tìm hiểu sự khác nhau về các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa giữa các dòng vi khuẩn edwardsiella ictaluri xác định bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và api 20e

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN







NGUYỄN TRÚC PHƯƠNG








TÌM HIỂU SỰ KHÁC NHAU VỀ CÁC CHỈ TIÊU
SINH LÝ VÀ SINH HÓA GIỮA CÁC DÒNG VI KHUẨN
Edwardsiella ictaluri XÁC ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SINH HÓA TRUYỀN THỐNG VÀ API 20E

L
L
L
U
U
U
Ậ
Ậ
Ậ
N
N
N



V
V
V
Ă
Ă
Ă
N
N
N



T
T

T
Ố
Ố
Ố
T
T
T



N
N
N
G
G
G
H
H
H
I
I
I
Ệ
Ệ
Ệ
P
P
P

Đ
Đ
Đ
Ạ
Ạ
Ạ
I
I
I



H
H
H
Ọ
Ọ
Ọ
C
C
C






N
N

N
G
G
G
À
À
À
N
N
N
H
H
H



N
N
N
U
U
U
Ô
Ô
Ô
I
I
I

T
T
T
R
R
R
Ồ
Ồ
Ồ
N
N
N
G
G
G



T
T
T
H
H
H
Ủ
Ủ
Ủ
Y
Y

Y



S
S
S
Ả
Ả
Ả
N
N
N



C
C
C
H
H
H
U
U
U
Y
Y
Y
Ê
Ê

Ê
N
N
N



N
N
N
G
G
G
À
À
À
N
N
N
H
H
H



B
B
B
Ệ
Ệ

Ệ
N
N
N
H
H
H



H
H
H
Ọ
Ọ
Ọ
C
C
C



T
T
T
H
H
H
Ủ
Ủ

Ủ
Y
Y
Y



S
S
S
Ả
Ả
Ả
N
N
N









2008
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN

NGUYỄN TRÚC PHƯƠNG





TÌM HIỂU SỰ KHÁC NHAU VỀ CÁC CHỈ TIÊU
SINH LÝ VÀ SINH HÓA GIỮA CÁC DÒNG VI KHUẨN
Edwardsiella ictaluri XÁC ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SINH HÓA TRUYỀN THỐNG VÀ API 20E







L
L
L
U
U
U
Ậ

Ậ
Ậ
N
N
N



V
V
V
Ă
Ă
Ă
N
N
N



T
T
T
Ố
Ố
Ố
T
T
T

N
N
N
G
G
G
H
H
H
I
I
I
Ệ
Ệ
Ệ
P
P
P



Đ
Đ
Đ
Ạ
Ạ
Ạ
I

I
I



H
H
H
Ọ
Ọ
Ọ
C
C
C






N
N
N
G
G
G
À
À
À
N

N
N
H
H
H



N
N
N
U
U
U
Ô
Ô
Ô
I
I
I



T
T
T
R
R
R
Ồ

Ồ
Ồ
N
N
N
G
G
G



T
T
T
H
H
H
Ủ
Ủ
Ủ
Y
Y
Y



S
S
S
Ả

Ả
Ả
N
N
N



C
C
C
H
H
H
U
U
U
Y
Y
Y
Ê
Ê
Ê
N
N
N



N

N
N
G
G
G
À
À
À
N
N
N
H
H
H



B
B
B
Ệ
Ệ
Ệ
N
N
N
H
H
H

H
H
H
Ọ
Ọ
Ọ
C
C
C



T
T
T
H
H
H
Ủ
Ủ
Ủ
Y
Y
Y



S

S
S
Ả
Ả
Ả
N
N
N







CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH
NGUYỄN THỊ TIÊN






2008
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
i

LỜI CẢM ƠN

Được làm luận văn tốt nghiệp là mong muốn của rất nhiều sinh viên, trong đó có
bản thân tôi. Tuy nhiên để có thể hoàn thành luận văn này là cả một quá trình phấn
đấu, phải mất nhiều thời gian và công sức để nghiên cứu, đồng thời phải được sự
hướng dẫn nhiệt tình của thầy cô.
Lời đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô khoa thủy sản trường Đại Học
Cần Thơ, đặc biệt là các thầy cô bộ môn sinh học và bệnh thủy sản đã truyền đạt
những kiến thức, những kinh nghiệm quý báo trong thời gian tôi theo học và nghiên
cứu tại trường.
Xin cám ơn gia đình đã động viên giúp đỡ không chỉ về vật chất mà cả về tinh thần
từ khi tôi bước chân vào trường.
Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh và chị Nguyễn Thị
Tiên đã tận tình giúp đỡ trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài.
Xin gởi lời cám ơn đến cô Nguyễn Thị Thu Hằng và thầy Đoàn Nhật Phương đã
nhiệt tình quan tâm động viên trong suốt thời gian làm cố vấn học tập.
Đồng thời xin gởi lời cám ơn đến tập thể lớp nuôi trồng và bệnh học thủy sản K30
đã động viên, hỗ trợ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.











Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

ii

TÓM TẮT

Chủng vi khuẩn tham khảo E223 cùng với 2 chủng C1, C2 phân lập trực tiếp từ cá
bệnh và 4 chủng trong tủ âm của khoa thủy sản CAF258, CAF255, 2B1, 3B3 được
sử dụng cho việc dịnh danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và
kiểm tra API 20E. Sau khi phục hồi trên TSA tiến hành test các chỉ tiêu cơ bản gồm.
Tất cả các chủng đều có đặc điểm của vi khuẩn E. ictaluri như dạng hình que,
gram âm, cho phản ứng oxidase âm tính, có khả năng lên men và oxi hóa đường
glucose, không có khả năng sinh khí H
2
S và không tạo sản phẩm indole. Hầu hết
các chỉ tiêu đều giống nhau ở cả 2 phương pháp.
Đề tài cũng tiến hành điện di, kết quả sản phẩm PCR có sự hiện diện của vi khuẩn
E. ictaluri tất cả đều hện vạch tại vị trí 407pb.
Chọn ngẫu nhiên 5 chủng CAF258, E223, 3B3, C1 và C2 tiến hành gây cảm
nhiễm. Kết quả 3 bể CAF28, C1 và C2 cá có xuất hiện dấu hiệu bệnh lý. Sau khi
tái phân lập và tái định danh tất cả các chủng đều có đặc điểm giống chủng ban
đầu, cho kết quả PCR giống nhau (hiện vạch 407 bp).

