123doc cac phuong phap tach dong gen tach dong gen potx

III. Các phương pháp tách dòng gen
Tách dòng gen (gene cloning), còn dưoc goi vói nhieu tên khác nhau: tao dòng
gen, nhân dòng gen, phân l¾p gen…Tách dòng gen là t¾p hop các ky thu¾t nham dưa
m®t gen, m®t doan DNA can thiet (DNA ensert) vào te bào chú (host cell), tao dieu
ki¾n tích hop de các te bào chú phân chia, tao nên vô so các te bào cùng mang m®t
doan DNA insert giong nhau, tao nên m®t dòng te bào tái to hop mang gen can tách
dòng.
Tách dòng gen có teh dưoc thnc hi¾n theo nhieu phương pháp khác nhau.Các
phương pháp tách dòng gen chú yeu duoc sú dnng nhieu trong công ngh¾ sinh hoc
phân tú

là tách dòng thnc nghi¾m (cloning in vitro) và tách dòng áo (cloning in

silico).
1. Tách dòng invitro.
Tách dòng in vitro hay tách dòng thnc nghi¾m là tách dòng gen dưoc thnc hi¾n
tù các mau sinh hoc (mô te vào, lông tóc, d%ch sinh hoc…), mang các gen can tách
dòng ho¾c tong hop nhân tao doan gen can tách dòng.
Tách dòng in vitro gom phương pháp khác nhau, có the tách dòng tù DNA, tách
dòng tù RNA ho¾c tách dòng trên cơ só trình tn cac acid amin trong chuoi
polypeptid….
1.1. Tách dòng gen tù DNA:
Tách dòn tù DNA gom các bưóc cơ bán sau:
Bưóc 1: Chuân b% gen can tách dòng (gen can thiet, gen dích - target gene) và
chon vectơ tách dòng.
- Chuan b% gen can tách dòng:
Trong các phòng thí nghi¾m sinh hoc phan tú gen can tách dòng thưòng dưoc
tách chiet tù các mau sinh hoc. Phương pháp này chuan b% gen tách dòng bang tong
hop nhân tao tù các oligonucleotid ít dưoc sú dnng, do ky thu¾t phúc tap, ton kém và
d® chuan xác không cao.
Trưòng hop chưa biet trình tn cúa gen can tách dòng, phái dna vào kích thưóc

cúa gen can tách dòng de chon loc doan gen can tách dòng. Các bưóc thnc hi¾n chú
yeu: tách chiet DNA b® gen, nhân gen bang PCR, sú dnng enzym giói han cat thành
các doan DNA nhó, di¾n di trên gel agar (ho¾c gel polyacrylamid) vói thang DNA

1


chuan. Tù ket quá di¾n di, dna vào kích thưóc cúa gen can tách dòng de lna chon dưoc
doan DNA chúa gen can tách dòng.

Sơ do ky thu¾t tách dòng thnc nghi¾m
- Chon vectơ tách dòng
Dna vào kích thưóc gen can tách dòng và mnc dích tách dòng de chon vectơ
tách dòng là plasmid, phage, các nhiem sac the nhân tao…
Bưóc 2: Tao vectơ tái to hop.
Sú dnng các enzym giói han thích hop cat các gen can tách dòng và vectơ tách
dòng ó nhung v% trí d¾c hi¾u giong nhau, tao dieu ki¾n thu¾n loi cho quá trình tái to hop
giua vectơ tách dòng và các doan DNA inset. Sú dnng enzym noi DNA ligase gan các
gen can tách dòng vào vectơ có hi¾u quá, hình thành các vectơ tái to hop (recombinant
vectơ).
Ðe hi¾u quá tao vectơ tái to hop cao, can chú ý tí l¾ thích hop giua vectơ tách
dòng và các doan DNA insert, dong thòi bo sung các enzym noi DNA thích hop.
Enzym T4DNA ligase xúc tác hình thành các liên ket phosphoeste noi các doan DNA


cat dau bang vói nhau, nên dưoc sú dnng rat r®ng rãi trong tao vectơ noi các doan
DNA.
Bưóc 3: Bien nap vectơ tái to hop vào te bào chú.
Bien nap vectơ tái to hop vào te bào chú (host cell) bang các phương pháp khác
nhau: Siêu âm, vi tiêm, ban gen, sú dnng PEG (polyethylen glycol)… Vói các te bào

