Nghiên cứu hiện tượng biến dị trong nuôi cấy in vitro cây chuối phục vụ công tác giống trên địa bàn tỉnh nghệ an

1. Mở đầu

1.1. Tính cấp thiết của đề tài

Cây chuối (Musa sp) là một trong 3 đối tợng cây ăn quả chính (chuối,
dứa và cây có múi) đợc sản xuất với quy mô rất lớn trên toàn thế giới. Theo
thống kê của FAO (2003)[35], sản lợng chuối trên thế giới năm 2002 khoảng
80 triệu tấn và tăng liên tục từ 1980 tới nay với tốc độ 2,5%/năm, đạt tỷ lệ xuất
khẩu cao nhất trong các loại quả (9 triệu tấn/năm).
Chuối là loại quả có giá trị dinh dỡng cao và còn là lơng thực, thực
phẩm rất quan trọng tại một số nớc ở châu á và châu Phi. Theo Anon (1963),
thành phần dinh dỡng của quả chuối nh sau: nớc (75,7%); gluxit (22,2%);
protein (1,1%); lipid (0,2%); tro (3,3%) vµ mét số vitamin rất cần thiết cho cơ
thể nh: A, B, C, thiamin, riboflavin, niaxin,... (DÉn theo Ngun Kh¾c Anh,
1999) [1].
VỊ hiệu quả kinh tế, cây chuối có chu kỳ sinh trởng ngắn, mức đầu t
không lớn, kỹ thuật trồng không phức tạp nên việc trồng chuối thu đợc hiệu
quả kinh tế tơng đối cao. Theo tính toán, 1 ha trồng chuối thu đợc giá trị sản
phẩm bằng 3,8 ha trồng lúa hoặc 2,0 ha trồng lạc (Dẫn theo Trần Thế Tơc, 1998)
[17].
ë n−íc ta nãi chung vµ tØnh NghƯ An nói riêng, cây chuối từ lâu đà gắn
liền với cuộc sống gia đình của hàng triệu ngời dân và đà góp phần đem lại
hiệu quả kinh tế trong cơ cấu thu nhập từ các sản phẩm nông nghiệp. Theo định
hớng ph¸t triĨn kinh tÕ - x· héi cđa tØnh giai đoạn từ nay tới 2010, cây chuối
chiếm một vị trí quan trọng trong chuyển đổi cơ cấu cây trồng, dự kiến phát
triển sản xuất thành vùng nguyên liệu tập trung phục vụ chế biến xuất khẩu tại
một số địa bàn của tỉnh nh Đô Lơng, Thanh Chơng, Nam Đàn,... Trớc m¾t,


Nghệ An đang xây dựng vùng trồng chuối tập trung làm tiền đề cho việc phát
triển vùng nguyên liệu chế biến với nguồn cây giống đợc sản xuất bằng phơng

pháp nuôi cấy mô, Trung tâm khoa học & công nghệ Nghệ An là đơn vị cung
cấp giống. Bởi vậy, trong vài năm gần đây, địa bàn và diện tích trồng chuối cấy
mô ngày càng mở rộng (từ 2 ha năm 2000 tăng lên 10-15 ha năm 2003 và năm
2004 dự kiến đạt 45-50 ha). Tuy nhiên, theo một số kết quả nghiên cứu và đặc
biệt qua thực tế sản xuất đà cho thấy có sự xuất hiện các biến dị ở các giống
chuối cấy mô. Đây là một vấn đề mới cần đợc nghiên cứu, đánh giá chính xác
và đề ra giải pháp khắc phục các biến dị có hại và khai thác biến dị có lợi phục
vụ phát triển sản xuất. Tuy nhiên, vấn đề này còn cha đợc quan tâm nghiên
cứu ở Việt Nam nói chung và tỉnh Nghệ An nói riêng. Vì lẽ đó, chúng tôi tiến
hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu hiện tợng biến dị trong nuôi cấy in vitro
cây chuối phục vụ công tác giống trên địa bàn tỉnh Nghệ An.
1.2. Mục đích của đề tài

Nghiên cứu hiện tợng biến dị trong nuôi cấy mô cây chuối, phát hiện
đợc một số nguyên nhân liên quan, trên cơ sở đó đa ra các giải pháp khắc
phục nhằm hoàn thiện quy trình nhân giống chuối bằng nuôi cấy mô cũng nh
khai thác những biến dị có lợi phục vụ công tác chọn tạo giống.
1.3. ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ đóng góp những dẫn liệu về hiện tợng
biến dị trong nhân nhanh in vitro cây chuối, góp thêm cơ sở lý luận về hiện
tợng biến dị soma xuất hiện trong nhân giống vô tính cây trồng.
- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần hoàn thiện quy trình nhân
giống chuối in vitro và các giải pháp khắc phục hiện tợng biến dị soma. Bên
cạnh đó, cũng có thể phát hiện những biến dị có lợi và khả năng khai thác phục
vụ công tác chọn giống chuối, trớc mắt cho tỉnh Nghệ An.


1.4. phạm vi nghiên cứu của đề tài

* Về chuyên môn:
Đề tài chỉ dùng lại ở các chỉ tiêu nghiên cứu về hình thái, sinh trởng,
phát triển, năng suất và bớc đầu đánh giá sự sai khác ở mức độ phân tử thông
qua ứng dụng kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA).
* Về địa điểm:
+ Trung tâm khoa học công nghệ Nghệ An: Nghiên cứu quy trình nhân
nhanh cây chuối bằng phơng pháp nuôi cấy mô và ảnh hởng của điều kiện
nuôi cấy tới hình thành các biến dị soma.
+ Các huyện Đô Lơng, Thanh Chơng, Nam Đàn: Tiến hành thu thập
các mẫu giống chuối đa vào nuôi cấy và là địa bàn triển khai trồng chuối nuôi
cấy mô.