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
iii

MỤC LỤC

Trang
LỜI CẢM ƠN i
TÓM TẮT ii
MỤC LỤC iii
DANH SÁCH BẢNG iv
DANH SÁCH HÌNH v
Chương I : Giới thiệu 1
Chương II: Lược khảo tài liệu 3
2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh cá 3
2.2 Tình hình nuôi và dịch bệnh trên cá tra ở ĐBSCL 3
2.3 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá da trơn 4
2.31. Bệnh xuất huyết 4
2.3.2 Bệnh mủ gan trên cá tra 5
2.4 Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp 8
Chương III: Nội dung và phương pháp nghiên cứu 11
3.1 Thời gian và địa điểm 11
3.1.1 Thời gian 11

3.1.2 Địa điểm 11
3.2 Nội dung thực hiện 11
3.3 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 11
3.3.1 Vật liệu 11
3.3.2 Thiết bị 11
3.4 Thuốc thử, môi trường dùng cho nghiên cứu 12
3.3.4 Số chủng vi khuẩn cần thiết 12
3.5 Phương pháp nghiên cứu 13
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
iv

3.5.1 Số chủng vi khuẩn cần thiết 13
3.5.2 Nguồn vi khuẩn 13
3.5.3 Phương pháp phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn 14
3.5.4 Định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống 14
3.5.5 Định danh vi khuẩn bằng bộ kit API20E 15
3.5.6 Phương pháp PCR 16
3.5.7 Thí nghiệm gây cảm nhiễm 17
Chương IV: Kết quả- thảo luận 19
4.1 Phương pháp sinh hóa truyền thống 19
4.2 Kết quả test API 21
4.3 Kết quả định danh vi khuẩn bằng PCR 23
4.4 Kết quả gây cảm nhiễm và tái định danh vi khuẩn 24
4.5 Thảo luận 28
Chương V: Kết luận – Đề xuất 32
5.1 Kết luận 32
5.2 Đề xuất 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
v

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 3.1: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn sử dụng cho đề tài 13
Bảng 3.2: Bảng test các chỉ tiêu sinh hóa của vi khuẩn 14
Bảng 3.3: Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn được xác định
bằng bộ kít API 20E 15
Bảng 3.4: Thành phần hóa chất thực hiện phản ứng PCR 16
Bảng 4.5: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng
vi bằng phương pháp sinh hóa truyền thống 19
Bảng 4.6: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng
vi bằng bộ kit API 20E 22

Bảng 4.7: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng
vi khuẩn tái phân lập từ thí nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp sinh hóa
truyền thống 26
Bảng 4.8: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng
vi khuẩn tái phân lập từ thí nghiệm cảm nhiễm bằng bộ kít API 20E 27
Bảng 4.9: Các đặc điểm khác nhau giữa loài E. ictaluri với các loài khác thuộc
nhóm Enterobacteriaceace (OIE, 2003) 29


Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
vi

DANH SÁCH HÌNH
Trang

Hình 3.1: Các bước chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm 18
Hình 4.2: Hình nhuộm gram vi khuẩn E. ictaluri 20
Hình 4.3: Khả năng lên men và oxi hóa đường glucose của E. ictaluri 20
Hình 4.4: Kết quả âm tính với indole cua vi khuẩn E. ictaluri 21
Hình 4.5: Khả năng thủy phân ornithine và lysine của E. ictaluri 21
Hình 4.6: Kết quả test API của vi khuẩn E. ictaluri 23
Hình 4.7: Kết quả điện di sản phẩm PCR các chủng vi khuẩn E. ictaluri 23
Hình 4.8: Thận cá tra nhiễm dòng vi khuẩn CAF258 25
Hình 4.9: Dấu hiệu bên ngoài của cá tra gây cảm nhiễm dòng E. ictaluri 25
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
1

CHƯƠNG I
GIỚI THIỆU
Một trong bảy vùng kinh tế quan trọng của cả nước Đồng Bằng Sông Cửu

Long (ĐBSCL) có nhiều điều kiện tự nhiên thuận lợi cho nuôi trồng thủy sản
phát triển. Trong những năm gần đây nuôi trồng thủy sản đã đóng góp đáng kể
vào kim ngạch xuất khẩu ở Việt Nam, tạo công ăn, việc làm, tăng thu nhập,
xóa đói giảm nghèo cho các vùng nông thôn. Nổi bật là nghề nuôi cá tra do
đây là đối tượng dễ nuôi, mau lớn, chất lượng thịt ngon, có khả năng thích ứng
cao với điều kiện môi trường khắc nghiệt. Năm 2006, sản lượng cá tra nuôi ở
ĐBSCL đạt 800.000 tấn, xuất khẩu được 292.800 tấn, thu về kim ngạch xuất
khẩu 773,64 triệu USD, chiếm 23,4% so với xuất khẩu thủy sản của cả nước
(www.fistenet.gov.vn)
Tuy nhiên khi diện tích nuôi được mở rộng, nghề nuôi được thâm canh hóa
nhất là nuôi với mật độ cao thì vấn đề dịch bệnh xảy ra thường xuyên hơn và
gây thiệt hại cũng nhiều hơn. Có thể nói trong những năm gần đây nghề nuôi
thủy sản đang phải đương đầu với tình trạng dịch bệnh bùng nổ do sự suy
thoái về môi trường và lây lan của mầm bệnh. Trong đó bệnh truyền nhiễm mà
nhất là bệnh vi khuẩn đã và đang gây thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất và
sản lượng cá nuôi với sự nổi bật là bệnh mủ gan đã gây thiệt hại không nhỏ về
kinh tế cho nhiều hộ nuôi. Các kết quả nghiên cứu gần đây xác định bệnh mủ
gan là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra, bệnh xảy ra trên cá tra nuôi ở
tất cả các giai đoạn, tỉ lệ hao hụt có thể lên đến 90% (Nguyễn Quốc Thịnh và
ctv, 2003).
Hiện nay phương pháp xác định vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên
cá tra phổ biến là phương pháp sinh hóa sử dụng phương pháp kiểm tra xác
định đặc tính sinh lý, sinh hóa truyền thống hoặc sử dụng bộ kit API 20E. Tuy
nhiên, chưa có những thông tin về sự đồng nhất hay sai khác khi xác định đặc
tính sinh lý và sinh hóa của hai phương pháp này khi định danh vi khuẩn E.
ictaluri. Đề tài “Tìm hiểu sự khác nhau về các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa
giữa các dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri được xác định bằng phương
pháp sinh hóa truyền thống và sử dụng bộ kít API 20E” được thực hiện
nhằm tìm ra những chỉ tiêu sinh hóa giống và khác nhau khi sử dụng hai
phương pháp nêu trên, góp phần vào việc chuẩn hóa phương pháp nghiên cứu

bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra trên cá tra.


Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
2

Mục tiêu nghiên cứu
So sánh các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa giữa các dòng vi khuẩn E. ictaluri
được xác định bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và sử dụng bộ kit API
20E.
Nội dung nghiên cứu
 Xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa các dòng vi khuẩn E. ictaluri
xác định bằng phương pháp truyền thống.
 Xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa các dòng vi khuẩn E. ictaluri
bằng bộ kit API 20E.
 Xác định kết quả định danh bằng phương pháp PCR

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
3

CHƯƠNG II
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh cá
Bệnh cá được bắt đầu nghiên cứu từ cuối thế kỷ XIX nhưng cơ bản vẫn mô tả
các dấu hiệu lâm sàng. Sang đầu thế ký XX các nhà khoa học thế giới đã bắt
đầu nghiên cứu các triệu chứng cũng như tác nhân gây bệnh trên cá. Năm
1904, Bruno Hofer người Đức đã viết cuốn sách “Father of fish Pathology”
(Bùi Quang Tề, 2006).
Viện sĩ V.A. Dogiel thuộc viện hàn lâm khoa học Liên Xô cũ là người có
công lớn khi viết phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng trên cá (1929), mở
đầu cho việc nghiên cứu ký sinh trùng trên cá. Năm 1939 ông cũng cho xuất
bản quyển “Bacterial Disease of Fish”. Những năm 1930 bệnh truyền nhiễm
của cá đã được nghiên cứu trong các phòng thí nghiệm. Năm 1949 nhà khoa
học người Liên Xô E. M. Lyaiman cho xuất bản sách giáo khoa về bệnh cá
(Bùi Quang Tề, 2006).
Kết quả nghiên cứu các tác nhân gây bệnh trên động vật thủy sản đến nay rất
phong phú, bệnh virút của cá đến nay đã phân loại được hơn 60 loại virút
thuộc 5 họ có cấu trúc ADN hoặc ARN (Bùi Quang Tề, 2006). Ở Việt Nam bộ
môn bệnh cá được Hà Ký thành lập năm 1960. Sau đó được đưa vào giảng dạy
trong các trường đại học. Từ cuối năm 1960 trở lại đây hàng loạt nghiên cứu

về bệnh của động vật thủy sản được tiến hành:
Nghiên cứu ký sinh trùng và bệnh của các loài cá nước ngọt miền Bắc Việt
Nam của tiến sĩ Hà Ký, 1961- 1967 (Bùi Quang Tề, 2006).
Công trình nghiên cứu khu hệ ký sinh trùng của một số loài cá nước ngọt
Đồng Bằng Sông Cửu Long của Bùi Quang Tề và ctv,1984-1990 (Trích lược
bởi Trần Thị Ngọc Hân, 2006)
Nghiên cứu khu hệ ký sinh trùng cá nước ngọt miền Trung và Tây Nguyên của
Nguyễn Thị Muội và ctv, 1981- 1985 (Trích lược bởi Trần Thị Ngọc Hân,
2006)….
2.2 Tình hình nuôi và dịch bệnh xảy ra trên cá tra ở ĐBSCL
Tính từ năm 2006, sản lượng cá tra nuôi ở ĐBSCL đạt 800.000 tấn, xuất khẩu
được 292.800 tấn, thu về kim ngạch xuất khẩu 773,64 triệu USD, chiếm
23,4% so với xuất khẩu thủy sản của cả nước. Trong 6 tháng đầu năm 2007,
diện tích nuôi cá tra toàn vùng ĐBSCL đã lên đến 3.642 ha, tăng 1.256 ha so
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
4

với năm trước. Từ đó, sản lượng cá tra đạt 380.489 tấn, số lượng cá tra xuất
khẩu được 173.100 tấn, đạt kim ngạch xuất khẩu 462,4 triệu USD, tăng 32%
về lượng và 38,9% kim ngạch so với năm 2006 (www.fistenet.gov.vn)
Tuy nhiên khi mật độ nuôi quá dày nhưng lại không đồng đều về kỹ thuật, môi
trường nuôi sẽ bị ô nhiễm tạo điều kiện cho dịch bệnh xảy ra. Dịch bệnh trên
cá tra xảy ra quanh năm kể cả mùa khô, mùa mưa, nhưng nặng nhất vào lúc
giao mùa, mùa nước đổ, thời tiết thay đổi đột ngột sẽ làm tăng tần số xuất hiện
bệnh. Theo Từ Thanh Dung và ctv (2004) thì tần số xuất hiện bệnh trên động
vật thủy sản là vi khuẩn (50,9%), virút (24,6%), ký sinh trùng (21,1%), nấm
(3,4%) (trích dẫn bởi Lê Phú Khởi, 2006).
Cũng theo điều tra của Lê Phú Khởi (2006) tại An Giang đã ghi nhận được
một số bệnh xuất hiện trên cá tra với tần suất khác nhau từ năm 2004 trở lại
đây là: bệnh đốm đỏ, mủ gan, ký sinh trùng, thối đuôi, vàng da, đường ruột, nổ

mắt, tuột nhớt, rong bè (bỏ ăn), sưng thận, nấm, thối mang. Trong đó 3 bệnh là
gan có mủ, đốm đỏ và ký sinh trùng xảy ra với tần suất cao nhất.
Kết quả này cũng phù hợp với điều tra của Nguyễn Chính (2005) là tình hình
bệnh trên cá tra nhìn chung chưa thấy phát sinh bệnh mới mặc dù tỉ lệ cảm
nhiễm và cường độ cảm nhiễm ngày càng cao hơn.
2.3 Vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh trên cá da trơn
2.3.1 Bệnh xuất huyết
Vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh xuất huyết được phân lập đầu tiên trên cá nheo
Mỹ bởi Hawke (1979). Năm 1999, Austin đã phát hiện ra vi khuẩn này gây
bệnh nhiễm trùng máu cấp tính (enteric septicemia of catfish - ESC) trên cá
nheo mỹ, gây thiệt hại lớn cho ngành công nghiệp nuôi cá nheo (Hawke và
ctv,1998).
Plumb, 1999 cho biết bệnh do vi khuẩn E. ictaluri xảy ra trên cá trơn vào mùa
có nhiệt độ thấp. Trên cá nheo, bệnh ESC thường xảy ra vào cuối mùa xuân
đến đầu mùa hè và trong suốt mùa thu khi nhiệt độ nước khoảng 18 - 28C.
Theo mô tả của Inglis và ctv (1993), khi cá bị bệnh trên đầu xuất hiện những
vết loét, cá bơi lờ đờ trên mặt nước, bơi xoay tròn với tư thế đầu trên đuôi
dưới, sưng tấy ở da, miệng, nắp mang và bụng, phù mắt. Bên trong xoang
bụng có chất dịch màu vàng, thận và tỳ tạng sưng to, quan sát mô và các cơ
quan có hiện tượng xuất huyết, đặc biệt là có những đốm trắng ở gan. Bệnh
này bên cạnh xuất hiện trên cá nheo nuôi ở miền Đông Nam Mỹ, thì bệnh
cũng được tìm thấy ở Indiana, Idaho, California, Arizona và New Mexico.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
5

