XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ BƯỚC ĐẦU LÂY NHIỄM MẪU LÁ CÂY CÀ ĐỘC DƯỢC (Datura innoxia Mill) BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

******************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ BƯỚC ĐẦU LÂY
NHIỄM MẪU LÁ CÂY CÀ ĐỘC DƯỢC (Datura innoxia Mill)
BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2004-2008
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ THU HÒA

Tháng 9/2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

******************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ BƯỚC ĐẦU LÂY
NHIỄM MẪU LÁ CÂY CÀ ĐỘC DƯỢC (Datura innoxia Mill)
BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes

Giáo viên hướng dẫn:
ThS NGUYỄN VŨ PHONG

Tháng 9/2008

Sinh viên thực hiện:
NGUYỄN THỊ THU HÒA


LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn:
 Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm
Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức
cho em trong suốt quá trình học tập tại trường.
 Thầy Nguyễn Vũ Phong đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời
gian em thực hiện đề tài.
 Tiến sĩ Trần Thị Lệ Minh đã cung cấp nguyên liệu cho em thực hiện đề tài.
 Các thầy cô, anh chị và các bạn sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm Bộ môn
Công Nghệ Sinh Học và Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm của Trường Đại
học Nông Lâm đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.
 Xin gởi lời cảm ơn đến tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 30 đã gắn bó, động
viên, giúp đỡ tôi trong suốt bốn năm qua.
 Con cảm ơn bố mẹ đã tạo điều kiện cho con được học hành.

Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Thu Hòa

iii

TÓM TẮT
NGUYỄN THỊ THU HÒA, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng
9/2008. “Xây dựng hệ thống tái sinh và bước đầu lây nhiễm mẫu lá cây cà độc dược
(Datura innoxia Mill) bằng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes”.
Giảng viên hướng dẫn: ThS NGUYỄN VŨ PHONG
Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học và
Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trường Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. Thời
gian thực hiện từ tháng 4 đến tháng 9 năm 2008.
Cây cà độc dược có khả năng sản xuất các alkaloid tropane chủ yếu ở bộ phận
rễ. Hai alkaloid tropane chủ yếu được tạo ra ở rễ là: hyoscyamin và scopolamin, tuy
nhiên với số lượng không đáng kể. Một trong những con đường để tăng cường sản
xuất các hợp chất alkaloid là nuôi cấy các rễ tóc “hairy root” biến đổi di truyền thông
qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes cung cấp số lượng sinh khối lớn. Ở Việt Nam,
đến nay vẫn chưa có kết quả nghiên cứu về chuyển gene và khảo sát hàm lượng
alkaloid tropane trên cà độc dược được công bố. Xuất phát từ tình hình nghiên cứu
trên, đề tài “Xây dựng hệ thống tái sinh và bước đầu lây nhiễm mẫu lá cây cà độc dược
(Datura innoxia Mill) bằng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes” được tiến hành.
Nội dung nghiên cứu:
 Môi trường thích hợp tạo sẹo từ mẫu lá, thân, rễ cây cà độc dược
 Môi trường thích hợp tạo chồi từ mô sẹo
 Môi trường thích hợp tạo rễ từ chồi con
 Thuần hóa cây con
 Nồng độ các kháng sinh cefotaxime và kanamycine ảnh hưởng đến sinh trưởng
của mẫu lá.
 Phương pháp lây nhiễm mẫu lá cà độc dược bằng vi khuẩn A. rhizogenes
Kết quả thực nghiệm:
 Môi trường thích hợp để tạo sẹo từ mẫu lá, thân, rễ cây cà độc dược là môi
trường MS+1mg/l BA+0,5mg/l NAA.
 Môi trường thích hợp để nhân chồi cây cà độc dược là môi trường MS +2mg/l
BA+1mg/l NAA, chồi con phát triển trên môi trường MS.

 Môi trường thích hợp cho sự ra rễ là môi trường MS bổ sung 0,5mg/l NAA và cây con
cà độc dược ngoài vườn ươm từ môi trường này cho tỷ lệ sống sót cao nhất 31,3%.
 Cefotaxime nồng độ 500mg/l ảnh hưởng đến sinh trưởng của mẫu lá cà độc dược.
 Kanamycine nồng độ 100mg/l ảnh hưởng đến sinh trưởng của mẫu lá cà độc dược.
 Giá trị OD từ 0,1-0,35, thời gian lây nhiễm 20 phút thích hợp cho lây nhiễm
mẫu lá cây cà độc dược bằng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes.
iv


SUMMARY
NGUYEN THI THU HOA, Nong Lam University. September, 2008. “Studies
on the regeneration system of Datura (Datura innoxia Mill) and co-culture leaf with
Agrobacterium rhizogenes”.
Supervisor: MSc NGUYEN VU PHONG

This thesis was completed at the laboratory of Department of Biotechnology
and Chemical and Biological Analysis and Experiment Center at Nong Lam
University from April to September 2008.
Datura can produce medicinal secondary metabolites at root. Two mainly
produced alkaloid tropanes are hyoscyamin and scopolamine. However, they have
little quantity. Transformed hairy roots cultures are one of the approaches to enhance
alkaloid production. In Vietnam, results of scientific researches on genetic engineering
and alkaloid content in Datura have not announced yet. In that research situation,
thesis “Regeneration and genetic transformation by Agrobacterium rhizogenes of
Datura (Datura innoxia Mill)” was carried out.
Research contents:
 Suitable medium for callus proliferation of datura leaf, stem, root
 Suitable medium for bud proliferation from callus
 Suitable medium for rooting of small shoots
 Acclimatization of plantlets in greenhouse

 Effect of antibiotic concentrations complemented on the growth of leaf
 Co-culture leaf of Datura with Agrobacterium rhizogenes

Results:
 Suitable medium for callus proliferation is MS supplemented with BA (1 mg/l)
and NAA (0,5 mg/l).
 Medium for bud proliferation is MS complemented with BA (2 mg/l) and NAA (1 mg/l).
 Medium for rooting is MS complemented NAA (0,5 mg/l) or NAA (1mg/l)
 Plantlet in greenhouse with highest survived rate is 31,3% from MS medium
complemented NAA (0,5 mg/l).
 500mg/l cefotaxime affect the growth of leaf.
 100mg/l kanamycine affect the growth of leaf.
 Co-culture of leaf with Agrobacterium rhizogenes: Suitable OD is from 0,1 to
0,35, explants were dipped with bacteria solution for about 20 minutes.
v


MỤC LỤC
Nội dung

Trang

Lời cảm ơn...............................................................................................................iii
Tóm tắt.................................................................................................................... iv
Summary................................................................................................................... v
Mục lục ................................................................................................................... vi
Danh mục các chữ viết tắt ....................................................................................... ix
Danh sách các hình ................................................................................................... x
Danh sách các bảng ................................................................................................. xi
Chương I. Mở đầu .................................................................................................. 1

