XÂY DỰNG CÂY PHẢ HỆ CỦA RUỒI ĐỤC QUẢ Bactrocera carambolae Ở MIỀN NAM VIỆT NAM DỰA TRÊN TRÌNH TỰ GEN 16S rRNA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
*************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG CÂY PHẢ HỆ CỦA RUỒI ĐỤC QUẢ
Bactrocera carambolae Ở MIỀN NAM VIỆT NAM
DỰA TRÊN TRÌNH TỰ GEN 16S rRNA

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: ĐÀO THỊ NGỌC HIỀN
Niên khóa: 2005 – 2009

Tháng 8/2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
*************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG CÂY PHẢ HỆ CỦA RUỒI ĐỤC QUẢ
Bactrocera carambolae Ở MIỀN NAM VIỆT NAM
DỰA TRÊN TRÌNH TỰ GEN 16S rRNA

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. NGUYỄN HỮU ĐẠT

ĐÀO THỊ NGỌC HIỀN

KS. PHAN THỊ THU HIỀN
KS. LÊ VĂN HUY

Tháng 8/2009


LỜI CẢM ƠN
Con xin cảm ơn ba mẹ cùng gia đình đã nuôi con đến ngày khôn lớn và cho con
ăn học thành tài.
Em xin chân thành cảm ơn
- Các thầy cô trong trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm cùng các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học đã tận tình truyền
đạt kiến thức cho em trong suốt bốn năm học.
- Thầy Nguyễn Hữu Đạt, chị Phan Thị Thu Hiền, anh Lê Văn Huy đã tận tình
chỉ dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
- Anh Chu Hồng Châu, chị Trương Thị Hoàng Oanh, chị Nhan Thị Minh Uyên
và các anh chị trong Trung tâm kiểm dịch thực vật sau nhập khẩu II đã hết
lòng hỗ trợ em trong quá trình thực hiện khóa luận.
Xin chân thành cám ơn bạn Nguyễn Thị Ngọc Thảo và các bạn lớp DH05SH đã
cùng tôi chia sẻ biết bao niềm vui, nỗi buồn trong suốt bốn năm đại học.

Xin chân thành cảm ơn!

ĐÀO THỊ NGỌC HIỀN

iii


TÓM TẮT
Ruồi đục quả là loài gây hại nghiêm trọng ở Việt Nam cũng như nhiều quốc gia
trên thế giới. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về loài ruồi đục quả nói chung và loài
Bactrocera carambolae nói riêng trong lĩnh vực sinh học phân tử vẫn chưa được thực
hiện. Chính vì vậy, việc xây dựng cây phả hệ của các loài ruồi đục quả dựa trên vùng
gen 16S rRNA thuộc DNA ty thể giúp xác định mối quan hệ giữa các loài ruồi đục quả
Bactrocera cũng như bước đầu bổ sung thêm cơ sở dữ liệu để nghiên cứu về các loài
ruồi đục quả này tại Việt Nam.
Đề tài “Xây dựng cây phả hệ của ruồi đục quả Bactrocera carambolae ở miền
Nam Việt Nam dựa trên trình tự gen 16S rRNA” được thực hiện từ tháng 2 đến tháng
07/2009 tại Trung tâm kiểm dịch thực vật sau nhập khẩu II.
Các mẫu trái cây nghi ngờ chứa trứng hay ấu trùng ruồi đục quả được thu về nhân
nuôi trong điều kiện được kiểm soát (Biotron). Các mẫu ruồi trưởng thành thu nhận
được phân lập dựa vào đặc điểm hình thái để chọn ra mẫu Bactrocera carambolae và
đem ly trích DNA. DNA ly trích được tiến hành chạy PCR và giải trình tự. Các trình
tự được xử lý và xây dựng cây phả hệ để xem xét mối quan hệ giữa các mẫu đã phân
lập với các loài Bactrocera khác trên thế giới.
Tổng số lượng mẫu thu được trong nghiên cứu là 45 mẫu Bactrocera carambolae
đã được định danh dựa vào đặc điểm hình thái ở một số tỉnh miền Nam Việt Nam. Kết
quả 10/45 mẫu đã được ly trích DNA theo quy trình cải tiến từ protocol 12
(Nishiguchi, 2002) và tiến hành chạy PCR. Dựa trên trình tự khuếch đại vùng gen 16S
rRNA (473 bp) của 7/10 mẫu ruồi, kết hợp với trình tự của các mẫu ruồi trên ngân
hàng gen. Kết quả cho thấy các mẫu ruồi đục quả này đều nằm trong phức hợp
Bactrocera dorsalis với tỷ lệ tương đồng cao (98,7%).

