Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp chất liên quan trong nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistonkinensis a được phân lập từ quả của cây chà chôi

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

BÙI BÍCH PHƢƠNG

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC
ĐỊNH HÀM LƢỢNG TẠP CHẤT LIÊN
QUAN TRONG NGUYÊN LIỆU THIẾT
LẬP CHẤT CHUẨN
CLEISTONKINENSIS A ĐƢỢC PHÂN
LẬP TỪ QUẢ CỦA CÂY CHÀ CHÔI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

BÙI BÍCH PHƢƠNG
Mã sinh viên: 1301322

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC
ĐỊNH HÀM LƢỢNG TẠP CHẤT LIÊN
QUAN TRONG NGUYÊN LIỆU THIẾT
LẬP CHẤT CHUẨN
CLEISTONKINENSIS A ĐƢỢC PHÂN
LẬP TỪ QUẢ CÂY CHÀ CHÔI
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:

1. ThS. Nguyễn Lâm Hồng
2. TS. Đoàn Thị Mai Hƣơng
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất
2. Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam

HÀ NỘI - 2018


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS. Nguyễn Lâm Hồng - Giảng
viên Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất và Ts. Đoàn Thị Mai Hƣơng- Viện Hóa sinh
biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, những ngƣời đã trực tiếp
hƣớng dẫn và tạo điều kiện về mọi mặt cho tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận
tốt nghiệp này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong Bộ môn Hóa phân
tích - Độc chất, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội cũng nhƣ Ths. Lê Công Vinh và các
anh chị Phòng tổng hợp hữu cơ, Viện hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã quan tâm, giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua.
Cũng nhân đây, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu, các thầy cô giáo
và cán bộ nhân viên Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, những ngƣời đã dạy bảo và giúp
đỡ tôi trong suốt năm năm học tập tại trƣờng.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, những ngƣời đã
luôn ở bên động viên, cổ vũ và giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành khóa luận này.
Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2018
Sinh viên

Bùi Bích Phƣơng

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... 3
1.1. Tổng quan về thực vật của cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.
Euphorbiaceae) ............................................................................................................. 3
1.1.1. Vị trí phân loại ............................................................................................... 3
1.1.2. Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) ....................................................................... 3
1.1.3. Chi Cleistanthus .............................................................................................. 3
1.1.4. Loài Cleistanthus tonkinensis ......................................................................... 5
1.2. Sơ lƣợc về hợp chất cleistonkinensis A ............................................................... 6
1.3. Chất chuẩn và quy trình thiết lập chất chuẩn ........................................................ 6
1.3.1. Khái quát về chất chuẩn ................................................................................. 6
1.3.2. Quy trình thiết lập chất chuẩn ........................................................................ 7
1.4. Tổng quan về thẩm định phƣơng pháp định lƣợng tạp chất liên quan ................. 8
1.4.1. Khái niệm ........................................................................................................ 8
1.4.2. Các kỹ thuật phân tích tạp chất liên quan ...................................................... 9
1.4.3. Thẩm định phương pháp xác định tạp chất liên quan. ................................. 11
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 18
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ...................................................................................... 18
2.1.1. Nguyên liệu ................................................................................................... 18
2.1.2. Hóa chất, dung môi, chất chuẩn ................................................................... 18
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị ........................................................................................... 18
2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 19
2.2.1. Xác định hàm lượng tạp chất liên quan và độ tinh khiết sắc ký của
cleistonkinensis A bằng HPLC/DAD ...................................................................... 19
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu..................................................................................... 19


2.3.1. Xác định hàm lượng tạp chất liên quan và đôk tinh khiết sắc ký của

cleistonkinensis A bằng HPLC/DAD. ..................................................................... 19
2.4. Xử lý kết quả ....................................................................................................... 22
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................... 23
3.1. Xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan và độ tinh khiết sắc ký của
cleistonkinensis A bằng HPLC/DAD ........................................................................ 23
3.1.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký .......................................................... 23
3.1.2. Thẩm định phương pháp ............................................................................... 27
3.2. Bàn luận .............................................................................................................. 39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 41


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ACN

Acetonitril

APG

Angiosperm Phylogeny Group

ARS

ASEAN Reference Standards

ASEAN

Association of Southeast Asian Nations

d

Độ chia nhỏ nhất

dd

Dung dịch

DAD

Diode Array Detector

ĐTK

Độ tinh khiết

EPCRS

European Pharmacopeia Reference Substances

GC

Gas Chromatography

GC-MS

Gas Chromatography – Mass Spectrometry

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

ICH

International Conference on Harmonisation of Technical
Requirements

for

Registration

of

Pharmaceuticals

Human Use
ICRS

International Chemical Reference Substances

IUPAC

International Union of Pure and Applied Chemistry

LC-MS

Liquid Chromatography – Mass Spectrometry

LOD

Limit of Detection

LOQ

Limit of Quantitation

MeOH

Methanol

N

Số đĩa lý thuyết

NIST

National Institute of Standards and Technology

RS

Độ phân giải

RSD

Relative Standard Deviation

of


S

Diện tích

SKĐ

Sắc ký đồ

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

S/N

Signal/Noise

T

Hệ số đối xứng pic

TB

Trung bình

TCCS

Tiêu chuẩn cơ sở

TLC

Thin Layer Chromatography

TLQ

Tạp liên quan

tR

Thời gian lƣu

USPRS

United States Pharmacopeia Reference Substances

UV-VIS

Ultraviolet - Visible Spectroscopy

WHO

World Health Organization


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. 1: Tỷ lệ thu hồi chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) .............. 16
Bảng 1. 2: Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) ......... 17
Bảng 3. 1: Chƣơng trình sắc ký gradient 1.......... ..........................................................23
Bảng 3. 2: Chƣơng trình sắc ký gradient 2 .................................................................... 24
Bảng 3. 3: Kết quả khảo sát chƣơng trình sắc ký .......................................................... 24
Bảng 3. 4: Khảo sát bƣớc sóng ...................................................................................... 26
Bảng 3. 5: Chƣơng trình sắc ký ..................................................................................... 27
Bảng 3. 6: Kết quả độ tinh khiết sắc ký dung dịch Cleistonkinensis A 1000 ppm trong
điều kiện chiếu tia UV ................................................................................................... 32