chú là vi khuan thưòng sú dnng phương pháp bien nap soc nhi¾t. Phương pháp soc
nhi¾t có hi¾u quá cao vói các te bào chú là vi khuan E.coli và m®t so loài vi khuan
khác. Trưòng hop te bào chú là nam men có the sú dnng phương pháp bien nap là
xung di¾n, bán gen….
Bưóc 4: Sàng loc các dòng tái to hop
Sàng long (screeing) các the tái to hop nham chon loc các te bào mang vectơ tái
to hop trong quan the. Tuỳ thu®c gen chí th% (marker) trong các vectơ tái to hop là chí
th% kháng sinh, ho¾c chí th% màu de lna chon phương pháp thích hop.
Bưóc 5: Nuôi cay dòng tái to hop thu sinh khoi và protein tái to hop.
Nuôi cay các dòng tái to hop trong môi trưòng dinh dưõng ó các dieu ki¾n thích
8

9

hop, khi m¾t d® te bào dat 10 - 10 te bào/1ml có the li tâm thu sinh khoi te bào.
1.2. Tách dòng gen tù RNA thông tin (mRNA).
Tách dòng gen tù mRNA là m®t quá trình phúc tap, có the thnc hi¾n theo các
bưóc sau:
Bưóc 1: Tách chiet mRNA
RNA thông tin dưoc tách chiet theo các protcol thông dnng trong các phòng thí
nghi¾m. Có the sú dnng sac kí ái lnc vói bi tù có mang oligo nucleotid T. Các phân tú
mRNA có duôi poly A tao liên ket vói oligo - dT, làm cho các phân tú mRNA bám
trên be m¾t các viên bi tù. Sú dnng ky thu¾t li tâm phân doan tách mRNA ra khói bi tù
0

de thu mRNA. Có the giu mRNA ó nhi¾t d® - 85 C de tiep tnc nghiên cúu.
Bưóc 2: Tong hop cDNA mach kép.
Sú dnng ky thu¾t PCR ngưoc có sn tham gia cúa enzym phiên mã ngưoc
(reverse transcriptase enzyme), enzym DNA polymerase de tong hop cDNA (cDNA
complêmntary DNA). Thuý phân soi khuôn mRNA bang enzym RNase H, sau dó bo

sung enzym DNA polymerase và các dNTP de tong hop soi dơn cDNA thú hai, tao phân
tú cDNA mach kép.


Bưóc 3,4,5: Gan cDNA mach kép vói các vectơ tách dòng thích hop, hình thành
các vectơ tái to hop. Bien nap vào te bào chú, sau dó sàng loc các te bào mang vectơ
tái to hop và cay truyen vào các ong thach nghiêng tao nên các dòng khác nhau duoc
tách dòng tù mRNA.

Tách dòng gen tù mRNA
Ket quá tù mRNA có the tao nên các dóng vi khuan mang doan cDNA mach kép,
tương ưng vói các gen can tách dòng.
2. Tách dòng in sillico.
Tách dòng in silico hay tách dòng áo (cloning in silico) là sn tong hop, phân
tích các ket quá tách dòng gen in vitro, trên cơ só thông tin tù các ngân hàng du li¾u
(STS, EST…) de lna chon m®t doan DNA ho¾c m®t gen can thiet nào dó.
Ket quá tách dòng in silico cho phép lna chon phương án thiet ke vectơ tái to
hop có hi¾u quá, dn toán trưóc ket quá tách dòng và hi¾u quá bieu hi¾n gen cũng như
múc d® thành công cúa thnc nghi¾m.


Bưóc 1: Sú dnng phan mem pDRAW 32 de chon vectơ tách dòng. Giái thiet chon
vectơ pCR 2.1 trong các loai vectơ hien th%, dong thòi kiem tra rình tn nucleotid cúa
vectơ pCR 2.1 và tìm v% trí cat cúa enzym giói han thích hop. Ví dn, doan DNA insert
có kích thưóc 958 bp, có the ài gan vào vectơ pCR 2.1 ó v% trí 294 và ket thúc ó v% trí
1252 .
IV. Ngân hàng b® gen (genome bank)
1. Khái ni¾m ngân hàng b® gen.
Ngân hàng b® gen là t¾p hop các doan DNA b® gen dưoc tách dòng trong te
bào chú, tao nên các dòng te bào khác nhau, moi dòng mang m®t doan DNA khác nhau

