Tách chiết và chuyển hoá chlorophyll a từ vi khuẩn cyanobacteria

퇬
퇬 Á 퇬 Љ1퇬¿11퇬11퇬1 퇬


퇬
2
222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222222222

222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222퇬 38 퇬
2.4.3 Cấu trúc của chlorin e6 – trimethylester 퇬 38 퇬
CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 퇬 40 퇬
3.1 Tách chiết và chuyển hoá chlorophyll a thành Pheophytin
a.
퇬 40 퇬
3.2 Thực hiện phản ứng chuyển hoá chlorophyll a thành
metylpheophobide a.
퇬 43 퇬
3.2.1 Đánh giá hai phương pháp
퇬 46 퇬
3.3 Chuyển hoá Metylpheophobide a thành chlorin – e6
trimethylester 퇬 47 퇬


퇬
CHƯƠNG IV : KẾT LUẬN 퇬 51 퇬
PHỤ LỤC 퇬 52 퇬
TÀI LIỆU THAM KHẢO
퇬 71 퇬


퇬
LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS. Đoàn
Duy Tiên đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn em làm nghiên
cứu khoa học.

Em xin cảm ơn thầy cô giáo ở bộ môn Hoá hữu cơ đã dạy
cho em những kiến thức bổ ích, và tạo điều kiện cho em
hoàn thành luận văn tốt nghiệp cao học này.
Em xin cảm ơn các anh chị, và các bạn học viên, sinh viên
trong phòng Tổng hợp hữu cơ 2 đã giúp đỡ em rất nhiều
trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu này.
Hà Nội, ngày
Học viên

Trần Thị Hiền

tháng

năm 2011


55
MỞ ĐẦU
Đã hơn thế kỷ nay, các nhà khoa học rất quan tâm tới việc
chiết tách các sắc tố từ lá xanh của thực vật bậc cao. Cách
đây hơn 100 năm các nhà hóa học đã tách được chất màu
xanh từ lá và gọi chúng là Chlorophyll. Vào năm 1913,
Richard Willstatter, nhà hóa học ngườI Đức đã chỉ ra rằng tất
cả các năng lượng sống đều nhờ mặt trời. Cây xanh có một
cách nào đó để giữ năng lượng mặt trời. Tới năm 1919, ông
đã giải thích được chức năng của chất giữ năng lượng mặt
trời chính là chất được gọi là Chlorophyll. Thực vật bậc cao
có lá xanh đã tự mình hấp thụ được năng lượng tia bức xạ và
chuyển hóa thành năng lượng dự trữ trong cơ thể.
Chlorophyll giữ vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình

quang hợp, là chất đầu tiên nhận năng lượng ánh sáng cho
hệ quang hợp. Chlorophyll hấp thụ ánh sáng chuyển về dạng
năng lượng ATP, trong quá trình này xảy ra các phản ứng
chuyển dịch electron (phản ứng oxy hóa khử) tạo thành các
sản phẩm oxy hóa và khử.
Chlorophyll có những ứng dụng khác nhau trong y học, công
nghiệp. Trong y học, chlorophyll được chú ý nhiều như một
thành phần cơ bản cho khẩu phần ăn kiêng chữa bệnh và
như là chất chữa bệnh. Thí dụ chlorophyllin dẫn xuất kim loại
của chlorophyll, có tiềm năng phòng chống các chất gây ung
thư từ thức ăn bị thiu mốc như hydrocarbon mạch vòng,
aflatoxin. Chlorophyll và các dẫn xuất còn được sử dụng như
là chất cảm thụ ánh sáng để diệt các tế bào ung thư và
chống virus, chất kháng bổ thể, chất chữa vết thương và khử
mùi hôi.
Chlorophyll ức chế phát triển của vi khuẩn, kích thích việc
phục hồi các mô đã bị hư hại và bảo vệ con người khỏi các
chất gây ung thư. Chlorophyll còn giúp cho tiêu hóa tốt và
làm cho da thêm đẹp…
Đã có những công trình nghiên cứu khả năng chữa bệnh của
các hợp chất với chlorophyll để chữa, tiêu diệt tế bào ung thư
tủy, virus leukemia, u ác tính (malignant melanoma).
Chlorophyll còn có tác dụng giảm viêm khớp (arthritis), xử lý
các u xơ, giảm mùi hôi, giảm đường máu của người bệnh già.
Chlorophyll có nhiều loại, chlorophyll (a, b, c, d, …), trong đó
chlorophyll a rất phổ biến trong tự nhiên, đó là chất diệp lục