2. Tổng quan tài liệu

2.1. giới thiệu chung về cây chuối

2.1.1. Nguồn gốc, phân loại và phân bố của một số nhóm giống chính
a. Nguồn gốc
Theo phân loại của Võ Văn Chi (1978)[5], các loài chuối thuộc ngành
ngọc lan (Mangolophyta), lớp hành (Liliopsida), phân lớp hành (Lilidae), bộ
gừng (Zingiberales), họ chi (Musaceae). Hä chi gåm 2 chi víi 70 loµi,
trong đó: chi Ensete gồm 10 loài, phân bố chủ yếu vùng châu Phi; chi Musa
gồm 60 loài phân bố ở các vùng nhiệt đới.
Cây chuối có nguồn gốc từ Đông Nam á, sau đó đợc di thực sang châu
úc rồi tới các nớc Trung và Nam Mỹ. Một số tác giả còn cho rằng từ Đông
Nam á, cây chuối đợc chuyển qua Madagasca vào lục địa châu Phi, sau đó, tới
các đảo Canari và Santodomigo (Champion J., 1976)[4].
b. Phân loại và phân bố
Theo Simmond N.W. (1962)[70], số lợng giống chuối hiện trồng trên thế

giới là 100 - 300 và tất cả các giống chuối ăn đợc đều thuộc nhóm Eumusa,
đợc hình thành do sự kết hợp di truyền giữa 2 loài chuối dại là M.acuminata
(A) và M.balbisiana (B), trong đó: những kiểu gen đều có gen A và gen B. Bên
cạnh một số ít ngoại lệ, đại bộ phận các gièng chi hiƯn nay lµ tam béi thĨ
(AAA, AAB, ABB), nhị bội thể (AA, AB, BB), còn tứ bội thể thì rất hiếm (chỉ
một giống ở Thái Lan).
Hệ thống phân loại của Simmond N.W. dựa trên cơ sở số lợng nhiễm sắc
thể và cho điểm các đặc điểm hình thái của 2 loài M.acuminata (A) và
M.balbisiana theo 15 đặc điểm thực vật học. Theo hệ thống phân loại này, các


nhãm gièng chi hiƯn nay cã c¸c kiĨu gen nh− sau (DÉn theo Ngun ThÞ ViƯt
Nga, 1996)[7]:
Nhãm 1: KiĨu gen AA
Trong nhóm này có các giống chuối Ngự, chuối Cau, chuối Piasang Mass
(Malaysia), Ladies Finger (Hawaii),... với những đặc điểm chính: quả nhỏ, vỏ
mỏng, chất lợng cao, năng suất thấp, chống chịu bệnh vàng lá Panama nhng
mẫn cảm với bệnh đốm lá Sigatoka.
Nhóm 2: Kiểu gen AAA
Trong nhóm này bao gồm các giống chuối Tiêu, chuối Già, Piasang
Embun (Malaysia), Chinese (Hawaii), Grom Isen, Robusta (Trung Mỹ), với
những đặc điểm chính: năng suất, chất lợng tốt, đợc trồng rất phổ biến, thị
trờng tiêu thụ lớn, thích hợp trồng những nơi có vĩ độ cao, mùa đông lạnh và
đòi hỏi nhiều dinh dỡng trong đất, có khả năng chống chịu bệnh héo vàng
Parama nhng mẫn cảm với bệnh đốm lá Sigatoka.
Nhóm 3: Kiểu gen ABB
Nhóm này bao gồm rất nhiều chủng loại, đa số là những giống chuối a
nhiệt độ cao nh chuối Tây, chuối Sứ, chuối Sừng, chuối Bom, chuối trà bột,...
Những giống này có đặc điểm chứa nhiều tinh bột, đợc trồng để ăn tơi và đôi
khi nấu chín, chiên, đặc biệt, tại một số nớc châu Phi, các giống này chỉ dùng

để lấy bột. Nhóm này có đặc điểm cây cao, sinh trởng khoẻ, không kén đất, có
thể trồng không tới, không bón phân trên những đồi dốc mới khai phá, đặc biệt
là chuối Bom. Ngoài ra, thân non, hoa chuối ít vị chát, có thể dùng làm rau sống
(chuối Tây).
Nhóm 4: Kiểu gen BB
Nhóm này bao gồm những giống chuối hột, với những đặc điểm cây
sinh trởng khoẻ, chịu bóng, chịu hạn khá, chống chịu sâu bệnh rất tèt, qu¶


chuối có chứa nhiều hạt nhng lại có hàm lợng tinh bột cao nên có thể thu
hoạch xanh để lấy bột. Ngoài ra, thân và hoa chuối có thể sử dụng làm rau sống
chất lợng cao.
Theo hệ thống phân loại cđa Simmond N.W., chi Eumusa gåm 9 - 10 loµi,
sè lợng nhiễm sắc thể cơ sở là 11, số lợng giống lên tới 131 và phân bố nh
sau (Simmond N.W.,1962)[70]:
Scitamineae
Marantaceae

Musaceae

Ensete
Ingentimusa

Zingiberaceae
Musa

Australimusa

Calimusa

Eumusa

Rhodochlamys

Bảng 2.1. Phân loại và sự phân bố của các chi thuộc Musa
(theo Simmond N.W.,1962)[70]