Ngoài cá nheo, các loài blue catfish (Ictalurus furcatus), white catfish
(Ictalurus melas) cũng nhạy cảm với E. ictaluri (Plumb và Sanchez, 1983) và
theo ghi nhận của Kasornchandra và ctv (1987) thì vi khuẩn này cũng được
tìm thấy trên cá trê trắng (Clarias batrachus) ở Thái Lan.
Hawke và ctv (1998) mô tả đặc điểm của vi khuẩn E. ictaluri là loài vi khuẩn

thuộc nhóm Enterobacteriaceace, vi khuẩn Gram âm, di động yếu ở 25-30 C,
ở nhiệt độ cao hơn không di động, H
2
S và indole âm tính, có khả năng lên men
O/F, phát triển chậm trên môi trường thạch, trên môi trường BHI (brain heart
infusion) sau 36 - 48 giờ ở 28 - 30C hình thành khuẩn lạc nhỏ, không phát
triển ở 37C (Plumb, 1999).
Năm 1986, Shotts và ctv tiếp tục nghiên cứu về đặc điểm sinh hoá của vi
khuẩn E. ictaluri, ngoài các đặc điểm trên thì vi khuẩn này còn cho phản ứng
cytochrome oxidase, có khả năng lên men glucose và sinh sản phẩm NO
3
-
từ
NO
2
-
(trích dẫn bởi Lê Minh Đương, 2007)
Vi khuẩn này tồn tại trong môi trường nước thời gian ngắn hay dài còn tuỳ
theo nhiệt độ. Nếu nhiệt độ nước là 5C thì vi khuẩn có thể tồn tại trong ao 15
ngày nhưng khi nhiệt độ nước tăng lên 25C

thì thời gian sống của chúng rút
ngắn chỉ còn khoảng 10 ngày. Tuy nhiên trong lớp bùn đáy ao vi khuẩn này có
thể tồn tại khoảng 15 ngày ở 5C, 45 ngày ở 18C và 95 ngày ở 25C (Plumb
1999)
2.3.2 Bệnh mủ gan trên cá tra
Năm 2001, Ferguson và ctv phát hiện đầu tiên bệnh mủ gan trên cá tra nuôi ở
ĐBSCL vào cuối năm 1998 và gọi là bệnh BNP (bacillary necrosis of
Pangasius).
Theo Từ Thanh Dung và ctv (2005) ở Việt Nam, vùng ĐBSCL bệnh mủ gan

xuất hiện đầu tiên ở các tỉnh nuôi cá tra thâm canh phát triển mạnh như An
Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ, sau đó bệnh lây lan sang các vùng lân cận.
Đặc biệt những năm gần đây bệnh cũng xuất hiện ở một số tỉnh mới phát triển
nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng. Tỷ lệ hao hụt lớn ở cá giống
nhưng gây thiệt hại kinh tế lớn nhất ở giai đoạn cá có trọng lượng từ 300-
500g.
Nguyễn Quốc Thịnh (2002) kết luận khi cá bị bệnh mủ gan biểu hiện bên
ngoài không có gì đặc biệt, một số có hiện tượng xuất huyết ở các vi, có khi
xuất huyết toàn thân, khi giải phẫu và quan sát nội tạng thấy có nhiều đốm
trắng trên gan, thận và tỳ tạng. Thêm vào đó, trong xoang bụng có chứa dịch
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
6

hơi đặc. Khi cấy những đốm trắng lên môi trường agar sau 24 - 48 giờ thấy
xuất hiện các khuẩn lạc rất thuần.
Tác nhân gây bệnh mủ gan được xác định là Edwardsiella ictaluri (Từ
Thanh Dung và ctv, 2005)
Mùa vụ xuất hiện và mức độ gây thiệt hại: Bệnh mủ gan thường xuất hiện
vào mùa lũ, cao điểm vào tháng 7, 8. Tuy nhiên trong hai năm gần đây bệnh
này xuất hiện trên cá tra hầu như quanh năm. Trong 1 vụ nuôi bệnh mủ gan có
thể xuất hiện 3-4 lần. Tỉ lệ hao hụt lên đến 10-15%, tùy thuộc vào chế độ
chăm sóc và quản lý (Từ Thanh Dung và ctv, 2005)
Dấu hiệu bệnh lý
Cá bị bệnh không có những dấu hiệu bệnh lý bất thường, ở giai đoạn mới
chớm bệnh cá vẫn còn bắt mồi nhưng giảm ăn. Một số trường hợp cá có biểu
hiện gầy, bơi lờ đờ da nhợt nhạt có biểu hiện xuất huyết trên da và hậu môn.
Dấu hiệu bệnh lý đặt thù nhất là bên trong nội quan các cơ quan gan, thận, tỳ
tạng xuất hiện những đốm trắng đường kính 1-3 mm, các cơ quan này sưng to
và có biểu hiện nhũng ở thận (Ferguson và ctv, 2001)
Kết quả nghiên cứu mô bệnh học cá tra bị bệnh trắng gan của Nguyễn Quốc

Thịnh và ctv (2003) cho thấy có nhiều hiện tượng thay đổi về cấu trúc đặc biệt
là ở gan, thận, tỳ tạng có hiện tượng xung huyết, xuất huyết và nhiều vùng bị
hoại tử trầm trọng. Vi khuẩn cũng được tìm thấy trên mẫu mô của tất cả các cơ
quan này, những vi khuẩn này tạo thành bó ở rìa các vết hoại tử.
Đặc điểm sinh lý và sinh hóa
E. ictaluri là loài thuộc họ Enterobacteriaceace, vi khuẩn gram âm, hình que
và có kích thước biến đổi, không di động hoặc di động yếu, lên men, cho phản
ứng catalate dương tính và oxidase âm tính, phản ứng indole và H
2
S âm tính.
Vi khuẩn E. ictaluri phát triển tốt ở 28C sau 24-48 giờ tạo thành những khuẩn
lạc kích thước rất nhỏ (Từ Thanh Dung và ctv, 2005).
Năm 2004, Từ Thanh Dung và ctv phân lập được 108 dòng vi khuẩn thuộc loài
E. ictaluri từ 181 mẫu cá tra bệnh. Vi khuẩn này sau khi phát triển 24 giờ trên
môi trường TSA tạo thành những khuẩn lạc có màu trắng, không có nhân, rìa
có dạng không đồng nhất. Đồng thời vi khuẩn này cũng có một số đặc điểm
khác với mô tả của Plumb (1993) như có dạng que và có kích thước biến đổi
(trích lược bởi Từ Thanh Dung và ctv, 2004), phát triển tốt ở 28C, phát triển
yếu ở 37C, điều này lý giải tại sao E. ictaluri cho tới nay chỉ phát hiện trên cá
mà chưa tìm thấy ở các loài động vật máu nóng khác như chim, gia súc, heo,
động vật có vú ở biển.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
7

