PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH VI KHUẨN Bifidobacterium TỪ SẢN PHẨM SỮA GAINPLUS ADVANCED IQ 3, KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN Bifidobacterium

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
*****************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH VI KHUẨN Bifidobacterium TỪ SẢN
PHẨM SỮA GAINPLUS ADVANCED IQ 3, KHẢO SÁT CÁC
YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA VI
KHUẨN Bifidobacterium

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2004 - 2008
Sinh viên thực hiện: ĐẶNG THỊ MỸ HÀ

Tháng 10/2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

**************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH VI KHUẨN Bifidobacterium TỪ SẢN
PHẨM SỮA GAINPLUS ADVANCED IQ 3, KHẢO SÁT CÁC
YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA VI
KHUẨN Bifidobacterium

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH

ĐẶNG THỊ MỸ HÀ

Tháng 10/2008


LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành gởi lời biết ơn sâu sắc của em đến thầy TS. Hoàng
Quốc Khánh, người đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện và khuyến khích em
trong thời gian qua để em hoàn thành tốt khóa luận này.
Em vô cùng biết ơn các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học và các
thầy cô khoa Sinh trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tận tình giảng
dạy, truyền thụ cho em những kiến thức quý báu trong bốn năm học qua.
Xin chân thành cảm ơn anh Nguyễn Minh Khang và các anh chị, bạn bè
trong trường Cao Đẳng Kinh Tế Công Nghệ đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên em
trong thời gian thực hiện khóa luận.
Xin cảm ơn sự động viên, sự nhiệt tình giúp đỡ của các bạn cùng lớp trong
những năm học qua.
Con vô cùng biết ơn cha mẹ đã nuôi dạy, tạo điều kiện học tập, động viên
và luôn ở bên con trong những lúc khó khăn trong suốt những năm tháng qua.

Tp Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2008
Sinh viên thực hiện
Đặng Thị Mỹ Hà

iii


TÓM TẮT
Đề tài nghiên cứu “Phân lập và xác định vi khuẩn Bifidobacterium từ sản
phẩm sữa GainPlus Advanced IQ 3, khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh
trưởng của vi khuẩn Bifidobacterium” do TS. Hoàng Quốc Khánh hướng dẫn, được
Đặng Thị Mỹ Hà thực hiện tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới và trường Cao đẳng Kinh Tế Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 3 năm 2008 đến tháng 9 năm
2008.
Thí nghiệm được tiến hành với hai nội dung chính:
1. Phân lập và xác định vi khuẩn Bifidobacterium từ sản phẩm sữa bằng:
- Thử nghiệm sinh lí và sinh hóa (nhuộm gram, quan sát hình thái, thử nghiệm
khả năng sinh acid, định tính acid lactic, khả năng lên men các nguồn carbohydrate).
- Kỹ thuật sinh học phân tử (PCR) với cặp mồi được sử dụng theo Matsuki
(2003) là: g – Bifid – F : 5’ – CTCCTGGAAACGGGTGG – 3’ và
g – Bifid – R: 5’ – GGTGTTCTTCCCGATATCTACA – 3’.
2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn
Bifidobacterium (nhiệt độ, pH, NaCl, tác nhân tạo điều kiện kỵ khí, điều kiện dao
động), nhằm kiểm tra khả năng sống sót của Bifidobacterium trong điều kiện tương
ứng trong đường tiêu hóa của người, phục vụ cho mục tiêu ứng dụng vào probiotic,
cũng như tìm ra điều kiện nuôi cấy phù hợp thu được lượng sinh khối lớn, đi vào
những thí nghiệm sâu hơn về Bifidobacterium.
Các kết quả thử nghiệm đã khẳng định:
1. Vi khuẩn phân lập thuộc giống vi khuẩn Bifidobacterium
2. Khả năng sống sót của Bifidobacterium ở điều kiện tương tự trong đường
tiêu hóa của người: 370C, pH 5 – 7,5, NaCl 0 – 7%, phù hợp với yêu cầu ứng dụng
vào các sản phẩm probiotic.

iv

SUMMARY
“Isolation and identification Bifidobacterium from dairy product GainPlus
Advanced IQ 3, investigate some factors’s effects on the Bifidobacterium’s
growth” study, instructional teacher: Dr. Hoang Quoc Khanh, was performed by Dang
Thi My Ha in the Institute of Tropical Biology and the Ho Chi Minh Technology –
Economic College, from March to Septemper 2008.
Study included two main subjects:
1. Isolation and identification Bifidobacterium from dairy product:
- Physiological, biochemical assays (Gram – staining, morphological
observations, acid proceduce ability assay, carbohydrate fermentation test).
- Molecular biology engineering (PCR) with primers (Matsuki, 2003):
g – Bifid – F: 5’ – CTCCTGGAAACGGGTGG – 3’
and g – Bifid – R: 5’ – GGTGTTCTTCCCGATATCTACA – 3’.
2. Investigations of some factors’s effects on the Bifidobacterium’s growth
(temperature, pH, NaCl, anaerobic factors, agitation) were carried out to test
Bifidobacterium’s survival ability in human gut for probiotic’s applies, also found the
optimized cultivation conditions for maximum biomass.
Studied results determined:
1. Isolated bacterium to be of Bifidobacterium
2. Bifidobacterium could survey in conditions corresponding human gut:
370C, pH 5 – 7.5, NaCl 0 – 7%, safed for probiotic’s applies.