1.1 Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1
1.2 Mục đích và yêu cầu .......................................................................................... 2
Chương II. Tổng quan tài liệu............................................................................... 3
2.1 Giới thiệu về cây cà độc dược (Datura innoxia Mill) ........................................ 3
2.2 Hệ thống tái sinh in vitro .................................................................................... 6
2.2.1 Khái niệm tái sinh in vitro ............................................................................... 6
2.2.2 Tái sinh thông qua giai đoạn nuôi cấy tế bào đơn .......................................... 7
2.2.3 Tái sinh qua giai đoạn nuôi cấy protoplast...................................................... 7
2.2.4 Nhân giống thông qua giai đoạn callus .......................................................... 7
2.2.5 Các giai đoạn nhân giống in vitro ................................................................... 8
2.3 Các chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy mô............................................ 9
2.3.1 Auxin ............................................................................................................... 9
2.3.2 Cytokinine ..................................................................................................... 10
2.4 Giới thiệu về vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes .......................................... 11
2.4.1 Vị trí phân loại............................................................................................... 11
2.4.2 Đặc điểm....................................................................................................... 12
2.4.3 Ri-plasmid .................................................................................................... 12
2.4.4 Chức năng T-DNA ........................................................................................ 12
2.4.5 Chức năng các gene vir ................................................................................. 13
2.5 Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật........................................................................ 15
2.6 Chuyển DNA ngoại lai vào tế bào và mô thực vật nhờ A. rhizogenes............. 17
vi


Chương 3. Vật liệu và phương pháp thí nghiệm ............................................... 20
3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm ..................................................................... 20
3.2 Vật liệu ............................................................................................................. 20
3.2.1 Đối tượng thí nghiệm..................................................................................... 20
3.2.2 Hóa chất sử dụng ........................................................................................... 21
3.2.3 Môi trường nuôi cấy ...................................................................................... 21

3.3 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 21
3.3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của phương pháp vô mẫu đến khả năng nảy mầm
của hạt

................................................................................................................ 21

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khả năng tạo callus từ lá, thân và rễ cây cà độc dược in vitro
trên môi trường nuôi cấy khác nhau ....................................................................... 22
3.3.3 Thí nghiệm 3: Khả năng tạo chồi cà độc dược trên các môi trường nuôi cấy
khác nhau................................................................................................................ 23
3.3.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ cà độc dược ........ 24
3.3.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của nồng độ cefotaxime đến sinh trưởng của mẫu
lá cà độc dược ......................................................................................................... 24
3.3.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh kanamycine đến sinh
trưởng của mẫu lá cà độc dược............................................................................... 25
3.3.7 Thuần hóa cây con......................................................................................... 26
3.3.8 Phương pháp lây nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ................ 26
3.3.8.1 Chuẩn bị vật liệu nuôi cấy .......................................................................... 26
3.3.8.2 Chuẩn bị vi khuẩn...................................................................................... 26
3.3.8.3 Lây nhiễm ................................................................................................... 27
3.3.8.4 Loại bỏ vi khuẩn ......................................................................................... 27
3.4 Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................ 27
Chương 4. Kết quả và thảo luận ........................................................................ 28
4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của phương pháp vô mẫu đến khả năng nảy
mầm của hạt............................................................................................................ 28
4.2 Thí nghiệm 2: Khả năng tạo callus từ lá, thân và rễ cây cà độc dược trên các
môi trường nuôi cấy khác nhau .............................................................................. 30
4.3 Thí nghiệm 3: Khả năng tạo chồi cà độc dược trên các môi trường nuôi cấy
khác nhau................................................................................................................ 33
vii

4.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ cà độc dược ........... 35
4.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của cefotaxime đến sinh trưởng của lá .................. 38
4.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của nồng độ kanamycine đến sinh trưởng của
mẫu lá .......................................................................................................... 40
4.7 Thuần hóa cây con............................................................................................ 40
4.8 Phương pháp lây nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ................... 41
Chương 5. kết luận và đề nghị............................................................................. 45
5.1 Kết luận............................................................................................................. 45
5.2 Đề nghị ............................................................................................................. 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

viii


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BA

: Benzyl adenine

2,4-D

: Dichlorophenory acetic acid

IAA

: -indole acetic acid

IBA

: -indole butyric acid

NAA

: -naphtalen acetic acid

CV

: Hệ số biến động

LSD

: Sai số nhỏ nhất

MS

: Murashige – Skoog, 1962

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình

Trang

Hình 2.1: Lá, hoa, quả cây cà độc dược .................................................................. 3
Hình 2.2: Rễ phụ do A.rhizogenes gây ra trên cây khoai tây................................. 12

Hình 2.3: Kênh vận chuyển phức hợp T-DNA...................................................... 15
Hình 2.4: Cấu trúc di truyền cơ bản ...................................................................... 16
Hình 2.5: A: Ri-plasmid, B: Ri-plasmid được chèn DNA ngoại lai .................... 17
Hình 2.6: Phương thức chuyển T-DNA vào genome của thực vật ....................... 18
Hình 2.7: Quá trình kết nạp T-DNA vào bộ gen của tế bào cây........................... 19
Hình 3.1: Plasmid pLAL21................................................................................... 20
Hình 3.2: Cây cà độc dược in vitro 20 và 45 ngày tuổi ......................................... 26
Hình 4.1: Hạt cà độc dược in vitro nảy mầm sau 2 ngày gieo, sau 1 tuần, tạo
sẹo sau 20 ngày ................................................................................................... 29
Hình 4.2: Lá, thân, rễ tạo sẹo trên môi trường ½ MS và MS sau 4 tuần nuôi cấy....... 31
Hình 4.3: Lá, thân, rễ tạo sẹo trên môi trường MS bổ sung BA và NAA sau
4 tuần nuôi cấy ...................................................................................................... 32
Hình 4.4: Mô sẹo tạo chồi trên các môi trường nuôi cấy khác nhau sau 4 tuần
nuôi cấy .......................................................................................................34
Hình 4.5: Chồi con phát triển trên môi trường MS sau 2 tuần nuôi cấy................ 35
Hình 4.6: Chồi cà độc dược được chuyển sang môi trường tạo rễ, trên môi trường
MS+0,1mg/l NAA .................................................................................................. 36
Hình 4.7: Rễ cây cà độc dược trên môi trường MS bổ sung NAA ở các nồng độc
khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy................................................................................ 37
Hình 4.8: Ảnh hưởng của cefotaxime đến sinh trưởng của mẫu lá ....................... 39
Hình 4.9: Ảnh hưởng của kanamycine đến sinh trưởng của mẫu lá...................... 40
Hình 4.10: Cây con ngoài vườn ươm..................................................................... 41
Hình 4.11: Mẫu trên môi trường đồng nuôi cấy sau 2 ngày .................................. 42
Hình 4.12: Mẫu nhiễm khuẩn chết sau 1 tuần lây nhiễm (A), mẫu đặt trên môi trường
đồng nuôi cấy bổ sung cefotaxime 500mg/l sau 1 tuần (B), sau 3 tuần (C) ................. 44