Bảng 3. 7: Kết quả thẩm định độ phù hợp hệ thống ...................................................... 35
Bảng 3. 8: Độ lặp lại tại LOQ........................................................................................ 36
Bảng 3. 9: Kết quả khảo sát độ tuyến tính ..................................................................... 37
Bảng 3. 10: Kết quả thẩm định độ lặp lại ...................................................................... 38
Bảng 3. 11: Kết quả độ ổn định của dung dịch cleistonkinensis A 1000 ppm:............. 39


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THI
Hình 1. 1: Tiêu bản cây Cleistanthus tonkinensis ........................................................... 5
Hình 1. 2: Quả của cây Cleistanthus tonkinensis ............................................................ 5
Hình 1. 3: Signal/noise .................................................................................................. 14
Hình 3. 1: Sắc ký đồ khảo sát chƣơng trình sắc ký gradient 1 ...................................... 23
Hình 3. 2: Sắc ký đồ khảo sát chƣơng trình sắc ký gradient 2 ...................................... 24
Hình 3. 3: Phổ hấp thụ UV-VIS của cleistonkinensis A và các tạp chất liên quan ....... 25
Hình 3. 4: Kết quả khảo sát thể tích tiêm ...................................................................... 26
Hình 3. 5: SKĐ của mẫu trắng và dung dịch cleistonkinensis A 1000ppm .................. 29
Hình 3. 6: Độ tinh khiết pic sắc ký dung dịch cleistonkinensis A 1000ppm ................ 29
Hình 3. 7: Phổ 3D của dung dịch cleistonkinensis A 1000 ppm ................................... 29
Hình 3. 8: SKĐ Dung dịch phân giải Cleistonkinensis A - Cleistantoxin ................... 30
Hình 3. 9: Sắc ký đồ dung dịch cleistonkinensis A 1000 ppm phân hủy trong các điều
kiện: H2O2 30% và đun cách thủy ở 1000C ................................................................... 30
Hình 3. 10: SKĐ cleistonkinensis A 1000 ppm phân hủy trong điều kiện chiếu tia UV
....................................................................................................................................... 31
Hình 3. 11: Độ tinh khiết pic sắc ký dung dịch cleistonkinensis A 1000ppm trong điều
kiện chiếu tia UV ........................................................................................................... 31
Hình 3. 12: Cleistonkinensis A 1000 ppm phân hủy trong H2SO4 0,1 N...................... 32
Hình 3. 13: Cleistonkinensis A phân hủy trong NaOH 0,1 N ....................................... 33
Hình 3. 14: Sắc ký đồ dung dịch cleistonkinensis A 0,05 ppm ..................................... 35
Hình 3. 15: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ .... 37

ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo Tổ chức Y tế Thể giới (WHO), ung thƣ là nguyên nhân dẫn đến tử vong đứng
thứ hai trên toàn cầu với 8,8 triệu ngƣời chết trong năm 2015 [22]. Nhiều liệu trình
điều trị đã đƣợc áp dụng nhƣ: hóa trị, xạ trị, can thiệp xâm lấn... tuy nhiên kết quả thu
đƣợc vẫn chƣa nhƣ mong đợi. Điều đó càng thúc đẩy các nhà khoa học tìm tòi nghiên
cứu ra các phƣơng pháp, các loại thuốc mới để chống lại căn bệnh này.
Trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam, một hƣớng nghiên cứu đang rất đƣợc quan tâm
đó là phát triển các thuốc điều trị ung thƣ có nguồn gốc từ dƣợc liệu. Năm 2009, dự án
"Phòng thí nghiệm hợp tác Pháp - Việt, nghiên cứu hóa thực vật của hệ thực vật Việt
Nam" đã đƣợc khởi động, dịch chiết ethyl acetat của hơn 2500 loài thực vật ở Việt
Nam đã đƣợc đem thử sàng lọc hoạt tính kháng tế bào ung thƣ trên dòng ung thƣ biểu
mô KB. Một trong những kết quả nổi bật nhất đó là dịch chiết từ quả của cây Chà chôi
(Cleistanthus tonkinensis) và cây Cách Hoa Đông Dƣơng (Cleistanthus indochinensis)
đã cho phần trăm ức chế dòng tế bào ung thƣ biểu mô KB đạt từ 88,40 - 95,17%. Từ
dịch chiết này, nhóm nghiên cứu đã phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc đƣợc 9 hợp
chất tinh khiết nhóm aryltetralin lignan, trong đó cleistantoxin có hoạt tính ức chế
mạnh nhất trên các dòng tế bào ung thƣ thử nghiệm (KB, MCF7, MCF7R, HT29) với
giá trị IC50 trong khoảng 14 - 36 nM (tƣơng đƣơng với khoảng 0,006 - 0,014 μg/ml)
[4]. Bên cạnh đó, các hợp chất glycosid của cleistantoxin phân lập đƣợc từ quả của cây
Chà chôi có cấu trúc hóa học gần nhƣ tƣơng tự etoposid và teniposid là hai dẫn chất
của podophyllotoxin đang đƣợc sử dụng làm thuốc điều trị ung thƣ phổi. Dựa trên các
kết quả này, nhóm tác giả đang nghiên cứu chế tạo cao định chuẩn phân đoạn giàu
cleistantoxin và các aryltetralin lignan đƣợc chiết xuất từ quả của cây Chà chôi để phát
triển thành nguyên liệu làm thuốc điều trị ung thƣ.
Nhằm xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho cao định chuẩn đang đƣợc nghiên cứu điều
trị ung thƣ, các chất chuẩn rất cần đƣợc thiết lập để tiến hành định tính và định lƣợng
các chất có mặt trong cao, trong đó chất chuẩn cleistonkinensis A đƣợc sử dụng làm
dung dịch phân giải khi định lƣợng tạp chất liên quan và độ tinh khiết sắc ký của
cleistantoxin trong nguyên liệu thiết lập chất chuẩn. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành

đề tài: "Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp chất liên quan trong
1


nguyên liệu thiết lập chất chuẩn Cleistonkinensis A được phân lập từ quả của cây
Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis)” với mục tiêu:
-

Xây dựn và thẩm định phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan và
độ tinh khiết sắc ký của cleistonkinensis A bằng HPLC/DAD.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về thực vật của cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.
Euphorbiaceae)
1.1.1. Vị trí phân loại
Theo APG III [18], họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) đƣợc phân loại nhƣ sau:
Thực vật có hoa (Angiosperms)
Thực vật hai lá mầm thật sự (Eudicots)
Nhánh Hoa hồng (Rosids)
Bộ Sơ-ri (Malpighiales)
Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)
1.1.2. Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)
Họ Thầu Dầu (Euphorbiaceae) hay còn gọi là họ Đại Kích là một họ lớn của thực
vật có hoa với 240 chi và khoảng 6000 loài. Trƣớc đây chia thành 5 phân họ bao gồm
Acalyphoideae, Crotonoideae, Euphorbioideae, Oldfieldioideae và Phyllanthoideae.
Ba phân họ đầu tiên là các phân họ một lá mầm trong khi hai phân họ sau là hai lá
mầm[19]. Phần lớn là thân cây thảo, ở khu vực nhiệt đới cũng tồn tại các loài cây bụi

hoặc cây thân gỗ, phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới [5].
1.1.3. Chi Cleistanthus
1.1.3.1. Đặc điểm thực vật
Cleistanthus (do chữ Latin cleisto, bắt nguồn từ chữ Hy Lạp kleistos: đóng, không
mở và anthos: hoa kết hợp thành) đƣợc dịch sang Tiếng Việt là cách hoa hoặc cọc rào.
Là cây gỗ nhỏ hay nhỡ, lá mọc so le xếp hai dãy, nguyên. Cụm hoa ở nách lá, thành
xim đơn hoặc bông, nhiều hoa hoặc ít hoa; lá bắc thƣờng ngắn hơn hoa; hoa không
cuống hoặc có cuống, cùng gốc hoặc khác gốc; đài hợp ở gốc. Hoa đực có 4-6 lá đài,
thƣờng là 5, xếp van. Cánh hoa 5 nhỏ, thƣờng nguyên. Đĩa mật phẳng hay lồi. Bầu
không lông hoặc có lông nhung. Quả nang có 3 mảnh vỏ tròn ở lƣng; hạt hình trứng - 3
góc [19].

3


Chi Cleistanthus gồm khoảng 140 loài mọc tự nhiên từ châu Phi, Ấn Độ đến
Australia. Ở nƣớc ta, theo sách "Cây cỏ Việt Nam" của tác giả Phạm Hoàng Hộ, chi
Cleistanthus có 14 loài, phân bố khắp cả nƣớc, từ Hà Giang tới Phú Quốc [2].
1.1.3.2. Tình hình nghiên cứu chi Cleistanthus
 Trên thế giới
Yixi Liu và các cộng sự thuộc trung tâm công nghệ Virginia, Mỹ đã nghiên cứu các
hợp chất có tác dụng chống tăng sinh tế bào trong dịch chiết Ethanol của lá
Cleistanthus boivinianus đƣợc thu hái từ khu vực rừng khô Madagascar. Trong đó các
hợp chất 3α - O - (β - D - glucopyranosyl) desoxypodophyllotoxin; (±) - β apopicropodophyllin và (-) - desoxypodophyllotoxin cho thấy có tác dụng chống tăng
sinh dòng tế bào ung thƣ buồng trứng A2780 mạnh, với giá trị IC50 tƣơng ứng là 33,0
± 3,6; 63,1 ± 6,7 và 230 ± 1 nM [24].
Một nghiên cứu khác trên loài Cleistanthus collius đã đƣợc thực hiện bởi các nhà
khoa học Ấn Độ. Phân tích phytochemical đã đƣợc thực hiện để chứng minh sự có mặt
của các thành phần nhƣ terpenoids, đƣờng, steroid, flavonoid,... trong lá cây C. collius.
Kết quả phân tích GC-MS dịch chiết aceton cho thấy sự có mặt của hợp chất mới