v


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN............................................................................................................... iii
TÓM TẮT......................................................................................................................iv

SUMMARY....................................................................................................................v
MỤC LỤC .....................................................................................................................vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...........................................................................x
DANH SÁCH CÁC BẢNG ..........................................................................................xi
DANH SÁCH CÁC HÌNH.......................................................................................... xii
DANH SÁCH SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ BIỂU ĐỒ......................................................... xiii
Chương 1: MỞ ĐẦU ......................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ...............................................................................................................1
1.2. Mục đích ...........................................................................................................................1
1.3. Yêu cầu ....................................................................................................................1
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.............................................................................2
2.1. Các nghiên cứu về Bifidobacterium .......................................................................2
2.1.1. Các nghiên cứu ngoài nước .................................................................................2
2.1.2. Các nghiên cứu trong nước...................................................................................2
2.2. Tổng quan về giống Bifidobacterium ......................................................................2
2.2.1. Đặc điểm phân loại...............................................................................................2
2.2.2. Đặc điểm hình thái................................................................................................5
2.2.3. Đặc điểm sinh lý...................................................................................................5
2.2.3.1. Dạng hô hấp.......................................................................................................5
2.2.3.2. Nhiệt độ và pH...................................................................................................6
2.2.3.3. Quá trình trao đổi chất.......................................................................................7
2.2.3.4. Nhu cầu dinh dưỡng ........................................................................................10
2.2.3.5. Tính kháng kháng sinh ....................................................................................11
2.2.4. Thành phần vách tế bào .....................................................................................11
2.2.5. Đặc điểm di truyền .............................................................................................12
vi


2.2.5.1. Thành phần DNA ............................................................................................12
2.2.6. Phân bố của giống Bifidobacterium ...................................................................13

2.2.6.1. Trong cơ thể người ..........................................................................................13
2.2.6.2. Trong cơ thể động vật ....................................................................................15
2.2.6.3. Trong môi trường ...........................................................................................15
2.2.7. Ứng dụng của Bifidobacterium ..........................................................................16
2.2.7.1. Probiotic...........................................................................................................16
2.2.7.2. Giảm nguy cơ dị ứng thực phẩm .....................................................................16
2.2.7.3. Phòng bệnh tiêu chảy......................................................................................16
2.2.7.4. Tăng cường hệ thống miễn dịch ......................................................................17
2.2.7.5. Ngăn ngừa bệnh ung thư .................................................................................17
2.2.7.6. Synbiotic..........................................................................................................18
2.3. Phân lập và xác định Bifidobacterium...................................................................18
2.3.1. Sự phân lập Bifidobacterium ..............................................................................18
2.3.2. Xác định giống Bifidobacterium bằng phương pháp PCR.................................19
Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM .....................................20
3.1. Thời gian và địa điểm............................................................................................20
3.2. Vật liệu ..................................................................................................................20
3.2.1. Nguồn phân lập...................................................................................................20
3.2.2. Môi trường phân lập – nuôi cấy .........................................................................20
3.2.3. Hóa chất sử dụng ................................................................................................20
3.2.3.1. Hóa chất dùng trong phân tách DNA ..............................................................20
3.2.3.2. Hoá chất dùng trong PCR................................................................................20
3.2.3.3. Hoá chất dùng trong điện di ............................................................................21
3.2.3.4. Hóa chất dùng trong nhuộm gram ...................................................................21
3.2.3.5. Các hoá chất khác............................................................................................21
3.2.3.6. Thiết bị.............................................................................................................22
3.2.4. Phần mềm thống kê ............................................................................................22
3.3. Phân lập và xác định vi khuẩn Bifidobacterium...................................................22
3.3.1. Phân lập ..............................................................................................................22
3.3.1.1. Kỹ thuật hộp trải..............................................................................................22
3.3.1.2. Kỹ thuật hộp đổ ...............................................................................................23

vii


3.3.2. Tuyển chọn vi khuẩn kỵ khí bắt buộc ................................................................23
3.3.3. Xác định giống Bifidobacterium ........................................................................24
3.3.3.1. Xác định Bifidobacterium dựa vào hình thái...................................................24
3.3.2.2. Nhuộm gram....................................................................................................24
3.3.2.3 Khảo sát khả năng di động ...............................................................................25
3.3.2.4 Thử nghiệm hoạt tính catalase..........................................................................25
3.3.2.5. Khảo sát khả năng sinh acid ............................................................................26
3.3.2.6. Định tính acid lactic.........................................................................................26
3.3.2.7. Thử nghiệm khả năng lên men các nguồn carbohydrate.................................26
3.3.2.8. Xác định Bifidobacterium bằng phương pháp PCR ........................................27
3.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng
của vi khuẩn Bifidobacterium.......................................................................................30
3.4.1. Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào .............31
3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ........................................................31
3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện pH................................................................32
3.4.4. Kiểm tra ảnh hưởng NaCl ..................................................................................32
3.4.5. Khảo sát ảnh hưởng của các tác nhân kỵ khí lên sự sinh trưởng
của vi khuẩn Bifidobacterium.......................................................................................33
3.4.6. Khảo sát ảnh hưởng của sự dao động lên sự sinh trưởng
của vi khuẩn Bifidobacterium.......................................................................................33
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................................35
4.1. Phân lập và chọn giống..........................................................................................35
4.1.1. Phân lập giống Bifidobacterium .........................................................................35
4.1.2. Tuyển chọn vi khuẩn kỵ khí bắt buộc ................................................................36
4.2. Xác định giống Bifidobacterium ..........................................................................37
4.2.1. Định tính gram và đặc điểm hình thái tế bào .....................................................37
4.2.2. Khả năng di động của vi khuẩn khảo sát............................................................38