x


DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng

Trang

Bảng 3.1: Khả năng tạo callus từ lá, thân, rễ cây cà độc dược in vitro trên các môi
trường nuôi cấy khác nhau ..................................................................................... 23
Bảng 3.2: Khả năng tạo chồi trên các môi trường nuôi cấy khác nhau ................. 23
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ .............................. 24
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của cefotaxime đến sinh trưởng của lá (sau 4 tuần) ........... 25
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ kanamycine đến sinh trưởng của mẫu lá ........ 25
Bảng 4.1: Ảnh hưởng của phương pháp vô mẫu đến tỷ lệ hạt vô trùng và nảy mầm ...28
Bảng 4.2: Khả năng tạo callus từ lá, thân và rễ cây cà độc dược trên các môi
trường nuôi cấy khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy ..................................................... 30
Bảng 4.3 : Khả năng tạo chồi cà độc dược trên các môi trường nuôi cấy khác nhau
sau 4 tuần ................................................................................................................ 33
Bảng 4.4: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ cà độc dược sau 3 tuần....... 36
Bảng 4.5: Ảnh hưởng của cefotaxime đến sinh trưởng của lá (sau 4 tuần) ........... 38
Bảng 4.6 Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh kanamycine đến sinh trưởng của
mẫu lá ..................................................................................................................... 40
Bảng 4.7: Khảo sát tỷ lệ sống sót của cây con trong vườn ươm sau 2 tuần .......... 40
Bảng 4.8: Ảnh hưởng của tuổi cây con và mật độ vi khuẩn đến khả năng sống của
mẫu sau 2 ngày đồng nuôi cấy ............................................................................... 42

xi


Chương 1

MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề

Thực vật là nguồn cung cấp phong phú các hợp chất thứ cấp có tính chất dược
liệu. Việc nghiên cứu sản xuất các hợp chất thứ cấp ứng dụng trong y học và mỹ phẩm
ngày càng được quan tâm và đang trở thành một lĩnh vực phát triển năng động (Sato et
al., 2001) (trích dẫn bởi Dechaux C. et al., 2005), hứa hẹn triển vọng to lớn cho sản
xuất ở quy mô công nghiệp.
Cà độc dược (Datura innoxia Mill) là cây thân thảo đa niên nằm trong họ cà
(Solanaceae), được trồng chủ yếu ở vùng khí hậu nhiệt đới (Nam Mỹ, Ấn Độ, Úc) và
mọc hoang dại nhiều nơi ở Việt Nam. Trong cây chứa nhiều alkaloid có hoạt tính y
dược, chủ yếu là scopolamine. Cà độc dược được dùng làm một số thuốc chữa bệnh gia
truyền như giảm ho, giảm đau bao tử, chống say tàu xe, chống phong tê thấp, đau giây
thần kinh tọa, đau răng…đặc biệt có tác dụng ngừa hen suyễn. Tuy nhiên vì tính độc
mạnh nên ít được lưu ý và ngày càng bị tiêu diệt do mọc hoang.
Đã có nhiều nghiên cứu trên cây cà độc dược với mục đích tăng cường sự tích
lũy các hợp chất alkaloid như trồng trong hệ thống thủy canh có tác động của các yếu
tố sinh học và phi sinh học (Trần Thị Lệ Minh, 2005), nuôi cấy tế bào (Nguyễn Thị
Thanh Uyên, 2006), tái sinh cơ quan và tích trữ alkaliod (Rawia Zayeda et al.,
2006)...Nuôi cấy rễ tóc “hairy root” biến đổi di truyền thông qua vi khuẩn
Agrobacterium rhizogenes cũng là một trong những con đường để tăng cường sự tích
lũy các hợp chất alkaloid, cung cấp số lượng sinh khối lớn tạo điều kiện thuận lợi cho
sản xuất và thu nhận các hợp chất thứ cấp với số lượng lớn (Wilson, 1997) (trích dẫn
bởi Dechaux C. et al., 2005). Các rễ tóc phát triển ổn định và có thể tăng trưởng nhanh
trong môi trường nuôi cấy thích hợp mà không cần bổ sung các chất điều hòa sinh
trưởng (Boitel-Conti et al., 2000) (trích dẫn bởi Dechaux C. et al., 2005). Hơn nữa các
rễ tóc còn tạo ra nhiều hợp chất thứ cấp có giá trị cao và số lượng lớn so với rễ cây
bình thường. Các nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến chuyển gene
(Rajbir S. Sangwan et al., 1991), chiến lược tăng cường tích trữ scopolamine bằng tăng
sinh khối rễ tóc cà độc dược trong bioreactor (Dechaux C. et al., 2005) đã góp phần
tăng cường sự tích lũy hợp chất alkaloid trong cây cà độc dược.
1

Ở Việt Nam, đến nay vẫn chưa có kết quả nghiên cứu về chuyển gene và khảo
sát hàm lượng alkaloid tropane trên cà độc dược được công bố. Muốn chuyển một gen
thành công cần phải chứng minh hiệu quả của phương pháp chuyển nạp, nhưng đôi khi
các loài được nghiên cứu hoặc không thể tái sinh được cây từ các mô không phân hóa,
hoặc có thể tái sinh nhưng sau đó khó phát triển thành cây hoàn chỉnh. Do đó, đề tài
“Xây dựng hệ thống tái sinh và bước đầu lây nhiễm mẫu lá cây cà độc dược (Datura
innoxia Mill) bằng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes” được tiến hành.
1.2 Mục đích và yêu cầu
 Mục đích
Xây dựng hệ thống tái sinh và bước đầu lây nhiễm mẫu lá cây cà độc dược
(Datura innoxia Mill) bằng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes làm tiền đề cho việc
chuyển gen phục vụ cho nghiên cứu sản xuất các hợp chất thứ cấp tiếp theo.
 Yêu cầu
 Xác định phương pháp vô mẫu hạt cà độc dược thích hợp tạo nguồn nguyên
liệu ban đầu.
 Xác định nồng độ phối hợp của BA và NAA bổ sung trong môi trường nuôi cấy
thích hợp cho sự tạo mô sẹo và chồi của mẫu cấy.
 Xác định nồng độ NAA bổ sung trong môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự tạo
rễ chồi con in vitro.
 Xác định nồng độ cefotaxime, kanamycine ảnh hưởng đến sức sống bình
thường của mẫu lá cà độc dược.
 Khảo sát phương pháp đồng nuôi cấy mẫu lá cà độc dược và vi khuẩn A.
rhizogenes.