Chi

Số NST cơ sở

Số loài

Phân bố

Australimusa

10

5-6

Queensland đến Philipine

Callimusa

10

5-6

Đông Dơng và Indonesia

Eumusa

11

9-10

Nam ấn Độ đến Nhật Bản

Rhodochlamys

11

5-6

ấn Độ đến Đông Nam á

Ingentimusa

14

1

New Guinea

Theo Trần Thế Tục (1995)[17], các giống chuối chính ở miền Bắc nớc ta
có thể phân thành 4 nhóm nh sau:
Nhóm chuối Tiêu: Nhóm này có 3 giống là Tiêu lùn, Tiêu nhỡ và Tiêu cao, có
đặc điểm về chiều cao cây từ thấp tới trung bình (2,0-3,5m), năng suất quả từ

trung bình đến rất cao; phẩm chất thơm ngon, thích hợp cho xuất khẩu quả tơi,
sinh trởng và phát triển tốt trong điều kiện các vùng có khí hậu mùa đông lạnh.
Nhóm chuối Tây: Bao gồm các giống chuối Tây, Tây hồng, Tây phấn, Sứ,
đợc trồng phổ biến ở nhiều nơi. Những giống này có đặc điểm cao cây, quả to
mập, ngọt đậm và kém thơm hơn so với các nhóm giống khác, sinh trởng khoẻ,
không kén đất, có khả năng chịu nắng hạn, chịu rét song dễ bị héo rụi (vàng lá
Parama).
Nhóm chuối Ngốp: Bao gồm các giống Ngốp cao, Ngốp thấp,..., có chiều cao
cây trung bình 3-5 m, quả tơng đối lớn, vỏ dày, vỏ nâu đen khi chín, thịt quả
nhÃo, hơi chua. Cây sinh trởng khoẻ, chịu bóng, ít sâu bệnh, chịu hạn khá, hình
thành buồng ở vị trí thấp nên rất thích hợp trồng ở vùng ®åi.
Nhãm chuèi Ngù: Bao gåm c¸c gièng chuèi Ngù, Ngù tiến, Ngự mắn, ..., có đặc
điểm quả nhỏ, màu vỏ sáng đẹp, thịt quả chắc, vị thơm đặc biệt, cho năng suất
thấp, chiều cao cây trung bình 2,5- 3,0 m, thân mảnh.
Bên cạnh các nhóm giống chính nêu trên, ở nớc ta còn có một số giống
khác nh: Pome, Mỏ giang, Mắn bột, Lá, Hột,... với số lợng trên 30 giống trên
phạm vi cả nớc với những đặc điểm khác nhau về hình thái, năng suất và phẩm
chất quả.
2.1.2. Giá trị dinh dỡng và thơng phẩm của chuối
a. Giá trị dinh dỡng
Chuối là một trong 5 loại quả trao đổi chủ yếu trên thị trờng thế giới, bên
cạnh giá trị là loại quả cho khối lợng sản phẩm lớn, chuối còn có hàm lợng
dinh dỡng khá cao, tại một số nớc châu á, châu Phi, chuối là lơng thực, thực
phẩm chủ yếu, đợc sử dụng nh khoai tây ở các nớc có khí hậu ôn đới.
Theo Anon (1963), thành phần dinh dỡng trong quả tính theo khối lợng
tơi và khô đối với chuối ăn và chuối nấu nh sau (Dẫn theo Đặng Thị Mai,
2001)[6]:

Bảng 2.2. Thành phần dinh dỡng quả trong chuối ăn và chuối nấu
Thành phần

Chuối ăn tơi (%)

Chuối nấu (%)

Theo khối

Theo khối

Theo khối

Theo khối

lợng tơi

lợng khô

lợng tơi

lợng khô

Nớc

75,7

66,4

Gluxit

22,2

91,4

31,2

92,8

Protêin

1,1

4,5

1,1

3,3

Lipít

0,2

0,8

0,4

1,2

Tro

0,8

3,3

0,9

2,7

Theo một số tác giả, thành phần quả chuối có một lợng vitamin khá lớn,
đặc biệt là các vitamin nhóm A và C với hàm lợng thay đổi tùy theo giống: các
giống chuối ăn tơi thờng giàu vitamin C và B6, còn các giống chuối trong
nhóm chuối nấu lại giàu vitamin A. Nhìn chung, hàm lợng vitamin trong chuối
rất phong phú và cao hơn một số đối tợng quả khác nh cam, táo, (bảng 2.3):
Bảng 2.3. Hàm lợng vitamin trong một số loại quả
(Theo Anon, 1963)
ĐVT: mg/100 gr quả
Loại quả

CarotinA

Thiamin

Riboflavin

Axit ascobic

(tiền vitC)

(vit B1)

(vit B2)

(vit C)

Chuối

0,24

0,05

0,06

10

Táo

0,045

0,025

0,073

5-8

Cam

0,037-0,172

0,078

0,032-0,045

52-53

Tác giả Champion J. cho rằng quả chuối có giá trị dinh dỡng cao, thể
hiện khi ăn 100 gr thịt quả cho mức năng lợng 110 - 120 calo, trong khi ®ã,


