ĐIỀU CHẾ KHÁNG HUYẾT THANH THỎ KHÁNG EDWARDSIELLA ICTALURI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐIỀU CHẾ KHÁNG HUYẾT THANH THỎ KHÁNG
EDWARDSIELLA ICTALURI

Họ và tên sinh viên: HỒ ĐÔNG QUANG
Ngành: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
Chuyên ngành: NGƯ Y
Niên khóa: 2004-2008

Tháng 09/2008


ĐIỀU CHẾ KHÁNG HUYẾT THANH THỎ KHÁNG EDWARDSIELLA
ICTALURI

Tác giả

HỒ ĐÔNG QUANG

Khóa luận được đệ trình để hoàn tất yêu cầu cấp bằng kỹ sư ngành
Nuôi Trồng Thủy Sản

Giáo viên hướng dẫn
TS.NGUYỄN HỮU THỊNH

Tháng 09 năm 2008
i

CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cảm ơn:
Cha mẹ và gia đình đã luôn ở bên cạnh, động viên và hỗ trợ về tinh thần lẫn vật
chất cho con trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
Ban Chủ nhiệm Khoa Thuỷ Sản cùng tất cả quý thầy cô đã tận tâm truyền đạt
những kiến thức quí báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho chúng tôi trong suốt quá
trình học tập.
Tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy Nguyễn Hữu Thịnh đã hướng dẫn tôi
hoàn thành tốt khoá luận tốt nghiệp này với tất cả trách nhiệm và lòng nhiệt thành.
Xin gửi lời cảm ơn đến tất cả bạn bè và tập thể Lớp Ngư y 30 đã luôn ở bên chúng
tôi, chia sẻ và động viên chúng tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi cũng xin cảm ơn sự giúp đỡ tận tình của cô Trần Ngọc Thiên Kim.
Tôi rất mong nhận được sự thông cảm và đóng góp ý kiến của quý thầy cô và các
bạn để đề tài được hoàn chỉnh hơn.

ii


TÓM TẮT
Đề tài nghiên cứu “Điều chế kháng huyết thanh thỏ kháng Edwardsiella
ictaluri” được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bệnh Học Thủy Sản, khoa Thủy Sản,
trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Thời gian từ tháng 04/2008 đến
tháng 08/2008.
Kết quả thu được
Điều chế đượchuyết thanh thỏ có chứa kháng thể kháng với vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri.
Kháng huyết thanh cho phản ứng ngưng kết với huyền phù FKC của Edwardsiella

ictaluri ở độ pha loãng 16 lần và cho phản ứng ngưng kết với vi khuẩn sống ở độ pha
loãng 8 lần.

