Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp chất liên quan trong nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleisindosid d được phân lập từ quả của cây chà chôi

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN HOÀNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
HÀM LƯỢNG TẠP CHẤT LIÊN QUAN
TRONG NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP
CHẤT CHUẨN CLEISINDOSID D
ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ QUẢ CỦA
CÂY CHÀ CHÔI
KHÓA LUẬN TÔT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2018


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN HOÀNG
Mã sinh viên: 1301169

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
HÀM LƢỢNG TẠP CHẤT LIÊN QUAN
TRONG NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP
CHẤT CHUẨN CLEISINDOSID D
ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ QUẢ CỦA
CÂY CHÀ CHÔI

KHÓA LUẬN TÔT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:

1. NCS. ThS. Nguyễn Lâm Hồng
2. TS. Đoàn Thị Mai Hƣơng
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất
2. Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam

HÀ NỘI – 2018


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Đoàn Thị Mai Hƣơng –
Viện Hóa Sinh Biển Việt Nam và NCS. ThS. Nguyễn Lâm Hồng – Giảng viên Bộ
môn Hóa phân tích và Độc Chất – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, ngƣời đã trực tiếp
hƣớng dẫn và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Hóa phân tích và Độc Chất
– Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức, giúp tôi có
thể áp dụng vào thực nghiệm để hoàn thiện khóa luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Lê Công Vinh cùng các anh chị ở trung
tâm tiên tiến – Viện Hóa Sinh Biển, Viện Hàn Lâm khoa học và công nghệ Việt Nam
đã hỗ trợ tôi trong quá trình thực nghiệm tại viện. Những kinh nghiệm và kỹ năng học
hỏi đƣợc đã góp phần giúp tôi thực nghiệm chính xác và thực tế hơn.
Cũng nhân đây, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu, các thầy cô
giáo và cán bộ nhân viên Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, những ngƣời đã dạy bảo và
giúp đỡ tôi trong suốt năm năm học tập tại trƣờng.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, những ngƣời
đã luôn ở bên động viên, cổ vũ và giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành khóa học này.
Trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 04 năm 2018

Sinh viên

Nguyễn Văn Hoàng


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ..........................................................................................................................1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN .......................................................................................................2
1.1. Tổng quan về thực vật của cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.
Euphorbiaceae) .....................................................................................................................2
1.1.1. Vị trí phân loại ......................................................................................................2
1.1.2. Họ Thầu Dầu (Euphorbiaceae) ...........................................................................2
1.1.3. Chi Cách hoa (Cleistanthus) ................................................................................2
1.1.4. Loài Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.) .................................................3
1.1.5. Các nghiên cứu về chi Cleistanthus....................................................................4
1.2. Hợp chất cleisindosid D...............................................................................................5
1.3. Tổng quan về chất chuẩn .............................................................................................6
1.3.1. Khái niệm chất chuẩn ..........................................................................................6
1.3.2. Phân lo ại chất chuẩn .............................................................................................7
1.3.3. Quy trình thiết lập chất chuẩn .............................................................................7
1.4. Tổng quan về tạp chất ..................................................................................................8
1.4.1. Khái niệm và phân loại ........................................................................................8
1.4.2. Tạp chất liên quan.................................................................................................9
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................... 13
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị............................................................................................ 13
2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................................ 13
2.1.2. Hóa chất, dung môi............................................................................................ 13
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị................................................................................................. 13
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................. 14
2.2.1. Khảo sát và xây dựng phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan

và độ tinh khiết sắc ký của cleisindosid D tinh chế đƣợc bằng HPLC/DAD ....... 14


2.2.2. Thẩm định phƣơng pháp ................................................................................... 14
2.3. Phƣơng pháp nghiên c ứu .......................................................................................... 15
2.3.1. Xây dựng phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan và độ tinh
khiết sắc ký của cleisindosid D đã tinh chế bằng HPLC/DAD .............................. 15
2.3.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích .................................................................. 15
2.4. Xử lý kết quả .............................................................................................................. 19
Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN............................................ 20
3.1. Xây dựng phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan và độ tinh khiết
sắc ký nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleisindosid D bằng phƣơng pháp
HPLC/DAD ....................................................................................................................... 20
3.1.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký ............................................................ 20
3.1.2. Xây dựng phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan và độ tinh
khiết sắc ký của cleisindosid D.................................................................................. 26
3.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích.......................................................................... 27
3.2.1. Độ đặc hiệu ......................................................................................................... 27
3.2.2. Độ phù hợp hệ thống ......................................................................................... 32
3.2.3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) ........................... 33
3.2.4. Khoảng tuyến tính.............................................................................................. 35
3.2.5. Độ chụm .............................................................................................................. 37
3.2.6. Độ ổn định của phƣơng pháp phân tích .......................................................... 40
3.2.7. Kết quả xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan và độ tinh khiết sắc ký của
nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleisindosid D bằng phƣơng pháp HPLC/DAD 42
3.3. Bàn luận ...................................................................................................................... 43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 44
I. Kết luận........................................................................................................................... 44
II. Kiến nghị ....................................................................................................................... 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................... 46

PHỤ LỤC ............................................................................................................................... 49


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
α

Hệ số chọn lọc

ACN

Acetonitril

APG

Angiosperm Phylogeny Group, Hệ thống phân loại thực vật

ARS

Chất chuẩn chính thức khu vực ASEAN

ASEAN

Association of South East Asian Nations

BP

British Pharmacopoeia, Dƣợc Điển Anh

CH2Cl2

Dicloromethan

HPLC/DAD

High-performance

liquid

chromatography

with

Diod

Array

Detector, Sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector mảng diod.

