CÔNG NGHỆ bảo QUẢN ĐÔNG LẠNH tế bào THỰC vật

CHÀO MỪNG CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ ĐẾN VỚI
BUỔI THUYẾT TRÌNH CỦA
NHÓM 9_56SH2

CHỦ ĐỀ 9:

CÔNG NGHỆ BẢO QUẢN ĐÔNG
LẠNH TẾ BÀO THỰC VẬT
GVHD: TS. Phạm Thị Minh Thu
1


I. GIỚI
THIỆU

II. CÔNG NGHỆ
BẢO QUẢN
ĐÔNG LẠNH TẾ
BÀO

III. CÔNG
TRÌNH
NGHIÊN CỨU

NỘI DUNG

IV. TÀI LIỆU THAM
KHẢO
2

I. GIỚI THIỆU

1. Tính
cấp thiết
của đề
tài

• Công nghệ bảo quản lạnh thực vật đã
được phát triển nhanh chóng, mở ra khả
năng lưu trữ lâu dài các nguồn gen có
giá trị của nhiều loại cây trồng và cây
rừng.
• Từ cách tiếp cận làm mát chậm ban đầu,
nghiên cứu đã chuyển sang nhiều kỹ
thuật dễ dàng hơn, cho phép hoàn thiện
quá trình đông lạnh các chất trong tế bào
thông qua việc ngâm trực tiếp trong nitơ
lỏng.
3


2. Cơ sở lý thuyết
• Bảo quản lạnh các mô sinh học chỉ có thể thành công nếu
không có sự hình thành các tinh thể băng trong TB.
•  Về bản chất, một số loài thực vật đã áp dụng các hệ thống có
thể tránh hình thành tinh thể băng ở nhiệt độ dưới 00 được
thực hiện nhờ việc bổ sung các chất như đường, proline và
protein làm giảm điểm đóng băng trong sự sống.
•  Sự "tránh hình thành" kết tinh, trong khi vẫn duy trì một mức
độ ẩm tối thiểu cần thiết để duy trì sự sống còn, khi xử lý nhiệt

độ bảo quản lạnh cực thấp. 
• Sự chuyển đổi của dung dịch nước thành một chất vô định
hình và đông lạnh chúng (tức là không tinh thể)

4


II. CÔNG NGHỆ BẢO QUẢN ĐÔNG
LẠNH TẾ BÀO
1. Công nghệ bảo quản đông lạnh tế bào
Phương pháp bảo tồn đông lạnh sử dụng các kỹ thuật hoặc
phối hợp các kỹ thuật, những phương pháp phổ biến
Cơ sở của phương pháp: làm lạnh chậm các mẫu bảo tồn có mặt
của dung dịch bảo vệ đông lạnh Dimethyl Sulfoxide (DMSO) nồng
độ trung bình 5-15%, trong quá trình hạ nhiệt độ, mức hạ nhiệt độ
-400C đảm bảo yêu cầu.

5


2. Phương pháp bảo quản

Sơ đồ phương thức bảo quản

6


 Môi trường bảo quản: nitơ lỏng

 Mẫu: phôi, mô sẹo, mô nuôi cấy

 Thời gian: 20-30 năm hoặc lâu hơn
 Trước bảo quản mẫu: cần xử lý để tránh sự tạo tinh
thể nước trong tế bào gây chết mẫu

7


Tách mẫu ở giai đoạn sinh trưởng mạnh để đưa vào bảo
quản.
Xử lý chống đông cho TB, mô nuôi cấy: bằng dung dịch
prolin 5-10%, manitol 3-6% có bổ sung chất chống đông
là dung dịch DMSO 1M + glycerol 1M + saccarose
2M…
Xử lý lạnh: đến nhiệt độ đóng băng ổn định của tế bào
chất (-300C đến -400C).
Bảo quản mẫu:trong nitơ lỏng(-1960C)
Sau bảo quản: phải phá băng (37-400C) để phục hồi mẫu 
nuôi cấy để cho cây hoàn chỉnh
Quy