cúa b® gen. B® gen cúa sinh v¾t b¾c cao gom các gen phân doan, có các exon xen ke
intron. Do dó, ngân hàng b® gen bao gom các doan DNA có các trình tn mang mã di
truyen (exon) xen ke vói các trình tn không mang mã di truyen (intron).
Moi loai enzym giói han cat d¾c hi¾u DNA ó nhung trình tn nhat d%nh. M®t b®
gen, khi sú dnng các loai enzym giói han khác nhau, tao nên so lưong doan cat khác
nhau, se hình thành nên các ngân hàng b® gen khác nhau.
2. Thiet l¾p ngân hàng b® gen.
Thiet l¾p ngân hàng b® gen có the thnc hi¾n ó các múc d® khác nhau: ngân
hàng gen cúa m®t nhiem sac the, m®t te bào hay m®t loài.
Thiet l¾p ngân hàng b® gen có the thnc hi¾n theo các bưóc cơ bán sau:
Tách chiet và tinh sach DNA b® gen, sú dnng m®t ho¾c m®t so loai enzym giói
han cat DNA b® gen thành tùng doan có kích thưóc nhó theo ý muon.
Tách riêng tùng doan DNA và gan vói m®t vectơ tách dòng tao nên các vectơ
tái to hop, moi vectơ tái to hop dưoc chuyen vào m®t te bào chú tao nên m®t dòng.

5


Sơ do thiet l¾p ngân hàng b® gen
V. Ngânhàng cDNA
Tách chiet và tinh sach mRNA cúa te bào, mô ó tùng thòi diem nhat d%nh thu
dưoc so loai mRNA tương úng vói so gen dang hoat d®ng trong te bào. Sú dnng ky
thu¾t phiên mã ngưoc tù mRNA tao nên các cDNA tương túng, moi cDNA dưoc gan
vào m®t vectơ tách dòng, tao nên các còng cDNA khác nhau.
T¾p hop tat cá các mRNA thu duoc tù m®t loai te bào, ó các giai doan phát trien
khác nhau tao nên t¾p hop cDNA dưoc tách dòng goi là ngân hàng cDNA cúa m®t te
bào.
1. Ky thu¾t phiên mã ngưoc tao cDNA.
Ký thu¾t phiên mã ngưoc tao cDNA khác nhau, gom hai nhóm phương pháp
chú yeu:

1.1 Phiên mã ngưoc bang phân huý hoàn toàn soi khuôn mRNA
Sú dnng ky thu¾t PCR vói các moi d¾c hi¾u có duôi oligo - dT, các loai
nucleotid tn do và enzym DNA polymerase, tù soi khuôn mRNA tong hop soi dơn
cDNA có cau trúc kep tóc (hairpin loop) ó dau cuoi (dau 3'). Sú dnng enzym RNase H
de phân huý hoàn toàn soi khuôn mRMA, dong thòi bo sung enzym DNA polymerase
và các nucleotid tn do tong hop soi dơn cDNA thú 2, nhò kéo dài cau trúc kep tóc (cau
trúc vòng). Xú lý enzym S1 nuclease de cat bó doan cau trúc kep tóc, tao nên phân tú
cDNA có cau trúc xoan kép, mang mã di truyen tương úng vói gen mã hoá mRNA.

6


Sơ dò tao cDNA theo cách phân huy hoàn toàn mRNA
1.2. Phiên mã ngưoc tao cDNA theo ky thu¾t RACE
Ky thu¾t RACE gon các bưóc tương tn như tách dòng tù mRNA.
Sau khi tong hop dưoc cDNA mach dơn, thuý phân toàn b® phân tú mRNA
bang RNase H. Thnc hi¾n ky thu¾t noi thêm duôi poly C (CCCC) vào dau 3' cúa
cDNA nhò enzym terminal transferase và ATP. Bo sung thêm các moi oligo dG
(GGGG), dNTP, enzym DNA polymerase và thnc hi¾n nhân gen PCR de tong hop
mach cDNA thú hai.

7


Su dnng ky thu¾t RACE de tách dòng gen tù mRNA
2. Thiet l¾p ngân hàng cDNA
Ngân hàng cDNA có the xây dnng trên m®t nhiem sac the, m®t cơ quan ho¾c
toàn b® cơ the.
Tù moi phân tú mRNA thu dưoc, thnc hi¾n phiên mã ngưoc tao nên m®t cDNA
mach kép. Moi phân tú cDNA mach kép dưoc gan vào m®t vectơ tách dòng và chuyen

vào m®t te bào chú dao nên các dòng cDNA.