66
trong hệ quang hợp của thực vật bậc cao, tảo biển, và vi

khuẩn quang hợp. Tuy nhiên trong thực vật bậc cao hệ thống
quang hợp có cấu tạo rất phức tạp và bao gồm nhiều loại
chlorophyll khác nhau. Quá trình tách các chlorophyll ra khỏi
nhau rất khó khăn và phức tạp. Trong các loại vi khuẩn
quang hợp thì vi khuẩn lam có cấu tạo hệ quang hợp đơn
giản nên việc phân lập dễ dàng hơn.Vì vậy tôi đã lựa chọn “
Tách chiết và chuyển hoá chlorophyll a từ vi khuẩn
cyanobacteria” làm đề tài cho luận văn tốt nghiệp cao học
của mình.


77
CHƯƠNG I : TỔNG QUAN
1.1 Cấu tạo và tính chất của hệ quang hợp
1.1.1 Cấu tạo và tính chất của hệ quang hợp ở thực vật và vi
khuẩn
Quang hợp là cơ sở năng lượng của sự sống trên trái đất. Do
ánh sáng điện tử chuyển từ sắc tố diệp lục trong các trung
tâm phản ứng quang hợp của vi khuẩn và thực vật, cuối
cùng hình thức NADPH và ATP được sử dụng để sản xuất
carbohydrate (Hình 1.1).
퇬

퇬

Hình 1.1: Việc sử dụng năng lượng bức xạ cho sự tổng hợp
của các phân tử hữu cơ
Các chất diệp lục có thể được coi là chất quang dẫn nằm
trong vùng ánh sáng hấp thụ và trung tâm phản ứng của bộ
máy quang hợp. Các chất diệp lục hấp thụ và chuyển đổi

quang năng thành hoá năng với hiệu suất cao.
Các hệ thống quang hợp (PS) (hình 1.2) phân loại theo cấu
trúc của trung tâm phản ứng, bao gồm PSI của vi khuẩn lam,
PSII của thực vật bậc cao và PS của vi khuẩn tía, bao gồm
bốn thành phần chính là ăng-ten, các trung tâm phản ứng,
khu chuyển điện tử và bộ máy cố định carbon. [5,3]
Hình 1.2 :Các hệ thống quang hợp.[28]
Ở trung tâm phản ứng của vi khuẩn tía, tiểu đơn vị protein L
và M, gắn các sắc tố hoạt động trong sự phân chia điện tích,
là bộ phận có liên quan với nhau bởi đối xứng bậc hai. Trung


88
tâm phản ứng được bao quanh bởi một vòng ánh sáng của
các protein thu hoạch (LH1). Các electron được chuyển vào
trung tâm phản ứng của một heme-binding cytochrome
(cyt).
Trong PSII , những protein D1 và D2 có cấu trúc và chức năng
tương đồng với các tiểu đơn vị L và M của trung tâm phản
ứng ở vi khuẩn và tổ chức các sắc tố hoạt động trong một
hình dạng tương tự. Năng lượng ánh sáng được thu thập bởi
LHCII và chuyển vào trung tâm phản ứng bởi nhân protein
chất diệp lục thu thập các lượng tử ánh sáng, CP43 và CP47,
được đặt ở bên cạnh của heterodimer D1-D2 (protein cấu
thành từ các polypeptit vốn khác nhau ở các dãy axit amin).
Việc phân tách điện tích cho phép các nhóm mangan trên bề
mặt lumen ôxi hóa nước và giải phóng oxi vào khí quyển.
Trong PS I, các protein PsaA và PsaB tạo thành một
heterodimer giống PSII. Mỗi PsaA và PsaB bao gồm một trung
tâm phản ứng tương đương với D1 hoặc D2, và một nhân