Độc lực của vi khuẩn E. ictaluri
Đã có nhiều tác giả tiến hành thí nghiệm gây cảm nhiễm xác định khả năng
gây bệnh của vi khuẩn E. ictaluri trên nhiều đối tượng khác nhau bằng phương
pháp tiêm hoặc ngâm với các mật độ vi khuẩn khác nhau.
Newton và ctv (1989), tiến hành ngâm cá nheo trong dung dịch có mật độ vi
khuẩn E. ictaluri là 5x10

8
CFU/ml nhận thấy có 93% cá nheo bị nhiễm và biểu
hiện bệnh ESC (trích dẫn bởi Plumb, 1999).
Năm 1993, để kiểm tra đường xâm nhập của vi khuẩn E. ictaluri vào hệ tiêu
hóa cá, Baldwin và Newton tiến hành gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri trên
140 cá nheo mỹ (khoảng 8-10 tháng tuổi) bằng phương pháp đưa vi khuẩn vào
hệ tiêu hóa với mật độ 1x10
9
CFU/ml. Kết quả tại thời điểm 0,25 giờ đã tìm
thấy vi khuẩn ở thận trước.
Hai nhà khoa học là Williams và Laurence (2005) đã sử dụng phương pháp
tiêm vi khuẩn E. ictaluri so sánh với phương pháp ngâm trên cá nheo Mỹ ở
các mật độ tăng dần. Đối với E. ictaluri R4383 WT (dùng phương pháp tiêm)
với mật độ 5,2x10
3
CFU/ml, 5,2x10
4
CFU/ml, 5,2x10
5
CFU/ml thì tỷ lệ cá chết
lần lượt là 67,2%, 100% và 100%. Trong khi đó E. ictaluri R4383 WT (dùng
phương pháp ngâm) với mật độ 5,7x10
3
CFU/ml,

5,7x10
4
CFU/ml, 5,7x10
5
CFU/ml, 5,7x10

6
CFU/ml thì tỷ lệ cá chết lần lượt là 63,5%, 98,7%, 100% và
100%. Qua thí nghiệm này họ kết luận không có sự khác nhau về tỷ lệ chết
giữa hai phương pháp ngâm và tiêm.
Phan Thị Mỹ Hạnh (2004) tiến hành thí nghiệm một số yếu tố ảnh hưởng của
bệnh mủ gan do vi khuẩn E. ictaluri gây ra trên cá tra ở ĐBSCL đưa ra kết
luận mật độ vi khuẩn khác nhau sẽ ảnh hưởng khác nhau đến khả năng nhiễm
bệnh mủ gan trên cá tra. Khi ngâm cá với mật độ vi khuẩn là 1,5x10
2
và
1,5x10
3
CFU/ml thì tỉ lệ cá chết dao động từ 56,6-56,7%.
Lương Trần Thục Đoan (2006) đã chứng minh rằng ngâm cá tra với mật độ vi
khuẩn 1x10
7
CFU/ml trong 1h, thời gian thí nghiệm 10 ngày, tỉ lệ cá chết là
75% so với hai nồng độ còn lại là 1x10
5
CFU/ml và 1x10
6
CFU/ml và đưa ra
kết luận rằng mật độ vi khuẩn 1x10
7
CFU/ml có độc lực cao nhất.
Ở một số thí nghiệm khác, Trần Thị Ngọc Hân (2006) khảo sát sự biến đổi cấu
trúc mô học của cá tra bệnh mủ gan bằng cách gây cảm nhiễm cá tra với dòng
vi khuẩn E. ictaluri ở các mật độ vi khuẩn lần lượt là 1x10
5
, 1x10

6
, 1x10
7

CFU/ml (phương pháp ngâm) và 10
4
, 10
5
và 10
6
CFU/ml (phương pháp tiêm),
theo dõi tỷ lệ cá chết trong thời gian 10 ngày thì thấy cso sự biến đổi về mặt
cấu trúc ở các mô thận, gan, tỳ tạng là nhiều nhất.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
8

Phương pháp sinh hóa truyền thống: Sinh hóa truyền thống là phương pháp
có từ rất lâu đời, được ứng dụng nhiều trong thủy sản và mang lại kết quả to
lớn, định danh thành công các loài vi khuẩn trong môi trường nước, góp phần
vào việc nghiên cứu, tìm ra tác nhân gây bệnh. Không phải tác giả nào cũng
đưa ra các chỉ tiêu giống nhau để định danh vi khuẩn, chẳng hạn chỉ tiêu này
là quan trọng cho loài này nhưng lại không cần thiết cho loài khác, nhưng nhìn
chung tất cả đều dựa vào một số chỉ tiêu cơ bản. Người ta chia vi khuẩn thành
các nhóm khác nhau, nhóm vi khuẩn gram âm và gram dương, nhóm di động
hay không di động mà từ đó có hướng đi khác nhau cho từng loài vi khuẩn.
Việc định danh vi khuẩn dùng sơ đồ gia phả đã được áp dụng bởi nhiều tác
giả, và định danh ra các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio, Edwardsiella,
Aeromonas…. Năm 2004, Buller dùng phương pháp định danh truyền thống
với 41 chỉ tiêu cho các chủng E. ictaluri để kiểm tra các đặc tính sinh lý, sinh
hóa. Tương tự, thì Plumb và ctv (1983) cũng đã dùng test sinh hóa truyền

thống, kiểm tra các đặc điểm sinh hóa và sinh lý của E. ictaluri với 47 chỉ tiêu.
Bộ kít API 20E
Kit API 20E là bộ kit do hãng bioMerieux sản xuất, nó được dùng cho việc
định danh các loài vi khuẩn gram âm, hình que. Mặc dù API là phương pháp
được ứng dụng cho việc định danh các loài vi khuẩn trên động vật nhưng ngày
nay cũng sử dụng rộng rãi trong thủy sản do các thao tác nhanh đơn giản
không mất nhiều thời gian, cho kết quả sớm. Cùng với phương pháp sinh hóa
truyền thống API được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực nghiên cứu các giống loài
vi khuẩn. Cụ thể năm 2002, Crumlish và ctv đã sử dụng API để kiểm tra các
đặc tính sinh lý, sinh hóa loài E. ictaluri trên cá tra ở 2 tỉnh An Giang và Cần
Thơ. Một nghiên cứu gần đây của Buller (2004) dùng kit API 20E không chỉ
cho chủng E. ictaluri mà còn cho các loài khác. Hàng loạt các đề tài nghiên
cứu của Lương Trần Thục Đoan (2006), Tiết Ngọc Trân (2007), Lê Minh
Đương (2007) cũng đã sử dụng kit API 20E để kiểm tra các đặc điểm sinh hóa
của E. ictaluri.
2.4 Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp
Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction- PCR) do Karl
mullis và cộng sự phát minh năm 1985 (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007).
Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2007) phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều
chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn sau:
a. Giai đoạn biến tính: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành
phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử ADN được biến tính ở nhiệt độ
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
9

cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của chúng, thường là 94-95C trong
vòng 30 giây đến 1 phút.
b. Giai đoạn lai: nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các
mồi bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong
khoảng 40-70C, tùy thuộc vào Tm của các mồi sử dụng mà thời gian bắt

cặp khác nhau và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.
c. Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ được tăng lên 72C, đó là điều kiện tốt nhất
để cho Taq polymerase hoạt động tổng hợp kéo dài mạch theo nguyên tắc
bổ sung từ hai đầu sợi khuôn ban đầu giúp cho ADN polymerase hoạt
động. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự ADN cần khuyếch đại,
thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một phân tử ADN khuôn được
nhân lên thành hai, các đoạn ADN vừa được nhân trong chu kỳ lại làm khuôn
cho chu kỳ nhân bản tiếp theo. Do đó sau mỗi chu kỳ số lượng ADN được
tổng hợp sẽ tăng lên gấp đôi và như vậy sau n chu kỳ nhân bản sẽ tạo ra 2
n
bản
ADN từ một khuôn ban đầu.
Ở các lĩnh vực khác kể cả thủy sản, PCR là một công cụ hữu hiệu trong việc
phát hiện mầm bệnh vi khuẩn, virút, ký sinh trùng và nấm. Một số mầm bệnh
thủy sản quan trọng ở tôm nuôi hiện nay được chẩn đoán bằng PCR gồm: virút
đốm trắng (WSSV), virút đầu vàng (YHV), virút gây hoại tử cơ quan tạo máu
và cơ quan tạo lập biểu mô (IHHNV), virút gây hội chứng Taura (TSV) (Đặng
Thị Hoàng Oanh, 2007).
Phương pháp phức hợp PCR (multiplex PCR - mPCR) là một dạng biến hóa
của PCR. Phương pháp này cho phép phát hiện đồng thời nhiều loại bệnh,
giúp tiết kiệm công sức lẫn chi phí xét nghiệm.
Đối với virút đặc biệt là virút trên tôm, mPCR đã có những bước phát triển
mới phát hiện nhiều loại bệnh cùng lúc, đem lại các kết quả chẩn đoán nhanh,
chính xác, tiết kiệm nhiều thời gian và công sức. Cụ thể Yang và ctv (2006),
đã phát triển phương pháp m-PCR phát hiện đồng thời hai loại virút IHHNV
và WSSV trên tôm he. Với đoạn mồi I 2814, I 3516 và W1, W2 lần lượt cho
hai loại bệnh trên với trọng lượng phân tử của sản phẩm PCR lần lượt là 703
và 824 bp.
Wongteerasupaya và ctv (1998) đã phát triển phương pháp mRT- PCR phát

hiện đồng thời cả ARN và ADN của hai loại virút khác nhau trên tôm là YHV
và WSSV, chúng hiện là nguyên nhân gây thiệt hại nghiêm trọng và phổ biến
trong nuôi tôm công nghiệp ở Thái Lan và châu Á. Phương pháp cho phép
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
10

chẩn đoán nhanh bằng cách thực hiện một bước ly trích cả RNA và DNA sử
dụng Trizol
TM
. Acid nucleic sau khi ly trích được khuếch đại bằng mRT-PCR
dùng qui trình RT-PCR một bước với mồi 10F-144R cho YHV và WSV4.2F-
WSV4.2R3 cho WSSV.
Năm 2008, Khawsak và ctv đã tìm ra một phản ứng mRT-PCR có thể phát
hiện cùng lúc 6 loại virus ở tôm là YHV, WSSV, TSV, HPV, IHHNV và
MBV trên tôm he. Sáu cặp mồi khuếch đại các acid nucleic cho kết quả là các
sản phẩm với các kích thước khác nhau. Những cặp mồi đặc hiệu cao và
không gắn vào những acid nucleic của tôm và virút khác. Độ nhạy của phương
pháp mRT-PCR là 0.15 pg IHHNV, 0.15 pg TSV, 1 pg HPV, 1.5 pg MBV, 5
pg WSSV và 10 pg YHV. Phương pháp này được thử trên 42 mẫu bao gồm tất
cả mô của tôm post và gan tụy của tôm sú đã chọn từ những ao ở trung tâm và
vùng phía Nam Thái Lan từ năm 2002 - 2005 được kiểm tra bằng phương
pháp mRT-PCR. Kết quả cho thấy rằng ảnh hưởng đơn lẻ là chủ yếu và
WSSV là phổ biến nhất tại thời điểm đó.
Gần đây, Panangala và ctv (2007) vừa được công bố phương pháp mPCR có
thể xác định cùng lúc cả ba loài vi khuẩn gây bệnh trên cá, đó là
Flavobacterium columnare (504pb), Edwardsiella ictaluri (407pb), và
Aeromonas hydrophila (209pb).
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
11

CHƯƠNG III
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.1 Thời gian
Từ tháng 01/2008 đến 05/2008.
3.1.2 Địa điểm
- Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản Khoa Thủy sản -
Trường Đại học Cần Thơ.
- Phòng thí nghiệm gây cảm nhiễm Khoa Thủy sản, trường Đại Học Cần
Thơ.
3.2 Nội dung thực hiện
- Phục hồi vi khuẩn từ nguồn vi khuẩn liệt kê ở Bảng 3.1
- Nuôi tăng sinh vi khuẩn.
- Định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống.
- Định danh vi khuẩn bằng kit API 20E.
- Dùng phương pháp PCR khẳng định kết quả định danh.
- Tiến hành thí nghiệm gây cảm nhiễm, tái phân lập và tái định danh vi
khuẩn.
3.3 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
3.3.1 Vật liệu
 Que cấy, bình xịt cồn, đèn cồn,
 Đĩa petri, ống nghiệm,
 Ống đong, lame, lamella,
 Chai nấu môi trường, bình tam giác,
 Cá từ, pipet, đầu cone, ống hút, găng tay,
 Các vật liệu nghiên cứu khác, v.v….
3.3.2 Thiết bị
 Kính hiển vi,
 Tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, tủ cấy,