2


Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về cây cà độc dược (Datura innoxia Mill)
2.1.1 Vị trí phân loại [11] *
Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Solanaceae
Họ: Solanaceae
Chi: Datura
Loài: Datura innoxia Mill
2.1.2 Đặc điểm sinh học
Cà độc dược là cây thân thảo, cao 1-2 m, sống quanh năm. Phần gốc của thân
hóa gỗ. Thân và cành non màu xanh lục hay tím, có nhiều lông tơ ngắn. Lá đơn, mọc
so le, phiến lá nguyên hình trứng nhọn, gốc phiến lá không đều nhau. Hoa mọc đơn
độc ở nách lá. Cánh hoa màu trắng hay vàng, dính liền nhau thành hình phễu, dài 16 18 cm. Quả hình cầu, đường kính khoảng 3 cm, mặt ngoài có nhiều gai mềm, khi chín
nứt theo 3 - 4 đường, chứa nhiều hạt màu vàng [13].

Hình 2.1: Lá, hoa, quả cây cà độc dược [12], [13], [11]
2.1.3 Nơi sống và thu hái
Cà độc dược được trồng chủ yếu ở vùng khí hậu nhiệt đới (Nam Mỹ, Ấn Độ,
Úc). Ở nước ta, cây mọc hoang khắp nơi và cũng được trồng làm cảnh và làm thuốc.
Trồng bằng hạt trước mùa mưa. Người ta đã tạo ra nhiều giống trồng với lá có màu

*

Kí hiệu số thứ tự trong [ ] là số thứ tự tên tài liệu trong phần tài liệu tham khảo phía sau

3

khác nhau: xanh, tía hay tim tím, hoa đơn hay hoa đôi. Có thể thu hái hoa vào mùa thu;
thu hái lá quanh năm [15].
2.1.4 Công dụng
Cây cà độc dược đã được sử dụng làm thuốc từ lâu để chữa một số bệnh như:
ngừa suyễn, giảm ho, chống đau, chống co giật, phong thấp đau nhức, ngừa cơn hen,
giảm đau bao tử, chống say tàu xe, điều trị phong tê thấp, đau dây thần kinh tọa, đau
răng... Người ta thường dùng lá cuộn thành điếu hay thái nhỏ vấn thành điếu thuốc để
hút (chữa ho, hen suyễn), dùng lá hơ nóng đắp điều trị đau nhức, tê thấp, hoặc phơi
khô tán bột mịn. Tuy cà độc dược có một số lợi ích như vậy nhưng việc dùng nó phải
được thực hiện rất cẩn trọng, nhất thiết phải theo chỉ định của bác sĩ. Những người thể
lực yếu, có bệnh tim mạch không được dùng. Nếu dùng sai, cà độc dược sẽ gây tử
vong và nhiều tai biến nguy hiểm [13].
2.1.5 Tính độc
Cây có độc tính cao, là một cây rất độc được xếp vào bảng độc A trong danh
mục dược phẩm [18]. Khi bị ngộ độc, có hiện tượng giãn đồng tử, mờ mắt, tim đập
nhanh, giãn phế quản, môi miệng khô, khô cổ đến mức không nuốt và không nói được,
chóng mặt, giảm thậm chí mất hẳn trí nhớ, mê sảng, rối loạn phát âm cuối cùng có thể
bị ức chế liệt thần kinh trung ương. Chất độc tác động vào hệ thần kinh trung ương, có
thể gây tử vong do hôn mê [13].
Một số người sử dụng cà độc dược để chữa chứng chảy nước mũi vì viêm
xoang dẫn đến bị mất khứu giác. Nguyên nhân là do chất atropin trong cà độc dược có
tác dụng làm co thắt các mao mạch trong mũi, làm nước mũi ngừng chảy. Điều này
khiến họ lầm tưởng là bệnh đã được chữa khỏi [14].
2.1.6 Các hợp chất thứ cấp
Ngoài các chất carbohydrate, lipid, protein, nucleic acid,…trong thực vật còn
tồn tại những hợp chất khác nhau do quá trình trao đổi các hợp chất nói trên tạo thành.
Mặc dù chúng chỉ chiếm tỷ lệ rất ít trong cây nhưng các chất này quy định tính đặc thù
của sự trao đổi chất trong từng loài thực vật. Các hợp chất này được gọi là các chất có
nguồn gốc thứ cấp [16]. Chúng dường như là sản phẩm của các phản ứng hóa học của
thực vật với môi trường chung quanh, là sự thích nghi với stress của môi trường hoặc

là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật [5]. Lượng hợp chất thứ cấp
được tạo ra thường rất nhỏ. Nhưng chúng có khả năng tiềm ẩn hoạt tính sinh học rất
4


mạnh ngay cả khi chúng được sản xuất thấp hơn 1% trọng lượng mô thực vật. Chúng
đặc biệt quan trọng đối với con người do các ứng dụng y học của chúng: 25% tất cả
các loại thuốc của chúng ta lấy từ thực vật [17]. Các hợp chất thứ cấp như: Các acid
hữu cơ, phenol, tannin, alkaloid, tinh dầu, ...
Alkaloid là những chất dị vòng chứa nitơ, có đặc tính kiềm và có tác dụng sinh
lý mạnh. Nhiều alkaloid là những chất độc. Đại bộ phận alkaloid tác động lên hệ thần
kinh. Ở liều lượng thấp chúng có tác dụng kích thích, còn ở liều lượng cao chúng có
tác dụng ức chế. Một số alkaloid điển hình: hordenine, ricinin, piperin, atropin,
cocaine, morphin, cafein, nicotin,…[16]
Cây cà độc dược có khả năng sản xuất các hợp chất thứ cấp có hoạt tính y dược
ở bộ phận rễ: Các alkaloid tropane. Về mặt hóa học, các phân tử của các hợp chất này
có cấu trúc hai vòng đặc trưng. Về mặt dược học, chúng là những chất chống cholin
mạnh nhất hiện có, nghĩa là chúng ngăn cản các tín hiệu thần kinh được các chất
truyền tải tín hiệu thần kinh nội sinh là acetylcholin (ACh) truyền tải. Các triệu chứng
của việc sử dụng quá liều có thể là khô miệng, giãn đồng tử, mất điều hòa, bí tiểu, ảo
giác, co giật, hôn mê và tử vong. Mặc dù là chất cực độc, nhưng các tropane vẫn là một
loại dược phẩm quan trọng khi sử dụng đúng liều chỉ định (một lượng cực nhỏ) [20].
Trong cây chứa nhiều alkaloid, chủ yếu là scopolamin, còn có hyoscyamin,
atropin, norhyoscyamin với tỷ lệ ít hơn. Người ta đã tìm được những chất khác như
saponin, cumarin, flavonoid, tanin và chất béo. Hai alkaloid tropane chủ yếu được tạo
ra ở rễ là hyoscyamin và scopolamin. Hàm lượng alkaloid toàn phần trong cây là rất
cao: 0,1 - 0,5% trong lá, 0,25 - 0,6% trong hoa, 0,1 - 0,2% trong rễ. Các alkaloid trong
cà độc dược là những thuốc hủy phó giao cảm và tác dụng giống nhau, chỉ khác nhau
về mức độ. Tác dụng dược lý chủ yếu là do các alkaloid: làm giãn phế quản, giãn đồng
tử, giảm nhu động ruột và bao tử nếu những cơ quan này co thắt, làm khô nước bọt,