dioctyl phthalat (cleistanthin A và cleistanthin B), chƣa đƣợc phân lập trƣớc đó.
Dioctyl phthalat thể hiện khả năng liên kết với thụ thể p53 (còn đƣợc gọi là protein 53
hoặc protein khối u 53), là một loại protein ức chế khối u ở ngƣời đƣợc mã hóa bởi gen
TP53 [16]. Trong đó, cleistanthin B đã đƣợc chứng minh có tác dụng chống ung thƣ
trên dòng tế bào biểu mô và bạch huyết trên cơ thê chuột bạch Thụy Sĩ [20].
Các nghiên cứu trên chi Cleistanthus đã mở ra hƣớng nghiên cứu và phát triển dịch
chiết thành cao định chuẩn làm thuốc điều trị ung thƣ có nguồn gốc tự nhiên.
 Ở Việt Nam
Một số cây thuộc chi cleistanthus: C.indokinensis, C.tonkinensis, C.eberhardtii là
các loài đặc thù ở Việt Nam. Các hợp chất đƣợc phân lập từ các cây thuộc chi
Cleistanthus có thể đƣợc phân loại nhƣ sau: Các hợp chất lignan, các hợp chất terpen
và một vài hợp chất khác.
Năm 2012, Trịnh Thị Thanh Vân và cộng sự đã tiến hành phân lập dịch chiết quả
của cây Cách Hoa Đông Dƣơng (Cleistanthus indokinensis) và xác định đƣợc cấu trúc
4


của 11 hợp chất, trong đó có 9 hợp chất mới là: cleistantoxin, demethoxycleistantoxin,
podocleistantoxin, cleindosid A, cleindosid B, cleindosid C, cleindosid D, cleindosid
E, cleindosid F, và hai hợp chất đã biết là axit gallic và amentoflavon. Trong đó
cleistantoxin có hoạt tính ức chế mạnh nhất trên các dòng tế bào ung thƣ thử nghiệm
(KB, MCF7, MCF7R, HT29) với giá trị IC50 trong khoảng 14 - 36 nM. Vì thế, dịch
chiết từ quả cây thuộc chi cleistanthus đang đƣợc nghiên cứu, phát triển thành cao
định chuẩn chứa hàm lƣợng cleistantoxin trên 50% làm nguyên liệu thuốc điều trị ung
thƣ trong pha tiền lâm sàng [4].
1.1.4. Loài Cleistanthus tonkinensis

Hình 1. 1: Tiêu bản cây Cleistanthus tonkinensis

Quả xanh

Quả chín

Hình 1. 2: Quả của cây Cleistanthus tonkinensis
1.1.4.1. Đặc điểm thực vật
Loài Cleistanthus tonkinensis có tên Tiếng Việt là Chà chôi, thuộc họ Thầu dầu
(Euphorbiaceae), đƣợc miêu tả nhƣ sau: Cây gỗ nhỏ cao 1 - 3 m; nhánh láng, đen.
Phiến lá tròn dài, to 7 - 13 x 2 - 5 cm, chót có mũi nhọn, đáy tròn, mỏng, cứng, láng,

5


gân phụ 7 - 8 cặp; cuống 1 cm, lá bẹ 2 - 3 mm. Chùm hoa cao 1 - 1,5 cm; hoa nhỏ,
không cọng; cánh hoa 5, to 1 mm, tiểu nhụy 5, nhụy cái lép; hoa cái không cọng, cánh
hoa 2 mm, đĩa mật quanh noãn sào có ít lông. Nang (quả) xoan, cao 1,3 cm, nở làm 3
mảnh; hột hoe, cao 7 mm.
Cây phân bố ở khu vực rừng trên đá vôi từ Cao Bằng, Lạng Sơn đến Nghệ An, Hà
Tĩnh [2].
1.1.4.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
Từ các kết quả nghiên cứu trên cây Cách hoa đông dƣơng (C.indokinensis) các nhà
khoa học tiếp tục nghiên cứu trên cây Chà Chôi (C. tonkinensis). Kết quả cho thấy
dịch chiết ethyl acetat của quả cây Chà chôi Cleistanthus tonkinensis thể hiện khả năng
ức chế mạnh sự phát triển của tế bào ung thƣ, cụ thể, nó cho phần trăm ức chế dòng tế
bào ung thƣ biểu mô KB lên tới 88,40 - 95,17%. Từ cao cồn khô chiết từ quả cây Chà
Chôi các nhà khoa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam đã phân
lập đƣợc các hợp chất: cleistantoxin, cleisindosid D, cleisindosid A, cleistonkinensis
A,.... [4].
1.2. Sơ lƣợc về hợp chất cleistonkinensis A
Cleistonkinensis A là một hợp chất toàn toàn mới, trên thế giới có một số nghiên
cứu về các cây thuộc chi Cleistanthus, nhƣng chƣa có nghiên cứu nào công bố về hoạt

chất cleistonkinensis A. Sau đây là một số thông tin về hợp chất cleistonkinensis A:
Danh pháp IUPAC: (8aR, 9R) - 5(benzo[d][1,3]dioxol - 5 - yl) - 9 - hydroxyl - 10
methoxy - 8a,9 - dihydrofuro[3’,4’:6,7]naphtho[2,3 - d][1,3]dioxol - 6(8H) - one.
Công thức phân tử: C21H16O8
Tính chất: Tinh thể rắn, màu trắng. Tan tốt trong dicloromethan, aceton và ACN,
kém tan trong MeOH. pKa dự kiến bằng phần mềm ChemBioDraw: 12,934.
1.3. Chất chuẩn và quy trình thiết lập chất chuẩn
1.3.1. Khái quát về chất chuẩn
 Khái niệm:
Theo Dƣợc điển Việt Nam V [1], chất chuẩn (chất đối chiếu) là chất đồng nhất đã
đƣợc xác định là đúng để dùng trong các phép thử đã đƣợc quy định về hóa học, vật lý
và sinh học. Trong các phép thử đó, các tính chất của chất đối chiếu đƣợc so sánh với
6