iii


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa

i

Cảm tạ

ii

Tóm tắt

iii

Mục lục

iv

Danh sách các chữ viết tắt

vii

Danh sách các hình

viii

Danh sách các bảng

ix

CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU

1

1.1 Đặt Vấn Đề

1

1.2 Mục Tiêu Đề Tài

2

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

2.1 Một Số Đặc Điểm Sinh Học Của Cá Tra

3

2.1.1 Phân loại

3

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố

4

2.1.3 Đặc điểm dinh dưỡng

4

2.1.4 Đặc điểm sinh trưởng

4

2.1.5 Đặc điểm sinh sản

5

2.1.6 Điều kiện sống

6

2.2 Vi Khuẩn Ewardsiella ictaluri

6

2.2.1 Những nghiên cứu về vi khuẩn Ewardsiella ictaluri

6

2.2.2 Lịch sử về bệnh do Ewardsiella ictaluri trên thế giới và Việt Nam

7

2.2.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa

7

2.2.4 Triệu chứng và bệnh tích

9

2.2.5 Kết quả mô bệnh học

10

2.2.6 Phương pháp phòng trị bệnh do Ewardsiella ictaluri gây ra

11

iv


2.3 Cơ Chế Hình Thành Huyết Thanh

11

2.3.1 Các định nghĩa

11

2.3.2 Liều lượng và đường vào của kháng nguyên

12

2.3.3 Tính đặc hiệu của kháng nguyên

12

2.3.4 Các loại kháng nguyên

14

2.3.5 Các tế bào tham gia vào đáp ứng miễn dịch

13

2.3.6 Tế bào lympho

14

2.3.7 Đại thực bào

15

2.3.8 Tá chất

15

2.3.9 Cơ chế hình thành kháng thể

17

2.3.10 Bản chất và tính chất của kháng thể

17

2.3.11 Phản ứng ngưng kết

18

CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

19

3.1 Thời Gian Và Địa Điểm Thực Hiện Đề Tài

19

3.2 Vật Liệu Và Trang Thiết Bị Dùng Trong Nghiên Cứu

19

3.2.1 Dụng cụ nghiên cứu

19

3.2.2 Trang thiết bị máy móc

19

3.2.3 Môi trường cấy và bảo quản giống vi khuẩn

19

3.3 Phương Pháp Nghiên Cứu

20

3.3.1 Phương pháp cấy mẫu bệnh phẩm

20

3.3.2 Kiểm tra vi khuẩn và làm thuần

21

3.3.3 Tạo FKC

21

3.3.4 Tạo tá chất bổ trợ

22

3.3.5 Tạo kháng thể bằng cách tiêm vào cơ thể thỏ

22

3.3.6 Kiểm tra kháng thể

24

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

27

4.1 Kết Quả Thu Mẫu Cá Bệnh

27

4.1.1 Biểu hiện bệnh tích

27

4.1.2 Kết quả phân lập vi khuẩn

28
v


4.2 Kết Quả Tạo FKC

30

4.3 Kết Quả Tạo Kháng Thể Trên Thỏ

31

4.3.1 Lần tiêm Thứ nhất

31

4.3.2 Lần tiêm thứ 2

32

4.3.3 Lần tiêm thứ 3,4 và 5

32

4.3.4 Lần tiêm thứ 6

33

4.3.5 Phản ứng ngưng kết trên phiến kính

34

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

36

5.1 Kết Luận

36

5.2 Đề Nghị

36

TÀI LIỆU THAM KHẢO

37

PHỤ LỤC

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BHIA : Brain Heart Infusion Agar
BHIB : Brain Heart Infusion Broth
TSA : Tryptone Soya Agar
TCR : T-cell receptor
FKC : Formalin killed cell
s

: que

vr

: biến đổi

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Đặc tính sinh lý, sinh thái cơ bản của vi khuẩn Ewardsiella ictaluri

8

Bảng 2.2 Đặc tính sinh hoá cơ bản của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

9

Bảng 2.3 Tỷ lệ phân bố tế bào lympho T và B

15

Bảng 3.1 Các lần tiêm và lấy máu thỏ

24

Bảng 3.2 Sơ đồ thực hiện phản ứng ngưng kết trên microplate

26

Bảng 4.1 Kết quả định danh vi khuẩn Ewardsiella ictaluri

30

Bảng 4.2 Kết quả thu huyết thanh thỏ ở lần tiêm thứ 3

32

Bảng 4.3 Kết quả thu huyết thanh thỏ ở lần tiêm thứ 4

33

Bảng 4.4 Kết quả thu huyết thanh thỏ ở lần tiêm thứ 5

33

Bảng 4.5 Kiểm tra, phân lập vi khuẩn trên cá gây bệnh thực nghiệm

35

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Hình thái ngoài của cá tra

3

Hình 2.2 Hình ảnh vi khuẩn Ewardsiella ictaluri dưới kính hiển vi

7

Hình 2.3 Khuẩn lạc vi khuẩn Edwardsiella ictaluri mọc trên môi trường TSA

8

Hình 2.4 Nội tạng cá xuất hiện đốm trắng

10

Hình 2.5 Gan xuất hiện nhiều vùng xung huyết

10

Hình 2.6 Vi khuẩn xuất hiện ở rìa các vết thương ở gan

11

Hình 3.1 Thỏ thí nghiệm

23

Hình 3.2 Kết quả phản ngưng kết trên microplate

26

Hình 4.1 Xoang bụng cá sau khi được mổ với 3 đường cắt

27

Hình 4.2 Đốm trắng xuất hiện trên gan thận cá tra

28

Hình 4.3 Khuẩn lạc vi khuẩn Ewardsiella ictaluri mọc trên môi trường BHIA

29

Hình 4.4 Vi khuẩn Ewardsiella ictaluri dưới kính hiển vi quang học

29

Hình 4.5 Vi khuẩn bất hoạt bằng formalin sau khi ly tâm

31

Hình 4.6 Thu máu thỏ

34

ix


CHƯƠNG I
MỞ ĐẦU
1.1

Đặt Vấn Đề
Edwardsiella ictaluri, trực khuẩn Gram âm, là nguyên nhân gây bệnh viêm ruột