4.2.3. Thử nghiệm hoạt tính catalase............................................................................38
4.2.4. Khảo sát khả năng sinh acid ...............................................................................38
4.2.5. Định tính acid lactic............................................................................................39
4.2.6. Thử nghiệm khả năng lên men các nguồn carbohydrate....................................40
4.2.7. Xác định vi khuẩn Bifidobacterium bằng kỹ thuật PCR ....................................41
viii


4.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của Bifidobacterium ...........................42
4.3.1. Đường chuẩn về sự tăng trưởng của Bifidobacterium........................................42
4.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ lên sự sinh trưởng
của Bifidobacterium......................................................................................................43
4.3.3. Ảnh hưởng của điều kiện pH lên sự tăng trưởng
của vi khuẩn Bifidobacterium.......................................................................................44
4.3.4. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên sự tăng trưởng
của vi khuẩn Bifidobacterium.......................................................................................46
4.3.5. Ảnh huởng của sự dao động lên sự sinh trưởng
của vi khuẩn Bifidobacterium.......................................................................................47
4.3.6. Ảnh hưởng của yếu tố kỵ khí lên sự sinh trưởng
của vi khuẩn Bifidobacterium.......................................................................................48
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................510
5.1. Kết luận................................................................................................................510
5.2. Đề nghị ..................................................................................................................51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................54
PHỤ LỤC

ix


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

- AOAC:

Association of Analytical Communities

- bp:

base pair

- CFU:

Colony forming unit

- dNTP:

Deoxyribonucleoside triphosphate

- DNA:

Deoxyribonucleic acid

- EDTA:

Ethylene diamine tetraacetic acid

- F – 6 – PPK:

Frutose – 6 – phosphate phosphoketolase

- FDA:

Food and Drug Administration

- G + C:

Guanine + Cystidine

- MDa:

Mega Dalton

- MRS:

de Man, Rogosa and Sharpe

- NAD:

Nicotinamine adenine dinucleotide

- NADH:

Nicotinamine adenine dinucleotide hydrogenase

- NAM:

N – acetylglucosamine

- NAG:

N – acetylmuramic acid

- OD:

Optical Density

- PCR:

Polymerase Chain Reaction

- SPW:

Saltly Peptone Water

- TAE:

Tris - acetate

- TCA:

Trichloro acetic acid

- UV:

Ultra violet

- WY:

Whey

x

DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng 2.1: Phân loại khoa học của Bifidobacterium .......................................................3
Bảng 2.2: Niên đại học của phân loại Bifidobacterium..................................................4
Bảng 2.3 : Tổng hợp các vitamin bởi vi khuẩn Bifidobacterium ..................................9
Bảng 2.4: Phân bố của các loài Bifidobacterium trong đường ruột người...................14
Bảng 2.5: Các loài Bifidobacterium trong động vật.....................................................15
Bảng 3.1: Thang DNA VI ............................................................................................21
Bảng 3.2: Hỗn hợp phản ứng PCR ...............................................................................29
Bảng 3.3: Tương quan nồng độ gel và kích thước các đoạn cần phân tách .................30
Bảng 4.1: Tương quan giữa mật độ tế bào vi khuẩn và giá trị OD600 ..........................42
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của Bifidobacterium ...............43
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của điều kiện pH lên sự tăng trưởng
của vi khuẩn Bifidobacterium.......................................................................................45
Bảng 4.4: Tương quan nồng độ NaCl với mật độ tế bào
vi khuẩn Bifidobacterium .............................................................................................46
Bảng 4.5: Tương quan giữa điều kiện dao động và mật độ tế bào vi khuẩn................48
Bảng 4.6: Ảnh hưởng của yếu tố kỵ khí lên sự sinh trưởng
của vi khuẩn Bifidobacterium.......................................................................................48

xi


DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH

TRANG

Hình 2.1: Hình thái của vi khuẩn Bifidobacterium ........................................................5
Hình 4.1: Khuẩn lạc vi khuẩn khảo sát trên môi trường MRS.....................................35
Hình 4.2: Khuẩn lạc của vi khuẩn khảo sát trên môi trường MRS ..............................36
Hình 4.3: Vi khuẩn được cấy đâm sâu trong môi trường MRS Agar ..........................37
Hình 4.4: Hình thái vi khuẩn khảo sát sau khi nhuộm gram (x100) ............................37
Hình 4.5: Khả năng phân giải CaCO3 của vi khuẩn khảo sát.......................................38
Hình 4.6: Định tính acid lactic của vi khuẩn khảo sát..................................................39
Hình 4.7: Khả năng lên men các nguồn carbohydrate của vi khuẩn khảo sát..............40
Hình 4.8: Bảng điện di các DNA khuếch đại của vi khuẩn khảo sát ...........................41

xii


DANH SÁCH SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ BIỂU ĐỒ
SƠ ĐỒ

TRANG

Sơ đồ 2.1: Đồng hóa oxigen của Bifidobacterium .........................................................6
Sơ đồ 2.2: Quá trình chuyển hóa các nguồn carbohydrate
của vi khuẩn Bifidobacterium.........................................................................................7
Sơ đồ 2.3: Con đường trao đổi chất của Bifidobacterium ..............................................8
Sơ đồ 2.4: Cấu trúc peptidoglycan của Bifidobacterium bifidum ................................12
Sơ đồ 3.1: Phân lập và chọn lọc giống vi khuẩn kỵ khí ...............................................23
Sơ đồ 3.2: Nguyên tắc của phương pháp PCR .............................................................29
ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1: Đường chuẩn tuyến tính giữa giá trị OD600
và mật độ tế bào vi khuẩn.............................................................................................42

BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng
của vi khuẩn Bifidobacterium.......................................................................................43
Biểu đồ 4.2: Ảnh hưởng của pH lên sự tăng trưởng
của vi khuẩn Bifidobacterium.......................................................................................45
Biểu đồ 4.3: Tương quan nồng độ NaCl với mật độ tế bào
vi khuẩn Bifidobacterium .............................................................................................46
Biểu đồ 4.4:Tương quan điều kiện dao động và mật độ tế bào
vi khuẩn Bifidobacterium .............................................................................................48
Biểu đồ 4.5: Ảnh hưởng của yếu tố kỵ khí lên sự sinh trưởng
của vi khuẩn Bifidobacterium.......................................................................................48

xiii


Chương 1

MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Probiotic là một thuật ngữ được sử dụng phổ biến trong lĩnh vực dinh dưỡng và
sức khỏe, nó được sử dụng để chỉ những vi sinh vật sống có lợi được bổ sung vào
trong thực phẩm nhằm cải thiện tình trạng sức khỏe của con người và động vật.
Hiện nay trên thị trường có rất nhiều sản phẩm, phục vụ cho lợi ích sức khỏe
của con người. Một vài trong số đó là những sản phẩm có lợi cho hệ thống đường tiêu
hóa như sữa chua, kefir, được bổ sung những vi sinh vật có lợi chủ yếu được phân lập
từ đường ruột người: Lactobacillus, Streptococcus và Bifidobacterium, là những vi
sinh vật phổ biến trong đường tiêu hóa của người và động vật.
Bifidobacterium là một loại vi sinh vật được tìm thấy chủ yếu trong đường tiêu
hóa của trẻ sơ sinh khỏe mạnh, chúng có khả năng chống lại bệnh tiêu chảy, giúp khôi
phục lại hệ thống vi sinh vật đường ruột, có vai trò trong phòng chống ung thư. Do đó,

khả năng ứng dụng loại vi sinh vật này vào trong các chế phẩm probiotic là rất lớn.
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về giống vi khuẩn này, tuy nhiên, ở Việt Nam
do những điều kiện khách quan, những nghiên cứu về giống vi khuẩn này vẫn còn hạn
chế và ít được quan tâm, do vậy chúng tôi thực hiện khóa luận “Phân lập và xác định
vi khuẩn Bifidobacterium từ sản phẩm sữa GainPlus Advanced IQ 3, khảo sát các
yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn Bifidobacterium”, mong góp
một phần nhỏ vào những nghiên cứu hiện nay và sau này.
1.2. Mục đích
Phân lập và xác định chủng Bifidobacterium, kiểm tra khả năng sống sót và tìm
ra điều kiện nuôi cấy phù hợp nhằm thu được một lượng lớn sinh khối vi sinh vật.
1.3. Yêu cầu
Sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để xác định vi khuẩn Bifidobacterium từ
các sản phẩm sữa phân lập bằng các thử nghiệm sinh lí và sinh hóa và kỹ thuật PCR.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của Bifidobacterium
trong điều kiện tương tự điều kiện trong đường ruột người (điều kiện nhiệt độ, yếu tố
pH, nồng độ NaCl, điều kiện dao động, yếu tố kỵ khí).
1


Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Các nghiên cứu về giống Bifidobacterium
2.1.1. Các nghiên cứu ngoài nước
Năm 1899, Tisser [37] đã phân lập và miêu tả được vi khuẩn kỵ khí từ phân
trẻ sơ sinh bú sữa mẹ và ông đặt tên là Bacillus bifidus communis.
Pacher và Kneifel (1996) đã phát hiện và định lượng Bifidobacterium trong
các sản phẩm lên men sữa.
Matsuki (2003) [34] đã dựa vào trình tự 16S rDNA của giống vi khuẩn
Bifidobacterium, thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR cho việc xác định và

định danh Bifidobacterium nhanh chóng và chính xác nhất.
Năm 2005, Leathy và cộng sự đã công bố những lợi ích của Bifidobacterium
đối với sức khoẻ con người: Chữa rối loạn tiêu hoá, tiêu chảy, giảm cholesterol, tăng
cường hệ miễn dịch, chống ung thư,…
Năm 2005, Kristiina cùng cộng sự đã tiến hành tối ưu hóa qui trình sản xuất
Bifidobacterium longum dựa trên thành phần của các chất: glucose, cao nấm men
và L – Cysteine, để tìm ra điều kiện nuôi cấy tối ưu nhất.
Từ đó cho tới nay có nhiều nghiên cứu chứng minh Bifidobacterium thuộc hệ
vi sinh vật đường ruột có vai trò quan trọng đối với sức khoẻ con người.
Trong ứng dụng sản xuất, các sản phẩm có bổ sung men Bifidobacterium
ngày càng nhiều: Sản phẩm sữa Netle, sữa chua dinh dưỡng, các loại men tiêu hoá.
2.1.2. Các nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam có rất ít công trình nghiên cứu về Bifidobacterium.. Đặc biệt là
những nghiên cứu về mối quan hệ tác động của Bifidobacterium đối với vi sinh vật
đường ruột khác.
2.2 Tổng quan về giống Bifidobacterium
2.2.1. Đặc điểm phân loại
Năm 1899, tại viện Pasteur, Tisser [37] đã phát hiện và phân lập từ phân của trẻ
sơ sinh một loại vi khuẩn lạ hình Y, và bắt đầu tiến hành phân loại. Đầu thế kỉ 19, dựa
trên khía cạnh về hình thái Tisser đã đặt tên cho loại vi khuẩn này là Bacillus bifidus
2