H2 O

Nƣớc

ICH

International Council for Harmonisation

ICRS

International Chemical Reference Substances, chất chuẩn quốc tế

IC50

Nồng độ ức chế 50 % số lƣợng cá thể

IUPAC

International Union of Pure and Applied Chemistry

LC-MS

Liquid chromatography–mass spectrometry

LOQ

Limit of quantification, giới hạn định lƣợng

MeOH

Methanol

NIST

National Institute of Standards and Technology

NMR

Nuclear Magnetic Resonance, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân

PCRS

Primary chemical reference substances, chất chuẩn sơ cấp

ppm

Part(s) per million, nồng độ phần triệu.

RSD

Relative Standard Deviation, độ lệch chuẩn tƣơng đối

Rs

Độ phân giải

S/N

Signal to noice ratio, tín hiệu/ nhiễu nền


SD

Standard deviation, độ lệch chuẩn

SKĐ

Sắc ký đồ

SRCS

Secondary chemical reference substances, chất chuẩn thứ cấp

tR

Thời gian lƣu

TCCS

Tiêu chuẩn cơ sở

TKSK

Tinh khiết sắc ký

USP

United States Pharmacopoeia, Dƣợc Điển Mỹ

UV

Ultra Violet, tia cực tím

VNRS

Viet Nam Reference Substances, Chất chuẩn quốc gia Việt Nam

WHO

World Health Organization, Tổ chức Y Tế Thế giới

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1. 1: Tiêu bản khô và hình ảnh hoa, quả của loài Cleistanthus tonkinensis Jabl....3
Hình 1. 2: Công thức cấu tạo cleisindosid D ........................................................................6
Hình 2. 1: Cách xác định tỷ số tín hiệu trên nhiễu (S/N) ................................................. 17
Hình 3. 1: Sắc ký đồ dung dịch cleisindosid D 1000 ppm chạy theo chƣơng trình
gradient 1 (1) và chƣơng trình gradient 2 (2) .................................................................... 21
Hình 3. 2: SKĐ dung dịch cleisindosid D 1000 ppm chạy với pha động ACN – dung
dịch đệm acetat pH = 4,0 theo chƣơng trình gradient 3 ................................................... 22
Hình 3. 3: SKĐ dung dịch cleisindosid D 1000 ppm chạy với hệ dung môi ACN –
dung dịch acid Formic 0,1 %. .............................................................................................. 23
Hình 3. 4: SKĐ dung dịch cleisindosid D 1000 ppm chạy với hệ dung môi ACN –
H2O.......................................................................................................................................... 23
Hình 3. 5: Hình ảnh đỉnh pic cleisindosid D với thể tích tiêm 20 µL (1) và 40 µL (2) 25
Hình 3. 6: SKĐ mẫu trắng (ACN – H2O) và dung dịch cleisindosid D 1000 ppm...... 28
Hình 3. 7: Hệ số tinh khiết pic cleisindosid D và phổ 3D của sắc ký đồ dung dịch
cleisindosid D 1000 ppm ...................................................................................................... 28
Hình 3. 8: SKĐ dung dịch cleisindosid D 1000 ppm phân hủy bởi H2O2 30 % trong 3
giờ so với SKĐ dung dịch cleisindosid D 1000 ppm. ...................................................... 29
Hình 3. 9: SKĐ các dung dịch cleisindosid D bị phân hủy bởi tia UV trong 24 giờ,
dung dịch acid sulfuric 0,1 N trong 1 giờ so với SKĐ dung dịch cleisindosid D 1000
ppm.......................................................................................................................................... 30
Hình 3. 10: SKĐ dung dịch cleisindosid D 1000 ppm bị phân hủy bởi nhiệt độ (cách
thủy 80 o C) trong 2 giờ và dung dịch NaOH 0,1 N trong 15 phút so với SKĐ dung dịch
cleisindosid D 1000 ppm. ..................................................................................................... 31
Hình 3. 11: SKĐ dung dịch cleisindosid D 0,1 ppm ........................................................ 34
Hình 3. 12: Biểu đồ thể hiện mối liên quan giữa diện tích và nồng độ cleisindosid D 36

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. 1: Các phƣơng pháp định lƣợng tạp chất liên quan trong 1 số tài liệu ............ 10
Bảng 3. 1: Các chƣơng trình s ắc ký đƣợc khảo sát ........................................................... 20
Bảng 3. 2: Kết quả độ phân giải của cleisindosid D với các tạp chất liền kề ................ 21
Bảng 3. 3: Chƣơng trình gradient 3 .................................................................................... 21
Bảng 3. 4: Chƣơng trình gradient chạy sắc ký .................................................................. 22
Bảng 3. 5: Phổ của cleisindosid D và các tạp chất liên quan........................................... 24
Bảng 3. 6: Độ tinh khiết sắc ký cleisindosid D và hàm lƣợng tổng tạp chất qua các lần
tiêm mẫu ................................................................................................................................. 25
Bảng 3. 7: Kết quả thẩm định độ phù hợp hệ thống ......................................................... 33
Bảng 3. 8: Kết quả tiêm lặp lại dung dịch cleisindosid D 0,1 ppm................................. 34
Bảng 3. 9: Quy trình pha các dung dịch trong đƣờng chuẩn ........................................... 35
Bảng 3. 10: Kết quả thẩm định độ tuyến tính .................................................................... 36
Bảng 3. 11: Kết quả thẩm định độ lặp lại ........................................................................... 38
Bảng 3. 12: Hàm lƣợng tổng tạp chất liên quan và độ tinh khiết sắc ký của cleisindosid
D .............................................................................................................................................. 39
Bảng 3. 13: Độ tinh khiết sắc ký và hàm lƣợng các tạp chất liên quan của cleisindosid
D trong quá trình bảo quản................................................................................................... 40
Bảng 3. 14: Kết quả khảo sát sự ổn định của tốc độ dòng ............................................... 41
Bảng 3. 15: Độ tinh khiết sắc ký và hàm lƣợng các tạp chất liên quan của nguyên liệu
thiết lập chất chuẩn cleisindosid D (%) .............................................................................. 41
Bảng 3. 16: Kết quả khảo sát độ ổn định về bƣớc sóng ................................................... 42