ăng - ten tương đương với CP43 hoặc CP47. Điện tử được lấy
từ liên kết thuận nghịch plastocyanin (PC) ở bên trên lumen,
và giao cho các cụm sắt sunfua (FeS) ở phía trên stroma , nơi
chúng được sử dụng để giảm NADP+ tới NADPH [28].
Hệ thống ăng-ten quang (Hình 1.3 và Hình 1.4) được tổ chức
để thu thập và cung cấp năng lượng cho một trạng thái kích
thích bằng cách kích thích chuyển tới các khu trung tâm
phản ứng nơi phản ứng quang hoá diễn ra. Loại đầu tiên của
ăng-ten bao gồm một heterodimer của các chuỗi axit amin
và hai phân tử chất diệp lục a, b trong khi loại thứ hai của
ăng-ten bao gồm một heterodimer của chuỗi axit amin dài
cùng với ba phân tử chất diệp lục a, b . Đại đa số các sắc tố
như carotenoid (Hình 1.5) trong một sinh vật quang hợp
không hoạt động hoá học, nhưng chức năng chủ yếu như
một ăng-ten


99
퇬

퇬

Hình 1.3 : Hệ thống ăng ten của các vi khuẩn tía
-một chất màu protein vòng phức hợp.[29]
Hệ thống ăng-ten tăng phần hiệu quả của sự hấp thụ qua
photon bằng cách tăng số lượng sắc tố nằm ở mỗi phức hợp
quang hóa. Cường độ của ánh sáng mặt trời là khá thấp và
một phân tử diệp lục duy nhất chỉ hấp thụ một vài photon
trong một giây. Bằng cách kết hợp nhiều chất màu vào một
đơn vị duy nhất, phản ứng sinh tổng hợp trung tâm và chuỗi

vận chuyển điện tử có thể được sử dụng với hiệu quả tối đa.
Sự đa dạng nổi bật của ăng-ten phức hợp đã được xác định
từ các lớp khác nhau của các sinh vật quang hợp. Kích thích
chuyển giao phải được nhanh chóng, đủ để cung cấp kích
thích trung tâm phản ứng quang hóa trong một thời gian
tương đối ngắn so với các thời gian trạng thái kích thích
trong trường hợp không có sự thu thập. Thời gian sống của
phức hợp ăng-ten, nơi trung tâm phản ứng được loại bỏ,
thường trong khoảng 1-5 ns. Quan sát thời gian trạng thái
kích thích của các hệ thống ăng-ten, nơi được kết nối với
trung tâm phản ứng này thường trên vài chục pico giây, đó là
đủ nhanh để có điều kiện sinh lý hầu như tất cả năng lượng
ánh sáng bị giữ lại là tiếp tục sử dụng trong các phản ứng
quang hóa.[1,4,7,12,15,26,27,29]


1010
Hình 1. 4: Ánh sáng hấp thụ phức hợp II ăng-ten protein của
thực vật
-một trimer với 14 chất diệp lục và 3 carotenoid cho một tiểu
đơn vị protein[15]
퇬퇬
Hình 1.5: Carotenoids của trung tâm phản ứng.
Phản ứng trung tâm bao gồm hàng trăm các chất diệp lục
ánh sáng thu hoạch và một cặp đặc biệt của chất diệp lục
quang hoá phản ứng một trong màng tế bào. Các phản ứng
quang hóa của loại trung tâm phản ứng I không sản xuất bất
kỳ oxy nào trong khi ở trung tâm phản ứng loại II oxy được
tạo thành.
Trung tâm phản ứng của vi khuẩn virdis Rhodopseudomonas

bao gồm bốn tiểu đơn vị protein (Hình 1.6). Hai trong số đó,
L và M , hình thức mở rộng năm màng xoắn. Cấu trúc này
cho thấy sự sắp xếp chính xác trong tiểu đơn vị L và M của
các nhóm hoạt động quang hoá có chứa một dimer của hai
monomeric chất diệp lục , hai phân tử pheophytin, phân tử
quinone QA, phân tử quinone và một ion sắt QB (Fe). Tiểu
đơn vị L và M và các nhóm mang màu của chúng có liên
quan bởi một trục đối xứng gồm hai phần đi qua dimer chất
diệp lục và sắt. Một tiểu đơn vị thứ ba H, không có nhóm
hoạt động và nằm trên bề mặt bên trong màng tế bào, được
neo vào các màng tế bào của một chuỗi xoắn protein. Các
tiểu đơn vị còn lại, một cytochrome ( một trong các chất màu
hô hâps protein phức chất) với bốn nhóm heme tương tự như
các sắc tố hemoglobin trong máu, gắn ở bề mặt ngoài của
màng.
Hình 1.6: Cấu trúc trung tâm phản ứng
của vi khuẩn Rhodopseudomonas virdis .[6]
Chuỗi vận chuyển điện tử là những hệ thống của các protein
và enzyme thông qua đó kích thích các electron di chuyển từ
mức năng lượng cao hơn về một mức độ năng lượng thấp
(Hình 1.7). Chúng bao gồm 3 khu phức hợp của các phân tử.
Trong chuỗi vận chuyển điện tử của màng thylakoid, các