communis. Ở Italy, cùng thời gian đó, Moro phát hiện trong cùng điều kiện một loại vi
khuẩn khác với Tisser, ông xác định nó thuộc giống Lactobacillus. Mặc dù có sự khác
nhau giữa hai loại vi khuẩn, Holland [17] đã đề nghị một tên dùng chung cho hai loại
vi khuẩn là Lactocbacillus bifidus.
Năm 1924, Orla-Jensen [27] đã đưa ra một phương pháp mới về phân loại và
xác định các loại vi sinh vật dựa vào những khía cạnh: sinh lý, nhu cầu dinh dưỡng,
các quá trình trao đổi năng lượng, quá trình chuyển hóa và các đặc tính về enzyme của

vi sinh vật. Do đó, năm 1967, De Vries và Stouthamer chứng minh ở Bifidobacterium
có sự hiện diện của enzyme frutose – 6 – phosphate phosphoketolase (F – 6 – PPK) và
không có hai enzyme aldolase và glucose – 6 – phosphatase dehydrogenase, là hai
enzyme được tìm thấy ở lactobacilli. Sau đó, họ kết luận rằng việc đưa
Bifidobacterium vào giống Lactobacillus là không đúng. Từ đó hình thành hai khuynh
hướng đối lập: Các nhà khoa học Pháp phân tách Lactobacillus và Bifidobacterium
thành hai giống riêng biệt. Các nhà khoa học Anglo – Saxon đưa Bifidobacterium vào
giống Lactobacillus.
Tiến bộ của kĩ thuật phân loại hóa học vào những thập niên 60 đã mở ra một
bước tiến mới cho ngành phân loại học dựa trên những đặc điểm sinh hóa. Việc nghiên
cứu những đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn prokaryote đã cho thấy việc phân tích
các thành phần của tế bào có thể trở thành một công cụ hữu hiệu cho việc phân loại
và xác định vi khuẩn. Năm 1965, bằng kĩ thuật di truyền phân tử, Sebald và Werner
[33, 38] đã cho thấy phần trăm guanine và cysteine (G + C%) trong DNA của vi khuẩn
Bifidobacterium khác so với Lactobacillus, Corynebacterium và Propionibacterium.
Bảng 2.1: Phân loại khoa học của Bifidobacterium [27]
Ngành

Firmicutes

Lớp

Actinobacteria

Lớp phụ

Actinobacteridae

Bộ

Bifidobacteriales

Họ

Bifidobacteriaceae

Giống

Bifidobacterium

3


Bảng 2.2: Niên đại học của phân loại Bifidobacterium [34]
Tên

Tác giả

Năm

Bacillus bifidus

Tissier

Bacteroides bifidus

Castellani và Chalmer

Lactobacillus bifidus

Bergey’s Manual

1920

Bifidobacterium bifidum

Holland

1924

Bacterium bifidum

Orla-Jensen

1927

Tisseria bifida

Lehmann và Neumann

1929

Nocardia bifida

Pribram

1931

Actinomyces bifidus

Vuillemin

1934

Actinobacterium bifidum

Nannizzi

1937

Lactobacillus acidophilus var. bifidus

Puntoni Weiss và Rettger

1938

Lactobacillus parabifidus

Weiss và Rettger

1938

Bifidobacterium bifidum

Weiss và Rettger

1938

Lactibacillus bifidus

Prevot

Cohnistreptothrix bifidus

Bergey’s Manual

1944

Corynebacterium bifidum

Negrovi và Fischer

1949

Lactobacillus bifidus

Olsen

1950

Lactobacillus bifidus var.
pennsylvanicus

Norris và cộng sự

1900
1919
1923 – 1934

1939 – 1957

1953
1957

Năm nhóm vi khuẩn bifidus

Gyorgy

1963

Bảng mô tả loài từ người

Dehnert

1963

Các loài mới từ động vật

Reuter

1969

Các loài mới từ động vật

Mitsuoka

1969

Các loài mới từ động vật

Scadovi

1972

Bảng giống Bifidobacterium tổng hợp

Holdemann và Moore

từ 11 loài

Bergey’s Manual

4

1974


2.2.2. Đặc điểm hình thái
Vi khuẩn thuộc giống Bifidobacterium có dạng phổ biến hình que, không di
động và không sinh bào tử. Chúng có màng tế bào không bình thường, dạng lõm, các
chi của chúng thường phồng lên thành dạng u, giống như phân nhánh. Tuy nhiên,
Bifidobacterium có sự biến đổi khác thường từ dạng tròn thành dạng dài hoặc ngắn,
biến thể ở mức độ rộng. Việc nhuộm gram cho thấy sự phân bổ khác thường của
chromatin, thường được tích lũy ở hai khối u. Sự đa hình này không gây ra sự thoái
hóa các dòng phát sinh từ dạng gốc.

