NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY SƯA (Dalbergia tonkinensis Prain)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
**********

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH
CÂY SƯA (Dalbergia tonkinensis Prain)

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2004 – 2008
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ LỆ HÀ

Tháng 9/2008
1


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
**********

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH
CÂY SƯA (Dalbergia tonkinensis Prain)

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

TS. VƯONG ĐÌNH TUẤN

NGUYỄN THỊ LỆ HÀ

Tháng 9/2008

2


LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cảm tạ:
 Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
 Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền
đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường.
 TS. Vương Đình Tuấn đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực
tập tốt nghiệp.
 CN. Nguyễn Lê Huyền Thanh, CN. Nguyễn Xuân Cường, cô Vân, đã giúp đỡ tôi
rất nhiều trong quá trình thực tập tốt nghiệp.
 Anh Nam, chị Hương, các cô chú thuộc phân viện cùng các bạn bè thân yêu của
lớp CNSH K30, đã giúp đỡ và chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học
cũng như hết lòng hỗ trợ trong thời gian thực tập tốt nghiệp.
 Cuối cùng xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và thành kính tới cha mẹ, anh
chị em trong gia đình và người thân.

Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Lệ Hà

iii

TÓM TẮT
“Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống vô tính cây Sưa (Dalbergia tonkinensis
Prain )”. Đề tài được tiến hành từ tháng 3/2008 đến tháng 9/2008 tại Phân viện nghiên
cứu khoa học Lâm nghiệp Nam Bộ.
Giáo viên hướng dẫn: Ts. Vương Đình Tuấn.
Nội dung thực hiện đề tài gồm 2 nội dung:
Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống vô tính cây Sưa bằng phương pháp
giâm hom.
Nội dung 2: Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống vô tính cây Sưa bằng phương pháp in
vitro.
Sau khi tiến hành nghiên cứu thu được kết quả sau
Kết quả nghiên cứu:
-

Kết quả giâm hom đạt tốt nhất khi sử dụng IBA ở nồng độ 100 ppm với tỉ lệ ra rễ

100 %. Tuy nhiên, trong quá trình nghiên cứu chúng tôi nhận thấy nếu sử dụng chất kích
thích ra rễ là N3M. Tuy tỉ lệ ra rễ đạt 75 % nhưng có hiệu quả kinh tế cao, rẻ tiền phổ biến
trên thị trường.
-

Trong nuôi cấy in vitro mẫu khử trùng đạt kết quả tốt nhất ở vị trí 2 và 3 (tính từ

ngọn xuống mỗi vị trí gồm một đoạn thân và một chồi nách) ở nồng độ Javel 20 % trong
5 phút kết hợp với 0.1 % HgCl2 trong 15 phút. Kết quả tạo chồi đạt tốt nhất trên môi
trường MS có bổ sung 2,5 mg/l BA.
-

Để xây dựng được một quy trình nhân giống vô tính cây Sưa hoàn

chỉnh. Những nghiên cứu tiếp tục về nồng độ chất điều hòa sinh trưởng và sự phối hợp
của chúng trong điều kiện in vitro và in vivo cần được triển khai một cách hệ thống hơn.

iv


SUMMARY
Nguyen Thi Le Ha, University of Agriculture and Forestry Ho Chi Minh City,
September 2008.
Dissertation: Study on development of propagation techniques of Dalbergia
tonkinensis Prain.
Supervisor: Vuong Dinh Tuan (Phd).
The work was carry out from March to September 2008 at the Forest Science Subinstitute of South Viet Nam.
To make this dissertation, we rearch on in vitro propagation and root cutting of
Dalbergia tonkinensis Prain.
Reseaching finding:
In vivo propagation
Treating cut branches of Dalbergia tonkinensis Prain with IBA (100 ppm)
produced 100 % of root induction. However, a concentration of 2000 ppm of N3M (a
commercial rooting product) cuols help to induce 75 % of root on the cut branches.
In vitro propagation
The second and third positions of the explant showed the best survival rate after 5
min treating with 20 % commercial Javel solution and 0,1 % HgCl2 for 15 min surface
sterilization.
This preliminary study showed that bud induction was suitably obtained on the MS
medium supplemented with BA (2,5 mg/l).
Further studies should be carry out on different concentrations of growth
regulation substainces either single or in combinations to find out the optimal does for
asexual propagation of Dalbergia tonkinensis Prain.