dịch vị, mồ hôi [19].
Atropin có nhiều trong quả cà độc dược và trong hạt cây họ cà, tác dụng mạnh
lên hệ thần kinh hoạt động của mắt [16].
Scopolamin có tác dụng làm giãn đồng tử, được sử dụng như một tác nhân
trong nhãn khoa làm cho việc kiểm tra mắt được thuận tiện hơn. Chúng cũng có thể
dùng làm chất chống gây nôn đối với những người bị hội chứng say tàu xe. Băng dán
xuyên da chống nôn khi đi tàu xe chứa scopolamin, khi thuốc thấm dần xuyên da qua
5


máu với lượng đủ scopolamin có tác dụng chống co thắt, giảm sự kích thích đưa đến
hóa giải buồn nôn và nôn do say tàu xe [19].
Cà độc dược chứa 2 chất hyoxin và atropin (trong lá, hoa, thân cây). Chất
atropin tác động lên não sẽ gây say, có khi làm nạn nhân phát điên, hô hấp tăng, sốt, có
lúc làm tê liệt tứ chi do thần kinh trung ương bị ức chế. Hyoxin có tác dụng gần giống
atropin nhưng làm giãn đồng tử trong thời gian ngắn hơn; nó ức chế thần kinh nhiều
hơn là kích thích nên được dùng trong lĩnh vực thần kinh (chữa co giật trong bệnh
Parkinson, phối hợp với atropin để chống say xe, làm dịu thần kinh) [14].
2.2 Hệ thống tái sinh in vitro
Tái sinh in vitro cây cà độc dược được tiến hành làm tiền đề cho việc chuyển
gene. Tuy nhiên, cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ tế bào nhận gene chuyển nạp có
khả năng tái sinh và phát triển thành cây hoàn chỉnh.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật có những khả năng đóng góp cho những nghiên
cứu và ứng dụng, đặc biệt là trong cải biến di truyền (chọn dòng tế bào, đột biến tế
bào, chuyển gene,…) và trong công nghệ thu nhận các chất có hoạt tính sinh học. Để
có được những đóng góp này là nhờ vào tính toàn năng của tế bào thực vật. Tính toàn
năng của tế bào thực vật là khả năng của các tế bào đã được biệt hóa ( trừ một số loại
tế bào đã được biệt hóa sâu như ống mạch, mao dẫn) có khả năng thể hiện toàn bộ hệ
thống di truyền và có thể trong điều kiện phù hợp sẽ phát triển theo chu trình giống
như sự phát triển phôi dẫn đến hình thành cây hoàn chỉnh mới. Tuy nhiên, không phải

toàn bộ tế bào đều thể hiện tính toàn năng. Chỉ có số ít tế bào có khả năng tái sinh và
biến nạp, một số khác có một trong hai khả năng, một số nếu tạo điều kiện phù hợp thì
trở nên có khả năng, một số khác hoàn toàn không có khả năng tái sinh và biến nạp
[6]. Do đó, phương thức tái sinh được xây dựng từ nguyên liệu tế bào đơn, protoplast
hay thông qua giai đoạn callus,…
2. 2.1 Khái niệm tái sinh in vitro
Tái sinh in vitro hay nuôi cấy in vitro còn gọi là nuôi cấy mô (tissue culture) là
hệ thống nuôi cấy bắt đầu với một mảnh nhỏ cây trồng không bị nhiễm vi sinh vật đặt
trong môi trường dinh dưỡng. Chồi mới hay callus mà mẫu cấy này tạo ra bằng sự tăng
sinh được phân chia và cấy chuyền [2].

6


2.2.2 Tái sinh thông qua giai đoạn nuôi cấy tế bào đơn [6]
Ngoài khả năng nuôi cấy các cơ quan và mô thực vật, tế bào thực vật có thể
được tách và nuôi riêng rẽ trong môi trường phù hợp.
Tế bào đơn có thể thu nhận bằng nghiền mô, hoặc xử lý enzyme. Mỗi một loài
cây, một loại tế bào khác nhau của một cây đòi hỏi những điều kiện nuôu cấy rất khác
nhau. Nhìn chung khi tế bào tách khỏi mô hoặc quần thể tế bào và được nuôi riêng rẽ
chúng bị mất các chất cần thiết cho phân chia tế bào vào môi trường. Vì vậy đòi hỏi về
dinh dưỡng đối với tế bào đơn phức tạp hơn đối với mô sẹo.
Nuôi cấy tế bào đơn để nghiên cứu khả năng tái sinh và phát triển thành cây
hoàn chỉnh của tế bào chuyển nạp gene. Ngoài ra còn được sử dụng để nghiên cứu cấu
trúc tế bào, ảnh hưởng của các điều kiện khác nhau lên các quá trình sinh trưởng, phát
triển và phân hóa của tế bào, chọn dòng tế bào.
2.2.3 Tái sinh qua giai đoạn nuôi cấy protoplast [6]
Protoplast có thể được tách từ mô hoặc cơ quan thực vật như lá, đỉnh chồi, rễ,
hạt phấn, quả và mô sẹo bằng các phương pháp cơ học hoặc xử lý enzyme để loại bỏ
thành cellulose tế bào. Do đó, tế bào chỉ còn màng nguyên sinh bao bọc tất cả các cấu

trúc của tế bào, tế bào như vậy gọi là tế bào trần hay protoplast. Trong điều kiện nuôi
cấy phù hợp protoplast có thể tái tạo thành tế bào mới, phân chia và tái sinh thành cây
hoàn chỉnh.
Do không có thành cellulose, protoplast trở nên một đối tượng lý tưởng trong
nghiên cứu biến đổi di truyền ở thực vật. Bằng phương pháp dung hợp hai protoplast
có thể tạo ra các cây lai soma. Ngoài ra có thể sử dụng kỹ thuật dung hợp protoplast
để chuyển các bào quan (nhân, lục lạp, ty thể) và chuyển gene.
2.2.4 Tái sinh thông qua giai đoạn callus [4]
Mô sẹo (callus) là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản
phân hoá của tế bào đã phân hoá. Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự
hiện diện của auxin. Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều
kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo.
Tế bào hay mô được tách ra từ phần có tổ chức của cây trồng bị mất tính
chuyên biệt rồi được nuôi cấy, mô sẹo không tổ chức được hình thành. Sự tăng trưởng
vô tổ chức này được cảm ứng chủ yếu bởi sự sử dụng nồng độ cao auxin hay cytokinin
7