Hình 2.1: Hình thái của vi khuẩn Bifidobacterium [40, 41, 42]
Tùy theo thành phần môi trường nuôi cấy, chúng có thể có các dạng V, Y và X.
Nhiều thành phần của môi trường có thể tác động lên hình dạng của vi khuẩn:
Nồng độ của N – acetylglucosamine liên quan đến quá trình sinh tổng hợp

peptidoglycan, ảnh hưởng đến hình dạng của B.bifidum (Glick và cộng sự, 1960) [13] .
Các loại amino acid khác nhau (alanine, aspartic acid, glutamic acid và
serine) (Husain và cộng sự, 1972) [18]
Ion Ca2+ (Kojima, 1986) [19]
Mức độ thấp của N – acetylglucosaine và amino acid, có sự phân nhánh ở mức
cao. Trái lại, trong môi trường thuận lợi, vi khuẩn có dạng dài hơn (Mayer, 1950) [23].
2.2.3. Đặc điểm sinh lý
2.2.3.1. Dạng hô hấp [34]
Bifidobacterium là vi sinh vật kỵ khí tuyệt đối. Tuy nhiên, mức độ chịu đựng
đối với oxygen còn phụ thuộc vào các dòng và môi trường nuôi cấy (De Vries, 1969).

5


Ba loại vi khuẩn tương ứng được quan sát trong quá trình chuyển đổi từ điều
kiện kỵ khí sang hiếu khí:
Tăng trưởng hiếu khí không có sự tích lũy H2O2: một dòng vi khuẩn
B.bifidum chịu được điều kiện hiếu khí, tạo ra một lượng nhỏ H2O2 bởi quá trình oxy
hóa NADH.
Tăng trưởng giới hạn với sự tích lũy H2O2: sự tích lũy hydrogen peroxide
được nhận thấy là một độc tố đối với enzyme chính trong quá trình chuyển hóa đường
của giống Bifidobacterium: Frutose – 6 – phosphate phosphoketolase (Rasic, 1983).
Tăng trưởng có sự tích lũy H2O2: một số dòng thử nghiệm cần có khả năng
oxy hóa khử thấp cho sự tăng trưởng và quá trình lên men.
Khi có mặt CO2, tính nhạy cảm với oxygen khác nhau đáng kể, phụ thuộc vào
các dòng. Một số dòng có thể phát triển trong sự hiện diện của oxy, một vài dòng âm
tính với catalase, một vài dòng dương tính với catalase, một số khác phát triển trong sự
có mặt đồng thời của catalase và hemin trong môi trường (Scardovi, 1986).
Polysaccharide
glucose

Con đường F6PPK

Acid acetic
Acid lactic

NADH

O2
O2 NADH: H2O2-oxidase

O2

H2O2

Superoxide
dismutase

NADH-peroxidase

H 2O

H2O2

Sơ đồ 2.1: Đồng hóa oxigen của Bifidobacterium [34]
2.2.3.2. Nhiệt độ và pH [30]
Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của các dòng Bifidobacterium có nguồn gốc từ
người là khoảng từ 36 – 380C. Trái lại, các dòng có nguồn gốc từ thú thì cao hơn,
khoảng 41 – 430C và thậm chí đạt đến 46,50C, sự tăng trưởng bị ức chế ở mức dưới
200C và trên 460C, chết ở 600C.

pH tăng trưởng tối ưu 6,5 – 7. Tăng trưởng bị ức chế ở điểm pH dưới 5 và trên 8.
6


2.2.3.3. Quá trình trao đổi chất
 Sự trao đổi chất đường [32]
Ở giống Bifidobacterium, hexose được phân giải hoàn toàn qua con đường
fructose – 6 – phosphate (Scardovi và Trovatelli, 1965). Fructose – 6 – phosphate
phosphoketolase được phát hiện ở Bifidobacterium trong khi đó không có mặt hai loại
enzyme Aldolase và glucose – 6 – phosphate hydrogenase. Quá trình lên men glucose
thu được hai sản phẩm acetate và lactate. Tỷ lệ các sản phẩm lên men cuối cùng khác
nhau đáng kể giữa các dòng và thậm chí giữa các dòng gần gũi. Một lượng nhỏ acid
succinic được tạo ra từ một vài dòng và một lượng nhỏ CO2 có thể được tạo ra trong
quá trình phân giải gluconate.

Sơ đồ 2.2: Quá trình chuyển hóa các nguồn carbohydrate của Bifidobacterium [39]

7


2

2 ATP
2 ADP

1

Pructose 6-P

3

Pructose 6-P
2
Pi
Acetyl-P
2 Acetyl-P

Erythrose 4P

Glyceraldehyde 3-P

3 ADP
3 ATP

8

Sedoheptulose 7-P

3 Acetate
4

2 Pi
7

Ribose 5-P
5

1+1 Xylulose 5-P 2 Glyceraldehyde 3-P
2 Pi

6

9

Ribulose 5-P

2 NAD+
2 (NADH+H+)

2 (1,3-Diphosphoglycerate)
10

2 ADP
2 ATP

2 (3-Phosphoglycerate)
11

2 (2-Phosphoglycerate)
2 H2O

Ethanol

19

18 17

Acetyl-P

8

Acetate

?

