Kháng sinh polymyxin

I.Đặc điểm
1.Lịch sử :

Kháng sinh Polymyxin

Polymyxin là tên gọi của một nhóm kháng sinh có cấu trúc polypeptiid do vi
khuẩn Bacillus polymyxa và Bacillus circulans tạo ra. Năm 1947, ba nhóm các nhà khoa
học gồm nhóm Ainsworth, nhóm Benedict và nhóm Stansly đã phân lập được từ chủng vi
khuẩn Bacillus polymyxa một hỗn hợp gồm 5 polymyxin A, B, C, D và E. Các nhà nghiên
cứu này cho thấy polymyxin B, D và E lại chia ra B 1- B2, D1 – D2 và E1- E2. Danh sách
các polymyxin được tìm thấy từ các chủng vi khuẩn ngày càng nhiều như polymyxin M,
polymyxin F1, F2, F3...Do độc tính cao đối với thận nên chỉ 2 trong các chất trên là
polymyxin B và polymyxin E được dùng dưới dạng muối sulfat để điều trị các bệnh
nhiễm trùng do vi khuẩn Gram (-).
Đến năm 1950, Koyama và cộng sự đã chiết được từ môi trường nuôi cấy chủng vi
khuẩn Bacillus colistinus chất colistin ( hay colimyxin) bao gồm 3 chất colistin A, B và C
có hoạt tính kháng khuẩn mạnh gấp 4 lần polymyxin mà độc tính lại thấp hơn. Các phân
tích về cấu trúc hóa học sau này cho thấy colistin A chính là polymyxin E 1
2.Tính chất vật lý và hóa học.
-

Tính chất vật lí:

 Tan trong nước.
 Các polymycin có phân tử lượng cao (1150Dalton), các sulfat polymycin B và E là
dạng muối có được sau khi proton hóa 5 nhóm amin L-DAB.
 Có dạng bột trắng không mùi, vị đắng, háo ẩm và bền ở tình trạng khô.
 Bền trong dung dịch có pH 5,5-8.
 Có sự tương kỵ với nhiều loại kháng sinh như beta-Lactamin, kanamycin,
Chloramphenicol,….
-

Tính chất hóa học:

 Thuộc nhóm polypeptid vòng.
 Phản ứng màu biure.
 Phản ứng thủy phân.
Các polymyxin có tác dụng diệt khuẩn, thuốc gắn vào phospholipid làm thay đổi
tính thấm và thay đổi cấu trúc màng tế bào của vi khuẩn. Hoạt tính kháng khuẩn của
polymyxin B chỉ giới hạn trên một số chủng vi khuẩn Gram (-) như E. coli, Aerobacter
aerogenes, salmonella, Proteus ...Và đặc biệt trên trực khuẩn mủ xanh Ps. aeruginosa.
Trong y học polymyxin B được dùng tại chỗ, đơn độc hay phối hợp với một số hợp
chất khác như neomycin sunfat, oxytetracyclin, hydrocortison...điều trị nhiễm khuẩn
mắt, tai mũi họng và một số nhiễm khuẩn khác. Polymycin E hay colistin được dùng
1


trong y học dưới dạng muối sulfat để điều trị tại chỗ nhiễm khuẩn đường tiết niệu hay
đường tiêu hóa. Dạng muối colistin natri mesilat được dùng dạng tiêm để điều trị
nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não, nhiễm khuẩn thận ...và chỉ sử dụng khi không
dùng được những thuốc khác do độc tính cao.
3.Công thức cấu tạo.
Các polymycin đã được nghiên cứu kỹ, riêng polymycin B, đã tổng hợp được. Về
cấu tạo chúng là 1 polypeptit vòng chỉ khác nhau về thành phần và số lượng acid amin.
Phân tử polymycin M có chứa D-leucin, 3 gốc treonin và 6 gốc acid , diaminobutyric
(DAB). Ngoài ra còn chứa 1 gốc acid-6-metyloctanoic.