nhiễm khuẩn huyết trên cá da trơn, Ictalurus puntatus, ở Hoa Kỳ. Vi khuẩn lần đầu tiên
được phân lập và định danh vào năm 1976 (Hawke, 1979). Từ đó đến nay, vi khuẩn này
luôn được xem là nguyên nhân gây bệnh với tỷ lệ chết rất cao trên cá nheo nuôi công
nghiệp.
Nghề nuôi cá tra thâm canh của nước ta phát triển rất nhanh trong 10 năm trở lại
đây. Sản lượng cá tra nuôi ước đạt 800 ngàn tấn vào năm 2006. Song song với sự phát
triển của nghề nuôi, vấn đề dịch bệnh trên cá tra nuôi ngày càng trở nên trầm trọng. Một
trong những bệnh quan trọng nông dân nuôi cá tra thường gọi là bệnh gan thận mủ, gây
thiệt hại rất lớn cho nghề nuôi. Cao điểm dịch bệnh thường xảy ra từ tháng 9 đến tháng 12
hàng năm vào lúc thời tiết chuyển mát. Thiệt hại do bệnh cũng rất lớn, tỷ lệ cá chết có thể
lên đến 90% trên cá tra giống và 50% trên cá nuôi thương phẩm. Ferguson và ctv (2001)
đã có công trình nghiên cứu đầu tiên mô tả về bệnh mủ gan trên cá tra nuôi tại Việt Nam.
Tuy nhiên, nguyên nhân gây bệnh chỉ được xác định sau đó một năm chính do vi khuẩn
E. ictaluri ( Từ Thanh Dung và ctv, 2002).

Khi dịch bệnh xảy ra thì việc chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh khá phức tạp và
thường mất nhiều thời gian.
Trước yêu cầu thực tế đó được sự phân công của khoa Thủy Sản trường Đại Học
Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh và được sự hướng dẫn tận tình của thầy Nguyễn Hữu
Thịnh – Chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Điều chế kháng huyết thanh thỏ kháng
Ewardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra”

1


1.2

Mục Tiêu Đề Tài
Điều chế kháng huyết thanh thỏ kháng vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh gan, thận, mủ

để chẩn đoán nhanh bệnh này trên cá tra.

2


CHƯƠNG II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1

Một Số Đặc Điểm Sinh Học

2.1.1 Phân loại
Theo hệ thống phân loại của Tyson Roberts và Vidthayvanon, 1991, vị trí phân
loại của cá tra như sau:
Ngành: Chordata

Bộ: Siluriformes
Họ: Pangasiidae
Giống: Pangasianodon
Loài: Pangasianodon hypophthalmus

Hình 2.1: Hình thái ngoài của cá tra (Nguồn: fistenet.gov.vn)

3


2.1.2 Nguồn gốc và phân bố
Cá tra phân bố ở lưu vực sông Mê kông, có mặt ở cả 4 nước Lào, Việt Nam,
Cămpuchia và Thái lan. Ở Thái Lan còn gặp cá tra ở lưu vực sông Mekloong và Chao
Phraya. Ở nước ta những năm trước đây khi chưa có cá sinh sản nhân tạo, cá bột và cá
giống tra được vớt trên sông Tiền và sông Hậu. Cá trưởng thành chỉ thấy trong ao nuôi,
rất ít gặp trong tự nhiên địa phận Việt nam, do cá có tập tính di cư ngược dòng sông Mê
kông để sinh sống và tìm nơi sinh sản tự nhiên. Khảo sát chu kỳ di cư của cá tra ở địa
phận Campuchia cho thấy cá ngược dòng từ tháng 10 đến tháng 5 và di cư về hạ lưu từ
tháng 5 đến tháng 9 hàng năm.
2.1.3 Đặc điểm dinh dưỡng
Cá tra khi hết noãn hoàng thì thích ăn mồi tươi sống. Dạ dày của cá phình to hình
chữ U và co giãn được, ruột cá tra ngắn, không gấp khúc lên nhau mà dính vào màng treo
ruột ngay dưới bóng khí và tuyến sinh dục. Dạ dày to và ruột ngắn là đặc điểm của cá
thiên về ăn thịt. Trong quá trình ương nuôi thành cá giống trong ao, chúng ăn các loại phù
du động vật có kích thước vừa cỡ miệng của chúng và các thức ăn nhân tạo. Khi cá lớn
thể hiện tính ăn rộng, ăn đáy và ăn tạp thiên về động vật nhưng dễ chuyển đổi loại thức
ăn. Trong điều kiện thiếu thức ăn, cá có thể sử dụng các loại thức ăn bắt buộc khác như
mùn bã hữu cơ, thức ăn có nguồn gốc động vật. Trong ao nuôi cá tra có khả năng thích
nghi với nhiều loại thức ăn khác nhau như cám, rau, động vật đáy.
2.1.4 Đặc điểm sinh trưởng

Cá tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh, còn nhỏ cá tăng nhanh về chiều dài.
Cá ương trong ao sau 2 tháng đã đạt chiều dài 10-12 cm (14-15 gam). Từ khỏang 2,5 kg
trở đi, mức tăng trọng lượng nhanh hơn so với tăng chiều dài cơ thể. Cỡ cá trên 10 tuổi
trong tự nhiên (ở Campuchia) tăng trọng rất ít. Cá tra trong tự nhiên có thể sống trên 20
năm. Nuôi trong ao 1 năm cá đạt 1-1,5 kg/con (năm đầu tiên ), những năm về sau cá tăng
trọng nhanh hơn, có khi đạt tới 5-6 kg/năm tùy thuộc môi trường sống và sự cung cấp
thức ăn cũng như loại thức ăn có hàm lượng đạm nhiều hay ít. Ðộ béo Fulton của cá tăng
dần theo trọng lượng và nhanh nhất ở những năm đầu, cá đực thường có độ béo cao hơn
cá cái và độ béo thường giảm đi khi vào mùa sinh sản.
4