v


MỤC LỤC
TRANG
Lời cảm tạ ...................................................................................................................... iii
Tóm tắt............................................................................................................................iv
Mục lục ...........................................................................................................................vi
Danh sách các chữ viết tắt ...............................................................................................x
Danh sách các hình và biểu đồ .......................................................................................xi
Danh sách các bảng .......................................................................................................xii
Chương 1. MỞ ĐẦU.....................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................................1
1.2. Mục đích và yêu cầu................................................................................................1
1.2.1. Mục đích ..............................................................................................................1
1.2.2. Yêu cầu ................................................................................................................1
1.2.3. Giới hạn đề tài ......................................................................................................1
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU..........................................................................2
2.1. Khái quát về cây Sưa ...............................................................................................2
2.1.1. Phân loại thực vật học ..........................................................................................2
2.1.2. Đặc điểm sinh học ................................................................................................3
2.1.3. Sinh thái học và phân bố ......................................................................................4
2.1.4. Công dụng ...........................................................................................................4
2.2. Các phương pháp nhân giống cây Sưa ....................................................................4
2.2.1. Nhân giống hữu tính ............................................................................................4
2.2.2. Nhân giống vô tính ..............................................................................................5
2.2.2.1. Nhân giống vô tính bằng phương pháp giâm hom ...........................................5
2.2.2.2. Ưu điểm của kỹ thuật giâm hom ......................................................................6
2.2.2.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến giâm hom ..........................................................6

2.2.2.4. Một số thành tựu trong nhân giống vô tính cây rừng bằng giâm hom .............6
2.2.3. Nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy in vitro ....................................6
vi


2.2.3.1. Ưu điểm của kĩ thuật nhân giống in vitro .........................................................7
2.2.3.2. Các giai đoạn nhân giống in vitro ....................................................................7
2.2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro ...............................................9
2.2.3.4. Một số thành tựu về nhân giống cây rừng trong in vitro ................................13
Chương 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................15
3.1. Thời gian và địa điểm............................................................................................15
3.2. Vật liệu .................................................................................................................15
3.3. Nội dung thực hiện ...............................................................................................15
3.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu kĩ thuật nhân giống vô tính cây Sưa bằng phương pháp
giâm hom .....................................................................................................................15
3.3.1.1. Vật liệu ...........................................................................................................16
3.3.1.2. Phương pháp ...................................................................................................16
3.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu kĩ thuật nhân giống vô tính cây Sưa bằng kĩ thuật nuôi cấy
in vitro ..........................................................................................................................17
3.3.2.1. Vật liệu ...........................................................................................................17
3.3.2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................19
3.2. Xử lý số liệu .........................................................................................................22
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................23
4.1. Nội dung 1: Nghiên cứu kĩ thuật giâm hom cây Sưa ...........................................23
4.2. Nội dung 2: Nghiên cứu kĩ thuật nuôi cấy in vitro cây Sưa .................................28
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................38
5.1. Kết luận..................................................................................................................38
5.2. Đề nghị ..................................................................................................................38
TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................................39
PHỤ LỤC

vii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BA

Benzyl adenine

HgCl2

Thủy ngân chlorite

IAA

-indole acetic acid

IBA

-indole butyric acid

NAA

-naphtalen acetic acid

IPA

Indole – 3 propionic acid

Ki

Kinetin

TDZ

Thidiazuron

BAP

6 – Benzyl amino purin

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ
HÌNH
Hình 2.1. Các bộ phận cây Sưa .....................................................................................3
Hình 2.2. Cây Sưa được trồng từ hạt .............................................................................5
Hình 3.1. Cây Sưa 5 tháng tuổi ...................................................................................15
Hình 3.2. Thuốc kích thích N3M .................................................................................17
Hình 4.1. Một số hình ảnh trong giâm hom Sưa ..........................................................28
Hình 4.2. Hình ảnh hom Sưa ra rễ ở các nghiệm thức .................................................28
Hình 4.3. Chồi Sưa in vitro sau 15 ngày .....................................................................31
Hình 4.4. Các vị trí lấy mẫu ........................................................................................31
Hình 4.5. Chồi tái sinh ở các vị trí lấy mẫu 1, 2, 3, 4 ..................................................33
Hình 4.6. Ảnh hưởng nồng độ BA lên sự nhân chồi ...................................................37
BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1. So sánh tỉ lệ ra rễ giữa các nghiệm thức .................................................25
Biểu đồ 4.2. So sánh số rễ và chiều dài rễ ở từng nghiệm thức ..................................25
Biểu đồ 4.3. So sánh hiệu quả khử trùng giữa các nghiệm thức .................................30

Biểu đồ 4.4. So sánh ảnh hưởng của chất khử trùng lên từng vị trí mẫu ....................32
Biểu đồ 4.5. So sánh ảnh hưởng nồng độ BA lên nhân chồi .......................................34
Biểu đồ 4.6. So sánh ảnh hưởng BA lên chiều cao chồi .............................................35