100gr táo cho mức năng lợng 64 calo, 100 gr cam cho 52 calo, 100 gr đào cho
45 calo,. Mặt khác, các thành phần dinh dỡng trong quả chuối đợc cơ thể
hấp thụ rất nhanh, vì vậy, chuối đợc coi là loại quả lý tởng cho ngời già, sức
khoẻ yếu, suy dinh dỡng, mệt mỏi,... Ngoài ra, quả chuối cũng có vị trí đặc biệt
trong khẩu phần ăn giảm mỡ, cholesteron và muối natri,(Champion
J.,1976)[4].
Thời gian gần đây, một số phát hiện đà cho biết chuối là sản phẩm có hiệu
quả trong việc chữa các bệnh về phủ tạng nh đờng ruột, ngoài ra, quả chuối
rất có lợi cho những ngời nhiễm độc than chì, có tác dụng chống các vết loét
gây ra bởi ngời bệnh dùng thuốc aspirin và có tác dụng làm lành các vết loét
này, đồng thời, trong thành phần chuối còn có đầy đủ các axit amin (Dẫn theo
Đặng Thị Mai)[6].
b. Giá trị thơng phẩm
Vì lý do là loại quả có giá trị dinh dỡng cao và giá thành rẻ nên chuối
đợc tiêu thụ với số lợng lớn trên thế giới. Bên cạnh tiêu thụ quả tơi, sản phẩm
chuối có thể là nguyên liệu sản xuất ra bột chuối và chuối sấy khô. Bột chuối là
loại dinh dỡng quý cho trẻ em và ngời già yếu, ngời có bệnh tiêu hoá và đây
là sản phẩm có giá trÞ kinh tÕ rÊt cao, cơ thĨ nh− sau (DÉn theo Đặng Thị Mai,
2001)[6]:
Khô đậu tơng (45% protêin)

: 300 USD/tấn

Bột sắn khô

: 100 USD/tấn

Bột chuối (cho ngời)

: 1000 USD/tấn

Bột chuối (cho gia súc)

: 110 USD/tấn

Protein đậu tơng

: 664 USD/tấn

Theo một số tác giả, chuối sấy là một sản phẩm cho năng lợng cao, khối
lợng nhẹ, dễ dàng vận chuyển và bảo quản. Ngoài ra, chuối sấy còn đợc sử
dụng làm nguyên liệu cho sản xuất bánh kẹo, tinh dầu. Một sè s¶n phÈm phơ


cđa chi nh− nhùa mđ,... cã tÇm quan träng trong sản xuất tanin, bẹ chuối là
nguyên liệu để sản xuất dây chÃo, lá chuối đợc sử dụng làm gói bọc, Ngoài
ra, chuối còn làm nguyên liệu cho công nghiệp sản xuất cồn, bia, rợu,... Thời
gian trớc, vỏ chuối trong ngành chế biến thực phẩm thờng bị loại bỏ dới
dạng phế thải, điều này gây tác hại lớn đến môi trờng xung quanh, không đem
lại hiệu quả kinh tế, nhng gần đây, ngời ta đà tạo ra đợc ethanol từ vỏ chuối
(Cohen J.I., 1990)[28].

So với nhiều loại cây trồng khác, toàn bộ sản phẩm của cây chuối có thể
làm lơng thực, thực phẩm, thức ăn gia súc, thuốc nhuộm, công nghiệp chế biến
thực phẩm, làm rợu, mứt và vì một lý do nào đó trong sản xuất kinh doanh, việc
xuất quả tơi gặp trở ngại thì cũng dễ dàng sử dụng sản phẩm chuối vào những
mục đích khác với trang thiết bị yêu cầu không cao nh chuối sấy khô, làm bột,
ủ chua,
Theo FAO (2003)[35], thị trờng tiêu thụ chuối trên thế giới ngày càng
đợc mở rộng, sản lợng chuối sản xuất, xuất khẩu chỉ đạt 7,2 7,3 triệu tấn,
trong đó, nhu cầu nhập đạt ở mức 7,6 triệu tấn, tập trung chủ yếu ở các nớc nh
Mỹ, Canada, châu Âu, ở trong nớc, lợng chuối tiêu thụ trên đầu ngời
trong 1 năm còn rất thấp, chỉ đạt 1,5 kg quả/ngời/năm (Hà Nội). Đây là con số
rất khiêm tốn so với một số nớc khác nh Đức (10,5kg/ngời/năm), Pháp (8,8
kg/ngời/năm), Mỹ (8,7 kg/ngời/năm), Anh (6,4 kg/ngời/năm), Nhật Bản (6,0
kg/ngời/năm),
2.2. kỹ thuật nuôI cấy mô tế bào và việc ứng dụng trong chọn
giống và nhân giống

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào đợc biết đến và nghiên cứu từ những năm
đầu của thế kỷ 20 dựa trên học thuyết tế bào của hai nhà sinh vật học ngời Đức
là Schleiden và Schwaun vào năm 1838: "Một cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm
nhiều các đơn vị tế bào hợp thành. Các tế bào dù phân hoá đều mang thông tin


di truyền có trong tế bào đầu tiên, đó là tế bào trứng sau khi thụ tinh là những
đơn vị độc lập mà từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể"(Dẫn theo Lê Trần
Bình, 1981)[2].
Theo Murashige T.(1974)[55], có hơn 300 loại cây trồng có thể nuôi cấy
và nhân giống trong điều kiện in vitro và có thể sử dụng kỹ thuật này với các
mục đích chọn giống và nhân giống khác nhau.
2.2.1. Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy in vitro

a. Tính toàn năng của tế bào (Totipotence)
Theo Haberlandt, kỹ thuật nuôi cấy mô dựa trên tính toàn năng của tế bào,
đó là: Mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng mang toàn bộ lợng thông
tin di truyền cần thiết và đủ của cả sinh vật đó, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi
tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh, đây chính là cơ sở lý
luận của phơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Cho đến nay, con ngời đÃ
hoàn toàn chứng minh đợc khả năng tái sinh của mọi cơ thể hoàn chỉnh từ một
tế bào riêng rẽ. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
thực chất là kết quả của sự phân hoá và phản hoá tế bào (Murashige T.,
1977)[56]; (Dẫn theo Lê Trần Bình, 1997)[3].
b. Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào
Mỗi cơ thể thực vật là một chỉnh thể thống nhất, bao gồm nhiều cơ quan
khác nhau với những chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác
nhau thực hiện những chức năng cụ thể, tuy nhiên, tất cả các loại tế bào đó đều
bắt nguồn từ tế bào phôi phân sinh. Sự phân hoá tế bào là sự chuyển hoá các tế
bào phôi phân sinh thành các tế bào của các mô chuyển hoá, đảm nhận các chức
năng khác nhau nhng những tế bào đà phân hoá không hoàn toàn mất khả năng
phân chia của mình. Trong trờng hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại
có thể trở về dạng tế bào phôi sinh, có khả năng phân chia mạnh mẽ và quá trình