2.1.5 Đặc điểm sinh sản
Tuổi thành thục của cá đực là 2 tuổi và cá cái 3 tuổi, trọng lượng cá thành thục lần
đầu từ 2,5-3 kg. Trong tự nhiên chỉ gặp cá thành thục trên sông ở địa phận của Campuchia
và Thái lan.
Cá tra không có cơ quan sinh dục phụ (sinh dục thứ cấp), nên nếu chỉ nhìn hình
dáng bên ngoài thì khó phân biệt được cá đực, cái. Ở thời kỳ thành thục, tuyến sinh dục ở
cá đực phát triển lớn gọi là buồng tinh hay tinh sào, ở cá cái gọi là buồng trứng hay nõan
sào. Tuyến sinh dục của cá tra bắt đầu phân biệt được đực cái từ giai đọan II tuy màu sắc
chưa khác nhau nhiều. Các giai đọan sau, buồng trứng tăng về kích thước, hạt trứng màu
vàng, tinh sào có hình dạng phân nhánh, màu hồng chuyển dần sang màu trắng sữa. Hệ số
thành thục của cá tra khảo sát được trong tự nhiên từ 1,76-12,94 (cá cái) và từ 0,83-2,1
(cá đực) ở cá đánh bắt tự nhiên trên sông cỡ từ 8-11kg. Trong ao nuôi vỗ, hệ số thành
thục cá tra cái có thể đạt tới 19,5%.
Mùa vụ thành thục của cá trong tự nhiên bắt đầu từ tháng 5-6 dương lịch, cá có tập
tính di cư đẻ tự nhiên trên những khúc sông có điều kiện sinh thái phù hợp thuộc địa phận
Campuchia và Thái lan, không đẻ tự nhiên ở phần sông của Việt Nam. Bãi đẻ của cá nằm
từ khu vực ngã tư giao tiếp 2 con sông Mêkông và Tonlesap, từ thị xã Kratie (Campuchia)
trở lên đến thác Khone, nơi giáp biên giới Campuchia và Lào. Nhưng tập trung nhất từ k

Kampi đến hết Koh Rongiev thuộc địa giới 2 tỉnh Kratie và Stung Treng. Tại đây có thể
bắt được những cá tra nặng tới 15 kg với buồng trứng đã thành thục. Cá đẻ trứng dính vào
giá thể thường là rễ của loài cây sống ven sông Gimenila asiatica, sau 24 giờ thì trứng nở
thành cá bột và trôi về hạ nguồn.
Trong sinh sản nhân tạo, ta có thể nuôi thành thục sớm và cho đẻ sớm hơn trong tự
nhiên (từ tháng 3 dương lịch hàng năm), cá tra có thể tái phát dục 1-3 lần trong một năm.
Số lượng trứng đếm được trong buồng trứng của cá gọi là sức sinh sản tuyệt đối.
Sức sinh sản tuyệt đối của cá tra từ 200 ngàn đến vài triệu trứng. Sức sinh sản tương đối
có thể tới 135 ngàn trứng/kg cá cái. Kích thước của trứng cá tra tương đối nhỏ và có tính
dính. Trứng sắp đẻ có đường kính trung bình 1mm. Sau khi đẻ ra và hút nước đường kính
trứng khi trương nước có thể tới 1,5-1,6mm.
5


2.1.6 Điều kiện sống
Nhiệt độ thích hợp cho cá tăng trưởng dao động từ 26-300C. Nhờ có cơ quan hô
hấp phụ nên cá có khả năng sống ở nhưng nơi ao tù nước bẩn, hàm lượng oxy hoà tan
thấp, cá khả năng chịu pH từ 4-5 (Ngô Trọng Lư và Thái Bá Hổ, 2004).Độ mặn 7-10o/oo.
pH thích hợp cho cá 6,5-7,5.
2.2

Vi Khuẩn E. ictaluri

2.2.1 Những nghiên cứu về vi khuẩn E. ictaluri
Waltman và ctv (1986) đã mô tả đặc điểm sinh hóa hoàn chỉnh của E. ictaluri.
Plumb và Vinitnantharat (1989) đã tìm thấy một vài đặc điểm hóa sinh học và tính
đa dạng về huyết thanh giữa các loài.
E. ictaluri có từ 1-3 plasmid (Speyerer và Boyle 1987, Newton và ctv (1988).
Chức năng của chúng vẫn chưa được làm rõ, nhưng chúng quan trọng trong việc nâng cao
tính kháng đối với kháng sinh cho E. ictaluri.