Tên
Polymyxin B1
Polymyxin B2
Polymyxin D1

Polymyxin D2

R
(+)-6-methyloctanoyl
6-methylheptanoyl
(+)-6-methyloctanoyl
6-methylheptanoyl

X
Phe
Phe
Leu
Leu

Y
Leu
Leu
Thr
Thr

Z
DAB
DAB
D-Ser
D-Ser

2


Tên

R
Polymycin E1 hay colistin A
(+)-6-methyloctanoyl
Polymycin E2
6-methylheptanoyl
Polymycin M
Hình: Cấu trúc hóa học của một số polymycin theo Merck index1996
DAB: L- - diaminobutyric acid R: acid béo, X, Y, Z: các acid amin
4. Cơ chế tác dụng.
(1) Làm thay đổi bên ngoài màng thấm bằng cách liên kết đến một vị trí mang điện tích
âm trong lớp lipopolysaccharide, trong đó có một điểm thu hút tĩnh điện cho các nhóm
amin mang điện tích dương trong các peptid cyclic phần ( vị trí này thường là một vị trí
liên kết với các ion canxi và magie ); kết quả là màng ngoài mất ổn định.
(2) Acid béo phần hòa tan trong vùng kị nước của màng tế bào chất và phá vỡ tính toàn
vẹn của màng, tăng tính thẩm thấu của nước và các phân tử.
(3) Rò rỉ của các phân tử tế bào, ức chế hô hấp tế bào và làm bất hoạt các nội độc tố.
Polymyxin là nhóm những chất kháng sinh có mối liên quan chặt chẽ do các chủng
Bacillus polymyxa tạo nên. Hoạt tính kháng khuẩn của polymyxin B hạn chế trên các vi
khuẩn Gram âm, gồm Enterobacter, E.coli, Klebsiella, Salmonella, Pasteurella,
Bordetella, Shigella và Pseudomonas aeruginosa.
Polymyxin B có tác dụng diệt khuẩn. Thuốc gắn vào phospholipid làm thay đổi tính thấm
và thay đổi cấu trúc màng bào tương vi khuẩn, gây rò rỉ các thành phần bên trong.
Polymyxin B được dùng tại chỗ,đơn độc hoặc phối hợp với các hợp chất khác để điều trị
nhiễm khuẩn mắt, tai và một số nhiễm khuẩn khác. Mặc dù vẫn còn có chế phẩm thuốc
tiêm, nhưng không nên dùng đường toàn thân vì thuốc rất độc với thận .
5. Hiện tượng đề kháng
Cơ chế gây kháng thuốc:
-Đề kháng polymycin có thể xuất hiện bởi cơ chế thích nghi hoặc đột biến và hầu hết có
sự đề kháng chéo polymyxin khác khau .Sự đa dạng trong biến đổi gen nhằm thay đổi lớp
màng ngoài của vi khuẩn gram âm, vốn là vị trí hoạt động của polymycin đã dẫn đến sự

kháng thuốc. Mặc dù dữ liệu về cơ chế gây kháng thuốc này còn rất ít và dường như còn
tùy thuộc từng vi khuẩn nhưng hệ thống điều hòa gen PmrA-PmrB và PhoP-PhoQ cho
thấy đóng vai trò quan trọng trong sự gia tăng kháng thuốc này. Những hệ thống điều hòa
gồm hai thành phần như PmrA-PmrB và PhoP-PhoQ, cho phép vi khuẩn đáp ứng với
những thay đổi của môi trường bằng cách biến đổi một số gen biểu hiện. Khi những hệ
3