1111
enzym của chất khử sắt, plastoquinon oxidoreductase và mở
rộng màng siêu phân tử phức hợp chất xúc tác cho việc sản
xuất năng lượng cao phân tử NADPH và ATP. Dòng electron
chảy từ nước tới NADP đòi hỏi ánh sáng và được nối với hệ
của một chuỗi proton qua màng thylakoid. Chuỗi proton này

được sử dụng để tổng hợp ATP. Khi các electron di chuyển
xuống dây chuyền vận chuyển, các protein luân phiên bị oxi
hoá và làm ngắn dần, giải phóng ra proton vào không gian
bên trong màng thylakoid. Nếu không có vận chuyển điện tử
dần dần từ trạng thái năng lượng cao đến trạng thái năng
lượng thấp, thì sự mất mát năng lượng từ một điện tử xảy ra
quá nhanh chóng ngăn các tế bào sử dụng năng lượng ánh
sáng.
Hình 1.7: Chuỗi eletron vận chuyển của màng thylakoid
Carbohydrates được sản xuất từ khí cacbonic và nước trong
pha tối của máy cố định cacbon bằng cách sử dụng xúc tác
enzyme và năng lượng từ ATP hoặc NADPH theo chu trình
Calvin-Benson C6 (Hình 1.8) hoặc chu trình C4 (Hình 1.9).
Hình 1.8: Cố định Carbon C6 theo chu trình Calvin-Benson.
Cố định Carbon dioxide liên quan đến một số phản ứng, gọi
là chu trình Calvin-Benson C6, mà tiền thu được trong stroma
của lạp lục. Các phản ứng ban đầu cố định CO2 liên quan
đến enzyme ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase
oxygenase (RuBisCO), nó có thể phản ứng với hoặc oxy dẫn
đến sự quang hô hấp hoặc với CO2. Các phản ứng của
RuBisCO với oxy hoặc với CO2 phụ thuộc vào nồng độ tương
đối của hai hợp chất tại vị trí của phản ứng. Trong tất cả các
sinh vật, thường khí CO2 là chất nền ưu tiên, nhưng nếu
nồng độ CO2 trở nên thấp hơn nhiều so với nồng độ oxy thì
sự quang hô hấp nào xảy ra ở mức độ đáng kể.

Hình 1.9: Máy móc cố định cacbon C4


1212

Ở một số loại thực vật, được gọi là chu trình C4 (Hình 9), sử
dụng phosphoenolpyruvate (PEP) để cố định CO2. Tỷ lệ tổng
lượng ATP cho mỗi cố định CO2 trong thực vật chu trình C4
là cao hơn trong các loại thực vật khác.
1.1.2 Chlorophyll
1.1.2.1 Cấu tạo và tính chất của chlorophyll a và các
chlorophyll khác
1.1.2.1.1 Cấu tạo
Có 5 loại diệp lục: a, b, c, d, e. Ở thực vật bậc cao chỉ có 2
loại diệp lục a và b; còn diệp lục c, d, e có ở vi sinh vật, rong,
tảo, vi khuẩn.
Về công thức cấu tạo, phân tử diệp lục chia ra hai phần:
nhân diệp lục và đuôi diệp lục.
퇬퇬
Hình 1.10: Công thức cấu tạo của diệp lục a

Diệp
a
Diệp
b
Diệp
c1
Diệp
c2
Diệp
d

lục tố
lục tố
lục tố

lục tố
lục tố

Công thức
phân tử
C55H72O5N4Mg
C55H70O6N4Mg
C35H30O5N4Mg
C35H28O5N4Mg
C54H70O6N4Mg