Shotts và Waltman (1990) đã nghiên cứu ra một môi trường có tính chọn lọc cho
E. ictaluri, Edward-siella ictaluri agar (EIA) giúp tăng tính chính xác khi phán đoán sự
có mặt của E. ictaluri trong lần phân lập vi khuẩn đầu tiên.
Roger 1981 đã định danh E. ictaluri bằng kỹ thuật enzyme link immunosorbant
assay ( gọi tắt là kỹ thuật ELISA).
Ainsworth và ctv, 1986 định danh E. ictaluri thông qua những đặc điểm sinh hóa
và huyết thanh của chúng bằng phản ứng ngưng kết huyết thanh chuyên biệt, hoặc dùng
kháng thể phát huỳnh quang (fluoresent antibody- FA).
ELISA và FA có thể dùng để thăm dò và định danh E. ictaluri trong những vết bôi
được làm trực tiếp từ mô của cá bị nhiễm bệnh.
Theo Wolter và Johnson (1994) khi gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm trên cá
nheo Mỹ (từ 15 - 20 cm) với mật độ vi khuẩn E. ictaluri là 1,2x106 cfu/0,1ml ở 250C, tốc
độ nước chảy 1 lít/phút, cho ăn 3% trọng lượng thân/ngày.
Theo Ferguson và ctv (2001) thì sau khi phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh
đốm trắng ở nội tạng cá tra rồi tiến hành gây cảm nhiễm. Kết quả vi khuẩn có khả năng
tạo hoại tử có khả năng tạo hoại tử trong 7 ngày.
6


Theo Phan Thị Mỹ Hạnh (2004) thí nghiệm gây cảm nhiễm trên cá tra bằng cách
tiêm vi khuẩn E. ictaluri với mật độ là 1,5x106 cfu/ml và mật độ 1,5x105 cfu/ml để xác
định khả năng bộc phát bệnh, kết quả cá chết 100% sau 6 ngày.
2.2.2 Lịch sử về bệnh do vi khuẩn E. ictaluri trên thế giới và Việt Nam
Bệnh được ghi nhận trên cá da trơn ở Mỹ năm 1976. Ba năm sau,1979 bệnh bắt
đầu được mô tả.
Năm 1981 lần đầu tiên mô tả nguyên nhân gây bệnh do vi khuẩn được định danh,
tên bệnh là bệnh là bệnh nhiễm trùng huyết và viêm ruột (Enteric Septimecia of catfish :
ESC). Năm 1985 Boonyaratpalin phát hiện E. ictaluri gây bệnh trên cá trê trắng và tìm
thấy trong môi trường nước ở Thái Lan (trích dẫn Từ Thanh Dung và ctv, 2002).
Năm 1992 phát hiện bệnh trên cá tra, basa nuôi ao bè ở Việt Nam Bệnh này xuất

hiện lần đầu tiên trên cá tra nuôi ở đồng bằng sông Cửu Long vào cuối năm 1998
(Ferguson và cộng sự, 2001).
Đến năm 2001 bệnh được gọi là bệnh mủ gan
2.2.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá
E. ictaluri thuộc họ Enterbacteriaceae là vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que
thẳng nhỏ với kích thước 1µm x 2-3 µm, không sinh bào tử, chuyển động nhờ vành tiêm
mao. Là vi khuẩn yếm khí tuỳ tiện, thành phần Cytozin và Guanin trong AND là 55-59
mol% (Bùi Quang Tề, 2006).

Hình 2.2:Vi khuẩn E. ictaluri dưới kính hiển vi (Nguồn: www.micro-gen.ouhsc.edu)
7


Vi khuẩn phát triển tốt trên các môi trường thạch Tryptic Soy, Brain Heart
Infulsion. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 28 0C. Sau 36h – 48h nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp
tạo thành khuẩn lạc màu trắng đục, không có nhân, rìa có dạng không đồng nhất (Từ
Thanh Dung và ctv, 2002).
Vi khuẩn sống trong bùn đến 95 ngày ở 250C, và có thể tồn tại trong gan, thận, não
cá sau khi khỏi bệnh vài tháng.