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Các nghiệm thức thí nghiệm về chất kích thích ra rễ và nồng độ được sử
dụng trong thí nghiệm giâm hom cây Sưa ...................................................................16
Bảng 3.2. Thành phần môi trường MS ........................................................................18
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng và thời gian khử mẫu đến tỉ lệ sống
của mẫu cây Sưa ..........................................................................................................20
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng đến khả năng nảy chồi của từng vị trí
lấy mẫu .........................................................................................................................21
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tạo cụm chồi in vitro cây Sưa .21
Bảng 4.1. Tác động của các chất kích thích ra rễ đến việc tạo rễ của cây Sưa ...........23
Bảng 4.2. Tỉ lệ ra rễ của hom Sưa ở các thời gian khác nhau .....................................24
Bảng 4.3. Số rễ và chiều dài rễ của từng nghiệm thức ................................................24
Bảng 4.4. Kết quả khảo sát hiệu quả vô trùng mẫu cấy sau 21 ngày ...........................29
Bảng 4.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chất khử trùng đến sức nảy chồi của từng vị
trí mẫu lấy ....................................................................................................................32
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự tạo chồi của cây Sưa ..........................34

x


Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Cây Sưa có tên khoa học là Dalbergia tonkinensis Prain, hay còn gọi là huê mộc
vàng, huỳnh đàn, trắc thối. Sưa là loại cây thân gỗ lâu năm có giá trị kinh tế cao. Ở Việt
Nam hiện nay giá gỗ Sưa khoảng 500 triệu đồng/m3 gỗ (Cây Sưa – Nông nghiệp số 120,
2006). Do gỗ Sưa có giá trị cao như vậy nên cây bị khai thác một cách bừa bãi đến mức bị
cạn kiệt và có nguy cơ tiệt chủng. Việc thu nhận hạt sưa phải tốn nhiều thời gian. Mặt
khác, hạt Sưa lại rất mau mất sức nảy mầm sau thu hoạch. Nên lượng cây giống cần thiết
cho trồng rừng thường không đảm bảo về số lượng và chất lượng. Để góp phần cung cấp
cây giống Sưa một cách chủ động cho sản xuất, phục hồi loài cây gỗ quý này. Việc tìm
được kỹ thuật nhân và sản xuất cây giống chất lượng là hết sức cần thiết. Nhằm góp
phần giải quyết những khó khăn về nguồn cây giống chất lượng, đề tài “
Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống vô tính cây Sưa (Dalbergia tonkinensis
Prain)” được tiến hành.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
1.2.1. Mục đích
Bước đầu xác định kỹ thuật nhân giống vô tính cây Sưa hiệu quả nhất.
1.2.2. Yêu cầu
 Xác định được chất kích thích ra rễ và nồng độ tốt nhất cho việc ra rễ đạt tỉ lệ
cao.
 Cây tạo được phải khỏe, phát triển hoàn chỉnh để đem trồng.
 Cây Sưa tạo được có giá thành thấp.
1.2.3. Giới hạn đề tài
Do thời gian có hạn nên thí nghiệm tìm môi trường thích hợp cho việc tạo rễ cây
Sưa chưa thực hiện được.

1


Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Khái quát về cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain)
2.1.1. Phân loại thực vật học
Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Fabales
Họ: Fabaceae
Chi: Dalbergia
Loài: Dalbergia tonkinensis
Chi cẩm lai hay chi trắc (Dalbergia) là một chi lớn của các loài cây thân gỗ có kích
thước từ nhỏ đến trung bình thuộc họ đậu (Fabaceae). Chi này phân bố rộng khắp, có
nguồn gốc từ khu vực nhiệt đới của Trung và Nam mỹ, Châu Phi, Madagascar và miền
nam Châu Á. Số lượng loài trong chi này còn nhiều mâu thuẫn, với các nguồn khác nhau
liệt kê các con số trong phạm vi 100 - 600 loài. Một số loài trong chi này như:
Dalbergia annamensis (trắc trung, trắc dây), Dalbergia balansea (cọ khẹt trắng,
hoàng đàn Lĩnh Nam), Dalbergia bariaensis (cẩm lai Bà Rịa), Dalbergia brownei,
Dalbergia cambodiana (trắc Cam bốt), Dalbergia conchinchinensis (trắc Nam Bộ, cẩm
lai Nam Bộ, hồng đàn Xiêm), Dalbergia dongnaiensis (cẩm lai Đồng Nai), Dalbergia
ecastaphyllum, Dalbergia decipularis (hoàng dương Brasil), Dalbergia hupeana (cọ khẹt,
hoàng đàn), Dalbergia latifolia (Hồng sắc Ấn Độ, sonokeling), Dalbergia melanoxylon
(trắc đen Châu Phi), Dalbergia monetaria, Dalbergia nigra (Hồng sắc Brasil, Ja caran
đá), Dalbergia obtusìfolia (hoàng đàn lá nhụt), Dalbergia oliverrii (cẩm lai), Dalbergia
odorifera (Giáng hương), Dalbergia rimosa (cọ khẹt leo), Dalbergia retusa (cocobolo),
Dalbergia sissoo (hồng sắc Ấn Độ, sheesham, sissoo), Dalbergia stevensonii ( hồng sắc
Honduras). ()

2

2.1.2. Đặc điểm sinh học
Sưa là cây gỗ nhỡ, lá thường xanh có thể cao tới 10 - 15 m, sinh trưởng trung bình,
thân màu vàng nâu hay xám, nứt dọc. Lá dài 9 - 20 cm; cuống không lông; lá kèm sớm
rụng, nhỏ, có lông nhỏ mịn và thưa, màu nâu vàng. Các cuống nhỏ không lông; số lá chét
5 - 9, với lá chét tận cùng thường là to nhất, hình trứng hay hơi thuôn dài, nhẵn, chất da,
có lông mịn lơ thơ khi non, nhanh chóng chuyển thành không lông, gốc lá chét tròn,
nhọn mũi.