1313

Nhóm C3
-CH=CH2
-CH=CH2
-CH=CH2
-CH=CH2
-CHO
Nhóm C7
-CH3
-CHO
-CH3
-CH3
-CH3
Nhóm C8
-CH2CH3
-CH2CH3
-CH2CH3

-CH=CH2
-CH2CH3
Nhóm C17
-CH2CH2COO-Phytyl
-CH2CH2COO-Phytyl
-CH=CHCOOH
-CH=CHCOOH
-CH2CH2COO Phytyl
Liên kết C17-C18
Đơn
Đơn
Kép
Đơn
Kép
Tần suất
Phổ biến


1414
Đa số thực vật
Các loại tảo khác nhau
Các loại tảo khác nhau
Vi khuẩn lam
(cyanobacteria)
Bảng 1.1: Thành phần của các chlorophyll khác nhau
Nhân diệp lục là phần quan trọng nhất trong phân tử diệp
lục, gồm 1 nguyên tử Mg ở trung tâm liên kết với 4 nguyên
tử N của 4 vòng pyrol tạo nên vòng Mg-pocphirin rất linh
hoạt. Phần nhân diệp lục có một hệ thống nối đôi đơn cách
đều tạo nên phân tử diệp lục có hoạt tính quang hoá mạnh.

Khả năng hấp thu ánh sáng phụ thuộc số lượng liên kết đôi
trong phân tử. Hệ thống liên kết có năng lượng liên kết rất
nhỏ nên dễ dàng bị kích động khi tiếp nhận năng lượng ánh
sáng để bật ra khỏi quỹ đạo cơ bản của nó. Đây là trạng thái
kích thích của phân tử diệp lục khi nhận năn 퇬 Á 퇬
Љ14퇬¿1414퇬1414퇬14 퇬


1515
퇬퇬퇬퇬 151515151515151515Љ 퇬
퇬 퇬 퇬 151515'15151515151515151515퇬 15151515
퇬 15151515퇬 1515151515151515·1515퇬 151515 퇬 15퇬15151
5퇬151515퇬 151515 퇬 151515 퇬 15t151515151515 15퇬
151515퇬
1
51515퇬
15È15퇬 15ϼ15퇬15ƌ15퇬
151515 퇬
15ʸ15ḭ15Պ15⍷15"15퇬151515퇬151515퇬151515☢15퇬15퇬15Ǥ1
5퇬15ô15퇬 1515 퇬 151515 퇬 151515 퇬 151515 퇬 151515 퇬
151515 퇬 15$15퇬 15ʢ15퇬 15^15퇬
15ť151515151515151515퇬 151515 퇬
1515151515151515151515◢15@15☢151515퇬 151515 퇬
151515 퇬 1515 퇬 Á 퇬 Љ15퇬¿1515퇬1515퇬15 퇬


1616
퇬퇬퇬퇬 161616161616161616Љ 퇬
퇬 퇬 퇬 161616'16161616161616161616퇬 16161616
퇬 16161616퇬 1616161616161616·1616퇬 161616 퇬 16퇬16161

6퇬161616퇬 161616 퇬 161616 퇬 16t161616161616 16퇬
161616퇬
1
61616퇬
16È16퇬 16ϼ16퇬16ƌ16퇬
161616 퇬
16ʸ16ḭ16Պ16⍷16"16퇬161616퇬161616퇬161616☢16퇬16퇬16Ǥ1
6퇬16ô16퇬 1616 퇬 161616 퇬 161616 퇬 161616 퇬 161616 퇬
161616 퇬 16$16퇬 16ʢ16퇬 16^16퇬
16ť161616161616161616퇬 161616 퇬
1616161616161616161616◢16@16☢161616퇬 161616 퇬
161616 퇬 1616 퇬 Á 퇬 Љ16퇬¿1616퇬1616퇬16 퇬