các tính chất của chất cần thử. Chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục
đích sử dụng.
 Phân loại chất chuẩn: [23]
- Chuẩn gốc: Chất chuẩn đƣợc xác định hoặc thừa nhận rộng rãi là có chất lƣợng
đo lƣờng cao nhất và giá trị của nó đƣợc chấp nhận mà không quy chiếu về các chất
chuẩn khác của cùng đại lƣợng, trong tình huống cụ thể. Một số chất chuẩn đƣợc coi là
chuẩn gốc nhƣ chuẩn Quốc tế (ICRS), chuẩn Dƣợc điển Mỹ (USPRS), chuẩn Dƣợc
điển châu Âu (EPCRS), chất chuẩn do Viện Tiêu chuẩn và Công nghệ Quốc gia Mỹ
(NIST) thiết lập. Ngoài ra, đối với các hoạt chất mới, chất chuẩn gốc theo TCCS của
nhà phát minh cũng đƣợc xếp vào nhóm này.
- Chuẩn thứ cấp: Chất chuẩn có giá trị đƣợc xác định bằng cách so sánh với chuẩn
gốc của cùng một đại lƣợng. Ví dụ nhƣ chuẩn ASEAN (ARS), chuẩn Dƣợc điển Việt
Nam, chuẩn làm việc...
1.3.2. Quy trình thiết lập chất chuẩn
Theo hƣớng dẫn của WHO và ASEAN, quy trình thiết lập chất chuẩn gồm các

bƣớc cơ bản sau:
 Lựa chọn nguyên liệu
 Xây dựng quy trình
 Đánh giá nguyên liệu
 Đóng lọ/ống
 Kiểm tra độ đồng nhất của quá trình đóng gói
 Đánh giá liên phòng
 Tập hợp và xử lý số liệu, hoàn thành hồ sơ
 Phê duyệt kết quả
 Đóng gói, bảo quản, phân phối
 Kiểm tra định kỳ [9],[23].
Tuy nhiên, trong phạm vi của khóa luận này chúng tôi chỉ đề cập chi tiết những nội
dung liên quan trực tiếp tới đề tài:
 Lựa chọn nguyên liệu:
Nguồn nguyên liệu với chất lƣợng tốt có thể đƣợc lựa chọn từ một lô chất có nguồn
gốc từ quá trình sản xuất thông thƣờng, nếu độ tinh khiết đạt tiêu chuẩn. Các yêu cầu
7


về độ tinh khiết đối với một chất đối chiếu hóa học phụ thuộc vào mục đích sử dụng
của nó. Chất chuẩn sử dụng trong phép thử định lƣợng bắt buộc phải có độ tinh khiết
cao; đối với chất chuẩn gốc, hàm lƣợng cần đạt trên 99,5% (tính trên nguyên liệu khan
hoặc không chứa các chất dễ bay hơi). Trong khi đó, chất chuẩn sử dụng cho phép thử
định tính không đòi hỏi độ tinh khiết quá cao do sự hiện diện của tạp chất ở một hàm
lƣợng nhỏ không ảnh hƣởng đáng kể đến kết quả của phép thử. Đối với tạp chuẩn,
nguồn nguyên liệu có thể lấy từ các nhà cung ứng thƣơng mại, nếu độ tinh khiết đạt
trên 95% (hoặc 90% nếu sử dụng cho TLC) [23].
 Xác định tạp chất trong nguyên liệu:
Các kỹ thuật phân tích cơ bản nhằm xác định tạp chất trong nguyên liệu thiết lập
chất chuẩn gồm:

-

Tạp hữu cơ: sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC/DAD [21],[23] ; sắc ký lỏng khối
phổ LC - MS; sắc ký khí khối phổ GC - MS [17]

-

Tạp vô cơ: Xác định tro sulfat [1],[7]; cắn sau nung [21]; quang phổ nguyên tử,
quang phổ phát xạ plasma, huỳnh quang tia X [7],[13].

-

Tạp bay hơi: Mất khối lƣợng do làm khô; chuẩn độ Karl Fisher
[1],[7],[21],[23]; sắc kí khí GC [1].

1.4. Tổng quan về thẩm định phƣơng pháp định lƣợng tạp chất liên quan
1.4.1. Khái niệm
Tạp chất là bất kỳ thành phần nào có mặt cùng với hợp chất chính phát sinh trong
quá trình tổng hợp, phân hủy, phát sinh từ dung môi phản ứng, chất xúc tác,... Hợp
chất chính bị giảm độ tinh khiết ngay cả khi chứa một chất không có tác dụng dƣợc lý
cũng nhƣ độc tính. Một lƣợng dù rất nhỏ tạp chất cũng có thể ảnh hƣởng đến chất
lƣợng và độ an toàn của các sản phẩm thuốc [11],[17].
Tạp chất liên quan là tạp chất thu đƣợc từ hợp chất chính và không bao gồm tạp
chất từ tá dƣợc, bao gồm các sản phẩm phân hủy, sản phẩm phụ, sản phẩm trung gian
trong quá trình tổng hợp hoặc có sẵn trong nguyên liệu ban đầu nhƣ đồng phân đối
quang của hoạt chất [8].

8

1.4.2. Các kỹ thuật phân tích tạp chất liên quan
Theo tham khảo các kỹ thuật trong dƣợc điển và một số tài liệu việc định lƣợng tạp
chất liên quan có thể thực hiện theo các kỹ thuật sau:
-

Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC/DAD [7],[21],[23].

-

Sắc ký lỏng khối phổ LC - MS [10],[14].