trong môi trường dinh dưỡng. Nhân giống thông qua giai đoạn callus cho hệ số nhân
cao nhưng thường kéo theo biến dị sôma. Từ đó, mô sẹo được dùng để chọn các dòng
chống chịu như chịu bệnh, chịu muối và chọn lọc các dòng cho năng suất các chất thứ
cấp cao, chọn lọc các cá thể sạch virus. Thông qua giai đoạn callus, các tế bào chuyển
nạp gene có thể tái sinh và phát triển thành cây hoàn chỉnh.
Tế bào callus khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Để
tránh tình trạng đó nhất thiết phải sử dụng loại callus vừa phát sinh, tức là callus sơ
cấp để tái sinh cây thì hy vọng sẽ thu được cây tái sinh đồng nhất.
2.2.5 Các giai đoạn nhân giống in vitro [4]
2.2.5.1 Giai đoạn I - Thiết lập sự nuôi cấy vô trùng
Mẫu vật đưa từ bên ngoài vào nuôi cấy vô trùng phải đảm bảo tỷ lệ nhiễm thấp,
tỷ lệ sống cao, tốc độ sinh trưởng nhanh. Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ cho tỷ

lệ sống cao và môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh.
2.2.5.2 Giai đoạn II - Nhân nhanh
Ở giai đoạn này, cơ quan phụ hoặc các cấu trúc khác như chồi nách, phôi vô
tính, đỉnh sinh trưởng mới được kích thích để từ đó phát sinh thành cây hoàn chỉnh.
Trong giai đoạn này cần nghiên cứu các tác nhân kích thích phân hóa cơ quan,
đặc biệt là chồi. Tăng cường thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, tối thiểu 1.000 lux.
Trong thực tế nghiên cứu, người ta nhận thấy khó tách biệt ảnh hưởng của chu kỳ
chiếu sáng khỏi ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng. Ánh sáng tím là thành phần quan
trọng kích thích phân hóa mạnh. Ánh sáng đỏ có ảnh hưởng giống cytokinin
(cytokinin-like effect), nó tạo nên sự tích lũy cytokinin trong mô của một số loài,
chính lượng cytokinin này đã góp phần kích thích quá trình phát sinh cơ quan và tạo
chồi từ những mô nuôi cấy in vitro. Bảo đảm chế độ nhiệt độ trong khoảng 20 - 30oC.
Trường hợp những loài có nguồn gốc nhiệt đới, nhiệt độ nuôi cấy thích hợp vào
khoảng từ 32 - 35oC. Ngược lại, đối với những loài hoa ở vùng ôn đới nhiệt độ thích
hợp cho quá trình tạo cụm chồi phải  30oC.
Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là xác định được phương thức nhân
nhanh nhất bằng môi trường dinh dưỡng và điều kiện khí hậu tối thích.

8


2.2.5.3 Giai đoạn III - Chuẩn bị và đưa ra ngoài đất
Đây là giai đoạn quan trọng bao gồm việc tạo rễ, huấn luyện thích nghi với thay
đổi nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nước, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự
dưỡng hoàn toàn. Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2-3 tuần, trong thời gian này
cây phải được chăm sóc và bảo vệ trước những yếu tố bất lợi như: Mất nước nhanh
làm cho cây bị héo khô, nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện tượng thối nhũn.
2.3 Các chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy mô
Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật là các chất hữu cơ có bản chất hóa học rất
khác nhau nhưng đều có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng phát triển của cây

từ lúc tế bào trứng thụ tinh phát triển thành phôi cho đến khi cây ra hoa kết quả, hình
thành cơ quan sinh sản, dự trữ và kết thúc chu kì sống của mình. Chúng được tổng hợp
với một lượng rất nhỏ ở các cơ quan, bộ phận nhất định của cây và từ đó vận chuyển
đến tất cả các cơ quan bộ phận khác để điều tiết các hoạt động sinh lý, các quá trình
sinh trưởng, phát triển của cây và để đảm bảo mối quan hệ hài hòa giữa các cơ quan bộ
phận trong cơ thể. Các chất điều chỉnh sinh trưởng mà ở nồng độ sinh lí có ảnh hưởng
kích thích đến quá trình sinh trưởng của cây được gọi là các chất kích thích sinh trưởng.
Các chất kích thích sinh trưởng gồm hai nhóm chính là auxin và cytokinin [7].
2.3.1 Auxin
Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là IAA. IAA có tác dụng
kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều khiển sự hình thành rễ. Ngoài IAA còn có
các dẫn xuất của nó là NAA, IBA, 2,4D,…là các auxin tổng hợp, các chất này cũng
đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia của mô và trong quá trình tạo rễ. NAA
được Went và Thimann (1937) phát hiện (theo trích dẫn của Nguyễn Đức Thành,
2000). Chất này có tác dụng làm tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính
enzyme và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử
dụng đường trong môi trường. NAA là một auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơn
auxin tự nhiên IAA. NAA có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ. Kết
quả nghiên cứu của Butenko (1964) cho thấy NAA có tác dụng tạo rễ mạnh hơn các
auxin khác (theo trích dẫn của Nguyễn Đức Thành, 2000). Nhiều kết quả nghiên cứu
đã chỉ ra rằng NAA tác động ở mức phân tử trong tế bào theo ba cơ chế: Cơ chế thứ
nhất là NAA gắn với phân tử enzyme và kích thích enzyme hoạt động. Cơ chế thứ hai
là auxin tác động vào gene và các enzyme phân giải acid nucleic. Cơ chế thứ ba là tác
9


động thông qua sự thay đổi tính thẩm thấu của màng. Trong tế bào, NAA có tác dụng
lên sự tổng hợp acid nucleic…[5]
Trong cây auxin được tổng hợp chủ yếu ở đỉnh sinh trưởng ngọn, từ đó vận
chuyển đến các cơ quan khác nhau theo hướng gốc. Ngoài đỉnh sinh trưởng ngọn,