thống điều hòa này tương tác lẫn nhau, chúng được cho là gây ra những thay đổi đa dạng
hơn.
- Một cơ chế kháng thuốc khác được cho thấy là liên quan với thay đổi cấu trúc của lớp
lipid A và lipopolysaccharides tích điện âm trên bề mặt của vi khuẩn. Sự thay đổi này là
kết quả của sự hoạt hóa hệ thống PmrA-PmrB. Hệ thống này được điều hòa bởi hệ thống
PhoP-PhoQ, nhưng cũng có thể hoạt động độc lập trong môi trường axit nhẹ hoặc nồng
độ sắt cao.Hệ thống PmrA-PmrB điều hòa chịu trách nhiệm trong việc thay đổi lipid A và
đóng vai trò quan trọng trong cơ chế kháng polymyxin. Khi được hoạt hóa, hệ thống
PmrA-PmrB sẽ gắn thêm ethanolamine vào nhóm phosphate của lipopolysaccharides và
lipid A, đồng thời cũng chèn thêm aminoarabinose tại vị trí 4' phosphate của lipid A. Sự
thay đổi này sẽ làm giảm tổng điện tích của lipopolysaccharide và vì vậy sẽ làm giảm ái
lực gắn kết với những polymyxin mang điện tích dương.
- Nồng độ magie và pH của môi trường là hai nhân tố chính cho thấy tác động lên sự biểu
hiện gen và sự xuất hiện kháng thuốc của vi khuẩn. Một nghiên cứu về sự phát triển của
Salmonella enterica trong điều kiện 10 mM magnesium chloride ở pH 5.8 đã cho thấy
kháng polymyxin B tăng lên xấp xỉ 100,000 lần so với những chủng được phát triển ở pH
7.7. Sự gia tăng này được cho là do sự tăng hoạt động của hệ thống PmrA-PmrB ở môi
trường pH acid nhẹ và nồng độ magnesium vi phân tử. Điều này có thể được dùng để theo
dõi hoặc chỉnh sửa nồng độ pH và magnesium giúp ngăn chặn sự kháng thuốc do những
yếu tố này gây ra. Tuy nhiên, chúng ta cần thêm nhiều thông tin hơn nữa trước khi có thể
xác định chắc chắn. Những nghiên cứu kiểm tra mối liên quan giữa nồng độ pH cũng như
magnesium trong môi trường với tỉ lệ kháng thuốc còn giới hạn, do đó vẫn chưa xác định

được những bước đi cụ thể mà nhà lâm sàng cần tiến hành. Tuy nhiên, rõ ràng cần tác
động pH và magnesium để hệ thống PmrA-PmrB hoạt động. Giả thiết về đột biến PmrA
cho thấy sự thất bại trong việc lý giải sự đề kháng polymyxin.
- Nồng độ magie thấp cũng gây gia tăng kháng thuốc do sự hoạt hóa PhoP và PmrA. Sự
hoạt hóa này không chỉ làm thay đổi lipopolysaccharides của vi khuẩn mà còn làm gia
tăng biểu hiện của gen OprH, đóng vai trò là yếu tố chính trong việc phát triển tình trạng
kháng thuốc. Gen OprH, PhoP và PhoQ tạo thành một “operon” kiểm soát cả PhoP và
nồng độ magnesium cũng như góp phần vào sự đề kháng polymyxin.Gen OprH nằm ngay
dưới hệ thống điều hòa PhoP-PhoQ, mã hóa cho một protein màng ngoài được gọi là
OprH, đây là protein gia tăng biểu hiện trong điều kiện nồng độ magnesium thấp. Những
protein này chiếm giữ những vị trí magnesium trên màng tế bào và làm giảm những vị trí
gắn kết của polymycin gây nên tình trạng kháng thuốc
II. Phân lập:
1. Nguồn phân lập vi khuẩn: Các chủng polymyxin A, B, C, D và E được phân lập từ
chủng vi khuẩn Bacillus poymyxa. Bacillus poymyxa có ở mọi nơi trong tự nhiên,
đặc biệt là những vùng đất liên kết với rễ cây. Khi điều kiện sống gay go, chúng có
khả năng tạo bào tử.
2. Môi trường: Để sinh tổng hợp polymyxin người ta nuôi cấy B.
polymyxa trên môi trường thạch có thành phần (%):
4


Cao Ngô
Cao Nấm Men
Glucose
Agar
pH

0.5
0.5

2.0
2.0
6.8- 7.2

Điều kiện:
-

Khử trùng 110ºC/20 phút. Nuôi ở 28ºC trong thời gian 24
giờ.

-

-

Môi trường nhân giống gồm (%):

Cao Ngô

1.0

Bột Đậu Tương

1.0

Glucose

2.0

Sulfat amoni

0.3

pH

6.8-7.2

Điều kiện : Khử trùng 115oC/20 phút ,cấy giống và nuôi 18-20 giờ/28oC.