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trên thế giới, ung thƣ là nguyên nhân dẫn đến tử vong đứng thứ hai trên toàn cầu
với 8,8 triệu ngƣời chết trong năm 2015 [29]. Có nhiều hƣớng điều trị đã đƣợc sử dụng
nhƣ: hóa trị, xạ trị, can thiệp ngoại khoa,..., tuy nhiên kết quả vẫn chƣa nhƣ mong đợi.
Điều này thôi thúc các nhà khoa học luôn luôn cố gắng tìm ra các phƣơng pháp và các
loại thuốc mới, có cả nguồn gốc hóa dƣợc và dƣợc liệu, để chống lại căn bệnh này.

Tại Việt Nam, các thuốc điều trị ung thƣ cũng đang rất đƣợc quan tâm và phát
triển, đặc biệt là các thuốc có nguồn gốc từ dƣợc liệu. Năm 2009, dự án "Phòng thí
nghiệm hợp tác Pháp - Việt, nghiên cứu hóa thực vật của hệ thực vật Việt Nam" đã
đƣợc khởi động, dịch chiết ethyl acetat của hơn 2500 loài thực vật ở Việt Nam đã đƣợc
đem thử sàng lọc hoạt tính kháng tế bào ung thƣ trên dòng ung thƣ biểu mô. Một trong
những kết quả nổi bật nhất đó là dịch chiết từ quả của cây Chà chôi (Cleistanthus
tonkinensis Jabl.) đã cho phần trăm ức chế dòng tế bào ung thƣ biểu mô đạt từ 88,40 95,17%. Từ dịch chiết này, nhóm nghiên cứu đã phân lập, tinh chế và xác định cấu
trúc đƣợc 9 hợp chất tinh khiết nhóm aryltetralin lignan, trong đó có hoạt chất
cleisindosid D có cấu trúc hóa học tƣơng tự etoposid và teniposid, là hai dẫn chất của
podophyllotoxin đang đƣợc sử dụng làm thuốc điều trị ung thƣ phổi. Dựa trên các kết
quả này, nhóm tác giả quyết định nghiên cứu phân đoạn giàu cleisindosid D và các
aryltetralin lignan đƣợc chiết xuất từ quả của cây Chà chôi để phát triển thành nguyên
liệu làm thuốc điều trị ung thƣ.
Nhằm xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho phân đoạn có tác dụng hóa trị liệu ung thƣ
này, các chất chuẩn rất cần đƣợc thiết lập để tiến hành định tính và định lƣợng các hợp
chất có mặt trong cao cồn trên. Chính vì vậy, tôi tiến hành đề tài: “ Xây dựng phƣơng
pháp xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan trong nguyên li ệu thiết lập chất
chuẩn cleisindosid D đƣợc phân lập từ quả của cây Chà chôi ” với mục tiêu:
- Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp xác định tổng hàm lƣợng tạp chất liên
quan và độ tinh khiết sắc ký của cleisindosid D làm nguyên liệu thiết lập chất
chuẩn bằng HPLC/DAD.

1


Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về thực vật của cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.
Euphorbiaceae)
1.1.1. Vị trí phân loại
Cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.) đƣợc phân loại nhƣ sau: [24]

Thực vật có hoa (Angiosperms)
Thực vật hai lá mầm thật sự (Eudicots)
Nhánh Hoa hồng (Rosids)
Bộ Sơ-ri (Malpighiales)
Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)
Chi Cách hoa (Cleistanthus)
Loài Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.)
1.1.2. Họ Thầu Dầu (Euphorbiaceae)
Họ Thầu Dầu (Ba mảnh vỏ, Đại Kích) – Euphorbiaceae, là một họ lớn của thực
vật có hoa với 240 chi và khoảng 6000 loài, đƣợc chia thành 5 phân họ bao gồm 3
phân họ một lá mầm (Acalyphoideae, Crotonoideae, Euphorbioideae) và 2 phân họ hai
lá mầm (gồm Oldfieldioideae và Phyllanthoideae) [20]. Phân bố chủ yếu ở khu vực
nhiệt đới và cận nhiệt [2][3]. Cây rất đa dạng, gồm cây bụi, cây gỗ, cây cỏ hay dây leo;
thƣờng có mủ trắng hoặc trong; gốc lá có thể có 2 tuyến mật (ngoài hoa); có lá kèm
hay không; hoa đơn tính; bầu dƣới 3 ô; quả nang mở bằng 3 mảnh vỏ; hạt thƣờng có
mồng [2].
1.1.3. Chi Cách hoa (Cleistanthus)
Cleistanthus, tên Tiếng Việt là Cách hoa hoặc Cọc rào (cleisto: đóng, không mở
và anthos: hoa kết hợp thành). Là cây gỗ nhỏ hay nhỡ, lá mọc so le xếp hai dãy,
2