auxin còn được tổng hợp một phần ở các cơ quan còn non như lá non, chồi non, quả
non. Sự vận chuyển của auxin trong cây có tính chất phân cực rất nghiêm ngặt, tức là
chỉ vận chuyển theo hướng gốc. Chính vì vậy mà càng xa đỉnh ngọn, hàm lượng auxin
càng giảm dần. Ngoài đỉnh ngọn ra cũng có tính chất như vậy là các cơ quan còn non
khác như lá non, quả non, phôi hạt đang sinh trưởng và cả thượng tầng…[7]
 Cơ chế tác dụng của auxin lên sự sinh trưởng của cây
Vai trò của auxin là gây nên sự giảm pH cho thành tế bào bằng cách hoạt hóa
bơm proton (H+) nằm trên màng sinh chất ngoài (plasmalem). Khi có mặt của auxin thì
bơm proton hoạt động và bơn H+ vào thành tế bào làm độ pH từ 6 - 7 giảm xuống 4 và
hoạt hóa enzyme xúc tác cho phản ứng cắt đứt các cầu nối ngang polisaccarit giữa các
sợi cellulose với nhau làm cho các sợi cellulose tách rời nhau và rất dễ dàng trượt lên
nhau. Dưới ảnh hưởng của sức trương tế bào do không bào hút nước vào mà các sợi
cellulose đã mất liên kết, lỏng lẻo rất dễ trượt lên nhau làm cho thành tế bào giãn ra.
Để tế bào sinh trưởng được thì song song với sự giãn thành tế bào, xảy ra sự tổng hợp
mới các cấu tử cấu tạo nên thành tế bào và cả chất nguyên sinh (cellulose, pectin,
protein,…). Với hiệu ứng này auxin đóng vai trò hoạt hóa gene để tổng hợp nên các
enzime cần thiết cho sự tổng hợp các vật chất đó [7].
2.3.2 Cytokinin
Cytokinin là chất kích thích sinh trưởng gồm có kinetin, BA, PBA,… có tác
dụng làm tăng sự phân chia tế bào. Kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh
và làm hạn chế sự hóa già của tế bào. Ngoài ra các chất này có tác dụng lên quá trình
trao đổi chất, quá trình tổng hợp DNA, tổng hợp protein và làm tăng cường hoạt tính
của một số enzyme. Cơ chế tác dụng của cytokinin ở mức độ phân tử trong tế bào thể
hiện bằng tác dụng tương hỗ của cytokinin với các nucleoprotein làm yếu mối liên kết
của histon với DNA, tạo điều kiện cho sự tổng hợp DNA.
Nhiều nghiên cứu khẳng định rằng cytokinin được hình thành chủ yếu trong hệ
thống rễ của thực vật. Ngoài ra một số cơ quan còn non đang sinh trưởng mạnh cũng
có khả năng tổng hợp cytokinin như chồi, lá non, quả non, tầng phát sinh,…
10

Cytokinin được vận chuyển trong cây không phân cực như auxin, có thể hướng
ngọn và hướng gốc. Ở trong cây, chúng bị phân giải bằng các enzyme, tạo nên sản
phẩm cuối cùng là urê.
Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hóa cơ quan của thực
vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi. Từ lâu người ta đã chứng minh rằng sự cân bằng tỷ lệ
giữa auxin (phân hóa rễ) và cytokinin (phân hóa chồi) có ý nghĩa rất quyết định trong
quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy in vitro cũng như trên cây nguyên vẹn.
Nếu tỷ lệ auxin cao hơn cytokinin thì kích thích sự ra rễ, còn tỷ lệ cytokinin cao hơn
auxin sẽ kích thích sự xuất hiện và phát triển của chồi. Để tăng hệ số nhân giống, người
ta tăng nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi in vitro… [6]
Cytokinin trong một số trường hợp ảnh hưởng lên sự nảy mầm của hạt và củ. Vì vậy
nếu xử lý cytokinin có thể phá bỏ trạng thái ngủ, nghỉ của hạt, củ, chồi…Ngoài ra trong mối
tương tác với auxin, cytokinin có ảnh hưởng tới ưu thế ngọn của cây. Cytokinin làm yếu
hiện tượng ưu thế ngọn, làm phân cành nhiều. chính vì vậy mà từ rễ (cơ quan tổng hợp
cytokinin) lên chồi (cơ quan tổng hợp auxin) thì hiện tượng ưu thế ngọn tăng dần tương ứng
với sự tăng hàm lượng auxin và giảm hàm lượng cytokinin.
Khi thiếu cytokinin thì tế bào không phân chia mặc dù DNA có thể tiếp tục
được tổng hợp nhưng quá trình tổng hợp protein không xảy ra. Vì vậy cytokinin kiểm
tra sự tổng hợp protein ở giai đoạn từ mRNA (dịch mã).
Hiệu quả của cytokinin ngăn chặn sự hóa già có liên quan nhiều đến khả năng
ngăn chặn sự phân hủy protein, acid nucleic và chlorophyn hơn là khả năng kích thích
tổng hợp chúng. Có lẽ cytokinin ngăn chặn sự tổng hợp mRNA điều khiển sự tổng hợp
nên các enzym thủy phân [7].
2.4 Giới thiệu về vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
2.4.1 Vị trí phân loại
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Alpha Proteobacteria
Bộ: Rhizobiales

Họ: Rhizobiaceae
Chi: Agrobacterium
Loài: Agrobacterium rhizogenes
11


Hình 2.2: Rễ phụ do A.rhizogenes gây ra trên cây khoai tây [21]
2.4.2 Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
Agrobacterium rhizogenes là vi khuẩn gram âm sống trong đất sở hữu Riplasmid thuộc họ Rhizobiaceae. Nó gây ra bệnh trên tầng lông hút của rễ cây song tử
diệp. A. rhizogenes là loài vi khuẩn gây bệnh cho thực vật được sử dụng như các
vector tự nhiên để mang các gen ngoại lai vào mô và tế bào thực vật. A. rhizogenes có
chứa một plasmid lớn kích thước khoảng 200 kb gọi là Ri-plasmid (root inducing
plasmid) mang tính chất gây ung bứu, chính là tác nhân gây bệnh cho cây [1]. Khi cây
bị nhiễm A. rhizogenes qua các vết thương, biểu hiện bệnh rõ nhất là các rễ bất định
hình thành ở ngay chỗ lây nhiễm. Người ta hiện biết tương đối khá ít về T-DNA của
Ri plasmid. Sự hình thành rễ bất định sau đó có thể tiếp tục mà không cần thiết phải có
sự hiện diện của vi khuẩn. Khả năng này có được do A. rhizogenes đã chuyển một
đoạn DNA của Ri-plasmid (T-DNA) xâm nhập vào hệ gen của cây bị bệnh. Vi khuẩn
này thường được sử dụng trong nuôi cấy mô để nuôi cấy rễ chuyển gene (Hairy roots)
sản xuất các hợp chất thứ cấp [4].
2.4.3 Ri-plasmid
Plasmid là các vòng DNA tự sinh sản độc lập. Đặc điểm quan trọng của
plasmid là chúng có thể liên kết vào nhiễm sắc thể nhưng cũng có thể tồn tại bên ngoài
nhiễm sắc thể một cách độc lập. Ri-plasmid chứa các gen vir, vùng gen cần chuyển (TDNA) và một số gen mã hoá cho việc tái sinh plasmid.
2.4.4 Chức năng T-DNA
T-DNA là một đoạn DNA có kích thước 10-30 kb trong đó chứa gene mã hóa
cho sinh tổng hợp auxin, opine. Khi cây nhiễm A. rhizogenes, do T-DNA nạp vào
trong hệ gene của cây chủ bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin và opine, toàn bộ
sinh trưởng của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các rễ bất
12