này gọi là sự phản phân hóa tế bào, ngợc lại với phân hoá tế bào (Murashige T.,
1974)[55].
2.2.2. Các phơng thức nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào
a. Nuôi cấy đỉnh sinh trởng
Trong kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trởng, mẫu nuôi cấy đợc tách từ đỉnh
sinh trởng có kích thớc rất nhỏ (khoảng 0,1 mm). Những kết quả nghiên cứu
cho biết: phơng pháp nuôi cấy đỉnh sinh trởng có tác dụng rất tốt khi muốn
làm sạch virus cho cây trồng và ở điều kiện thích hợp, đỉnh sinh trởng sẽ phát
triển thành 1 hay nhiều chồi, các chồi này sẽ phát triển thành cây hoàn chỉnh (có

rễ, thân, lá đầy đủ). Có 2 phơng pháp tạo cây hoàn chỉnh từ việc nuôi cấy đỉnh
sinh trởng nh sau (Krul W.R., 1980)[47]:
- Từ đỉnh sinh trởng phát triển trực tiếp thành cây: chủ yếu trên các đối
tợng cây hai lá mầm nh khoai tây, thuốc lá, cam, chanh,... và một số loại cây
một lá mầm nh mía, dứa sợi,...
- Từ đỉnh sinh trởng phát triển qua giai đoạn dẻ hành (protocom):
phơng thức này chủ yếu gặp ở các loại đơn tử diệp (cây một lá mầm) nh
phong lan, hoa huệ,... từ 1 đỉnh sinh trởng tạo thành hàng loạt protocorm và các
protocorm này lại tiếp tục phân chia thành các protocorm khác hoặc phát triển
thành cây hoàn chỉnh. Bằng phơng thức này, trong một thời gian ngắn, ngời ta
có thể thu đợc hàng triệu cá thể và đây là phơng pháp nhân giống áp dụng cho
nhiều loại cây trồng.
b. Tái sinh cây hoàn chỉnh từ một số bộ phận của cây
Bên cạnh phơng pháp nuôi cấy đỉnh sinh tr−ëng, cã thĨ sư dơng mét sè
bé phËn cđa c©y để phục vụ công tác nhân giống nh đoạn thân, mảnh lá, cuống
hoa, đoạn rễ,... Những đối tợng cây trồng hay đợc sử dụng phơng pháp này
là thuốc lá, cà chua, mía, bắp cải,(Barz W., 1977)[23].


c. Tái sinh cây qua giai đoạn mô sẹo
Trong nhân giống vô tính bằng phơng pháp nuôi cấy in vitro, nhiều loại
cây trồng đà đợc tái sinh trực tiếp từ mô nuôi cấy không qua giai đoạn tạo mô
sẹo. Với cách làm này, có thể nhân giống một số lợng lớn cây giống đồng nhất
về mặt di truyền, tuy nhiên, trong một số trờng hợp, nhiều đối tợng nuôi cấy
không tái sinh trực tiếp thành cây mà hình thành mô sẹo (callus), những khối mô
này phải qua cấy chuyển mới tạo thành cây. Quá trình tạo mô sẹo dễ gây cho
khối mô không ổn định về mặt di truyền và để khắc phục, ngời ta chỉ sử dụng
các mô sẹo vừa mới tạo thành để tái sinh cây (Banks M.S., 1979)[22].
2.2.3. Các bớc trong quá trình nhân giống in vitro
Theo một số tác giả, kỹ thuật nhân giống in vitro bao gồm một số bớc cơ

bản nh sau (Dẫn theo Anderson W.C., 1980[19]; Nguyễn Đức Thành, 2000
[8]):
a. Giai đoạn khởi động
Là giai đoạn khử trùng đa mẫu vào nuôi cấy in vitro, trong giai đoạn
này, cần đảm bảo các yêu cÇu: tû lƯ nhiƠm thÊp, tû lƯ sèng cao, khèi mô tồn tại
và sinh trởng tốt. Khi lấy mẫu, yêu cầu cần thiết là cần chọn đúng loại mô,
đúng giai đoạn phát triển của cây, những vật liệu thờng đợc chọn là mô phân
sinh đỉnh, chồi nách, các bộ phận gần hoa và cuối cùng là những đoạn thân,
mảnh lá, đoạn rễ,
b. Giai đoạn nhân nhanh
Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thành chồi và vấn đề
quan trọng là phải xác định đợc môi trờng và điều kiện nuôi cấy thích hợp để
có hiệu quả cao nhất theo nguyên tắc chung là hệ số tạo chồi phụ thuộc tỷ lệ
hàm lợng các chất kích thích sinh trởng (auxin và xytokinin) trong môi trờng
nuôi cấy.


c. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
Là giai đoạn tạo kích thích cho chồi nuôi cấy hình thành rễ, tạo những cá
thể hoàn chỉnh chuẩn bị đa ra vờn ơm. Đây là giai đoạn rất quan trọng có ý
nghĩa quyết định tới kết quả nhân giống, một số kết quả nghiên cứu cho thấy
quá trình ra rễ phụ thuộc vào tỷ lệ hàm lợng auxin và xytokinin trong môi
trờng nuôi cấy.
d. Giai đoạn vờn ơm
Là giai đoạn đa cây từ điều kiện nuôi cấy nhân tạo ra điều kiện tự nhiên,
vì vậy, kết quả quá trình này phụ thuộc vào nhiều yếu tố: nhiệt độ, độ ẩm, dinh
dỡng, giá thể cho cây con.
2.2.4. Một số kết quả ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào phục vụ công tác
nhân giống cây trồng
a. Một số kết quả nghiên cứu ngoài nớc

Nhân giống vô tính cây trồng là hình thức nhân giống thông qua sử dụng
các cơ quan sinh dỡng (thân, lá, rễ, củ,...) để tạo ra những cá thể mới và cho tới
nay, một số phơng pháp nhân giống vô tính thờng đợc sử dụng nh giâm
cành, chiết cành, ghép và nuôi cấy in vitro (Campbell R.S., 1975)[26].
Kỹ thuật nuôi cÊy in vitro tõ khi míi ra ®êi ®· thĨ hiện u điểm là có thể
tạo ra một quần thể cây con đồng đều, giữ nguyên đợc đặc tính của cây mẹ, có
hệ số nhân giống cao, sớm phát huy đợc hiệu quả kinh tế, không tốn diện tích
phục vụ cho nhân giống, khắc phục những điều kiện bất lợi của thời tiết, đặc
biệt, đối với một số loại cây trồng rất khó nhân giống bằng con đờng hữu tính,
một số loại cây quý hiếm, có số lợng giống ban đầu hạn chế nhng yêu cầu
phát triển trong thời gian ngắn. Bên cạnh đó, kỹ thuật nuôi cấy in vitro còn có
lợi ích là có thể phục tráng những giống cây trồng đang thoái hoá, tạo các giống
sạch bệnh, vì vậy, trải qua quá trình nghiên cứu, phát triển, kỹ thuËt nu«i cÊy m«


tế bào đà đợc nhiều tác giả nghiên cứu, ứng dụng trên các đối tợng cây trồng
khác nhau (Boxus P.H., 1977)[24].
+ Trên cây hoa:
Theo Holgate D.P. (1977)[40], những nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi
cấy in vitro trong nhân nhanh một số giống hoa quý là công việc đem lại hiệu
quả kinh tế hàng đầu trong thời gian qua và cho tới nay, kỹ thuật này đà ứng
dụng rộng rÃi ở các phòng thí nghiệm cũng nh những công ty kinh doanh giống
hoa thơng phẩm.
Một trong các đối tợng hoa sản xuất thơng mại với số lợng lớn trên thế
giới phải kể đến là phong lan, đây là loại hoa thờng đợc nhân giống theo
phơng thức truyền thống từ hạt, tuy nhiên, việc nhân giống trong điều kiện tự
nhiên đà gặp một số hạn chế, đó là một số loại lan (Dendrobium, Epidendrum)
không hình thành hạt và việc nhân giống phải sử dụng một số bộ phận sinh
dỡng, bên cạnh ®ã, viƯc ph¸t triĨn cđa mét sè gièng lai dÉn đến sử dụng
phơng pháp nhân giống truyền thống sẽ cho kết quả cây không đồng đều và hệ

số nhân giống rất thấp (Oglesby R.P., 1978)[59].
Một số tác giả khi nghiên cứu nhân giống hoa lan đà cho rằng: nên sử
dụng môi trờng có thành phần dinh dỡng đơn giản, có thể Knudson hoặc
Vacin and Went, đây là môi trờng tơng đối phù hợp cho hầu hết các đối tợng
lan nh Phalaenopsis, Dendrobium, Vanda, ở giai đoạn khởi động, nên sử
dụng môi trờng đặc (có agar), sau khi protocorm xuất hiện, có thể chuyển sang
môi trờng lỏng trên máy lắc với tốc độ 100- 200 vòng/phút, tuy nhiên, một số
tác giả khác lại cho rằng với giống lan Cymbidium, tốc độ vòng quay tối u lại
là 2 vòng/phút (Oglesby R.P., 1978)[59].
Irawati J. (1977)[44] khi nghiên cứu nhân giống lan Cattleya đà có một số
nhận xét nh sau: ở giai đoạn khởi động nên sử dụng môi trờng cơ bản


(Knudsson) cã bæ sung 0,1 ppm ∝-NAA; 0,2 ppm Kinetin; 15% nớc dừa và 0,5
gr đờng/lít môi trờng; giai đoạn nhân nhanh cần bổ sung thêm 0,19 ppm NAA, 0,35 ppm GA3, 0,22 ppm Kinetin; 20 gr đờng/lít môi trờng và giai đoạn
tạo cây hoàn chỉnh nên sử dụng môi trờng (Knudsson) không có chất kích
thích sinh trởng.
Tại một số nớc châu Âu, Anthurium (Anthurium spp) là loại hoa có giá
trị kinh tế và sử dụng rất cao, tuy nhiên, cây giống và cây hoa thơng phẩm
thờng có nguồn gốc nhân giống từ hạt, tỷ lệ phân ly rất lớn, dẫn tới chất lợng
hoa bị suy giảm. Để cải thiện chất lợng cũng nh giảm giá thành cây giống cho
sản xuất, Leffring L. (1976)[49] đà nghiên cứu nuôi cấy thành công Anthurium
trên môi trờng MS có bổ sung 2iP (3 ppml), BAP (1 ppm) để tái sinh cây, sau
đó, tiến hành nhân chồi trên môi trờng MS có bổ sung Kinetin (3ppm) và kết
quả nghiên cứu này đà đợc ứng dụng để nhân giống thơng phẩm.
Theo Trần Thanh Vân (1974)[77], hoa Gesneriads cã rÊt nhiỊu gièng cã
thĨ nh©n nhanh b»ng phơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nh Saintpaulia,
Sinningia, và có thể tái sinh chồi trong điều kiện in vitro từ nhiều bộ phận của
cây nh đoạn thân, mảnh lá, trên môi trờng MS có bổ sung 2-3 ppm BAP;
0,5 ppm NAA.