nguyên. Cụm hoa ở nách lá, thành xim đơn hoặc bông, nhiều hoa hoặc ít hoa; lá bắc
thƣờng ngắn hơn hoa; hoa không cuống hoặc có cuống, cùng gốc hoặc khác gốc; đài
hợp ở gốc. Hoa đực có 4 – 6 lá đài, thƣờng là 5, xếp van. Cánh hoa 5 nhỏ, thƣờng
nguyên. Đĩa mật phẳng hay lồi. Bầu không lông hoặc có lông nhung. Quả nang có 3
mảnh vỏ tròn ở lƣng; hạt hình trứng – 3 góc. [5][6]
Chi Cleistanthus gồm khoảng 140 loài mọc tự nhiên từ châu Phi, Ấn Độ đến
Australia. Ở nƣớc ta, chi Cleistanthus có 14 loài, phân bố khắp cả nƣớc, từ Hà Giang
tới Phú Quốc và một số loài đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong dân gian với nhiều mục

đích khác nhau. [4][5]
1.1.4. Loài Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.)

Hình 1. 1: Tiêu bản khô và hình ảnh hoa, quả của loài Cleistanthus tonkinensis Jabl.
1.1.4.1. Đặc điểm thực vật
Loài Cleistanthus tonkinensis Jabl. có tên Tiếng Việt là Chà chôi (hoặc Cọc rào),
thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), đƣợc miêu tả nhƣ sau:
- Cây gỗ nhỏ cao 1 - 3 m; nhánh láng, đen.
- Phiến lá tròn dài, to 7 - 13 x 2 - 5 cm, chót có mũi nhọn, đáy tròn, mỏng, cứng,
láng, gân phụ 7 - 8 cặp; cuống 1 cm, lá bẹ 2 - 3 mm.
- Chùm hoa cao 1 - 1,5 cm; hoa nhỏ, không cọng; cánh hoa 5, to 1 mm, tiểu
nhụy 5, nhụy cái lép; hoa cái không cọng, cánh hoa 2 mm, đĩa mật quanh noãn
sào có ít lông.
- Nang (quả) xoan, cao 1,3 cm, nở làm 3 mảnh; hột hoe, cao 7 mm.
3


Cây phân bố ở khu vực rừng trên đá vôi từ Cao Bằng, Lạng Sơn đến Nghệ An,
Hà Tĩnh. [5]
1.1.4.2. Thành phần hóa học
Đến nay, đã có 9 hợp chất tinh khiết nhóm aryltetralin lignan đƣợc phân lập từ
quả của cây Chà chôi trong đó có hợp chất cleisindosid D. [25]
1.1.4.3. Hoạt tính sinh học
Từ năm 2009, Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam phối hợp với Viện Hóa học các hợp chất tự nhiên (Cộng hòa Pháp) đã thu hái,
định danh khoa học và thử sàng lọc hoạt tính sinh học dịch chiết ethyl acetat của hơn
2500 loài thực vật Việt Nam, trong đó có cây Chà Chôi, về hoạt tính kháng ung thƣ
trên dòng tế bào ung thƣ biểu mô. Kết quả cho thấy dịch chiết từ cây Chà Chôi
(Cleistanthus tonkinensis Jabl.) thể hiện khả năng ức chế mạnh sự phát triển của tế bào
ung thƣ, cụ thể, nó cho phần trăm ức chế dòng tế bào ung thƣ biểu mô lên tới 88,40 95,17%. [6]

1.1.5. Các nghiên cứu về chi Cleistanthus
Đã có một số nghiên cứu về các hoạt chất nhóm lignan đƣợc chiết xuất ra từ một
số cây thuộc chi Cleistanthus, đặc biệt là các dẫn xuất của podophyllotoxin đƣợc chiết
xuất từ cây Cleistanthus boinivianus. Các chất đƣợc phân lập đã đƣợc xác định cấu
trúc, sau đó đƣợc thử nghiệm lâm sàng và cho thấy kết quả khả quan trên tế bào ung
thƣ

buồng

trứng

A2780,

trong

đó

chất

3α-O-(β-D-glucopyranosyl)

desoxypodophyllotoxin, là một trong những chất mới đƣợc phân lập, cho khả năng ức
chế tế bào A2780 mạnh nhất với trị số IC50 khoảng 33,0 ± 3,6. [18]
Ngoài ra, các hoạt chất Cleistanthins A và B đƣợc chiết xuất từ cây Cleistanthus
collinus cũng đã đƣợc đem thử nghiệm và cho thấy tác dụng làm giảm huyết áp, và tác
dụng này phụ thuộc vào liều dùng. Cả 2 hoạt chất này đều làm giảm tác dụng của
epinephrin, norepinephrin và thụ thể α-1 của dopamin. Cùng với đó, Cleistanthins B
cũng làm giảm tác dụng của acetylcholin lên huyết áp trung bình [21]. Cũng trong năm
2012, M. Pratheepa cùng các cộng sự đã công bố tìm kiếm đƣợc hoạt chất mới là
4