Tuy nhiên trong phạm vi khóa luận chúng tôi chỉ đề cập chi tiết đến phƣơng pháp
HPLC/DAD
1.4.2.1. Chuẩn hóa diện tích
Phần trăm tạp chất liên quan đƣợc tính theo công thức:
ừ

% Tạp chất liên quan

100%

Đây là phƣơng pháp đơn giản vì không cần phải sử dụng chất chuẩn, thích hợp khi
không có chất chuẩn hoặc chất chuẩn không có sẵn.
Độ tuyến tính: Do các hàm lƣợng các tạp chất liên quan thƣờng dƣới 1% và hoạt
chất trên 95% do đó điều quan trọng là phải có sự tuyến tính từ ngƣỡng nồng độ các
chất liên quan (ví dụ, 1%) đến nồng độ của hoạt chất (ví dụ, 95%). Tuy nhiên trong
một số trƣờng hợp hình dạng đỉnh của pic chính không cân đối tại nồng độ cao do vậy
sẽ không tuyến tính và cho kết quả không chính xác.
Nồng độ mẫu (độ nhạy của phƣơng pháp): Để duy trì khoảng nồng độ tuyến tính
các nhà khoa học phải giảm nộng độ mẫu để cải thiện hình dạng pic chính. Tuy nhiên

nếu nồng độ mẫu quá thấp sẽ ảnh hƣởng đến độ nhạy của phƣơng pháp và khả năng
phát hiện tạp nồng độ thấp [8].
1.4.2.2. Phương pháp pha loãng dung dịch thử
Trong phƣơng pháp này cần chuẩn bị một mẫu ở nồng độ cao tƣơng tự phƣơng
pháp chuẩn hóa diện tích và một mẫu khác đƣợc pha loãng từ mẫu có nồng độ cao theo
tỷ lệ thích hợp (thƣờng pha loãng theo tỷ lệ tạp liên quan so với hợp chất chính trong
mẫu nồng độ cao). Kết quả sau khi phân tích cho thấy, tất cả các tạp chất liên quan đều
đƣợc phát hiện trong mẫu có nồng độ cao và trong mẫu nồng độ thấp hầu nhƣ chỉ xuất
hiện pic của hợp chất chính ( sau khi pha loãng hàm lƣợng tạp chất liên qua quá nhỏ)
9


Sau khi pha loãng, nồng độ của tạp liên quan ở mẫu nồng độ cao sẽ tỷ lệ với nồng
độ của hợp chất chính ở mẫu nồng độ thấp
Phƣơng pháp này khắc phục đƣợc nhƣợc điểm của phƣơng pháp chuẩn hóa diện
tích tuy nhiên mẫu phải đƣợc tiêm ít nhất hai lần do đó thời gian phân tích kéo dài hơn
và sai sót trong quá trình pha loãng mẫu có thể dẫn đến kết quả không chính xác [8].
1.4.2.3. Phương pháp sử dụng chất chuẩn tạp
Trong kỹ thuật này, nồng độ các tạp chất liên quan đƣợc xác định dựa trên một
đƣờng chuẩn. Nồng độ của các tạp chất liên quan đƣợc xác định bởi đáp ứng (diện tích
pic của mỗi tạp) với đƣờng cong hiệu chỉnh. Một chất chuẩn đối chiếu của hoạt chất
đƣợc sử dụng trong việc hiệu chuẩn. Do đó, cần phải tính đến hệ số hiệu chỉnh nếu đáp
ứng của tạp chất liên quan và hoạt chất rất khác nhau. Đƣờng chuẩn một điểm áp dụng
khi hệ số chắn trục tung không đáng kể. Nếu không, phải sử dụng đƣờng chuẩn đa
điểm. Kỹ thuật này có một số lợi thế so với phƣơng pháp chuẩn hóa diện tích
Thu hẹp phạm vi tuyến tính: Không giống nhƣ chuẩn hóa diện tích và phƣơng
pháp pha loãng dung dịch thử, sử dụng đáp ứng của hoạt chất trong mẫu để tính toán,
phƣơng pháp chuẩn ngoại sử dụng một đƣờng chuẩn. Thông thƣờng phạm vi nồng độ
của đƣờng cong hiệu chuẩn tƣơng đƣơng nồng độ các tạp chất liên quan trong mẫu (ví
dụ 1% đến 5% nồng độ mẫu danh nghĩa). Do đó, phƣơng pháp này chỉ yêu cầu dải

tuyến tính nhỏ.
Cải thiện độ nhạy của phương pháp. Trong cách tiếp cận này, chỉ tính riêng đáp
ứng của các tạp chất liên quan riêng lẻ. Vì diện tích pic hoạt chất trong mẫu tiêm
không cần thiết cho việc tính toán nên có thể sử dụng nồng độ mẫu cao mà không lo
lắng về đáp ứng ngoài khoảng tuyến tính của hoạt chất. Cách tiếp cận này đặc biệt hữu
ích khi các nhà khoa học muốn cải thiện độ nhạy của phƣơng pháp bằng cách tăng
nồng độ mẫu
Một trong những hạn chế của phƣơng pháp chuẩn ngoại là cần thiết phải có một
chất chuẩn đối chiếu tốt. Thêm vào đó, mỗi phép phân tích đòi hỏi phải cân chính xác
một lƣợng nhỏ (ví dụ, 10 mg) chất chuẩn đối chiếu. Do đó, sai sót khi cân có thể ảnh
hƣởng đến độ đúng và độ chính xác của phƣơng pháp [8].

