hay cao RĐB không gây ra các tác dụng này [17].
6
1.1.7.1.4. Chống trầm cảm
Thí nghiệm in vitro đã chứng minh khả năng ức chế enzyme MAO-A của
bacopasid I, đồng thời khẳng định là nó thành phần ức chế MAO-A chủ yếu trong dịch
chiết RĐB [33].
Trên mô hình chuột bơi cưỡng bức được gây nghiện opioid, cao RĐB cho thấy
khả năng chống trầm cảm cai nghiện (làm giảm thời gian bất động so với nhóm chứng
p<0,001) ở chế độ dùng dài ngày [20].
1.1.7.1.5. Chống tăng động giảm chú ý
Một phân tích meta cho thấy RĐB có khả năng cải thiện sự tập trung chú ý và
đặc biệt là tốc độ phản ứng [10]. CDRI 08, một loại cao RĐB chứa không dưới 55%
bacosid, dạng bào chế: viên nang 160mg đã cho thấy khả năng cải thiện các vấn đề về
hành vi của bệnh tăng động giảm chú ý ở trẻ em (nam, 6-14 tuổi) mắc tăng động giảm
chú ý ở mức độ cao [19].
1.1.7.1.6. Trên trẻ sơ sinh hạ đường huyết
Vỏ não chuột sơ sinh hạ đường huyết được điều trị bằng cao RĐB hoặc bacosid
A có sự cải thiện hoạt động của hệ dopaminergic hiệu quả hơn so với liệu pháp
glucose [36].
1.1.7.2. Tác dụng bảo vệ gan
Trên mô hình gây ung thư gan ở chuột bằng DEN, sử dụng bacosid A làm tỉ lệ
chuột có bướu trên gan, giảm số lượng khối u/chuột; giảm nồng độ các chất chỉ dấu
ung thư: AFP, CEA, 5’-nucleotid; dập tắt sự peroxy hóa lipid cũng như tăng nồng độ
các chất chống oxy hóa ở gan (p<0,05) [15].
1.1.7.3. Tác dụng trên vết thương
Một nghiên cứu cho thấy bacosid A và cao RĐB có tác dụng tăng sức bền kéo
của da trên 3 mô hình gây vết thương trên chuột: vết thương cắt, rạch, không gian chết;
làm giảm thời gian lành vết thương ở vết thương cắt; tăng khối lượng khô của mô hạt
ở vết thương không gian chết. Nghiên cứu này cũng chỉ ra bacosid A đóng vai trò quan
trọng trong quá trình lành vết thương do khả năng ức chế protease, enzyme giải phóng
từ Staphylococcus aureus [31].
7
1.1.7.4. Tác dụng kháng khuẩn
Bacosid A được xem là chất kháng khuẩn hiệu quả với MIC<400 mcg/mL trên
2 chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus MTCC 96 and Pseudomonas aeruginosa
MTCC 2488. Ngoài ra, sự diệt trừ biofilm của vi khuẩn cũng được ghi nhận (bằng
hình ảnh SEM) khi sử dụng bacosid A [28].
1.1.8. Một số nghiên cứu chiết xuất và làm giàu (hoặc phân lập) bacosid
Trên thế giới hiện nay đã có nhiều nghiên cứu làm giàu bacosid từ dịch chiết
alcolhol của RĐB, chủ yếu xử lý với dung môi hữu cơ.
H K Shing và cộng sự đã chiết bacosid A và B bằng EtOH, sau đó bay hơi
dung môi dưới áp suất giảm. Rửa cao thu được nhiều lần với benzen. Sau khi xử lý với
chì acetat và bay hơi dung môi dưới áp suất giảm, cao được chiết phân đoạn với BuOH
và nước. Phân đoạn BuOH chứa bacosid được bay hơi dung môi dưới áp suất giảm,
sau đó được kết tinh từ EtOH cho những tinh thể hình kim không màu. Sắc ký lớp
mỏng trên bản silicagel, tinh thể trên cho 2 vết bacosid, trong đó bacosid A chiếm ưu
thế [13]. Tuy nhiên, việc sử dụng benzen và muối chì gây nên mối lo ngại về sự tồn dư
hóa chất độc hại trong sản phẩm cuối cùng. Đồng thời, do tốn thời gian và nhiều bước,
quy trình này không thích hợp với quy mô công nghiệp.