dioctyl phthalat có mặt trong dịch chiết aceton của cây Cleistanthus collinus. Hoạt chất
này liên kết với protein 53, là một loại protein ngăn ngừa ung thƣ, nên nó cũng đƣợc
coi nhƣ là 1 chất ngăn ngừa ung thƣ. [22]
Từ đó, các nhà khoa học tiến hành chiết xuất và tìm kiếm sự có mặt của các hoạt
chất này trong các loài thuộc chi Cleistanthus. Tuy nhiên, theo các nhà khoa học,
ngoài cây C. boinivianus, chỉ 5 trong hơn 140 loài xuất hiện nhóm các hoạt chất này,
gồm có: C. collinus, C. patulus, C. schlechteri var. schlechteri, C. gracilis and C.
indochinensis. [18]
Tại Việt Nam, dự án "Phòng thí nghiệm hợp tác Pháp - Việt, nghiên cứu hóa
thực vật của hệ thực vật Việt Nam" đã đƣợc khởi động từ năm 2009. Dịch chiết ethyl
acetat của hơn 2500 loài thực vật ở Việt Nam đã đƣợc đem thử sàng lọc hoạt tính
kháng tế bào ung thƣ trên dòng ung thƣ biểu mô và dịch chiết từ quả của cây Chà chôi
(Cleistanthus tonkinensis Jabl.) đã cho phần trăm ức chế dòng tế bào ung thƣ biểu mô
đạt từ 88,40 - 95,17%. Từ dịch chiết này, nhóm nghiên cứu đã phân lập, tinh chế và
xác định cấu trúc đƣợc 9 hợp chất tinh khiết nhóm aryltetralin lignan, trong đó có hoạt
chất cleisindosid D có cấu trúc hóa học tƣơng tự etoposid và teniposid, là hai dẫn chất
của podophyllotoxin đang đƣợc sử dụng làm thuốc điều trị ung thƣ phổi. [6]
1.2. Hợp chất cleisindosid D
Danh pháp IUPAC:
(9R)-5-(benzol[d][1,3]dioxol-5-yl)-10-methoxy-9-(((2R,3R,5S,6R)-3,4,5trihydroxy-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-2-yl)oxy)-5,8,8a,9tetrahydrofuro[3’,4’,6,7]naphtho[2,3-d][1,3]dioxol-6(5aH)-one.
Công thức phân tử: C26H28 O13
Khối lượng phân tử: 369,0 Da
Công thức cấu tạo:

5


Hình 1. 2: Công thức cấu tạo cleisindosid D

Tính chất: Tinh thể rắn, màu trắng. Tan tốt trong dicloromethan, aceton,
methanol và acetonitril, kém tan trong nƣớc.
1.3. Tổng quan về chất chuẩn
1.3.1. Khái niệm chất chuẩn
Chất đối chiếu là chất đồng nhất đã đƣợc xác định là đúng để dùng trong các
phép thử đã đƣợc quy định về hóa học, vật lý và sinh học. Trong các phép thử đó các
tính chất của chất đối chiếu đƣợc so sánh với các tính chất của chất cần thử. Chất đối
chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng. [1][14][16][28]
Chất chuẩn đƣợc dùng trong các phép thử sau:
(1) Định tính bằng phƣơng pháp quang phổ hấp thụ hồng ngoại.
(2) Định lƣợng bằng phƣơng pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến,
quang phổ huỳnh quang.
(3) Các phép thử định tính tạp chất và định lƣợng bằng phƣơng pháp sắc ký.
(4) Định lƣợng bằng phƣơng pháp vi sinh vật.
(5) Các phép chuẩn độ đo thể tích, phân tích khối lƣợng.
(6) Các phép thử sinh học.
(7) Một số phép thử khác h ycó hƣớng dẫn trong các chuyên luận riêng.
[1][13][14][17][27]
6


1.3.2. Phân loại chất chuẩn
1.3.2.1. Chất chuẩn gốc (Primary Chemical Reference Substances – PCRS)
Chất chuẩn gốc là chất chuẩn đƣợc xác định hoặc thừa nhận rộng rãi, có chất
lƣợng phù hợp với những mục đích sử dụng cụ thể, trong những hoàn cảnh cụ thể mà
không cần phải so sánh với chất hoá học khác. [8][9][13][14][27][28]
Một số chuẩn gốc nhƣ: chuẩn Quốc tế (ICRS) [27], chuẩn Dƣợc điển Mỹ
(USPRS) [26], chuẩn Dƣợc điển châu Âu (EPCRS), chất chuẩn do Viện Tiêu chuẩn và
Công nghệ Quốc gia Mỹ (NIST) thiết lập.
1.3.2.2. Chất chuẩn thứ cấp (Secondary Chemical Reference Substances – SCRS)

Chất chuẩn thứ cấp là chất chuẩn có giá trị đƣợc xác định hoặc hiệu chuẩn bằng
cách so sánh với chuẩn gốc của cùng một đại lƣợng. [13][23][27]
Một số chuẩn thứ cấp nhƣ: chuẩn ASEAN (ARS) [17], chuẩn Dƣợc điển Việt
Nam, chuẩn làm việc, ...
1.3.3. Quy trình thiết lập chất chuẩn
Theo hƣớng dẫn của WHO và ASEAN, quy trình thiết lập chất chuẩn gồm các
bƣớc cơ bản sau:
- Lựa chọn nguyên liệu
- Xây dựng quy trình
- Đánh giá nguyên liệu
- Đóng lọ/ống
- Kiểm tra độ đồng nhất của quá trình đóng gói
- Đánh giá liên phòng
- Tập hợp và xử lý số liệu, hoàn thành hồ sơ
- Phê duyệt kết quả
7