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
12

 Bếp nấu môi trường, máy lắc, nồi thanh trùng,
 Máy ly tâm, máy chu kỳ nhiệt, máy ủ nhiệt, máy so màu quang phổ,…
 Cân điện tử, lò viba, bộ điện di….
 Các thiết bị khác, v.v….
3.4 Hóa chất, thuốc thử và môi trường dùng cho nghiên cứu
 Cồn 70
0
, cồn 96
0
.
 Môi trường phục hồi và nuôi cấy vi khuẩn: EIA (edwardsiella ictaluri
agar), TSA (tryptone soya agar; Merck), NB (nutrient broth; Merck)
 Bộ kít API 20E (bộ test + thuốc thử: TDA, IND, VP) (BIO
MÉRIEUX).
Môi trường
 Các môi trường đường (glucose, arabinose, rhamnose, sorbitol,
manitol, innositol, sucrose) (Merck) dùng để kiểm tra khả năng lên men
của vi khuẩn.
 Môi trường OF (Merck) dùng để kiểm tra khả năng oxi hóa và lên men
của vi khuẩn.
 Môi trường thạch Simon Citrate (Merck) dùng để kiểm tra khả năng sử
dùng nguồn cacbon của vi khuẩn.
 Môi trường MR-VP (Voges Proskauer; Merck) dùng cho phản ứng VP.
 Môi trường NB (nutrient broth; Merck) dùng kiểm tra khả năng sinh
indole.
 Môi trường decarboxylase (Himedia) + yeast extract (Merck) + 1% acid
amin (arginine, lysine và ornithin) (Merck) dùng kiểm tra khả năng khử

amino acid.
 Môi trường 0.1% pepton (Himedia) + 0.2% KH
2
PO
4
(Merck) +
0.0012% phenol red (Merck) +0.1% glucose + 2% ure (Merck) dùng
kiểm tra khả năng sử dụng urea của vi khuẩn.
 Môi trường TSI (triple sugar iron; Merck) dùng kiểm tra khả năng sinh
khí H
2
S của vi khuẩn.
Thuốc thử
 Dung dịch oxy già H
2
O
2
3% cho phản ứng catalase.
 Que thử Oxidase (Merck).
 Đĩa ONPG (Ortho-nitrophenyl galactosidase; Merck)
 Thuốc thử Kovac’s (Merck) cho phản ứng sinh indole.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
13

 Thuốc thử Lugol’s Iodine (cách pha được trình bày ở phần Phụ lục) cho
khả năng thủy phân tinh bột (starch).
 Thuốc thử cho phản ứng VP.
 Các dung dịch nhuộm Gram.
Các hóa chất cần thiết cho phản ứng PCR
 LB (10g tryptone, 5g yeast extract và 5g sodium chloride, trong 1L

nước cất ).
 TE (pH 8.0) gồm 10mM Tris HCl và 1mM EDTA.
 Hóa chất dùng trong khuếch đại DNA: Bufer 10X, MgCl
2
, dNTPs
(10mM), Taq polymerase (5u), mồi, nước cất 2 lần.
 Loading dye 6X, ethidium bromide, agarose, dung dịch chạy diện di
TAE (Tris HCl:acetate:EDTA).
3.5 Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Số chủng vi khuẩn cần thiết
- Chủng tham khảo: E223.
- Chủng nghiên cứu: 6 chủng (2 chủng phân lập trực tiếp từ cá bệnh và 4
chủng phục hồi từ nguồn vi khuẩn của Khoa Thủy sản)
3.5.2 Nguồn vi khuẩn
- Các dòng vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá tra bị bệnh mủ gan từ
nhiều nguồn khác nhau, sau khi phân lập được trữ ở -80 C.
- Vi khuẩn phân lập trực tiếp từ cá bệnh (mẫu dịch vụ)
- Chủng vi khuẩn E. ictaluri tham khảo mã số 223 được phân lập từ ao cá
tra bệnh ở An Giang (Từ Thanh Dung, 09/2002, khoa thuỷ sản, trường
Đại Học Cần Thơ)
Bảng 3.1 Nguồn gốc các dòng vi khuẩn sử dụng cho đề tài
STT Mã PTN Địa điểm Cơ quan phân lập
1 CAF255 Châu Phú Thận
2 CAF258 Châu Phú Tỳ tạng
3 2B1 Ô môn- CT Thận
4 3B3 Ô môn- CT Thận
5 C1 Thốt Nốt- CT Thận
6 C2 Thốt Nốt- CT Thận
7 E223 Chủng tham khảo -

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
14

3.5.3 Phương pháp phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn
- Vi khuẩn được phục hồi bằng cách cấy lên môi trường TSA, ghi nhận
kết quả phục hồi của vi khuẩn sau 24-48 giờ ở 28 C.
- Chọn một khuẩn lạc từ đĩa cấy thuần cho vào ống nghiệm 5ml NB đặt
trên máy lắc sau 24 - 48 giờ kiểm tra kết quả.
3.5.4 Định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống
Hình dạng, kích thước tính ròng và các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn được
xác định bằng phương pháp của Barrow và Feltham (1993).
Các chỉ tiêu sinh hóa được thực hiện cho phương pháp sinh hóa truyền thống
và sử dụng bộ kít API 20E được trình bày ở Bảng 3.2 và Bảng 3.3. Các chỉ
tiêu sử dụng phương pháp sinh hóa truyền thống được thực hiện lặp lại 3 lần,
kết quả được ghi nhận là kết quả có ít nhất hai lần lặp lại. Cách tiến hành,
thành phần môi trường và cách pha chế được trình bày ở phụ lục 1.
Bảng 3.2 Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn
được xác định bằng phương pháp sinh hóa truyền thống
STT Chỉ tiêu kiểm tra
1 Nhuộm Gram
2 Hình dạng
3 Tính di động
4 Oxidase
5 Catalase
6 O/F
7 ONPG
8 Arginine
9 Lysin
10 Ornithine
11 Khả năng sử dụng citrate

12 Khả năng sinh H
2
S
13 Khả năng sinh urease
14 Khả năng sinh indole
15 Phản ứng VP
Khả năng sử dụng các loại đuờng
16 Arabinosse
17 Glucose
18 Innositol
19 Mannitol
20 Rhamnose
21 Sorbitol
22 Sucrose



Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
15


3.5.5 Định danh vi khuẩn bằng bộ kít API 20E
Định danh theo hướng dẫn của nhà sản xuất (BioMerieux). Đọc kết quả theo 7
giá trị.
Phương pháp
- Cho một ít nước vào khay nhựa của bộ kit để giữ ẩm trong quá trình ủ
trong tủ ấm.
- Dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào 5ml nước cất hoặc
nước muối sinh lý (0.85% NaCl) tiệt trùng, lắc đều.
- Dùng pipet tiệt trùng hút vi khuẩn cho vào các ô của bộ kit. Các ô CIT,