Hình 2.3: Vi khuẩn E. ictaluri phát triển trên môi trường TSA sau 48h (Nguồn: Từ
Thanh Dung và ctv, 2002. Vi khuẩn đốm trắng gây bệnh trên cá tra )
Bảng 2.1: Các đặc tính sinh lý, sinh thái cơ bản của vi khuẩn E. ictaluri(Nguồn: Từ
Thanh Dung va ctv, 2002. Vi khuẩn đốm trắng gây bệnh trên cá tra )
Chỉ tiêu

Kết quả

Nhuộm Gram

-

Hình dạng

s, vr

O/F

-/+

Oxidase

-

Catalase

+

8


Bảng 2.2: Các đặc tính sinh hóa cơ bản của vi khuẩn E. ictaluri (Bùi Quang Tề, 2006.
Bệnh học thủy sản)
ĐẶC ĐIỂM

E.ictaluri

Di động ở 25oC

có

Di động ở 35oC

không

Sinh Indole

-

Methyl red

-

Citrate simmons

-

Citrate Christensens

-

Sinh H2S trong triple sugar iron

-

Sinh H2S trong pepton iron agar

-

Giới hạn nồng độ muối 1,5%

+

Giới hạn nồng độ muối 3,0%

-

Tỷ lệ G – C của AND mol%

53

2.2.4 Triệu chứng và bệnh tích
Bệnh hay thường xảy ra vào tháng 9 và tháng 10 hàng năm lúc thời tiết chuyển
mát, trong ao nuôi có mật độ cao, nuôi cá lồng bè. Về độ tuổi cá thường có bệnh, hầu hết
báo cáo đề cập bệnh gây thiệt hại nặng nhất ở giai đoạn cá con.
Bệnh bộc phát mạnh khi nhiệt độ 20-280C, trên 300C tỷ lệ cá chết giảm dần.
Khi cá nhiễm bệnh, tỷ lệ chết tăng cao từ 10-90% tuỳ thuộc vào cách quản lý và cỡ
cá nuôi. Cá bị bệnh thường có dấu hiệu bơi lờ đờ, kém ăn hoặc bỏ ăn, gầy yếu, bụng
chướng to, xung quanh miệng có các đám xuất huyết, gốc vây xuất huyết, mắt lồi, đồng
thời trên gan, thận và tỳ tạng xuất hiện nhiều đốm trắng đường kính 1-3 mm bên trong
chứa dịch màu trắng đục nên người dân thường gọi là bệnh mủ gan (Bùi Quang Tề,
2006).

9


Hình 2.4: Nội tạng cá xuất hiện đốm trắng (Nguồn: Từ Thanh Dung va ctv, 2002. Vi
khuẩn đốm trắng gây bệnh trên cá tra )
2.2.5 Kết quả mô bệnh học
Vi khuẩn E. ictaluri gây ra nhiều biến đổi trên cấu trúc mô ở cá tra bị bệnh, đặc

biệt là gan, thận, tỳ tạng có hiện tượng sung huyết, xuất huyết và hoại tử trầm trọng ở hầu
hết các vùng chức năng của những cơ quan này (Từ Thanh Dung và ctv, 2002).

Hình 2.5: Gan xuất hiện nhiều vùng xung huyết (Nguồn: Từ Thanh Dung va ctv, 2002.
Vi khuẩn đốm trắng gây bệnh trên cá tra )

10


Đồng thời vi khuẩn cũng được tìm thấy trên các mẫu mô, những vi khuẩn này tạo
thành bó ở rìa các vết hoại tử

Hình 2.6: Vi khuẩn xuất hiện ở rìa các vết thương ở gan (Nguồn: Từ Thanh Dung va ctv,
2002. Vi khuẩn đốm trắng gây bệnh trên cá tra )
2.2.6 Phương pháp phòng trị bênh do E. ictaluri gây ra
Phòng bệnh:
Các biện pháp như giảm mật độ nuôi, tránh cho ăn thức ăn thừa. Vệ sinh ao nuôi,
lồng nuôi cần được thực hiện thường xuyên. Tránh đến mức tối đa tách đàn, chia đàn,
phân cỡ cá trong thời gian dịch bệnh thường xảy ra.
Trị bệnh:
Theo Bùi Quang Tề thì có thể tắm cho cá giống bằng Oxytetraxylin hay
Streptomycin trong vòng 1h với nồng độ 20-50 ppm. Còn đối với cá thịt thì trộn kháng
sinh Sulfamid cùng thức ăn tinh với liều dùng 150-200 mg/ kg cá/ ngày, cho ăn liên tục từ
5-7 ngày nhưng từ ngày thứ hai trở đi thì liều lượng giảm một nữa so với ngày ban đầu.
2.3

Cơ chế hình thành kháng huyết thanh

2.3.1 Các định nghĩa
Chất sinh miễn dịch là chất khi đưa vào cơ thể động vật ở điều kiện thích hợp có

khả năng gây đáp ứng miễn dịch.