Wright N.A. (1982)[82] khi nghiªn cøu nhân giống hoa Tulip đà cho rằng
đây là đối tợng tơng đối khó ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro, tuy nhiên,
vẫn có thể thu đợc kết quả tốt khi đảm bảo nghiêm ngặt những yêu cầu kỹ
thuật theo 1 trong 2 phơng pháp nh sau:
- Mẫu nuôi cấy ®−ỵc lÊy víi kÝch th−íc rÊt nhá (3-5 mm) tõ cđ gièng, sư
dơng m«i tr−êng MS cã bỉ sung 0,12 ppm -NAA và 4 ppm BAP.
- Mẫu đợc lấy là đế hoa thành thục với kích thớc 1 mm, nuôi cấy trên
môi trờng MS bổ sung 500 ppm casein hydrat, 1 ppm ∝-NAA, 1 ppm BAP,


sau 3- 4 tuần, lấy chồi hình thành trực tiếp trên các mẫu nuôi cấy lắc trong GA3
(nồng độ 1 ppm) trong 15 giờ, sau đó, tiếp tục nuôi cấy thì sẽ thu đợc chồi số
lợng chồi rất lớn.
Kỹ thuật nuôi cấy in vitro cũng đợc nghiên cứu và ứng dụng thành công
trên giống hoa Cyclamen, một loại hoa mà cho tới nay vẫn duy trì hình thức
nhân giống bằng hạt, tuy nhiên, thời gian gần đây, một số giống lai chất lợng
cao đà đợc chọn tạo, vì vậy việc nhân giống vô tính trở nên rất cần thiết. Các
tác giả Mayer L. (1956)[51]; Stichel E. (1959)[75] và Geier T. (1982)[36] đÃ
xây dựng quy trình nhân giống đối tợng này thông qua tái sinh mô sẹo lấy từ
thân, hoa, lá của cây.
Trên đối tợng hoa đồng tiền, kỹ thuật nuôi cấy mô tỏ ra là phơng pháp
hữu hiệu và rất có ý nghĩa trong việc phát triển những giống hoa mới, công nghệ
này đợc nhiều phòng thí nghiệm sử dụng trong thời gian hiện nay. Một số tác
giả đà đề xuất quy trình nuôi cấy đỉnh sinh trởng cây hoa đồng tiền nh sau:
giai đoạn nhân cụm chồi sử dụng m«i tr−êng MS cã bỉ sung 0,5 ppm ∝-NAA,
10 ppm Kinetin với điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 27oC, ánh s¸ng 1.000 lux, thêi
gian chiÕu s¸ng 12- 16 giê; giai đoạn ra rễ: môi trờng là MS bổ sung 10 mg/l
-NAA với cờng độ ánh sáng 10.000 lux, tuy nhiên, theo Wozniak
J.(1982)[81], giai đoạn khởi động mẫu có thể sử dụng 10 ppm Kinetin nhng
nồng độ này rất dễ gây ngộ độc cho mẫu, vì vậy, giai đoạn sau nên sư dơng

Kinetin ë nång ®é 3- 5 ppm (t thc giống) và chất lợng cây càng đợc cải
thiện thêm khi bổ sung ABA (2,6 ppm) trong giai đoạn ra rễ.
Trên đối tợng hoa hồng, kỹ thuật nhân giống in vitro một số giống hoa
hồng lai đà đợc tác giả Davies D.R. (1980)[31] nghiên cứu và đề xuất: sử dụng
phơng pháp nuôi cấy đỉnh sinh trởng trên môi trờng MS có bỉ sung thiamin
HCl 0,5 ppm, sau ®ã cÊy chun sang môi trờng ra rễ có hàm lợng khoáng
thấp và không cã chÊt kÝch thÝch sinh tr−ëng thuéc nhãm auxin


+ Trên cây công nghiệp, lâm nghiệp:
Theo Sondahl M.R.(1977)[72], có thể tạo phôi vô tính một số giống cà
phê thông qua hình thành callus từ nguồn mẫu nuôi cấy là hạt hoặc mảnh lá trên
môi trờng MS có bổ sung 0,05 ppm ∝-NAA vµ 0,5 ppm Kinetin. Trong mét sè
tr−êng hợp khác, có thể sử dụng tổ hợp 2,4 D và Kinetin ở nồng độ tơng ứng là
1 và 4 ppm. Tác giả Monaco L.C. (1977)[53] còn cho rằng, có thể nuôi cấy đỉnh
sinh trởng giống cà phê C.arabica từ chồi đỉnh của hạt nảy mầm trên môi
trờng MS có bổ sung vitamin của môi trờng B5 và 1-2 ppm BAP hoặc Zeatin.
Trên các đối tợng cây lâm nghiệm, kỹ thuật nhân giống bằng phơng
pháp nuôi cấy mô tế bào đà tỏ ra có hiệu quả, đợc nhiều tác giả nghiên cứu, đề
cập trên các đối tợng Eucalytus (De Fossard R.A., 1977[33]; McComb J.A.,
1982[52]);Teak (Gupta P.K., 1980[38]); Tamarind (Mascarenhas A.F.,
1982[50]);… và đều cho rằng nhân giống in vitro cây lâm nghiệp bằng nuôi cấy
chồi đỉnh là rất có hiệu quả, cho hệ số nhân giống và hiệu quả kinh tế cao, có
thể đạt công suất 15.000- 50.000 cây giống/năm trên 1 m2 phòng thí nghiệm.
+ Trên cây rau:
Theo một số tác giả, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào đợc nghiên cứu và
thành công trên hầu hết các loại rau nh cà chua, bắp cải, ớt, da chuột, hành,
tỏi,.., tuy nhiên, theo Collin G.B. (1982)[29], kỹ thuật này hầu nh chỉ sử dụng
phục vụ công tác chọn tạo giống và khi tiến hành nuôi cấy in vitro, cần lu ý
một số vấn đề nh sau:

- Nếu mẫu nuôi cấy là hạt: Nên sử dụng môi trờng nuôi cấy là MS cã bỉ
sung 4- 5 ppm ∝-NAA vµ 0,1 - 0,5 ppm Kinetin.
- Nếu mẫu nuôi cấy là mô thành thục: Nên sử dụng môi trờng nuôi cấy
là MS có bổ sung 0,5-1,0 ppm IAA vµ 3-4 ppm BAP.
- NÕu mÉu nuôi cấy là chồi hoa: Nên sử dụng môi trờng nuôi cấy là MS
có bổ sung 1 ppm IBA và 2-11 ppm BAP.


+ Trên cây ăn quả:
Trên các đối tợng cây ăn quả, ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro phục
vụ công tác nhân giống đợc rất nhiều tác giả nghiên cứu, tuy nhiên, bên cạnh
kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, một số phơng pháp nhân giống vô tính (chiết,
ghép, giâm cành) hiện vẫn đợc sử dụng và phát huy hiệu quả, vì vậy, ngời ta
chỉ sử dụng nuôi cấy in vitro trong một số trờng hợp nh sau:
- Nhân nhanh giống mới.
- Nhân nhanh những đối tợng mà việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in
vitro ít ảnh hởng tới sinh trởng, phát triển, năng suất và chất lợng giống.
- Nhân nhanh giống làm cây gốc ghép.
Theo Hutchinson J.F. (1982)[41], giống táo Malus thờng phát triển tốt
trên môi trờng có thành phần đa lợng cũng nh vi lợng theo MS, tuy nhiên,
một số thành phần có giảm bớt, sau đó, ở giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh, vẫn sử
dụng môi trờng MS những không cần bổ sung thêm chất kích thích sinh trởng.
Trên các đối tợng cây có múi, việc nuôi cấy in vitro đà đợc Murashige
T. (1969)[54] đa ra và đề xuất sử dụng môi trờng MS có bổ sung hàm lợng
một số vitamin cao và ở giai đoạn ra rễ, cần giảm bớt hàm lợng sắt trong môi
trờng cơ bản.
Green C.E. (1978)[37] khi nghiên cứu nuôi cấy ®Ønh sinh tr−ëng cña mét
sè gièng cam ®· cho biÕt nÕu lÊy ngn mÉu gièng tõ nh÷ng chåi cđa nh÷ng cây
quá già cỗi (40 năm tuổi), rất khó tạo ra sự phát sinh cụm chồi trên môi trờng
MS, tuy nhiên, tác giả Kitto S.L. (1981)[46] lại cho rằng có thể tái sinh cụm chồi

trên giống Carrizo citrange.
Trên một số đối tợng cây ăn quả khác nh: nho, dâu tây, đu đủ, đào ,,
cũng đợc nhiều tác giả nghiên cứu và ®Ò cËp (Hirabayashi T., 1976[39]; De
Bruijne E., 1974 [32]; Boxus P.H., 1977[24]; Shingha S., 1980[69]).


Đối với cây dứa, là loại cây ăn quả có hình thức sinh sản vô tính thì việc
nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào phục vụ công tác nhân giống
có vai trò rất quan trọng, đặc biệt, trên các đối tợng có hệ số nhân giống tự
nhân thấp (Cayen, dứa cảnh,).
+ Trên cây chuối:
Chuối là đối tợng cây ăn quả có hình thức sinh sản vô tính với phơng
thức nhân giống truyền thống là sử dụng chồi nách làm giống trồng những thế
hệ kế tiếp, vì vậy, sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào nhân giống chuối đÃ
đợc nghiên cứu, ứng dụng từ rất lâu tại nhiều nớc trên thế giới
Theo Reuveni O.(1986)[63], kỹ thuật nuôi cấy in vitro chuối có một số u
điểm nh sau:
- Nhân đợc số lợng lớn giống từ cây ban đầu đà xác định tính trạng.
- Chất lợng cây giống sản xuất hoàn toàn sạch bệnh.
- Tránh đợc những sâu hại gây ra qua nguồn đất (tuyến trùng), vì vậy,
rất tiết kiệm đợc chi phí hoá chất cho xử lý đất.
- Cây nuôi cấy mô có thể trồng 1 vụ với mức độ thâm canh cao, thời gian
sinh trởng ngắn, có thể điều khiển thời gian thu hoạch.
- Tỷ lệ cây sống cao trên điều kiện đồng ruộng (> 98%).
- Cây giống in vitro có khả năng sinh trởng nhanh hơn cây có nguồn gốc
chồi nách.
- Cây giống in vitro phát triển đồng đều, ra hoa đồng loạt.
- Thời gian thu hoạch ngắn.
- So với cây giống sử dụng chồi nách, cây nuôi cấy mô có giá thành rẻ và
dễ nhân giống, vận chuyển.