Cây Sưa

Lá và hạt Sưa

Hoa Sưa

Hình 2.1. Các bộ phận cây Sưa
(Nguồn: )

Hoa tự dạng chùy, mọc ở nách lá, khoảng 5 - 15 cm. Hoa trắng có đài hợp, thơm.
Quả dạng quả đậu hình trứng thuôn dài, dài 5 - 6 cm, rộng khoảng 1 cm và chứa 1 - 2 hạt
dạng bầu dục, đường kính khoảng 9 mm. Quả khi chín không tự nứt. Cành non màu xanh
có đốm bì khổng màu trắng. Hoa ra tháng 4 - 7. Quả chín thu hoạch tháng 11 - 12.

3


2.1.3. Sinh thái học và phân bố
Là cây ưa sáng, ưa đất sâu, dày, ít dốc, phân bố ở độ cao dưới 500 m.
Phân bố ở Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Giang, Phú Thọ, Hà Tây, Hòa Bình, Ninh
Bình, Nghệ An, Khánh Hòa, Đồng Nai. Được trồng ở một số thành phố: Hà Nội (Vườn
Bách Thảo, Nghĩa Đô), Hải Phòng. Còn có ở Trung Quốc (Hải Nam) (Nguyễn Ngọc Bách

và Nguyễn Văn Trung, 2006).
2.1.4. Công dụng
Gỗ thớ mịn, cứng, thơm, không bị mối mọt, dùng trong xây dựng, đóng đồ mộc
cao cấp, làm hàng mỹ nghệ và đồ tiện khắc. có thể trồng cây bóng mát và làm cảnh, vì tán
lá đẹp và hoa thơm
Theo Đỗ Tất Lợi, gỗ cây này còn được sử dụng cùng với dạ dày nhím làm vị chính
trong đơn thuốc chữa bệnh đau dạ dày. Hiện tại ở trung Quốc người ta chiết suất một số
chất có trong gỗ Sưa này để chế thuốc chữa ung thư dạ dày.
2.2. Các phương pháp nhân giống cây Sưa
Hiện nay, chưa tìm thấy kết quả nào được công bố về nhân giống Sưa ở trong
nước. Nhưng thực tế trong sản xuất, người dân đang sử dụng hạt Sưa để nhân giống.
Hiện có 2 phương pháp nhân giống phổ biến là: nhân giống vô tính và nhân giống
hữu tính.
2.2.1. Nhân giống hữu tính
Nhân giống hữu tính là sử dụng hạt Sưa trưởng thành, ngâm ủ rồi gieo ươm thành
cây con rồi đem trồng.
Kĩ thuật này đơn giản, dễ áp dụng. Tuy nhiên chất lượng cây con không đồng nhất.
Mặt khác, hạt Sưa mất sức nẩy mầm nhanh nên ảnh hưởng đến số lượng cây con cần thiết
cho một đơn vị diện tích.

4


Hình 2.2. Cây Sưa được trồng từ hạt
(Nguồn: baodaidoanket_net-ddk-images-Image-2007-all-cay%20sua1_jpg.htm )

2.2.2. Nhân giống vô tính
2.2.2.1. Nhân giống vô tính bằng phương pháp giâm hom
Nhân giống vô tính được tiến hành bằng các kĩ thuật như:
 Chiết cành: một đoạn thân được tách lớp biểu bì và được bó lại bằng vật liệu có

cơ cấu xốp nhằm duy trì độ ẩm, sau một thời gian chỗ được tách lớp biểu bì ra
rễ, cắt tách rời với thân chính hay nhánh được một cây hoàn chỉnh, gọi là cây
chiết cành.
 Ghép hay tháp cành: phần dưới là thân của một giống, phần trên có thê cùng
giống hay khác giống. Phần trên là một đoạn thân, nhánh hay mắt mầm. Gốc
ghép thường mang đặc tính chống chịu.
 Giâm cành (Giâm hom): giâm cành thường là một đoạn thân, nhánh và không
có chồi lá được xử lý với hóa chất kích thích tạo rễ để tạo cây hoàn chỉnh rồi
đem trồng (Trần Văn Minh, 2005).
Đối với cây rừng phương pháp nhân giống chủ yếu là giâm hom và
nuôi cấy in vitro.