11


Kháng nguyên là chất có khả năng ngưng kết với kháng thể. Tất cả các chất sinh
miễn dịch đều là kháng nguyên.
Kháng thể là các globulin có trong huyết thanh của động vật có khả năng liên kết
đặc hiệu với kháng nguyên đã kích thích sinh ra nó. Kháng thể theo định nghĩa trên đây
được gọi là kháng thể miễn dịch hay kháng thể đặc hiệu.
Kháng thể chủ yếu được tìm thấy trong huyết thanh của động vật, do vậy huyết
thanh chứa kháng thể kháng kháng nguyên được gọi là kháng huyết thanh.
2.3.2 Liều lượng và đường vào của kháng nguyên
Liều lượng và cách đưa kháng nguyên vào cơ thể ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh
kháng thể. Khi đưa liều quá ít sẽ không đủ khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch, còn
quá nhiều có thể dẫn đến tình trạng tê liệt đáp ứng miễn dịch. Khi đưa lượng nhỏ kháng
nguyên vào cơ thể sẽ kích thích mạnh tế bào lympho T, tạo trí nhớ miễn dịch và dẫn đến
đáp ứng miễn dịch. Nhưng nếu tiêm nhắc lại thì đáp ứng miễn dịch dịch thể sẽ tăng lên,
tạo khả năng đáp ứng miễn dịch cao và bền vững. Đó là nguyên lý tiêm vaccine.
Trong tự nhiên kháng nguyên có thể vào cơ thể bằng nhiều con đường khác nhau
như qua niêm mạc đường hô hấp, sinh dục, qua da. Người ta có thể chủ động tiêm kháng
nguyên vào trong da, dưới da, trong bắp thịt hay tĩnh mạch, giúp kháng nguyên nhanh
chóng tiếp cận với hệ thống miễn dịch.
2.3.3 Tính đặc hiệu của kháng nguyên
Sự liên kết của kháng nguyên và kháng thể hay giữa kháng nguyên và tế bào
lympho luôn mang tính đặc hiệu cao. Không phải toàn bộ kháng nguyên tham gia vào
kích thích hệ thống miễn dịch mà chỉ có một phần nhất định của kháng nguyên gọi là
quyết định kháng nguyên hay epitop mới liên kết với kháng thể hoặc tế bào lympho. Phần
tương ứng với quyết định kháng nguyên nằm trên mỗi kháng thể gọi là vị trí kết hợp
kháng nguyên hay paratop, còn phần tương ứng với tế bào lympho là thụ thể, thụ thể của

tế bào T (T – cell receptor). Mỗi epitop chỉ gắn đặc hiệu với một paratop hoặc TCR và chỉ
sinh ra một dòng kháng thể đặc hiệu.

12


2.3.4 Các loại kháng nguyên
Kháng nguyên trong tự nhiên rất đa dạng, theo quan điểm và mức độ quan tâm mà
có sự phân loại khác nhau. Một vài loại kháng nguyên điển hình:
Kháng nguyên vi khuẩn: thành phần kháng nguyên của vi khuẩn rất phức tạp, có
thể coi tế bào vi khuẩn như là một túi chứa kháng nguyên. Có hai loại: kháng nguyên hoà
tan – là các enzym ngoại bào, ngoại độc tố tiết ra bên ngoài và loại kháng nguyên không
hòa tan – là thành phần của tế bào.
Kháng nguyên virus: có hai nhóm chính đó là kháng nguyên V – là một phần hoặc
toàn bộ hạt virus nguyên vẹn có khả năng kích thích sinh kháng thể trung hoà virus và
kháng nguyên S là kháng nguyên hòa tan. Kháng nguyên S cấu trúc khuếch tán từ hạt
virus, có thể là glycoprotein vỏ ngoài hoặc acid nucleic. Kháng nguyên S không cấu trúc
tách từ tế bào chủ đã bị nhiễm virus.
Kháng nguyên protein: là kháng nguyên sinh kháng thể mạnh nhất vì có trọng
lượng phân tử lớn và có cấu trúc đa dạng do các acid amin sắp xếp thay đổi theo các tổ
hợp khác nhau. Tính đặc hiệu phụ thuộc rất nhiều vào trình tự acid amin cũng có thể tạo
nên một dòng kháng thể khác. Khi dùng enzym phá vỡ các cấu trúc lập thể (bậc 2, 3, 4)
của protein sẽ làm thay đổi tính kháng nguyên. Các polypeptic có trọng lượng phân tử
thấp, có tính kháng nguyên yếu do cấu trúc đơn điệu.
Kháng nguyên polysaccharide: đa số polysaccharide là kháng nguyên yếu vì cấu
trúc lặp đi lặp lại, thiếu sự đa dạng về mặt hóa học và khi vào cơ thể chúng bị phân giải.
Kháng nguyên polysaccharide điển hình là kháng nguyên nhóm máu A, B. Tuy nhiên
thông thường trong cơ thể polysaccharide thường tham gia vào các thành phần phức tạp
hơn như glycoprotein màng vi khuẩn, vỏ capsid của vi khuẩn, …
Kháng nguyên lipid: bản thân lipid không phải là chất sinh miễn dịch, nhưng khi

gắn với protein (lipoprotein) thì trở thành kháng nguyên.
Kháng nguyên acid nucleic: acid nucleic (ADN, ARN) là kháng nguyên yếu,
nhưng khi gắn với protein (nucleoprotein) hoạt tính sinh miễn dịch sẽ tăng lên.
2.3.5 Các tế bào tham gia vào đáp ứng miễn dịch
Tế bào B (Bone): tiền thân của tế bào Plasma ( tương bào) sản xuất kháng thể.
13