Tài liệu [23] phân lập bacosid A bằng hạt silicagel. Sau khi chiết hồi lưu bột
dược liệu toàn cây RĐB (1 kg) với MeOH (3x4 L) trong 2 giờ. Bay hơi dịch chiết tổng
dưới áp suất giảm và sấy ở 70oC được 140 g cao. Lấy 50 g cao hấp phụ trên cột
(silicagel, 1 kg, 60-120 mesh) và giải hấp phụ bằng hỗn hợp chloroform : MeOH. Thu
lấy phân đoạn chloroform : MeOH (85:15) và bay hơi dung môi dưới áp suất giảm
được 7 g cao. Sắc ký cột chớp nhoáng phân đoạn này (silicagel, 100-200 mesh), phân
đoạn chloroform : MeOH 85:15 được bay hơi dưới áp suất giảm và kết tinh trong
MeOH 70% trong nước để thu lấy bacosid A (2,5 g).
Phát minh US20050209445 chiết cao toàn phần (20-30% bacosid A và B)
bằng dung môi alcohol hoặc hỗn hợp alcohol-nước. Cách thứ nhất, cao chiết được
chiết 3 lần với ether dầu hỏa để loại chất béo, rồi đun hồi lưu với ethyl acetat ít nhất 2
lần. Pha hữu cơ được rửa bằng nước, làm khan bằng Na2SO4 khan và thu được cao
60% bacosid A và B. Cách thứ hai, cao toàn phần được chiết bằng aceton, xử lý với nhexan, làm khan rồi bay hơi dung môi để thu được cao 59% bacosid A và B. [39]
8
Phát minh US20080132455A1 chiết RĐB bằng MeOH 70% trong 4 giờ, lọc
và thu hồi dung môi. Cao chiết được hoà tan trong BuOH rồi rửa với nước. Pha hữu cơ
được bay hơi dung môi rồi chiết bằng EtOAc để loại bỏ tạp chất, sau đó xử lý tiếp với
silica gel. Một cách khác, cao chiết toàn phần (cao chiết cồn chứa 15% saponin theo
HPLC) được hòa tan trong BuOH, lọc bỏ tạp chất không tan (được cao chứa 20-35%
saponin), rửa pha hữu cơ bằng nước, rồi bằng dung dịch NaOH 2%, rửa lại bằng nước.
Pha BuOH được bay hơi đến khô, hàm lượng saponin là 60-75%. Hòa tan trong
MeOH rồi xử lý với than hoạt tính, lọc rồi bay hơi dung môi thu được cao hàm lượng
saponin 85%. [40]
Quy trình công nghệ được công bố bởi CIMAP: [41]
- Sấy khô dược liệu tươi, nạp vào thiết bị chiết Soxhlet.
- Bơm n-hexan vào bình chứa dược liệu, chiết 4 lần (2 giờ/lần), dung môi được
cất loại và loại bỏ cắn trong bình chứa dung môi bên dưới. Dung môi n-hexan còn
trong dược liệu được loại hết bằng cách gia nhiệt cho lớp vỏ thiết bị ở 75oC. Thêm
aceton và chiết 4 lần Soxhlet (2 giờ/ lần) để loại tạp. Bay hơi aceton trong phần dược
liệu. Thêm MeOH và chiết 4 lần Soxhlet (2 giờ/lần). Dịch chiết sau đó được cất loại
MeOH còn một nửa. Dịch chiết cô đặc được chuyển sang máy cô màng mỏng ở điều
kiện áp suất thấp 275 mbar, nhiệt độ 60oC, thu được cao chiết đặc.
- Chuyển vào bình thép, khuấy với aceton, trong 1 giờ. Hỗn hợp được lọc hút
chân không để loại bỏ aceton.