5


2.2.2.2. Ưu điểm của kỹ thuật giâm hom
Giâm hom là một phương pháp dễ dàng thực hiện, ít tốn kém đầu tư, dễ dàng mở
rộng và chuyển giao cộng nghệ cho các cơ sở sản xuất. Các phương pháp chủ yếu là từ
cành hoặc chồi được cắt thành từng đoạn dài 10 – 15 cm, nhúng vào hóa chất kích thích
tạo rễ rồi cắm vào giá thể (bằng cát hay trong túi bầu). Phòng cấy hom được phun mù để
giữ ẩm cho hom không bị khô để tạo rễ.
2.2.2.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến giâm hom
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến kết quả của việc giâm hom, nhưng phụ thuộc bởi
hai yếu tố chính là: tác nhân bên trong (kiểu gen, giai đoạn sinh trưởng) và tác nhân bên
ngoài (môi trường, kích thích tố, giá thể).
2.2.2.4. Một số thành tựu trong nhân giống vô tính cây rừng bằng giâm hom
Trên thực tế, người ta đã giâm hom thành công trên một số giống cây rừng: cây Pơ
mu (Fokienia hodgissi), được giâm hom thành công ở những cá thể từ 2 - 8 tuổi, bằng
cành của cây trưởng thành hoặc đã qua tạo chồi. Hom ra rễ đạt tỉ lệ 80 - 90 % khi xử lý
bằng NAA 1,5 % với giá thể bằng cát hay trực tiếp trong túi bầu. Cây Bách xanh

(Calocedrus macrolepis), giâm hom thành công ở những cá thể từ 2 - 10 tuổi. Hom ra rễ
đạt 85 - 95 % khi xử lý bằng IBA 1% trên cát hay trên túi bầu. Cây hồng tùng
(Dacrydium elatum), được giâm hom thành công ở các giai đoạn độ tuổi khác nhau. Hom
ra rễ đạt 80 - 85 % khi xử lý bằng IBA 1,5 % trên giá thể bằng cát. Cây Bạch tùng
(Podocarpus imbricatus), giâm hom ở các độ tuổi khác nhau, nhưng ở giai đoạn từ 2 - 8
tuổi thì thời gian ra rễ nhanh hơn. Hom ra rễ đạt tỉ lệ 80 - 85 % trên giá thể bằng cát (Trần
Văn Tiến, 2006)
Cây Dalbergia sissoo Roxb., thuộc chi Dalbergia đã được giâm hom thành công ở
giai đoạn 1 tuổi với tỉ lệ thành công 59,9 – 80,5 %, khi xử lý IBA ở nồng độ 500 ppm
(Sunil Puri và Swamy, 1999). Với sự thành công của việc giâm hom của một số cây rừng
nói trên, hy vọng lớn cho việc nhân giống vô tính cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain)
sẽ thành công.

6


2.2.3. Nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy in vitro
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một kĩ thuật nhân giống mà kết quả của nó là tạo ra
hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian
đưa một giống mới vào sản xuất. Cho đến nay nuôi cấy mô được coi là phương pháp
nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan hiệu quả nhất.
Trong công tác giống cây trồng, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được phát
triển những cơ sở lý thuyết về tế bào học và cơ sở sinh lý thực vật học.
2.2.3.1. Ưu điểm của kĩ thuật nhân giống in vitro
Nuôi cấy mô tạo ra nhiều cây con đồng nhất và giống như cây mẹ về mặt di truyền.
Đối với các cây trồng thuộc nhóm thụ phấn chéo như phần lớn các cây ăn trái, cây con
sinh ra từ hạt không hoàn toàn đồng nhất, trong trường hợp này thì nhân giống vô tính có
ưu điểm hơn nhân giống từ hạt (Bùi Bá Bổng, 1995).
Theo Nguyễn Văn Uyển (1996), kĩ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh cây hoàn
chỉnh từ mô, thậm chí là từ một tế bào nuôi cấy tách rời; loại trừ vius bằng nuôi cấy đỉnh

sinh trưởng, tạo các dòng vô tính cây sạch bệnh ở các cây nhân giống vô tính: dùng chồi
nách các thể chồi protocom vào nhân giống vô tính với tốc độ nhanh phục tráng giống cây
trồng phục vụ sản xuất; bảo quản các nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm, tạo các
cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn. Hấp thụ DNA ngoại lai vào tế bào nhờ
công nghệ gen. Tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài với nhiệt độ thấp mà
không làm mất tính toàn thể của tế bào.
2.2.3.2. Các giai đoạn nhân giống in vitro
Theo Trần Thị Dung (2005), sự thành công của việc nhân giống in vitro chỉ đạt
được khi trải qua các giai đoạn:
Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy
Đây là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống in vitro.