Tế bào T (Thymus): quần thể tế bào lympho biệt hóa trong tuyến ức.
Tế bào T hỗ trợ: tế bào T hỗ trợ tế bào B biệt hóa thành tế bào plasma sản xuất
kháng thể.
Interluekin (IL 1 – IL 10): do bạch cầu tiết ra có tác dụng kích thích hoạt hóa và
biệt hóa tế bào lympho.
Trí nhớ miễn dịch: sau khi tiếp xúc với kháng nguyên lần 1 một số tế bào B và T
có khả năng lưu trữ thông tin để khi gặp lại kháng nguyên có khả năng sản xuất kháng
thể.
Biệt hóa tế bào B: sự biến đổi tế bào nguồn thành tế bào B tăng trưởng trong tủy
xương, giai đọan không cần kích thích của kháng nguyên sau đó biến đổi thành tế bào
plasma (cần sự kích thích của kháng nguyên).
Epitop: phần kháng mang tên quyết định kháng nguyên được gắn bởi Paratop của
kháng thể hoặc TCR của tế bào T.
Paratop: vị trí kết hợp của kháng thể (nơi gắn với quyết định kháng nguyên).
Thụ thể đặc hiệu tế bào T (TCR) là protein màng cắm sâu vào màng sinh chất giúp
tế bào T nhận diện được kháng nguyên.
Phân tử phức hợp phù hợp tổ chức chính (MHC: Major Histocompatibility
Complex) hoạt động như điểm trung chuyển giúp tế bào T phân biệt kháng nguyên lạ hay
quen.
2.3.6 Tế bào lympho
Tế bào lympho phân tán khắp cơ thể trong tuần hoàn máu và bạch huyết. Có hai
loại tế bào lympho: lympho B (gọi tắt là tế bào B) và lympho T (gọi tắt là tế bào T). Tuy

cả hai đều có nguồn gốc chung là tế bào nguồn trong tủy xương nhưng tế bào T được biệt
hóa và trưởng thành trong tuyến ức (Thymus, nên ký hiệu là T) còn tế bào B biệt hóa và
trưởng thành trong tủy xương (Bone marrow nên ký hiệu là B).

14


Bảng 2.3: Tỷ lệ phân bố của các tế bào lympho T và B
Cơ quan

Tế bào T

Tế Bào B

Tủy xương

Một số

Nhiều

Tuyến ức

Nhiều

Rất hiếm

Ống ngực

85%

15%

Hạch lympho

80%

20%

Lách

65%

36%

2.3.7 Đại thực bào
Đại thực bào là tế bào có kích thước lớn có khả năng bắt giữ, xử lý kháng nguyên
cũng như hợp tác với các tế bào lympho để sản xuất kháng thể đặc hiệu.
Khi kháng nguyên xâm nhập vào biểu mô sẽ tiếp xúc với thực bào, chẵn hạn đại
thực bào. Tế bào này sẽ bắt giữ, nuốt các tế bào có kích thước lớn như vi khuẩn và tiết
enzym phân hủy proteinza, lipaza và lysozym để tiêu hóa chúng, làm bộc lộ quyết định
kháng nguyên nằm trong đại thực bào.
Kháng nguyên sau khi xử lý sẽ được đại thực bào dùng để bắt đầu giai đọan sớm
của quá trình tổng hợp kháng thể. Ở đây đại thực bào đóng vai trò tế bào trình diện kháng
nguyên, gọi tắt là APC (Antigen presenting cell). Có nghĩa chúng sẽ đẩy kháng nguyên lạ
ra bề mặt, tạo điều kiện cho kháng nguyên tiếp cận tế bào T.
2.3.8 Tá chất
Nguyên lý sử dụng của tá chất
Tá chất là chất phụ gia khi trộn với kháng nguyên sẽ tăng cường đáp ứng miễn
dịch với kháng nguyên đó. Khi gắn với tá chất, kháng nguyên bị phân giải chậm hơn,
phóng thích dần dần trong cơ thể tương tự như khi tiêm kháng nguyên nhỏ nhiều lần. Tá

chất tăng cường đáp ứng miễn dịch bằng cách kích thích đại thực bào làm nhiệm vụ thực
bào hoặc kích thích tế bào T và B. Tá chất là những chất trơ khó phân giải như nhũ dầu,
parafin, hydroxite nhôm…
Cơ chế tác động của tá chất dùng trong vaccine được giải thích như sau:

15