- Cao RĐB dưới dạng bánh sau khi lọc được hòa tan trong nước rồi chuyển vào
thiết bị chiết lỏng - lỏng. Chiết với BuOH 5 lần, tỉ lệ nước: BuOH = 50:15 để chuyển
bacosid sang pha hữu cơ. Tách lấy lớp BuOH, rồi bay hơi bằng máy cô quay màng
mỏng, áp suất 5 - 10 torr, nhiệt độ 45 - 50 oC.
- Hòa tan cao trong nước, thêm cyclodextrin nhằm mục đích ổn định bacosid,
sau đó sấy phun được sản phẩm chứa 26% bacosid A (định lượng bằng HPTLC).
Có thể thấy đa số các quy trình này khá phức tạp, sử dụng nhiều thiết bị đắt tiền
nên không phù hợp với nhiều cơ sở trong nước.
1.2. Nhựa macroporous và ứng dụng làm giàu hoạt chất từ thực vật
1.2.1. Giới thiệu chung
Nhựa macroporous hay nhựa hấp phụ macroporous là hạt polyme hình cầu, có
cấu trúc xốp với các lỗ lớn trên bề mặt, có cấu trúc mạng và diện tích bề mặt tiếp xúc
9
lớn, được ứng dụng chủ yếu để tách các nhóm chất khác nhau [35]. Một số ứng dụng
nổi bật của nhựa macroporous: bất động enzyme, nuôi cấy mô, sắc ký cột, kiểm soát
giải phóng thuốc. Những ứng dụng trên đều yêu cầu sự kiểm soát ở mức độ cao về cấu
trúc không gian ba chiều và các đặc tính của lỗ xốp [26].
1.2.2. Bản chất hóa học
Hiện nay, nhựa macroporous (không ion hóa) thường được sản xuất bằng cách
polyme hóa styren divinyl benzen (DVB) hoặc dẫn chất của acid acrylic. Hình 1.5 biểu
diễn một phần mạng lưới polyme polystyren liên kết chéo. Quá trình tổng hợp có sự
hiện diện của “porogens” như: toluen, n-heptan, iso-octan, isobutanol. Porogen có thể
trộn lẫn với hỗn hợp monome nhưng không hòa tan polyme. Porogen, trong quá trình
polyme hóa, đi vào khoảng trống trong hỗn hợp monome và khi kết thúc quá trình
polyme hóa, bay hơi để lại những lỗ hổng trong hạt nhựa [26].
Hàm lượng DVB cao (tới 20% (kl/kl)) khiến hạt nhựa macroporous nhiều liên
kết chéo hơn, do vậy có khả năng chịu đựng được được các điều kiện khắc nghiệt hơn
như: áp suất thẩm thấu cao, các chất oxy hóa mạnh; nhưng đồng nghĩa với việc làm
giảm độ xốp hạt nhựa, giảm dung lượng hấp phụ [16]. Ngoài ra, trong quá trình tổng
hợp polyme, các yếu tố ảnh hưởng tới đặc tính lỗ xốp còn có: bản chất, nồng độ chất
pha loãng; bản chất của chất mồi và nhiệt độ của quá trình polyme hóa [26].
Hình 1.5. Một phần mạng lưới polyme polystyren liên kết chéo [40]
1.2.3. Ứng dụng trong làm giàu các hoạt chất từ thực vật
1.2.3.1. Phương pháp chiết pha rắn
Quá trình làm giàu hợp chất đích bằng nhựa macroporous thực chất là quá
trình chiết pha rắn (SPE). Nguyên tắc của SPE:
10
- Chất cần tách lúc đầu ở dạng lỏng (pha nước hay hữu cơ), còn chất chiết ở dạng
rắn (pha tĩnh): hạt nhỏ, xốp, được nhồi vào một cột chiết. Chất chiết có thể là silicagel
trung tính hoặc đã được alkyl hóa nhóm –OH, oxyd nhôm…
- Đầu tiên, dung dịch chất mẫu được dội lên cột chiết. Pha tĩnh lúc này sẽ tương
tác với các chất và giữ một nhóm chất phân tích lại trên cột, còn các nhóm chất khác sẽ
đi ra khỏi cột với dung môi hòa tan mẫu. Sau đó, dùng một dung môi thích hợp hòa tan
tốt các chất phân tích để rửa giải chúng ra khỏi pha tĩnh (cột chiết), thu được dung dịch
có chất phân tích [3].