3. Phương pháp phân lập
-

Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn:
Dùng muỗng gạt nhẹ, bỏ phần lớp đất mặt khoảng 2 - 3cm, lấy lớp đất ở
dưới. Cân 10 g mẫu đất cho vào bình tam giác có chứa 90 ml nước muối
sinh lí vô trùng và lắc đều, được nồng độ pha loãng 10-1

-

Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus poymyxa.
 Bước 1: Chuẩn bị 4 ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lí vô
trùng, đánh số thứ tự từ 1 đến 4.


Bước 2: Dùng micropipete hút 1 ml từ bình tam giác chứa mẫu đất
phân lập có nồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm 1 và lắc đều
bằng máy vortex, được nồng độ pha loãng 10 -2, tiếp tục làm cho đến
ống nghiệm cuối cùng.

 Bước 3: Chọn các ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10 -3 ,10-4, 10-5
dùng micropipete hút 0,1 ml từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa

môi trường nuôi cấy trên (mỗi nồng độ lặp lại 2 lần) và trang đều
bằng que trang vô trùng,
 Bước 4: Cho những đĩa thạch này vào tủ ấm ủ ở 37 o C/24h. Sau đó
quan sát khuẩn lạc hình thành trên đĩa, chọn những khuẩn lạc là của
vi khuẩn Bacillus poymyxa, dùng que cấy vòng bắt và cấy giữ giống
5


lại trên môi trường thạch nghiêng .
III. Lên men và sản suất.
1. Lên men: Môi trường lên men tạo kháng sinh có thành phần.
Cao Ngô
1.0
Bột Đậu Tương
2.0
Glucose
3.0
Muối
MgSO4.7H2O, KH2PO4, NaCl.
-

Điều kiện: khử trùng môi trường và cấy giống vào với lượng 2-2.5%. Tiến hành
trong điều kiện nhiệt độ 28-30 0C. Thông khí với lưu lượng 1VVM. Thời gian lên
men.
2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men:
-Trong quá trình lên men các yếu tố ảnh hưởng : nhiệt độ lên men tối ưu , pH, nồng
độ oxy, thế oxy hóa khử , cường độ sục khí , cường độ khuấy trộn dịch lên men.
-Đối với sản xuất các loại kháng sinh khác nhau , đối với nuôi cấy các vi sinh vật
sinh kháng sinh khác nhau sẽ tương ứng có các điều kiện nuôi cấy khác nhau .
3. Phương pháp thu nhận và tinh sạch.

Acid hóa đến Ph = 3,5-4,0

Giải phóng kháng sinh
Lọc loại sinh khối

Trung hòa bằng NaOH
Tách bằng dung môi hữu cơ n-butanol

Kết tủa bằng action
Lọc qua bông thủy tinh

Bơm qua cột trao đổi ion Na+

Rửa bằng nước cất
6


Hấp phụ kháng sinh bằng HCl hoặc Sunfuric 10%

Tẩy màu bằng than hoạt tính

Loại bỏ Cation kim loại (Sulfocationit)

THÔNG TIN TRAO ĐỔI

Bốc hơi chân không (, P=10-15 mmHg)

*Vai trò của phản ứng Biure
-

Để xác định Bacillus polymyxa có khả năng sinh kháng sinh Polymycin.
Nhận diện kháng Sấy
sinhphun
Polymycin
có bản chất là acid amin.
thu kháng sinh

IV. Tài liệu tham khảo :
1. Từ Minh Koong, Đoàn Thanh Xuân -Kỹ thuật sản xuất dược phẩm,Nhà xuất bản Y
Học Hà Nội -2007 . trang 63-71.
2. Kiều Hữu Anh - Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp , NXB Khoa Học và Kỹ
thuật ,1999 .
3. Nguyễn Văn Cách – Công nghệ lên men các chất kháng sinh, NXB Khoa học và
kỹ thuật , 2004 .
4. Bộ môn Công nghiệp Dược- Kỹ thuật sản xuất dược phẩm , tập 1, Trường Đại Học
Dược Hà Nội,2001.

7