7


Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùng để đưa vào
nuôi cấy in vitro.
Loại mẫu khác nhau yêu cầu hóa chất và kỹ thuật xử lý khác nhau.
Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy
Mục đích của các giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô nuôi
cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin,
cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, bên cạnh điều kiện đó
cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy. Thường mô non, chưa phân hoá có khả
năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành. Người ta còn nhận thấy rằng mẫu nuôi cấy
trong thời gian sinh trưởng nhanh của cây cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi.
Giai đoạn 3: Nhân nhanh
Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình. Để tăng hệ số nhân, ta
thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hoà sinh trưởng
(Auxin, Cytokynin, Gibberellin…), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm
men,… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Tuỳ thuộc vào từng đối tượng

nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành qua các cụm chồi
(nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của các chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông
qua việc tạo cây từ phôi vô tính.
Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở giai
đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Thường 2 – 3 tuần, từ những chồi riêng lẽ này sẽ xuất hiện
rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này người ta thường bổ sung vào môi trường
nuôi cấy các auxin là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô
nuôi cấy.

8


Giai đoạn 5: Đưa cây ra đất
Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của quá trình
nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn
sản xuất.
Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống
hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh (nhiệt dộ, ánh sáng, ẩm
độ, giá thể,…) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng
như ruộng sản xuất.
Đồng thời việc nuôi cấy mô tế bào cũng tạo những cơ sở cho quá trình nghiên cứu
di truyền thực vật, vai trò chất điều hoà sinh trưởng thực vật.
Thành công của việc nuôi cấy mô phụ thuộc vào nhiều yếu tố: mô nuôi cấy, chất
kích thích sinh trưởng, tỉ lệ chất kích thích sinh trưởng, môi trường nuôi cấy, điều kiện
nhiệt độ, pH….
2.2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro
 Mẫu nuôi cấy
Murashige (1974) ghi nhận sự quan trọng của chọn lựa mẫu cấy thích hợp và chỉ
cho thấy hầu hết những cơ quan có thể dùng để nuôi cấy mô. Điều quan trọng cho thấy

một số nhân tố khi chọn lọc mẫu bao gồm kiểu gen, cơ quan được chọn lọc, tuổi sinh lý,
mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khoẻ của mẫu và nguồn mẫu.
 Kiểu gen
Kiểu gen ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy. Với loài thuốc lá được sử dụng
như cây kiểu mẫu, Cheng và Smith (1973) ghi nhận sự khác nhau giữa các genom qua
nuôi cấy sinh trưởng mô lõi. Hơn nữa, Jaramillo và Summers (1990) ghi nhận kiểu di
truyền ảnh hưởng đến số lượng và đường kính mô sẹo qua nuôi cấy hạt phấn cà chua
Lycopersycon esculentum Mill.

9


 Chọn cơ quan
Murashige (1974), cho rằng hầu hết các loại cơ quan và mô đều có khả năng sử
dụng nuôi cấy in vitro. Ông cho rằng mẫu nuôi cấy khác nhau ở các loài khác nhau, như ở
Petunia dùng chồi đỉnh để nuôi cấy. Doerschung và Miller (1976) cho rằng chồi mầm
thích hợp làm mẫu nuôi cấy ở các cây nẩy mầm từ hạt.
 Tuổi và sinh lý
Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm của mẫu nuôi cấy cho thấy
có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hoá tế bào và tuổi sinh lý. Có nhiều nghiên cứu khác
nhau về ảnh hưởng của tuổi sinh lý mẫu nuôi cấy, theo Pierik (1970) ghi nhận rễ phát sinh
trên lá non và không phát sinh trên lá già.
 Mẫu in vitro
Trong những năm gần đây, nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu in vitro có khả
năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên đồng ruộng hay trong vườn ươm như ở cây
Azalea (Economou và Read, 1986). Tuy nhiên, Lu và cộng sự (1991) ghi nhận nuôi cấy
túi phấn đạt tỷ lệ thành công cao khi nuôi cấy túi phấn trên cây đồng ruộng.
 Sức sống của mẫu
Mẫu cây mẹ có ảnh hưởng rất quan trọng đến nuôi cấy in vitro. Morel (1952, 1955)
đã nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để loại virus, sản xuất cây sạch bệnh.

 Điều kiện nuôi cấy
 Nhiệt độ
Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy mô là 23 – 27oC. Theo Murashige (1974), nhiệt độ
ảnh hưởng sâu sắc đến sinh trưởng và phát triển cây in vitro qua những tiến trình sinh lý
như hô hấp hay hình thành tế bào hay cơ quan.