trình

8


3. Ưu và nhược điểm
Ưu điểm

Nhược điểm

• Đảm bảo độ an toàn và sạch
bệnh cao, có khả năng tạo quần
thể cây đồng nhất với số lượng
lớn.
• Với phương pháp bảo quản siêu
lạnh có thể bảo quản được lâu
dài với số lượng lớn và ổn định.
• Hạn chế khả năng mất nguồn
gen, nhất là các nguồn gen có
nguy cơ xói mòn cao, các loài
có nguy cơ bị tuyệt chủng.
• Không có nguy cơ bị ô nhiễm
bởi nấm mốc hoặc vi khuẩn

• Chi phí bảo quản lớn
• Đòi hỏi trình độ kỹ
thuật cao và trang
thiết bị hiện đại
• Có khả năng tạo ra
biến dị Soma với tần
số biến dị khác nhau 9


III. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU
1. Cây Vanilla planifolia (thuộc họ lan, thân dây leo)

Là giống cây trồng quan trọng trong công nghiệp sản
xuất hương vị và cũng là giống mang tính thương
mại nhất thuộc họ lan.

10


Cách tiến hành

11


Thực hiện
Tiền xử lý và làm khô
Cẩn thận chọn những hạt nhỏ, tròn đều, đường kính từ
4-5mm
 Xử lý chất bảo vệ: prolin 5-10%, dd DMSO 1M và lactose
10%
Tăng nồng độ từng bước trong môi trường MS: ở nồng
độ sucrose lên 0.1,0.3,0.5,0.7 và 1.0M trong 5 ngày, mỗi
ngày ứng với 1 nồng độ
Làm khô những hạt đã được tiền xử lý trên giấy lọc vô
trùng trong đĩa Petri và sấy khô trên đĩa mỏng từ 1-10h
ở nhiệt độ phòng
12


Kĩ thuật trữ lạnh
 Chuyển 10 hạt khô vào mỗi lọ cryo 2.0ml

Làm đông nhanh bằng cách cho trực tiếp lọ
cryo vào nito lỏng
Mẫu có thể được dự trữ trong nito lỏng
trong 10 năm

13


Hóa lỏng, rã đông, tái tạo thành cây hoàn chỉnh
 Hóa lỏng mẫu bằng cách nhúng trực tiếp lọ cryo vào nước
ở 400 C trong vòng 5-10 phút
 Trồng những hạt đã được rã đông vào đĩa Petri chứa 25ml
môi trường MS rắn gồm 30g/l sucrose, 1mg/l BAP và 0,5mg/l
IBA, đặt trong tối 7 ngày đầu sau đó chiếu sáng với cường độ
35 µmol/m2/s để cây mẹ phát triển. Tốc độ hồi phục 50-70%
 Sau 2 tuần, chồi mọc lên từ hạt đã được rã đông

Sự nảy mầm của hạt

14



Sau đó cấy chuyền vào môi trường MS cơ
bản để giúp cho sự phát triển của chồi và hệ thống
rễ.
Cảm ứng tạo rễ: cấy những đoạn chồi có chiều dài khoảng
2cm vào môi trường MS cơ bản. Trong vòng 3 ngày ta sẽ
thấy được sự hình thành rễ.

Cây sau quá
trình tạo rễ

15

Cảm ứng tạo mô sẹo:
•Nuôi cấy mô, sau đó cắt các nguyên liệu nuôi cấy đẻ chuẩn
bị cho quá trình cảm ứng tạo sẹo.
•Cấy các mô cho môi trường MS có bổ sung 1mg/lBA và
0.5mg/l NAA.
•Ban đầu giữ cho mô cấy ở trong tối từ 2-5 ngày để cảm ứng
tạo sẹo.

16


Tái sinh cây
Cấy các mô sẹo mới hình thành vào môi trường MS có
chứa 1mg/l BA và 0.5mg/l IBA. Nuôi cấy cấp 2 trong môi
trường MS trong vòng 20 ngày.
Mô sẹo sẽ phân hóa thành Protocorm, chồi có rễ trong
khoảng 3-6 tháng.
Tách rời và nuôi cấy các chồi phát triển tốt và có tạo rễ
cho đến khi cứng cáp rồi đem ra ngoài vườn hay sử dụng
làm nguyên liệu cho quá trình nhân giống kế tiếp.