Đối với ứng dụng phân tách hợp chất thiên nhiên, hạt nhựa macroporous
đóng vai trò pha tĩnh: sau khi được hấp phụ hoạt chất từ dịch chiết, cột nhựa sẽ được
rửa giải với dung môi như: nước, MeOH, EtOH hay aceton ở các nồng độ khác nhau
để giải hấp phụ hoạt chất [35].
1.2.3.2. Phạm vi ứng dụng
Từ những năm 1960, macroporous được sử dụng để tách các các chất hữu cơ
không phân cực hoặc kém phân cực từ dung dịch nước. Kể từ những năm 1990, số
lượng hợp chất thiên nhiên được tinh chế bằng nhựa macroporous ngày càng tăng lên,
bao gồm các nhóm hợp chất: flavonoid, polyphenol, saponin, carotenoid,... [16].
Đối với tinh chế saponin, đã có nhiều công bố ứng dụng nhựa macroporous, một
số quy trình đã thành công ở quy mô lớn. Có thể kể đến một vài ví dụ:
- Panax pseudoginseng: 2 nhóm saponin protopanaxatriol (PTS) và
protopanaxadiol (PDS) từ dịch chiết rễ cây không những được làm giàu mà còn được
tách thành các phân đoạn riêng nhờ sử dụng dung môi rửa giải là EtOH 30% và 80%
tương ứng với PTS và PDS. Độ tinh khiết của PTS và PDS lần lượt là 88,2% và
92,6%. [14]
- Centella asiatica: Guangtao và Xiuyang Lu đã nghiên cứu làm giàu saponin
madecassosid và asiaticosid trên 5 loại hạt nhựa: HPD100, HPD300, X-5, AB-8 và
D101. Tác giả cũng khảo sát và lựa chọn được nồng độ EtOH giải hấp phụ là 50%.
Đồng thời, tốc độ giải hấp phụ được lựa chọn là tốc độ thấp nhất trong khoảng khảo
sát (2 BV/h) vì ở tốc độ này, với cùng một thể tích dung môi giải hấp phụ, lượng
saponin thu được là lớn nhất. Kết quả, sau khi làm giàu, hàm lượng madecassosid và
asiaticosid tăng tương ứng từ 3,9 và 2,0% tới 39,7 và 21,5%; tức là hơn 10 lần. Hiệu
suất của quá trình tinh chế là hơn 70% đối với mỗi loại saponin trên [12].
11
- Camellia oleifera: Pengjie và cộng sự, bằng thí nghiệm tĩnh, đã cho thấy
saponin trong hạt chè có độ phân cực phù hợp nhất với EtOH 90% và chọn EtOH 90%
làm dung môi giải hấp phụ. Không những thế, trước khi giải hấp phụ saponin, tác giả
còn tiến hành loại tạp và các chất màu bằng dung dịch NaOH 0,25% sau khi khảo sát
một dãy nồng độ NaOH. Ngoài ra, tốc độ giải hấp phụ cũng ảnh hưởng tới hiệu suất
giải hấp phụ. Tốc độ 1 BV/h cho hiệu suất tốt nhất. Hiệu suất giảm không đáng kể ở
tốc độ 2 BV/h, và giảm mạnh khi tốc độ bắt đầu tăng lên đến 3 BV/h. Quy trình này
cho sản phẩm có hàm lượng saponin lên tới 96,0 % (định lượng UV). [29]
- Paris polyphylla var. yunnanensis: Zhen Liu và cộng sự đã tiến hành khảo sát
phân tách saponin trên 7 loại hạt nhựa macroporous và lựa chọn hạt D101 vì dung
lượng hấp phụ và tỷ lệ giải hấp phụ đều cao nhất. Sau khi làm giàu, hàm lượng
saponin tăng lên 4,83 lần so với trong dịch chiết (đạt 32,35%), hiệu suất 85,47%. Bên
cạnh đó, việc tái chế hạt nhựa D101 bằng EtOH 95% cũng được khảo sát, cho thấy hạt
nhựa này có thể tái sử dụng trong 10 chu kỳ trở lên. [45]
- Một quy trình tinh chế gồm 2 giai đoạn (lần lượt với 2 loại nhựa macroporous
HPD-22 và ADS-7) được thực hiện, nâng hàm lượng akebia saponin D (thành phần
của rễ Dipsacus asperoides) từ 6,27 lên 95,95% và đã thành công ở quy mô công
nghiệp [43].