- Đóng gói, bảo quản, phân phối
- Kiểm tra định kỳ. [13][27]
Độ tinh khiết của chất chuẩn đƣợc tính theo công thức:
Purity (%) = 100 – tạp hữu cơ (%) – tạp vô cơ (%) – nƣớc (%) – dung môi tồn dƣ
(%) [8][27][28]
1.4. Tổng quan về tạp chất
1.4.1. Khái niệm và phân loại
1.4.1.1. Khái niệm
Tạp chất là bất kỳ thành phần nào đƣợc phát sinh từ quá trình tổng hợp, phân hủy
hoặc các hóa chất không mong muốn, tồn tại cùng với các hoạt chất trong dƣợc phẩm
và làm giảm độ tinh khiết của dƣợc chất. Các tạp chất có thể trơ hay có tác dụng mạnh
hoặc yếu về mặt dƣợc lý. Ngay cả khi xuất hiện trong sản phẩm với lƣợng nhỏ, các tạp

chất sẽ ảnh hƣởng trực tiếp đến chất lƣợng thuốc, đến hiệu quả và an toàn khi sử dụng
thuốc. [9][12]
Các tạp chất có thể đến từ nhiều nguồn, chẳng hạn nhƣ: các tạp chất sinh ra trong
quá trình tổng hợp (do các phản ứng tổng hợp hữu cơ rất khó xảy ra hoàn toàn nên các
sản phẩm phụ (tạp chất) luôn xuất hiện cùng với các sản phẩm chính), các tạp chất liên
quan đến quá trình chiết tách từ nguyên liệu thiên nhiên (do các hợp chất từ thiên
nhiên thƣờng rất khó để chiết, tách nhau hoàn toàn), các tạp chất liên quan tới quá
trình kết tinh, các dung môi tồn dƣ, các tạp chất liên quan đến công thức, các tạp chất
phát sinh trong quá trình bảo quản, tạp chất liên quan đến phƣơng pháp, tƣơng tác lẫn
nhau giữa các thành phần và sự phân hủy của các nhóm chức điển hình,... [9][19]
1.4.1.2. Phân loại tạp chất
Tạp chất đƣợc chia làm 3 loại chính:
- Tạp chất hữu cơ
- Tạp chất vô cơ
8


- Tạp chất bay hơi (nƣớc và dung môi tồn dƣ) [12]
a. Tạp chất hữu cơ
Các tạp chất hữu cơ có thể có sẵn trong nguyên liệu ban đầu (thƣờng là các tạp
chất đồng phân) hoặc đƣợc sinh ra trong quá trình sản xuất và quá trình bảo quản, bao
gồm các sản phẩm phụ, các sản phẩm trung gian, các chất xúc tác, các chất thử và các
sản phẩm phân hủy. [9][10][12][19]
b. Tạp chất vô cơ
Các tạp chất vô cơ có thể xuất hiện trong quá trình sản xuất, bao gồm các kim
loại nặng, muối vô cơ hoặc hỗn hợp (thuốc thử, các chất xúc tác) và các nguyên liệu
khác (từ thiết bị lọc, than hoạt,...); hoặc xuất hiện trong quá trình bảo quản (sự phân
hủy các muối của dƣợc chất với các acid vô cơ,...). [9][12]
c. Tạp chất bay hơi
Tạp chất bay hơi gồm nƣớc và các dung môi hữu cơ dễ bay hơi đƣợc sử dụng

hoặc đƣợc sinh ra trong quá trình sản xuất thuốc. Trong quá trình sản xuất mà dƣợc
chất đƣợc phân lập từ dƣợc liệu, các tạp chất bay hơi có thể xuất phát từ dung môi
đƣợc sử dụng để phân lập dƣợc chất, dung môi đƣợc sử dụng để tinh chế dƣợc chất,
dung môi do hấp phụ hoặc bắt nguồn từ quá trình bào chế. [9]
Các dung môi tồn dƣ có thể gây độc tính hoặc trơ về tác dụng dƣợc lý. Các dung
môi độc, gây ung thƣ, gây nguy hại cho môi trƣờng cần tránh hoặc sử dụng với lƣợng
phù hợp nếu cần thiết. Chính vì vậy cần phải có sự kiểm soát về lƣợng tồn dƣ dung
môi trong sản phẩm để tránh khỏi những tác động xấu tới con ngƣời và môi trƣờng.
[12]
1.4.2. Tạp chất liên quan
Các tạp chất liên quan nằm trong nhóm các tạp chất hữu cơ. Có thể là các thành
phần không tách đƣợc hoàn toàn ra khỏi hoạt chất chính khi tinh chế, hoặc có thể đƣợc
phân hủy ra từ hoạt chất chính trong quá trình sản xuất và bảo quản [12]. Việc định
danh và xác định hàm lƣợng các tạp chất liên quan có ý nghĩa vô cùng quan trọng
9


trong quy trình xây dựng chất chuẩn. Xác định các tạp chất hữu cơ chính là khía cạnh
thách thức nhất trong việc phát triển một phƣơng pháp phân tích phù hợp. [9]
1.4.2.1. Các phương pháp xác định tạp chất liên quan
Các phƣơng pháp định lƣợng tạp hữu cơ trong một số tài liệu tham khảo:
Phƣơng pháp định lƣợng

Tài liệu tham khảo
WHO pharmacopoeia library (phụ lục 1.14.4)

HPLC/DAD [30]

BP 2016 (phụ lục 5.12)

Kỹ thuật tách và phổ [8]

Dƣợc điển Châu Âu 9.0 (trang 735)

Kỹ thuật tách và phổ [14]

USP 38 (trang 621)

HPLC/DAD [26]

Guidelines for the establishment, handling, storage HPLC/DAD [13]
and use of ASEAN reference substances.
Herbal

Reference

Standards:

applications, HPLC/DAD [31]

definitions and regulatory requirements.
Reference-standard material qualification

HPLC/DAD, LC – MS [9]

A review on reference substances

LC-MS [23]