Quá trình tái sinh cây từ mô sẹo
17


1. Cây Nothapodytes nimmoniana

Nothapodytes nimmoniana là một cây thuốc chống ung
thư quan trọng có nhiều chất hoạt tính sinh học, trong

đó camptothecin (CPT) là chất quan trọng nhất. 

18


QUY TRÌNH

Khử trùng và xử lý hạt
• Hạt được tách ra từ quả.
• Rửa hạt bằng nước máy để loại bỏ chất nhầy trong 10 phút
• Hạt giống sau đó đã được khử trùng bằng cách ngâm trong
0,01% HgCl2 trong 5-10 phút. Tiếp theo rửa trong nước cất
vô trùng từ 3-5 lần.
• Tiến hành tách áo hạt bằng kẹp và dao mổ vô trùng (thao
tác được thực hiện trong tủ cấy để tách lấy phôi
• Mỗi lần lấy 20 phôi và làm mất nước dưới luồng không khí
sạch trong 30, 60,90, 120,150,180 và 210 phút
19


Nuôi cấy phôi đã khử trùng
Mẫu phôi đã được xử lí được nuôi cấy trong môi trường MS
(Murashige and Skoog, 1962) ( ở điều kiện: 25±2 0C, thời gian
chiếu sáng là 10 giờ sáng/14 giờ tối) nuôi cấy trong 8 tuần.

Bảo quản lạnh phôi bằng nito lỏng
(-196OC)
•Phôi tiếp tục được xử lí khô trong 30 phút.
•Chuyển các phôi vừa được xử lí vào lọ cryo 2.0ml có chứa
sẵn chất bảo vệ.

•Cho trực tiếp lọ cryo vào nito lỏng (cần đưa về nhiệt độ tối
ưu cho tế bào).
20


Rã đông tế bào
•Sau quá trình bảo quản trong nito lỏng, các lọ cryo được
lấy ra từ môi trương nito lỏng và được ngâm trong bể nước
ở 400C trong 1-2 phút.
•Có thể tiến hành chuyển phôi vào môi trường nảy mầm để
nuôi cấy phục hồi.

Đánh giá khả năng nảy mầm của phôi
Các quan sát về sự nảy mầm phôi được thực hiện sau 8
tuần. Tỷ lệ sống sót được đánh giá là Tỷ lệ phần trăm của
các phôi được thể hiện ở bất kỳ sự tăng trưởng nào, bao
gồm cả sự phát triển thành cây con cây, sự phát triển của
thân và sự phát triển của rễ.
21


Kết quả thí nghiệm

Hình a: Các trục phôi với lá mầm mới được tách ra từ hạt có độ
ẩm 55,7% và khả năng nảy mầm đạt 86,67% và tăng trưởng
bình thường trong môi trường MS.

Mô sẹo sau khi rã đông

22

• Xử lí làm mất nước phôi dưới luồng không khí làm độ ẩm
giảm xuống
• 43,7% sau 30 phút
• 31,3% sau 60 phút.
 khả năng nảy mầm của phôi (76-77%).
• 19,6% sau 120 phút.
 khả năng nảy mầm lên đến 66,67% và là khoảng thời gian
mất nước tối ưu để có được khả năng nảy mầm tối đa (60%)
sau khi xử lý LN( nito l.

23


Xử lí mất nước (150-180 phút) không chỉ giảm tỷ lệ sống
sót xuống còn 16.67-10% mà còn gây ra tăng trưởng bất
thường với sự phát triển của hạt trong phôi sống sót

Sự thoái hóa của đọt cây non trong phôi bị khô trong
180 phút.
24


• 12,1% sau 210 phút: không có phôi nào sống sót

Cây con từ phôi bảo quản lạnh sau 60 ngày nuôi cấy trên
môi trường MS cơ bản

25