- Một quy trình phân lập dioscin từ Dioscorea nipponica, với 2 giai đoạn lần
lượt sử dụng nhựa macroporous D101 và D900 cũng đã được thực hiện ở quy mô công
nghiệp. Kết quả, hàm lượng dioscin tăng 9,16 lần (từ 9,35% lên 85,64%) với hiệu suất
81,47%. Trước khi giải hấp phụ saponin bằng cồn cao độ, mỗi giai đoạn đều dùng cồn
thấp độ để rửa tạp (EtOH 20% hoặc EtOH 30%). [21]
1.2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình làm giàu hợp chất đích sử dụng nhựa
macroporous
1.2.3.3.1. Các đặc tính của hạt nhựa macroporous
Ba đặc tính quan trọng ảnh hưởng đến quá trình hấp phụ của nhựa macroporous:
diện tích bề mặt lỗ xốp (thường từ 100-1000m2/g), đường kính lỗ xốp (từ 100 – 300 Å)
và độ phân cực bề mặt [16]. Bảng 1.2 liệt kê một số loại nhựa macroporous với các
đặc tính của chúng.
12
Bảng 1.2. Một số loại nhựa macroporous và đặc tính
Diện tích bề mặt lỗ xốp
Đường kính lỗ xốp
2
(m /g)
(Å)
D101
480-550
90-150
DM11
≥500
70-80
HPD-100
600
520
LSA-20
420-500
85-90
XDA-1
AB-8
800-1000
480-520
85-95
130-140
DM-301
≥330
140-170
DS-410
≥480
120-140
ADS-17
520-600
250-300
HPD-800
700-750
90-110
LSA-10
500-540
85-90
HPD-500
500-550
100-120
HPD-600
500-550
100-120
HPD-850
1100-1300
85-95
NKA II
160-200
145-155
XDA-6
450-500
120-160
Tính chất
Tên
phân cực
Không phân
cực
Phân cực yếu
Phân cực
trung bình
Phân cực
Tới nay, nhiều nhà nghiên cứu có xu hướng sử dụng cột nhựa D101(để làm giàu
các hợp chất thiên nhiên) bởi tính kinh tế và tính hiệu quả.
Bảng 1.3. Một số đặc tính lý hóa của hạt nhựa macroporous D101
Tiêu chí
Thông số kỹ thuật
Bản chất hóa học
Polystyren liên kết chéo
Độ phân cực
Không phân cực
Hình thức
Hạt trắng, hình cầu
Kích thước hạt (mm)
0,3-1,25
Độ ẩm (%)
65-75
Diện tích bề mặt (m2/g)
500-550
Đường kính lỗ xốp trung bình (nm)
9-10
(Nguồn: Nhà sản xuất - Anhui sanxing resin technology Co.Ltd)
13
Một số đặc tính của nhựa macroporous D101 được trình bày trong bảng 1.3.
Nhựa D101 đạt được sự cân bằng giữa 2 đặc tính: tổng diện tích bề mặt và kích thước
lỗ xốp. Bề mặt hấp phụ càng lớn (nhiều lỗ xốp nhỏ), dung lượng hấp phụ càng tăng.
Tuy nhiên, tỷ lệ tối ưu của đường kính lỗ xốp : đường kính phân tử bị hấp phụ là 2 –
6,93. Đường kính lỗ xốp quá nhỏ, phân tử bị hấp phụ rất khó khuếch tán vào bên trong
lỗ xốp. Mặt khác, nếu lỗ xốp quá lớn, phân tử sau khi bị hấp phụ sẽ có xu hướng rời
khỏi lỗ xốp. Các glycosid có đường kính khoảng 2 nm, như vậy tỉ lệ đường kính lỗ
xốp: đường kính phân tử bị hấp phụ vào khoảng 5:1, nằm trong khoảng tỷ lệ tối ưu
[16]. Đây là căn cứ ban đầu khi lựa chọn hạt macroporous D101 để làm giàu bacosid.