ICHQ6A

HPLC/DAD [16]

Bảng 1. 1: Các phương pháp định lượng tạp chất liên quan trong 1 số tài liệu
Bảng 1.1 cho thấy phƣơng pháp HPLC đƣợc sử dụng rất phổ biến để xác định
hàm lƣợng các tạp chất liên quan. Vì vậy, tiến hành nghiên cứu chi tiết về phƣơng
pháp định lƣợng tạp chất liên quan sử dụng HPLC với detector DAD (HPLC/DAD).
1.4.2.2. Các kỹ thuật định lượng tạp chất liên quan bằng HPLC/DAD
 Kỹ thuật 1: Chuẩn hóa diện tích
Phần trăm tạp chất liên quan đƣợc tính theo công thức:
Stạp đơn

tạp đơn =

Spic

tổng tạp =

10

Stạp
Spic

100

100


Trong đó:
% tạp đơn là hàm lƣợng phần trăm của mỗi tạp chất liên quan.

% tổng tạp là hàm lƣợng phần trăm của tổng các tạp liên quan có mặt trong
SKĐ.
Stạp đơn là diện tích pic của 1 tạp liên quan.
Stạp là tổng diện tích các pic của các tạp liên quan có mặt trong SKĐ.
Spic là tổng diện tích các pic của cleisindosid D và các tạp chất liên quan.
Đây là một trong những cách đơn giản nhất để định lƣợng tạp chất liên quan mà
không cần chuẩn tạp. Phƣơng pháp đƣợc áp dụng khi đáp ứng các tiêu chí dƣới đây:
- Khoảng nồng độ tuyến tính: hàm lƣợng các tạp chất liên quan thƣờng dƣới 1% và
hoạt chất trên 95

do đó điều quan trọng là phải có sự tuyến tính từ ngƣỡng

nồng độ các chất liên quan.
- Độ nhạy của phương pháp: Trong một số trƣờng hợp, hình dạng pic của hoạt
chất không đối xứng ở nồng độ cao dẫn đến sự mất tuyến tính. Vì thế, để duy trì
tính tuyến tính ở nồng độ của hoạt chất thì cần phải giảm nồng độ mẫu để cải
thiện hình dạng pic hoạt chất. Tuy nhiên, nếu nồng độ mẫu quá thấp sẽ không
phát hiện đƣợc đầy đủ các tạp chất liên quan. Do đó, phƣơng pháp phải đáp ứng
đƣợc độ nhạy cần thiết để có thể phát hiện đƣợc đầy đủ các pic tạp chất khi mẫu
ở nồng độ thấp.
- Hệ số đáp ứng: Các hệ số đáp ứng tƣơng đối của các chất liên quan với hoạt chất
nên gần với 1 (cho phép từ 0,8 – 1,2) [8]. Nếu không, phải xác định hệ số hiệu
chỉnh để tính toán. [11]
 Kỹ thuật 2: Kỹ thuật pha loãng dung dịch thử
Kỹ thuật này có thể khắc phục đƣợc hạn chế của kỹ thuật chuẩn hóa diện tích khi
không đáp ứng đƣợc yêu cầu về khoảng tuyến tính. Trong kỹ thuật này, mẫu đƣợc
phân tích ở cả nồng độ cao (tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp chuẩn hóa diện tích) và nồng
độ thấp. Phân tích mẫu có nồng độ cao nhằm phát hiện tất cả các pic tạp, từ đó làm
tăng độ nhạy của phƣơng pháp; còn mẫu ở nồng độ thấp để đảm bảo sự tuyến tính
trong đáp ứng của hoạt chất. Mặt khác, đáp ứng của hoạt chất trong mẫu có nồng độ

11


thấp tƣơng tự nhƣ tạp chất liên quan có trong mẫu nồng độ cao nên chỉ cần một
khoảng tuyến tính hẹp để tiến hành định lƣợng. Tuy nhiên, tổng thời gian phân tích bị
tăng lên gấp đôi và có thể mắc phải sai số do pha loãng nếu sử dụng phƣơng pháp này.
[11]
 Kỹ thuật 3: Sử dụng chất chuẩn tạp
Nồng độ các tạp chất liên quan đƣợc xác định dựa trên 1 đƣờng chuẩn đƣợc xây
dựng từ chuẩn tạp đó và đƣợc xác định bởi đáp ứng (diện tích pic của mỗi tạp) với
đƣờng cong hiệu chỉnh. Nếu đáp ứng của tạp chất liên quan và hoạt chất chính là khác
nhau thì cần phải sử dụng chất chuẩn đối chiếu của hoạt chất để hiệu chuẩn. Do đó,
cần phải tính đến hệ số hiệu chỉnh.
Có hai hình thức hiệu chuẩn là hiệu chuẩn đơn điểm và đa điểm. Hiệu chuẩn đơn
điểm áp dụng khi hệ số chắn không đáng kể, nếu không phải sử dụng hiệu chuẩn đa
điểm. Kỹ thuật sử dụng tạp chuẩn có một số lợi thế so với phƣơng pháp chuẩn hóa
diện tích.
- Giảm khoảng tuyến tính: thƣờng khoảng nồng độ của đƣờng chuẩn cũng tƣơng tự
nhƣ nồng độ các tạp chất liên quan trong mẫu (ví dụ 1 đến 5% nồng độ định danh
của hoạt chất). Do đó, phƣơng pháp này chỉ yêu cầu dải tuyến tính nhỏ.
- Cải thiện độ nhạy của phương pháp: do chỉ dùng diện tích pic của các tạp chất
liên quan để tính. Vì thế diện tích pic hoạt chất không cần cho việc tính toán nên
có thể sử dụng nồng độ mẫu cao mà không lo lắng về đáp ứng ngoài khoảng
tuyến tính của hoạt chất.
Tuy nhiên, phƣơng pháp vẫn có hạn chế nhƣ: chất chuẩn đối chiếu thƣờng đắt,
khó tìm và phải cân chính xác với lƣợng nhỏ mỗi mẫu. Vì vậy, sai số khi cân có thể
ảnh hƣởng đến độ chụm và độ đúng của phƣơng pháp. [11]