10


Một điểm lƣu ý khi thu thấp dữ liệu là phải có một ngƣỡng giá trị mà khi diện tích
pic dƣới giá trị này sẽ bỏ qua. Mức "bỏ qua" thƣờng bằng 0,1% hoặc 0,05% chất đang
đƣợc kiểm tra [21],[23].
1.4.3. Thẩm định phương pháp xác định tạp chất liên quan.
1.4.3.1. Độ đặc hiệu/chọn lọc
 Khái niệm: Độ chọn lọc của phƣơng pháp phân tích đƣợc định nghĩa là mức độ
mà một phƣơng pháp có thể định lƣợng đƣợc chất phân tích trong sự có mặt của các
thành phần khác. Các thành phần khác có thể có mặt bao gồm tạp chất, chất phân hủy,
nền mẫu,... Thuật ngữ tính đặc hiệu và tính chọn lọc thƣờng đƣợc sử dụng thay thế
cho nhau. Thuật ngữ độ đặc hiệu đƣợc dùng khi nói đến một phƣơng pháp chỉ tạo ra
đáp ứng với một chất phân tích duy nhất, trong khi thuật ngữ chọn lọc đề cập đến một
phƣơng pháp tạo ra đáp ứng cho một số thực thể hóa học có thể hoặc không thể phân
biệt đƣợc với nhau [8],[12].
 Cách tiến hành:
-

Tiến hành sắc ký mẫu trắng và mẫu thử

-

Mẫu đƣợc chuẩn bị trong các điều kiện khắc nghiệt nhƣ nhiệt độ, độ ẩm, ánh
sáng, thủy phân trong acid/base và quá trình oxy hóa,… sau đó đƣợc tiến hành
sắc ký [8].

 Yêu cầu: Độ chọn lọc của phƣơng pháp có thể đƣợc đánh giá bằng cách kiểm
tra độ tinh khiết pic. Một pic đƣợc gọi là tinh khiết nếu pic đó không lẫn bất kỳ thành
phần mẫu nào khác, đƣợc phản ánh thông qua hệ số purity factor. Giá trị purity factor
phải

990,00.

1.4.3.2. Độ phù hợp hệ thống
 Cách tiến hành
-

Tiêm lặp lại 06 lần dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp và tiến hành sắc ký
theo điều kiện đã lựa chọn.

-

Ghi nhận SKĐ và xác định các giá trị thời gian lƣu, diện tích, hệ số đối xứng
của pic và số đĩa lý thuyết của cột. Tính RSD (%) của thời gian lƣu và diện tích
pic.
RSD% =

̅

√

∑

11

̅


Trong đó: yi là diện tích pic chính mỗi lần tiêm mẫu
̅ là trung bình diện tích pic chính của các lần tiêm mẫu
n là số lần tiêm mẫu lặp lại
 Yêu cầu: RSDthời gian lƣu ≤ 1,0%; RSDdiện tích pic ≤ 2,0% [1].
1.4.3.3. Giới hạn định lượng (LOQ), giới hạn phát hiện (LOD)
 Khái niệm:
 Giới hạn định lƣợng LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu
thử mà ta có thể định lƣợng bằng phƣơng pháp khảo sát và cho kết quả
có độ chụm mong muốn.

 Giới hạn phát hiện LOD là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong
mẫu có thể phát hiện đƣợc nhƣng chƣa thể định lƣợng đƣợc (đối với
phƣơng pháp định lƣợng) [12]
 Cách tiến hành [3],[8]:
 Dựa trên độ lệch chuẩn
Cách 1. Làm trên mẫu trắng (mẫu trắng có thành phần nhƣ mẫu thử nhƣng không
có chất phân tích). Phân tích mẫu 10 lần song song, tính độ lệch chuẩn.
LOD= ̅̅̅ + 3SDo

LOQ = ̅̅̅ + 10SD0i

Trong đó : ̅̅̅ = trung bình của mẫu trắng
SD0 = độ lệch chuẩn của mẫu trắng
Cách 2. Làm trên mẫu thử: Làm 10 lần song song. Nên chọn mẫu thử có nồng
độ thấp (ví dụ, trong khoảng 5 đến 7 lần LOD ƣớc lƣợng).
LOD = 3×SD

LOQ = 10×SD

Trong đó: ̅ = trung bình của mẫu thử
SD = độ lệch chuẩn của mẫu thử

12


 Dựa trên đƣờng chuẩn: LOD, LOQ có thể đƣợc xác định dựa vào độ dốc của
đƣờng chuẩn và độ lệch chuẩn của tín hiệu đo.
LOD =

LOQ =

Trong đó: SD là độ lệch chuẩn của tín hiệu
a là độ dốc của đƣờng chuẩn
Giá trị a có thể dễ dàng tính đƣợc từ đƣờng chuẩn, giá trị SD có thể đƣợc tính theo
nhiều cách khác nhau, bao gồm:
-

Dựa trên độ lệch chuẩn của mẫu trắng: Phân tích mẫu trắng lặp lại 10 lần và
tính SD tƣơng ứng;

-

Dựa trên độ lệch chuẩn của mẫu thêm chuẩn ở nồng độ nhỏ gần LOD/LOQ, lặp
lại 10 lần và tính SD;

-

Dựa trên hệ số chặn của đƣờng chuẩn, làm nhiều lần để tính SD của giá trị b
(intercept)

 Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N)
Cách này chỉ áp dụng đối với các quy trình phân tích sử dụng các thiết bị có nhiễu
đƣờng nền. Thông thƣờng cách tính này áp dụng phổ biến cho các phƣơng pháp
sắc ký, điện di,…
Phân tích mẫu (mẫu thực, mẫu thêm chuẩn hoặc mẫu chuẩn) ở nồng độ thấp còn
có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Số lần phân tích lặp lại 4 lần. Xác định
tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio)
S/N =

2H
h

Trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích,
N là nhiễu đƣờng nền
Nhiễu đƣờng nền đƣợc tính về hai phía của đƣờng nền và tốt nhất là tính nhiễu lân
cận hai bên của píc, bề rộng mỗi bên tối thiểu gấp 10 lần chiều rộng của pic tại nửa
chiều cao.
LOD đƣợc chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đƣờng
nền, thông thƣờng thƣờng lấy S/N =3.