định. Opine được vi khuẩn sử dụng như một loại “thức ăn” nhờ gene chuyển hóa opine
trên Ri-plasmid [4]. Trong nhiều dòng của A. rhizogenes, nó sản xuất ra opine
agropine, T-DNA được tách ra thành hai phần: TL và TR. Các gene tổng hợp agropine
và auxin định vị trên đoạn sau cùng. Điều này khác với octopine Ti plasmid, chúng có
gene auxin trên đoạn TL. Điều khá lý thú là các T-DNA của Ri plasmid sản xuất những
opine như: cucumopine và mannopine đều không có gene auxin, nhưng lại cho ra kiểu
hình “hairy root”. Trong trường hợp này auxin dường như được cung cấp bởi cây và
các gene auxin có vai trò là các auxin phụ trợ khi nó thiếu auxin [1].
Trong Ri-plasmid, vị trí của T-DNA được giới hạn bằng right border (RB) và
left border (LB). Trình tự nucleotide của bờ phải và bờ trái tương tự nhau và đều có
kích thước 25bp. Một chuỗi mã có tính chất lặp lại bao gồm 24 nucleotide, được tìm
thấy rất gần vùng biên giới của T-DNA, được gọi là “T-DNA border”. Chuỗi này có
vai trò vô cùng quan trọng cho quá trình dịch chuyển. Bất cứ chuỗi DNA nào định vị
giữa hai chuỗi “border”, nó đều được chuyển vào cây. Đặc điểm này đã được khai thác
trong kĩ thuật di truyền (Grierson và Covey, 1988) (theo trích dẫn của Bùi Chí Bửu,
Nguyễn Thị Lang, 2000). Border bên phải của T-DNA (RB) được định vị trên một
hoặc hai nucleotide của chuỗi mã có 24 nucleotide, border bên trái của T-DNA (LB)
biến động nhiều hơn, nó định vị trên cả chuỗi mã 24bp cho đến 100bp [1]. Do đó,
chuỗi DNA 25bp (RB và LB của T-DNA) có vai trò là vị trí cảm ứng cho các sản
phẩm của tổ hợp các gene vùng vir, đặc biệt là protein từ gene virE mang chúng dẫn
truyền vào tế bào thực vật. Chúng hoạt động như các tín hiệu nhận biết và khởi động
quá trình dẫn truyền.
2.4.5 Chức năng các gene vir
Trong các vùng DNA của Ri plasmid, ngoài T-DNA, được nghiên cứu nhiều
hơn cả là vùng DNA phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir. Sản phẩm hoạt
động của các gene nằm trong vùng vir dưới tác động kích thích của các hợp chất bảo
vệ phenol tiết ra từ vết thương là một loạt các protein vir đặc hiệu từ A đến G. Các
protein này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết là cây hai lá

mầm), kích thích sản sinh ra các đoạn T-DNA, bao bọc che chở các đoạn DNA này và
giúp chúng tiếp cận với hệ gene của cây chủ một cách an toàn.
Các sản phẩm protein của vùng vir có tác dụng cho việc dẫn truyền T-DNA từ
vi khuẩn vào tế bào thực vật. Các loại protein đó rất cần thiết cho quá trình cắt T-DNA
13


khỏi Ri plasmid, cảm ứng thay đổi màng tế bào thực vật mà chúng tiếp xúc, tham gia
di chuyển phần T-DNA qua màng vi khuẩn tới tế bào chất của tế bào thực vật, vận
chuyển tới nhân rồi cuối cùng xâm nhập vào genome của cây chủ [4].
VirA và virG nhận diện và tương tác với hợp chất phenolic tiết ra từ tế bào cây
trồng bị thương, làm kích hoạt các gene độc khác ở vùng vir, tạo các protein cần thiết.
VirD2 mã hóa enzyme endonuclease, enzyme này sẽ cắt T-DNA tại vị trí
nucleotide thứ 3 và thứ 4 trên trình tự bờ phải 25 bp để tạo ra phân tử sợi đơn T-DNA.
Protein này liên kết đồng hoá trị với đầu 5’ (định vị ở border bên phải, nơi rất cần cho
tiến trình di chuyển) của sợi đơn T-DNA, bắt đầu cho sự tổng hợp sợi T-DNA, hình
thành phức hợp T-DNA, dẫn đường cho phức hợp xuyên qua kênh vận chuyển. Ngoài
ra, Protein VirD2 được cho là có chức năng trong sự hòa hợp T-DNA, bởi nó gắn vào
đầu 5’ của T-DNA, đưa T-DNA vào nhân tế bào và lưu lại cùng với T-DNA trong các
bước hòa hợp. Hai giả thuyết về chức năng của protein VirD2 trong sự hòa hợp TDNA đã được đề nghị: VirD2 hoạt động như một integrase và VirD2 hoạt động như
một ligase [3].
VirC1 đã được thấy gắn kết vào vùng “overdrive”, vùng này nằm gần bờ phải,
và bởi vậy giúp tăng cường sự cắt T-DNA ở vị trí bờ vai của VirD2 endonuclease đẩy
mạnh hiệu quả tổng hợp sợi T-DNA.
Protein VirE2 là một protein gắn trên sợi đơn DNA , nó sẽ bảo vệ T-DNA khỏi
sự phân giải của các enzyme nuclease trong tế bào cây.
VirB11 và VirB4 tổng hợp kênh vận chuyển xuyên qua bên trong và bên ngoài
màng tế bào vi khuẩn có chức năng cất giấu giúp cho việc vận chuyển phức hợp TDNA vào trong tế bào cây trồng. Hệ thống chuyển nạp T-DNA (kênh vận chuyển)
được mã hóa bởi operon virB, operon này mang 11 gene. Sự chuyển phức hợp T-DNA
dựa trên chiên mao (pili) do operon virB mã hoá và đột biến ở bất kì gene nào trong số

11 gene của operon này đều làm mất khả năng tạo pili và tạo khối u (Lai và Kado,
1998) (Theo trích dẫn của Ngô Việt Duy, 2005). Các protein VirB điều khiển tạo chiên
mao và VirB2 là tiểu phần chính của chiên mao này. Hai protein VirB4 và VirB11 có
hoạt tính ATPase và được cho là cung cấp năng lượng cho việc xuất các tiểu phần
protein khác, cho vận chuyển T-DNA. Hệ thống VirB đưa T-DNA tới tế bào chất của
tế bào cây, nơi đây các bước cần cho chuyển T-DNA vào nhân và hòa hợp với DNA
của cây được thực hiện [3].
14