12

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu: Cleisindosid D đƣợc phân lập và tinh chế từ cao cồn khô của quả
cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl., Euphorbiaceae) đƣợc thu hái ngày
06/06/2016 tại La Bằng, Đại Từ, Thái Nguyên.
Mẫu thực vật đƣợc định danh bởi Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.1.2. Hóa chất, dung môi
- Acetonitril dùng cho HPLC (Fisher).
- Nƣớc cất hai lần.
- Acid formic, acid acetic, natri acetat đạt tiêu chuẩn hóa chất tinh khiết phân tích
dùng cho HPLC.
- Aceton, dicloromethan, ethyl acetat, methanol đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích.
- Silicagel 60, cỡ hạt 40 – 63 μm, 63 – 200 μm (Merck).
- RP – 18, cỡ hạt 140 μm (Merck).
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị
- Hệ thống máy HPLC Agilent 1200 Series (Mỹ) với cột sắc ký Inertsil ® ODS – 3
(250 mm x 4,6 mm; 5 μm – Nhật Bản) và cột Phenomenex (250 mm x 4,6 mm; 5
μm – Mỹ), sử dụng phần mềm xử lý số liệu Agilent ChemStation.
- Cân phân tích Mettler Toledo XPE105 (d = 0,01 mg; Max 120 g) (Mỹ).
- Cân kỹ thuật Sartorius TE412 (d = 0,01 g; Max 410 g) (Đức).
- Máy đo quang Shimadzu UV-1601 (Nhật Bản).
- Máy đo pH Mettler Toledo FE20 (Mỹ).
- Máy cất nƣớc hai lần Hamilton WSC/4D (Anh).
- Máy rửa siêu âm Elma Ultrasonic LC60H (Đức).
13

- Máy lắc xoáy Labinco L46 (Hà Lan).
- Bộ lọc hút chân không với màng lọc 0,45 μm.
- Tủ lạnh bảo quản mẫu.
- Dụng cụ thủy tinh:
 Bình định mức các loại: 10,00 mL (± 0,03 mL), 20,00 mL (± 0,03 mL), 50,00
mL (± 0,06 mL), 100,0 mL (± 0,1 mL) (Đức).
 Pipet định mức các loại: 1,000 mL (± 0,008 mL), 1,500 mL (± 0,010 mL),
2,000 mL (± 0,010 mL), 2,500 mL (± 0,010 mL), 3,000 mL (± 0,010 mL),
5,000 mL (± 0,015 mL) (Đức).
 Cột sắc ký thủy tinh.
- Micro pipet loại: 1000 μl (± 5 μl) (Đức).
- Xi lanh, màng lọc PTFE 0,20 μm (Việt Nam).
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát và xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp chất liên quan và
độ tinh khiết sắc ký của cleisindosid D tinh chế được bằng HPLC/DAD
- Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký.
- Xây dựng phƣơng pháp
2.2.2. Thẩm định phương pháp
- Tiến hành thẩm định các tiêu chí:
 Độ đặc hiệu.
 Độ phù hợp hệ thống.
 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng.
 Khoảng tuyến tính.
 Độ chụm (độ lặp lại và độ chụm trung gian).
 Độ ổn định của phƣơng pháp (độ ổn định thể tích tiêm, tốc độ dòng, bƣớc
sóng phát hiện và độ ổn định của dung dịch).

14

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp chất liên quan và độ tinh
khiết sắc ký của cleisindosid D đã tinh chế bằng HPLC/DAD
2.3.1.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký
Dựa trên cấu trúc phân tử và tính chất của cleisindosid D đồng thời tham khảo
hƣớng dẫn của ICH về đánh giá tạp chất trong hoạt chất làm thuốc mới [15] cùng dƣợc
điển Mĩ (USP 38) [26] và dƣợc điển Anh (BP 2016) [8] để tìm ra các điều kiện phù
hợp nhƣ:
+ Bản chất pha tĩnh
+ Thành phần pha động
+ Bƣớc sóng phát hiện
+ Tốc độ dòng pha động
+ Thể tích tiêm mẫu
2.3.1.2. Xây dựng phương pháp
Tiến hành xây dựng phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan và độ
tinh khiết sắc ký của cleisindosid D tinh chế đƣợc bằng phƣơng pháp sắc ký HPLC với
detector DAD dựa trên các điều kiện đã đƣợc khảo sát và lựa chọn.
2.3.2. Thẩm định phương pháp phân tích
Sau khi đã lựa chọn đƣợc phƣơng pháp phân tích, tiến hành thẩm định phƣơng
pháp về các mặt: độ đặc hiệu, độ phù hợp của hệ thống, giới hạn phát hiện, giới hạn
định lƣợng, độ tuyến tính, độ chụm (độ lặp lại, độ chụm trung gian) và độ ổn định của
dung dịch.
 Độ đặc hiệu:
- Độ đặc hiệu của phƣơng pháp đƣợc xác định bằng khả năng tạp chất liên quan
tách khỏi pic của cleisindosid D.
15