1.2.3.3.2. Một số yếu tố khác
Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình làm giàu bằng cột nhựa macroporous
được thể hiện trên sơ đồ xương cá dưới đây (Hình 1.6).
Hấp phụ
Môi trường
Cột hấp phụ
Nồng độ
hoạt chất
Độ ổn định
Nhiệt độ
Tỷ lệ chiều cao
– đường kính
Độ ẩm
Tốc độ
Tốc độ
Thể tích
Độ cồn
Quá
trình
làm
giàu
Tốc độ
Thể tích
Thể tích
Giải hấp phụ
Rửa tạp
Hình 1.6. Sơ đồ một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình làm giàu (phân tách) hoạt chất
bằng phương pháp SPE [38]
1.2.3.4. Ưu điểm của nhựa macroporous trong làm giàu hoạt chất từ thực vật
[16], [29]
- Khả năng tinh chế ở mức độ trung bình
- Chi phí vận hành thấp, hạt nhựa có thể tái chế
- Quá trình tinh chế tiết kiệm dung môi, sử dụng dung môi ít gây ô nhiễm môi trường
- Thích hợp với quy mô công nghiệp
14
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Nguyên vật liệu
- Dịch chiết RĐB do khoa Công nghệ chiết xuất, Viện Dược liệu cung cấp.
Hình 2.1. Nguyên liệu RĐB
Hình 2.2. Hạt nhựa macroporous D101
- Hạt nhựa macroporous D101, nhà sản xuất: Anhui sanxing resin technology Co.Ltd,
Trung Quốc.
2.1.2. Hóa chất, thiết bị, dụng cụ
2.1.2.1. Hóa chất
Bảng 2.1. Danh sách hóa chất sử dụng
STT
1
2
Tên hóa chất
EtOH 96%
Nguồn gốc, tiêu chuẩn
Việt Nam
Chất chuẩn bacosid A3
(độ tinh khiết 97%)
Trung Quốc
3
NaOH
Trung Quốc
4
HCl
Trung Quốc
5
CAN
Mỹ
6
Natri dihydrophosphat
Đức
7
MeOH
Trung Quốc
8
Than hoạt
Việt Nam
15
2.1.2.1. Dụng cụ
- Cột thủy tinh (đường kính 1,7 cm; 2,6 cm)
- Pipet 10 mL
- Phễu thủy tinh
- Cốc thủy tinh
- Ống đong 25 mL, 100 mL, 250 mL, 1000 mL, 2000 mL
- Giấy lọc
- Phễu lọc
- Bình định mức 10 mL
- Màng lọc 0,45 µm
- Bình nón 1000 mL, 250 mL
2.1.2.2. Thiết bị
- Máy cất quay Daihan scientific (Hàn Quốc)
- Cân phân tích Mettler Toledo AB204S (Thụy Sỹ)
- Máy đo hàm ẩm Ohaus (Thụy Sỹ)
- Cân phân tích Wisd (Thụy Sỹ)
- Tủ sấy Memmert (Đức)
- Hệ thống lọc Buchner
- Máy siêu âm Daihan scientific (Hàn Quốc)
- Bể điều nhiệt
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu quá trình hấp phụ bacosid từ dịch chiết lên hạt nhựa
macroporous D101
- Khảo sát tốc độ hấp phụ
- Xác định điểm dừng hấp phụ
2.2.2. Nghiên cứu quá trình giải hấp phụ bacosid từ hạt nhựa macroporous D101
- Khảo sát dung môi giải hấp phụ
- Khảo sát thể tích dung môi giải hấp phụ tạp
- Khảo sát thể tích dung môi giải hấp phụ bacosid
- Khảo sát tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột
2.2.3. Đề xuất và đánh giá tính ổn định của quy trình làm giàu bacosid ứng dụng
hạt nhựa macroporous D101
16