10


 Cường độ ánh sáng
Cường độ ánh sáng là một nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng đến khả
năng nuôi cấy in vitro cây có lá xanh. Ảnh hưởng của ánh sáng hình như có liên hệ với
các loài, có loài chịu ánh sáng cao, ánh sáng trung bình và ánh sáng thấp hay tối
(Papachatzi và cộng sự, 1981; Miller và Murashige, 1976; Thorpe và Murashige, 1970).
Việc nuôi cấy in vitro tốt nhất trong điều kiện ánh sáng 1000 lux.
 Quang kỳ và chất lượng ánh sáng
Thời gian chiếu sáng ảnh hưởng sâu sắc đến những đáp ứng sinh lý ở cây trồng.
Chất lượng ánh sáng ảnh hưởng trực tiếp đến cây in vitro, vì ánh sáng cao hơn ánh
sáng đỏ hay ánh sáng đỏ có ảnh hưởng đến những biến đổi sinh lý trên cây như ra hoa,
chế độ dinh dưỡng và những hiện tượng khác như tăng sinh chồi in vitro.
Thành phần chất khí trong bình nuôi cấy có ảnh hưởng đến sinh trưởng cây in
vitro. O2, CO2 và ethylen là những thành phần chất khí được khảo sát nhiều trong môi
trường nuôi cấy. Ẩm độ cũng được quan tâm đến, do ảnh hưởng đến quá trình làm khô
mẫu nuôi cấy.
 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp trong nuôi cấy mô là rất cần thiết. Vì mỗi
loại cây trồng khác nhau đều yêu cầu một hàm lượng dinh dưỡng khác nhau. Mặt khác,
môi trường còn thay đổi tuỳ thuộc vào sự phân hoá của mô cấy, tuỳ theo trường hợp duy
trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hay tái sinh cây hoàn chỉnh.
Việc lựa chọn môi trường cần dựa vào tài liệu đã cho cùng đối tượng nuôi cấy

hoặc thăm dò qua một số môi trường đã cho để xác định môi trường thích hợp cho mẫu
nuôi cấy.
Các môi trường đều được thành lập từ một số thành phần chính với nguyên tắc có
sự cân bằng các yếu tố trong môi trường.
Các thành phần chính:
Đường làm nguồn carbon.
Các muối khoáng đa lượng, vi lượng.

11


Các vitamin.
Các chất điều hòa sinh trưởng.
Ngoài ra các tác giả còn cho thêm một số chất hữu cơ như: Nước dừa, nước chiết
nấm men.
 Chất điều hoà sinh trưởng thực vật
Chất điều hoà sinh trưởng là những chất với liều lượng thấp nhưng có hiệu ứng
sinh học cao, được tổng hợp tại một cơ quan và gây ảnh hưởng điều tiết đến các quá trình
sinh lý, trao đổi chất trong những cơ quan khác. Chất điều hoà sinh trưởng là sản phẩm
trao đổi chất bình thường của cơ thể thực vật. Nó đóng vai trò chủ đạo trong quá trình
sinh trưởng, phát triển và những quá trình sinh lý, hoá sinh khác cũng như trong phản
ứng thích nghi của thực vật đối với điều kiện của môi trường (Trần Văn
Minh, 2005).
 Auxin
Tác dụng sinh lý của auxin chủ yếu làm tăng thể tích của tế bào, kích thích sự hình
thành rễ, kìm hãm sự sinh trưởng của chồi bên, kìm hãm sự rụng hoa, rụng quả. Auxin
hoạt hoá các hợp chất cao phân tử (protein, cellulose, pectin) và ngăn cản sự phân giải
chúng. Auxin được xem là hormone thực vật quan trọng nhất vì chúng có vai trò rất cơ
bản trong quá trình phối hợp sinh trưởng và biệt hoá tế bào cần thiết cho sự phát triển
bình thường của thực vật. Auxin cùng với một số chất điều chỉnh khác đảm bảo cho sự

tạo thành khối các tế bào đang phân chia thành cơ thể thực vật hoàn chỉnh.
 Cytokinin
Bao gồm các nhóm chất: BAP, Ki, TDZ.
Cytokinin có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của tế bào cấy mô và làm tăng tốc
độ phân bào. Khi ở nồng độ cao, nó có tác dụng kích thích sự tạo chồi, đồng thời ức chế
sự phân hoá rễ của mô cấy.

12


Cytokinin có hiệu quả rất rõ trên sự phân chia của tế bào, trong quá trình này
cytokinin cần thiết nhưng chúng không có hiệu quả nếu vắng mặt auxin. Trong một tỷ lệ
giữa cytokinin và auxin thì có kích thích tạo chồi hay tạo rễ, thông thường cytokynin cao
hơn auxin thì kích thích tạo chồi. Và ngược lại, auxin cao hơn cytokinin thì kích thích sự
tạo rễ.
Trong cơ thể thực vật cytokinin có tác dụng rất lớn là tăng cường sự tổng hợp
DNA và protein, kích thích quá trình trao đổi chất.
 Ảnh hưởng của pH và Agar
pH của môi trường nuôi cấy thường ở khoảng 5,8 – 6. Nếu pH môi trường thấp hơn
4,5 hoặc cao hơn 7 đều ức chế sự phát triển của mô (Trần Văn Minh, 2005).
Agar xuất phát từ rong biển, được sử dụng như là chất keo trong hầu hết môi trường
dinh dưỡng. Agar là polysaccharide, trọng lượng phân tử cao có khả năng làm đông môi
trường. Agar hoà tan hình thành chất keo kết dính với nước và hấp thụ hoá chất. Nồng độ
agar thường sử dụng trong nuôi cấy mô là 0,6 – 0,8 %.
2.2.3.4. Một số thành tựu về nhân giống cây rừng trong in vitro
Tuy còn non trẻ nhưng ngành nuôi cấy mô của nước ta cũng đã thu được nhiều
thành tựu đáng kể: nước ta có một số cơ sở nghiên cứu về cây rừng, Viện lâm nghiệp,
nhiều Trường Đại học Nông Nghiệp và khoa học cũng đã xây dựng các phòng nuôi cấy
mô. Từ năm 2001 đến nay, Sở Khoa học – Công nghệ tỉnh Lạng Sơn, mỗi năm cung cấp
hàng vạn cây giống bạch đàn Europhylla được công nhận là giống thuần chủng quốc gia