1717
퇬퇬퇬퇬 171717171717171717Љ 퇬
퇬 퇬 퇬 171717'17171717171717171717퇬 17171717
퇬 17171717퇬 1717171717171717·1717퇬 171717 퇬 17퇬17171
7퇬171717퇬 171717 퇬 171717 퇬 17t171717171717 17퇬
171717퇬
1
71717퇬
17È17퇬 17ϼ17퇬17ƌ17퇬
171717 퇬 17ʸ17ḭ17Պ17⍷17"1717
퇬 171717 퇬 171717 퇬 171717 퇬 171717 퇬 17$17퇬 17ʢ17퇬
17^17퇬 17ť171717171717171717퇬 171717 퇬
1717171717171717171717◢17@17☢171717퇬 171717 퇬
171717 퇬 1717 퇬 Á 퇬 Љ17퇬¿1717퇬1717퇬17 퇬

1818
퇬퇬퇬퇬 181818181818181818Љ 퇬
퇬 퇬 퇬 181818'18181818181818181818퇬 18181818
퇬 18181818퇬 1818181818181818·1818퇬 181818 퇬 18퇬18181
8퇬181818퇬 181818 퇬 181818 퇬 18t181818181818 18퇬
181818퇬
1
81818퇬
18È18퇬 18ϼ18퇬18ƌ18퇬
181818 퇬
18ʸ18ḭ18Պ18⍷18"18퇬181818퇬181818퇬181818☢18퇬18퇬18Ǥ1
8퇬18ô18퇬 1818 퇬 181818 퇬 181818 퇬 18181818 퇬 181818 퇬
1818181818181818181818◢18@18☢181818퇬 181818 퇬
181818 퇬 1818 퇬 Á 퇬 Љ18퇬¿1818퇬1818퇬18 퇬


1919
퇬퇬퇬퇬 191919191919191919Љ 퇬
퇬 퇬 퇬 191919'19191919191919191919퇬 19191919
퇬 19191919퇬 1919191919191919·1919퇬 191919 퇬 19퇬19191
9퇬191919퇬 191919 퇬 191919 퇬 19t191919191919 19퇬
191919퇬
1
91919퇬
19È19퇬 19ϼ19퇬19ƌ19퇬
191919 퇬
19ʸ19ḭ19Պ19⍷19"19퇬191919퇬191919퇬191919☢19퇬19퇬19Ǥ1
9퇬19ô19퇬 1919 퇬 191919 퇬 191919 퇬 191919 퇬 191919 퇬
191919 퇬 19$19퇬 19ʢ19퇬 19^19퇬
19ť191919191919191919퇬 191919 퇬

1919191919191919191919◢19@19☢191919퇬 191919 퇬
191919 퇬 1919 퇬 Á 퇬 Љ19퇬¿1919퇬1919퇬19 퇬


2020
퇬퇬퇬퇬 202020202020202020Љ 퇬
퇬 퇬 퇬 202020'20202020202020202020퇬 20202020
퇬 20202020퇬 2020202020202020·2020퇬 202020 퇬 20퇬20202
0퇬202020퇬 202020 퇬 202020 퇬 20t202020202020 20퇬
202020퇬
2
02020퇬
20È20퇬 20ϼ20퇬20ƌ20퇬
202020 퇬
20ʸ20ḭ20Պ20⍷20"20퇬202020퇬202020퇬202020☢20퇬20퇬20Ǥ2
0퇬20ô20퇬 2020 퇬 202020 퇬 202020 퇬 202020 퇬 202020 퇬
202020 퇬 20$20퇬 20ʢ20퇬 20^20퇬
20ť202020202020202020퇬 202020 퇬
2020202020202020202020◢20@20☢202020퇬 202020 퇬
202020 퇬 2020 퇬 Á 퇬 Љ20퇬¿2020퇬2020퇬20 퇬


2121
퇬퇬퇬퇬 212121212121212121Љ 퇬
퇬 퇬 퇬 212121'21212121212121212121퇬 21212121
퇬 21212121퇬 2121212121212121·2121퇬 212121 퇬 21퇬21212
1퇬212121퇬 212121 퇬 212121 퇬 21t212121212121 21퇬
212121퇬
2
12121퇬

21È21퇬 21ϼ21퇬21ƌ21퇬
212121 퇬
21ʸ21ḭ21Պ21⍷21"21퇬212121퇬212121퇬212121☢21퇬21퇬21Ǥ2
1퇬21ô21퇬 2121 퇬 212121 퇬 212121 퇬 212121 퇬 212121 퇬
212121 퇬 21$21퇬 21ʢ21퇬 21^21퇬
21ť212121212121212121퇬 212121 퇬
2121212121212121212121◢21@21☢212121퇬 212121 퇬
212121 퇬 2121 퇬 Á 퇬 Љ21퇬¿2121퇬2121퇬21 퇬