LOQ đƣợc chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10-20 lần nhiễu đƣờng
nền, thông thƣờng thƣờng lấy S/N = 10 [1],[3],[8],[15].
13


Hình 1. 3: Signal/noise
1.4.3.4. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Khái niệm: Khoảng tuyến tính của một phƣơng pháp phân tích là khoảng nồng độ ở
đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lƣợng đo đƣợc và nồng độ chất phân tích [12].
Cách tiến hành: Việc xác định khoảng tuyến tính thƣờng đƣợc khảo sát bắt đầu từ
giới hạn định lƣợng (điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm cao
nhất). Nói chung, để xác định khoảng tuyến tính cần khoảng 10 (tối thiểu là 6) nồng độ
khác nhau [8].
Để xác định khoảng tuyến tính cần thực hiện đo các dung dịch có nồng độ thay đổi
và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ. Vẽ đƣờng cong phụ thuộc giữa tín
hiệu đo và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính.
Khoảng tuyến tính dài hay ngắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó quan trọng nhất
là bản chất của chất phân tích và kỹ thuật sử dụng
Sau khi xác định khoảng tuyến tính cần xây dựng đƣờng chuẩn và xác định hệ số
hồi quy tƣơng quan. Trong phân tích thực tế, có thể xây dựng các đƣờng chuẩn ngắn,
trùm lên vùng nồng độ trong mẫu, không nhất thiết phải lập đƣờng chuẩn toàn bộ
khoảng tuyến tính. Nồng độ trong mẫu không đƣợc vƣợt ra ngoài giới hạn cao nhất và
thấp nhất của đƣờng chuẩn và tốt nhất phải nằm ở vùng giữa đƣờng chuẩn.
Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn (tối thiểu 6 nồng độ). Xác định các giá trị đo đƣợc y
theo nồng độ x (lặp lại 2 lần lấy giá trị trung bình). Nếu sự phụ thuộc tuyến tính, ta có
khoảng khảo sát đƣờng biểu diễn là một phƣơng trình: y = ax + b
Trong đó: a: giá trị độ dốc slope;
b: giá trị hệ số chặn intercept
và hệ số tƣơng quan
14

Yêu cầu:
 Hệ số tƣơng quan 0,995 < R ≤ 1 hay 0,99 ≤ R2 ≤ 1 [1]
 % Hệ số chắn (%Y) tại nồng độ 100% phải ≤ 5,0%.
Với %Y =

Hệ số chắn
Diện tích pic chuẩn 100%

x 100

1.4.3.5. Độ đúng
Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá
trị thực hoặc giá trị đƣợc chấp nhận là đúng μ [12].
Đối với đa số mẫu phân tích, giá trị thực không thể biết một cách chính xác, tuy
nhiên nó có thể có một giá trị quy chiếu đƣợc chấp nhận là đúng (gọi chung là giá trị
đúng)
Độ đúng thƣờng đƣợc diễn tả bằng độ chệch (bias) [15],[3]

Trong đó: Δ là độ lệch (bias) %
Xtb là giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm
µ là giá trị thực hoặc giá trị đƣợc chấp nhận là đúng
Ngoài ra độ đúng cũng có thể tính theo công thức
Độ đúng =

% tạp liên quan theo tính toán
% tạp liên quan theo lý thuyết

×100% [8]

Trong trƣờng hợp không có giái trị đƣợc chấp nhận là đúng, có thể sử dụng phƣơng
pháp tính độ thu hồi nhƣ sau:
-

Thêm một lƣợng chất chuẩn vào mẫu thử để đƣợc các dung dịch có nồng độ
tƣơng ứng với khoảng 90%, 100% và 110% so với nồng độ định lƣợng, mỗi
mức nồng độ làm 03 mẫu. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn.

-

Tính tỷ lệ thu hồi của chất chuẩn trong từng mẫu.

Yêu cầu: Tỷ lệ thu hồi tùy thuộc vào tỷ lệ tạp chất liên quan. RSD của tỷ lệ thu hồi
tại mỗi mức nồng độ ≤ 2,0% [6]

15


Bảng 1. 1: Tỷ lệ thu hồi chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC)
Tỷ lệ chất cần phân tích

Tỷ lệ thu hồi(%)

100%

98-102

10%

98-102

1%

97-103

0.1%

95-105

0.01%

90-107

0.001%

80-110

1.4.3.6. Độ chụm
Khái niệm: Độ chụm chỉ mức độ mức độ dao động của các kết quả thử nghiệm độc lập
quanh trị giá trung bình.
Độ chụm có thể đƣợc phân ra thành ba trƣờng hợp sau:
-

Độ lặp lại (repeatability)

-

Độ chụm trung gian (intermediate precision)

-

Độ tái lặp (reproducibility) [12]

 Độ lặp lại
Tiến hành làm thí nghiệm lặp lại 10 lần (ít nhất 6 lần) trên cùng một mẫu (mỗi lần
bắt đầu từ cân hay đong mẫu). Mẫu phân tích có thể là mẫu chuẩn, hoặc mẫu trắng
có thêm chuẩn, tốt nhất là làm trên mẫu thử hay mẫu thử thêm chuẩn.
Nên tiến hành ở nồng độ khác nhau (trung bình, thấp, cao) trong khoảng làm việc,
mỗi nồng độ làm lặp lại 10 lần (ít nhất 6 lần). Tính độ lệch chuẩn SD và độ lệch
chuẩn tƣơng đối RSD hay hệ số biến thiên CV theo các công thức sau:

Trong đó: ̅ = trung bình của mẫu thử
xi là giá trị tính đƣợc ở lần thí nghiệm thứ “i”
16