(T14) để các lâm trường trong tỉnh phát triển trồng rừng, như Lâm Trường Hữu Lũng I,
II, Lâm Trường Cao Lộc ….Sau một thời gian ngắn triển khai việc trồng thí nghiệm giống
cây bạch đàn mới đã đem lại hiệu quả kinh tế cao ().
Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam
đã chọn tạo được một số giống cây rừng có chất lượng cao như một số dòng keo lai tự
nhiên, bạch đàn lai nhân tạo, lát hoa, phi lao… có khả năng gây trồng trên diện rộng và
sinh trưởng tốt. Đến nay, Trung tâm đã tiến hành nhân giống thành công cho khoảng 120

13


dòng ưu trội thuộc 8 loài cây trông rừng chủ yếu đã được chọn lọc qua khảo nghiệm và
một số loài cây bản địa có giá trị kinh tế cao ().
Khoa lâm nghiệp trường Đại học Nông Lâm TP. HCM, cũng đã có nhiều thành tựu
về nuôi cấy mô cây rừng như: nuôi cấy mô một loài cây bạch đàn (E. camaldulensis), cây
thông caribê (Pinus caribaea), cây giá tỵ (Tectona grandis Linn F.), cây thông ba lá
(Pinus kharya Royle), cây thông đỏ, cây trầm hương, cây mây nếp,... song kết quả còn
chủ yếu dừng lại ở giai đoạn ống nghiệm.
Pradhan và cộng sự (1998), đã nghiên cứu hiệu quả của việc tái sinh cây Dalbergia
latifolia Roxb., bằng hệ thống nuôi cấy tế bào huyền phù tạo mô sẹo. Mô sẹo được hình
thành từ trụ dưới lá mầm, từ hạt cây 1 tuần tuổi. Hiệu quả sự hình thành mô sẹo được cho
là cao nhất là trên môi trường MS có bổ sung 10,8 M NAA, 2,2 M BA và 10 % nước
dừa. Sau đó mô sẹo được chuyển qua môi trường tạo chồi là MS có bổ sung 2,7 M NAA
và 13,3 M BA. Chồi non hình thành được nuôi và tạo rễ trong môi trường ½ MS có bổ
sung 5,7 M IAA, 4,9 M IBA và 5,3 M IPA cho đến khi phát triển thành cây hoàn
chỉnh để đưa ra vườn ươm.
Năm 2002, Singh và cộng sự, đã nghiên cứu quy trình nhân giống cây Dalbergia
sissoo Roxb., từ lá mầm chưa trưởng thành và lá mầm trưởng thành. Sự tạo thành chồi
non bất định được cho là hiệu quả nhất từ lá mầm chưa trưởng thành là trên môi trường
MS có bổ sung 4,44 M BA và 0,26 M NAA. Sau đó chồi non được chuyển qua môi

trường kéo dài chồi ½ MS có bổ sung 4,44 M BA và 0,26 M NAA. Còn đối với lá
mầm trưởng thành thì chồi non được hình thành trên môi trường MS chỉ chứa BA với
nồng độ 22,2 M BA mà không cần NAA. Và trước khi nuôi cấy phải nuôi cấy trên môi
trường MS lỏng có bổ sung 8,88 M BA trong 48 giờ. Chồi non hình thành từ là mầm
trưởng thành và bán trưởng thành được nuôi và tạo rễ trong môi trường ½ MS có bổ sung
1,23 M IBA cho đến khi phát triển thành cây hoàn chỉnh để đưa ra vườn.
Riêng đối với cây Sưa, hiện chưa tìm được tài liệu nào công bố về kết quả nhân
giống trong điều kiện in vitro cũng như giâm hom.

14


Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1. Thời gian và địa điểm
Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 3/2008 đến tháng 9/2008 tại Phân viện nghiên
cứu khoa học lâm nghiệp Nam Bộ.
3.2. Vật liệu
Cây Sưa 5 tháng tuổi có tại vườn ươm Phân Viện khoa học nghiên cứu Nam Bộ.

Hình 3.1. Cây Sưa 5 tháng tuổi
3.3. Nội dung thực hiện
3.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu kĩ thuật nhân giống vô tính cây Sưa bằng phương pháp
giâm hom
Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nồng độ các chất kích thích ra rễ cho việc tạo rễ
cây Sưa.

15