2222
퇬퇬퇬퇬 222222222222222222Љ 퇬
퇬 퇬 퇬 222222'22222222222222222222퇬 22222222
퇬 22222222퇬 2222222222222222·2222퇬 222222 퇬 22퇬22222
2퇬222222퇬 222222 퇬 222222 퇬 22t222222222222 22퇬
222222퇬
2
22222퇬
22È22퇬 22ϼ22퇬22ƌ22퇬
222222 퇬
22ʸ22ḭ22Պ22⍷22"22퇬222222퇬222222퇬222222☢22퇬22퇬22Ǥ2
2퇬22ô22퇬 2222 퇬 222222 퇬 222222 퇬 222222 퇬 222222 퇬
222222 퇬 22$22퇬 22ʢ22퇬 22^22퇬
22ť222222222222222222퇬 222222 퇬
2222222222222222222222◢22@22☢222222퇬 222222 퇬
222222 퇬 2222 퇬 Á 퇬 Љ22퇬¿2222퇬2222퇬22 퇬


2323
퇬퇬퇬퇬 232323232323232323Љ 퇬

퇬 퇬 퇬 232323'23232323232323232323퇬 23232323
퇬 23232323퇬 2323232323232323·2323퇬 232323 퇬 23퇬23232
3퇬232323퇬 232323 퇬 232323 퇬 23t232323232323 23퇬
232323퇬
2
32323퇬
23È23퇬 23ϼ23퇬23ƌ23퇬
232323 퇬
23ʸ23ḭ23Պ23⍷23"23퇬232323퇬232323퇬232323☢23퇬23퇬23Ǥ2
3퇬23ô23퇬 2323 퇬 232323 퇬 232323 퇬 232323 퇬 232323 퇬
232323 퇬 23$23퇬 23ʢ23퇬 23^23퇬
23ť232323232323232323퇬 232323 퇬
2323232323232323232323◢23@23☢232323퇬 232323 퇬
232323 퇬 2323 퇬 Á 퇬 Љ23퇬¿2323퇬2323퇬23 퇬


2424
퇬퇬퇬퇬 242424242424242424Љ 퇬
퇬 퇬 퇬 242424'24242424242424242424퇬 24242424
퇬 24242424퇬 2424242424242424·2424퇬 242424 퇬 24퇬24242
4퇬242424퇬 242424 퇬 242424 퇬 24t242424242424 24퇬
242424퇬
2
42424퇬
24È24퇬 24ϼ24퇬24ƌ24퇬
242424 퇬
24ʸ24ḭ24Պ24⍷24"24퇬242424퇬242424퇬242424☢24퇬24퇬24Ǥ2
4퇬24ô24퇬 2424 퇬 242424 퇬 242424 퇬 242424 퇬 242424 퇬
242424 퇬 24$24퇬 24ʢ24퇬 24^24퇬
24ť242424242424242424퇬 242424 퇬

2424242424242424242424◢24@24☢242424퇬 242424 퇬
242424 퇬 2424 퇬 Á 퇬 Љ24퇬¿2424퇬2424퇬24 퇬


2525
퇬퇬퇬퇬 252525252525252525Љ 퇬
퇬 퇬 퇬 252525'25252525252525252525퇬 25252525
퇬 25252525퇬 2525252525252525·2525퇬 252525 퇬 25퇬25252
5퇬252525퇬 252525 퇬 252525 퇬 25t252525252525 25퇬
252525퇬
2
52525퇬
25È25퇬 25ϼ25퇬25ƌ25퇬
252525 퇬
25ʸ25ḭ25Պ25⍷25"25퇬252525퇬252525퇬252525☢25퇬25퇬25Ǥ2
5퇬25ô25퇬 2525 퇬 252525 퇬 252525 퇬 252525 퇬 252525 퇬
252525 퇬 25$25퇬 25ʢ25퇬 25^25퇬
25ť252525252525252525퇬 252525 퇬
2525252525252525252525◢25@25☢252525퇬 252525 퇬
252525 퇬 2525 퇬 Á 퇬 Љ25퇬¿2525퇬2525퇬25 퇬