12

2 Phosphoenolpyruvate

Formate

15

13

2 ADP
2 ATP

2 Pyruvate
16

14

2 (NADH+H+)
2 NAD+

2 L(+) Lactate

1 - hexokinase and glucose-6-phosphate isomerase;
2 - fructose-6-phosphate phosphocetolase;

3 - transaldolase;
4 - transketolase;
5 - ribose-5-phosphate isomerase;
6 - ribulose-5-phosphate epimerase;
7 - xylulose-5-phosphate phosphocetolase;
8 - acetate kinase;
9 - homofermentative pathway enzymes;
10 - L(+) lactate ehydrogenase;
11 - phosphoroclastic enzyme;
12 - formate dehydrogenase;
13 - alcohol dehydrogenase.
Sơ đồ 2.3: Con đường trao đổi chất của Bifidobacterium [34]

8


 Enzyme [32]
Enzyme đặc trưng cho quá trình chuyển hóa đường của giống Bifidobacterium
là F – 6 – PPK (fructose – 6 – phosphate phosphoketolase), enzyme này đặc trưng cho
giống, nó vắng mặt ở các vi khuẩn kỵ khí khác về hình thái với Bifidobacterium như
Lactobacillus, Arthrobacter, Corynebacterium và Actinomyceteace (Scardovi, 1965).
 Các vitamin được tạo ra
Deguchi và cộng sự (1985) [10] đã nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp 6
vitamin của Bifidobacterium có nguồn gốc từ con người: thiamine (B1), riboflavin
(B2), pyridoxine (B6), forlic acid (B9), cyanocobalamine (B12) và acid nicotinic (PP).
Năm loại vitamin trên (trừ riboflavin) được tổng hợp bởi hầu hết các dòng thử nghiệm
và một lượng lớn mỗi loại vitamin (B6, B9 và B12) được tiết ra. Các tác giả cũng cho
biết rằng B.bifidum và B.infantis tạo ra đáng kể thiamine, acid forlic và acid nicotinic.
Trong khi đó, B.breve và B.longum tạo ra với số lượng nhỏ và B.aldolescentic không
sinh tổng hợp các vitamin đó.

B.longum sản xuất một lượng lớn vitamin B2 và B6.
B.breve và B.infantis tạo lượng lớn vitamin PP.
Bảng 2.3 : Tổng hợp các vitamin bởi vi khuẩn Bifidobacterium [17]
B.breve

B.infantis

B.longum

B.bifidum

B.aldolescentis

Thiamine (B1)

+

+++

+

+++

+

Riboflavin (B2)

+

+

+++

++

+

Pyridoxine (B6)

++

++

+++

+

++

Folic acid (B9)

+

+++

+

++

+

Cobalamine (B12)

+

++

+++

+

+

Ascorbic acid (C)

++

++

+++

++

+

Nicotinic acid (PP)

+++

+++

+

+++

+

Biotin (H)

++

+++

++

++

++

(+: khả năng tổng hợp vitamin của Bifidobacterium)

9


2.2.3.4. Nhu cầu về dinh dưỡng
 Nhu cầu về nitrogen
Hầu hết các dòng thuộc Bifidobacterium có thể sử dụng các muối ammonium
như nguồn nitrogen duy nhất. Tuy nhiên, B.suis, B.magnum, B.choerinum và
B.cuniculi chỉ phát triển khi có mặt nitrogen hữu cơ (Hassinen và cộng sự, 1951) [14].
Trong điều kiện invitro và không có nitrogen hữu cơ, Bifidobacterium có thể

tổng hợp một lượng lớn amino acid. Điển hình, B.bifidum tạo ra alanine, valine, acid
aspartic và trên 150 mg/l threonine (Matteuzi, 1978) [22].
Theo Hatanaka và cộng sự (1987) [15, 16], hai enzyme glutamine synthetase và
glutamate dehydrogenase của Bifidobacterium có lẽ liên quan đến quá trình tiêu hóa
các phức hợp nitrogen của vi sinh vật.
 Các nguyên tố
B.bifidum chỉ sinh trưởng trong điều kiện có Mg, Mn và một lượng lớn các iron.
Iron có thể được tiêu hóa bởi B.bifidum trong hầu hết các quá trình oxy hóa, phụ thuộc
vào tính acid của môi trường (Bezkorovainy, 1986 và Ueda, 1983).
Iron Fe2+ được sử dụng ở pH 5. Việc vận chuyển dựa vào màng ATPase và việc
hấp thu nó có thể bị ức chế cạnh tranh bởi Zn. Iron Fe3+ được sử dụng ở pH trung tính.
Các iron này liên hệ đến quá trình sản sinh acid acetic của B.bifidum qua trung gian
các ferroenzyme (Bezkorovainy, 1986) [8]
 Các vitamin [34]
Các dòng Bifido có nguồn gốc từ người cần thiamine (B1), pyridoxine (B6),
acid forlic (B9), cyanocobalamine (B12) và acid nicotinic (PP) cho sự tăng trưởng
của chúng. (Teraguchi và cộng sự, 1984).
 Các yếu tố tăng trưởng [34]
Poch và Bezkorovainy (1988) bổ sung vào môi trường cơ bản các tác nhân
tăng trưởng để xác định những yếu tố thiết yếu cho sự phát triển của các dòng
Bifidobacterium. Chỉ có B.aldolescentis và B.longum có thể phát triển được trong môi
trường không bổ sung yếu tố tăng trưởng. Còn tất cả các dòng khác yêu cầu sự
hiện diện của các yếu tố tăng trưởng.
Năm 1953, Gyorgy phát hiện ra một dòng của B.bifidum (sau này được biết là
L.bifidus), dòng này chỉ phát triển trong điều kiện có sữa người và đặc biệt có