GEL và VP thì cho đầy, các ô còn lại cho vừa đủ.
- Cho paraffin tiệt trùng vào các ô ADH, LDC, ODC, H
2
S và URE.
- Ủ trong tủ ấm ở 28C và đọc kết quả sau 48 giờ.
Đọc kết quả
- TDA: Nhỏ một giọt thuốc thử TDA. Một màu đen xuất hiện cho phản ứng
dương (+), màu vàng cho phản ứng âm (-).
- IND: Nhỏ một giọt thuốc thử IND. Đợi 2 phút. Một vòng màu đỏ xuất hiện
cho phản ứng dương (+), màu vàng cho phản ứng âm (-).
- VP: Thêm một giọt mỗi dung dịch thuốc thử VP
1
, VP
2
. Đợi ít nhất 10 phút,
màu hồng hoặc màu đỏ xuất hiện cho phản ứng dương (+). Nếu màu hồng
nhạt xuất hiện trong vòng 10-12 phút, được coi là phản ứng âm (-).
- Các chỉ tiêu còn lại đọc kết quả dựa vào bảng chỉ tiêu, không cần sử dụng
thuốc thử. Sau khi cho thuốc thử vào không nên đem ủ trở lại trong tủ ấm.
Bảng 3.3: Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi
khuẩn được xác định bằng bộ kit API 20E
Chỉ tiêu Âm tính Dương tính
ONPG Không màu Vàng
ADH Vàng Đỏ/cam
LDC Vàng Đỏ/cam
ODC Vàng Đỏ/cam
CIT Vàng Xanh/xanh lá
H
2
S Không màu Đen

URE Vàng Đỏ/cam
TDA Vàng Nâu sậm
IND Vàng Hồng
VP Không màu Hồng/đỏ (10 phút)
GEL Không màu (còn kết tủa đen) Đen
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
16

GLU Xanh/xanh lá Vàng
MAN Xanh/xanh lá Vàng
INO Xanh/xanh lá Vàng
SOR Xanh/xanh lá Vàng
RHA Xanh/xanh lá Vàng
SAC Xanh/xanh lá Vàng
MEL Xanh/xanh lá Vàng
AMY Xanh/xanh lá Vàng
ARA Xanh/xanh lá Vàng

3.5.6 Phương pháp PCR
Chiết tách Acid nucleic (Bartie và ctv, 2006)
 Nuôi tăng sinh vi khuẩn (24 giờ) trong ống nghiệm có chứa 5ml môi
trường LB.
 Chuyển 1.5ml dung dịch vi khuẩn sang ống eppendorf và cho vào
100µl dung dịch TE (10mM Tris HCl và 1mM EDTA).
 Đun ở 95C trong vòng 15 phút.
 Làm lạnh trong nước đá.
 Ly tâm 14000 vòng/phút trong 2 phút. Rút phần dung dịch. Đo hàm
lượng DNA.
Khuyếch đại ADN: (theo Panangala và ctv (2007) có chỉnh sửa)
- Thành phần cho phản ứng:

Đoạn mồi xuôi (EiFd-1): GTAGCAGGGAGAAAGCTTGC
Đoạn mồi ngược (EiRs): GAACGCTATTAACGCTCACACC
Bảng 3.4 Thành phần hóa chất thực hiện phản ứng PCR
STT Thành phần tham gia phản ứng Hàm lượng
1 PCR Buffer 10 X
2 MgCl
2
1.5 mM
3 dNTPs 200 µM
4 Taq DNA polymerase 5 U
5 Đoạn mồi (EiFd-1) 0.4 µM
6 Đoạn mồi (EiFd-1) 0.4 µM
7 Mạch khuôn 20 ng
8 Nước cất -
- Chu kỳ nhiệt
1. Giai đoạn tiền biến tính: 95C trong 4 phút.
2. Tiếp theo là 30 chu kỳ gồm:
- Giai đoạn biến tính: 95C trong 30 giây
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
17

- Giai đoạn gắn mồi: 53C trong 45 giây
- Giai đoạn kéo dài chuỗi: 72C trong 30 giây.
3. Giai đoạn kéo dài chuỗi cuối cùng: 72C trong 10 phút.
Điện di
Quá trình điện di được thực hiện với dung dịch TAE 0,5X và bản thạch chứa
1.5% agarose. Đun nóng dung dịch agarose tan hoàn toàn. Sau đó để dung
dịch nguội khoảng 50-60C cho ethidium bromide vào và đổ agarose vào
khay. Thể tích gel tùy thuộc vào kích cỡ của khay đựng gel. Độ dày của gel
chỉ cần cao hơn đáy của lược gel khoảng 0,3-0,5 cm và bề dày gel không quá

0,8cm Cho gel vào bồn điện di. Thêm dung dịch điện di cho vừa bao phủ gel.
Dùng pipette hút 10µl cho mẫu cần phân tích trộn với một giọt 6X dung dịch
nạp mẫu vào từng giếng một. Sử dụng thang DNA để xác định khối lượng
phân tử của sản phẩm PCR. Sử dụng dòng điện từ 100-150V. Ngừng điện di
khi màu xanh đậm di chuyển khoảng 1/2 đến 2/3 gel.
Đọc kết quả
Đặt gel lên bàn UV để đọc kết quả. Kết quả điện di được ghi nhận bằng máy
đọc gel Vilber Lourmat. Căn cứ vào thang DNA 1 kb plus ladder (Invitrogen)
để xác định trọng lượng phân tử. Trọng lượng phân tử đọan ADN của vi khuẩn
E. ictaluri cần phát hiện là 407bp.
3.5.7 Thí nghiệm gây cảm nhiễm
Mục đích của thí nghiệm gây cảm nhiễm trong đề tài này là để kiểm chứng lại
kết quả tái định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và
bằng bộ kit API 20E. Thí nghiệm được bố trí như sau:
- Bể composite (100L) và các dụng cụ được khử trùng bằng chlorine, xà
phòng, rửa lại bằng nước sạch. Sau đó cho nước vào bể và lắp hệ thống
sục khí liên tục vài ngày để loại hết chlorine.
- Cá tra có trọng lượng 50-60g/con, màu sắc tươi sáng, phản ứng linh
hoạt được chọn và bố trí ngẫu nhiên 6con/bể vài ngày cho cá quen dần
với môi trường nước. Vẫn cho ăn bình thường, tiến hành kiểm tra ký
sinh trùng và vi sinh trước khi gây cảm nhiễm.
- Vi khuẩn sau khi phục hồi trên môi trường TSA, giữ trong tủ ấm 48 giờ
ở 28C, sau đó chọn một khuẩn lạc nuôi tăng sinh trong môi trường
nutrient broth 24 giờ, sau đó ly tâm 15 phút (4000 vòng/phút), rửa bằng
nước muối sinh lý (0.85% NaCl), xác định mật độ vi khuẩn bằng máy
so màu quang phổ ở bước sóng 650nm, xác định OD = 1(tương đương