10


N – acetylglucosamine. Loài Bifidobacterium bifidum do Tisser phát hiện cần các yếu

tố protein và không cần các loại đường N – acetylate cho sự phát triển của nó.
Trong thực tế, loài Bifidobacterium bifidum có thể chia làm hai loại: loại A hay
B.bifidum do Tisser tìm ra ở người trưởng thành và loại B. bifidum pennsylvanicus do
Gyorgy phân lập từ trẻ em. Hai dòng này có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau,
Bifidobacterium loại A không nhạy cảm đối với N – acetylglucosamine, yêu cầu các
yếu tố protein theo con đường tương tự của B.longum và B. infantis, trái lại, B. bifidum
loại B cần các nguồn đường từ sữa người với số lượng khác nhau tùy từng loại (Neut,
1981; Beerens, 1980).
Hầu hết các loài Bifidobacterium không thể phát triển trong môi trường tổng
hợp cơ bản mà cần các cơ chất sinh học phức tạp như caseine digestate bò, lactoserum
từ sữa bò, dịch nhầy dạ dày heo, cao nấm men (Poch và cộng sự, 1983).
2.2.3.5. Tính kháng kháng sinh [34]
Đặc tính kháng kháng sinh của Bifidobacterium có thể được giải thích như sau:
Bifidobacterium vẫn tồn tại trong đường ruột trong quá trình điều trị
bằng kháng sinh.
Kháng sinh từ dược phẩm hay thức ăn được bổ sung vào môi trường nuôi
cấy như là tác nhân chọn lọc cho việc phân lập Bifidobacterium.
Tính nhạy của Bifidobacterium đối với kháng sinh được kiểm tra ở nhiều thử
nghiệm nhưng rất khó đưa ra một chuẩn quốc tế bởi tính biến động của điều kiện thử
nghiệm. Tuy nhiên, chúng ta có thể chấp nhận những luận điểm sau: Bifidobacterium
kháng với lượng lớn các kháng sinh như nalidixic acid, gentamicin, kanamycin,
metronidazole, neomycin, polymycin B, và streptomycin, độ nhạy của các loài
biến thiên từ 10 – 500 (hoặc lớn hơn) mg kháng sinh/ml. Trái lại, ampicillin,
bacitracin, chloramphenycol, clindamycin, erythomycin, lincomycin, nitrofunrantoin,
oleandomycin, penicillin G và vancomycin ức chế mạnh đối với hầu hết các dòng.
Đặc biệt, độ nhạy đối với tetracycline khác nhau giữa các loài thậm chí giữa các dòng
trong cùng một loài (Matteuzi, 1983).
2.2.4. Thành phần vách tế bào [34]
Thành phần chính của thành tế bào vi khuẩn thuộc giống Bifidobacterium
(gram dương) là mucopeptide, peptidoglycan, mureine. Đây là một đại phân tử chứa

các chuỗi polysaccharide mạch thẳng liên kết với nhau bằng cầu nối tetrapeptibringen.
11


Chuỗi polysaccharide chứa N – acetylglucosamine (NAG) hoặc N – acetylmuramic
acid (NAM). Tetrapeptide liên kết với NAM qua cầu nối peptide trung gian.
Các amino acid cấu thành nên các chuỗi peptide là alanine, glutamic acid,
ornithine hoặc lysine liên kết với một hoặc hai amino acid sau: glycine, serine,
aspartic acid hoặc threonine. Các amino acid có thể giống hoặc khác nhau giữa các
dòng, thậm chí khi các amino acid giống nhau thì trình tự của chúng trong các chuỗi
tetrapeptide cũng khác nhau, có thể chứa amino acid đơn, dipeptide hoặc tripeptide.
Điển hình như B.longum có cầu nối tetrapeptide loại ornithine và chuỗi liên kết
là L – Ser – L – Alar – L – Thr – L – Alar (Rasic, 1983).

N-AcetylD-glucosamine

N-Acetylmuramic acid

N-AcetylD-glucosamine

N-Acetylmuramic acid

L-Alanine

L-Alanine

D-Glutamic acid

D-Glutamic acid

L-Omithine

L-Omithine
L-Serine

L-Serine
D-Alanine

L-Aspartic
acid

D-Alanine

Sơ đồ 2.4: Cấu trúc peptidoglycan của Bifidobacterium bifidum [34]
2.2.5. Đặc điểm di truyền
2.2.5.1. Thành phần DNA
Phần trăm Guanine và Cystidine (G + C %) của vi khuẩn thuộc giống
Bifidobacterium ở khoảng 57,2 – 64,5%.
Trong tổng số 24 loài Bifidobacterium, chỉ có 5 dòng có plasmid:
B. logum chứa 13 mô hình plasmid (1,25 – 9,5 MDa) [35, 36].
B. globosum chứa một plasmid thuộc một trong ba loại đại phân tử (13,5, 24,5
và 46 Mda).
12