iv

SUMMARY
DAO THI NGOC HIEN, Department of Biotechnology, Nong Lam University,
Ho Chi Minh City, August 2009.
The fruit flies are a serious pest in agriculture of Viet Nam and the world. In Viet
Nam, Bactrocera carambolae fruit flies haven’t been used to examine by molecular
biological technology. Determining phylogenetic Bactrocera carambolae fruit fly in
Southern of Viet Nam based on the sequence of 16S rRNA gene would be useful for
studying relationships and creating more data among Bactrocera species.
The title of research: “Determining phylogenetic Bactrocera carambolae fruit fly
in Southern of Viet Nam based on the sequence of 16S rRNA gene” were studied from
a month 2-7/2009.
The fruit fly samples, which doubt contains eggs or larvae of the fruit fly, were
carried out and reared in controlled enviroment condition (Biotron). The adult flies
were classified based on morphological characters in order to select B. carambolae
fruit flies and to extract total DNA. Total DNA was analysed PCR and sequenced.
These sequences were analysed to infer phylogenetic relationships among these
samples with the other Bactrocera species in the world.
The result showed that there were 45 samples of Bactrocera carambolae
determined in morphological characteristics. Only were ten of forty – five samples
extracted total DNA and analysed PCR. Then, seven of these PCR products, 473 bp,
were sequenced. Combining our sequences with 27 sequences of Bactrocera on
Genbank, we maked phylogenetic tree. The tree inferred that these samples are belong
to Bactrocera dorsalis complex.

v


MỤC LỤC

Trang
Lời cảm ơn ................................................................................................................iii
Tóm tắt ......................................................................................................................iv
Summary .................................................................................................................... v
Mục lục .....................................................................................................................vi
Danh sách các chữ viết tắt........................................................................................viii
Danh sách các bảng ...................................................................................................ix
Danh sách các hình .....................................................................................................x
Chương 1 MỞ ĐẦU ...................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ..........................................................................................................1
1.2. Yêu cầu ..............................................................................................................2
1.3. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................................3
2.1. Tổng quan về ruồi đục quả..................................................................................3
2.1.1. Ruồi đục quả....................................................................................................3
2.1.2. Ruồi đục quả Bactrocera..................................................................................5
2.1.2.1. Phân loại .......................................................................................................5
2.1.2.2. Lịch sử phát triển ..........................................................................................5
2.2. Các phương pháp nghiên cứu về ruồi đục quả.....................................................6
2.2.1. Dựa vào đặc điểm hình thái..............................................................................6
2.2.2. Dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử ...................................................................7
2.3. Tổng quan về DNA ty thể...................................................................................7
2.3.1. DNA ty thể ......................................................................................................7
2.3.2. Gen 16S – thước đo tiến hoá ............................................................................8
2.3.3. Vùng gen cytochrome oxidase II – tRNALys - tRNAAsp ...................................9
2.4. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về ruồi đục quả Bactrocera..................... 10
2.4.1. Nghiên cứu trong nước................................................................................... 10
2.4.2. Nghiên cứu ngoài nước .................................................................................. 10
2.5. Polymerase Chain Reaction (PCR) ................................................................... 12
2.5.1. Khái niệm ...................................................................................................... 12

vi


2.5.2. Nguyên tắc phản ứng PCR ............................................................................. 12
2.5.3. Thành phần và vai trò hoá chất trong phản ứng PCR...................................... 13
2.5.4. Ứng dụng ....................................................................................................... 13
2.5.5. Ưu và nhược điểm.......................................................................................... 13
2.6. Phương pháp xây dựng phả hệ phân tử ............................................................. 14
2.6.1. Khái niệm ...................................................................................................... 14
2.6.2. Nguyên tắc phân tích phả hệ .......................................................................... 14
2.6.3. Một số loại cây phả hệ ................................................................................... 14
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... 15
3.1. Thời gian và địa điểm ....................................................................................... 15
3.2. Đối tượng thí nghiệm........................................................................................ 15
3.3. Vật liệu và hoá chất .......................................................................................... 15
3.4. Phương pháp thí nghiệm ................................................................................... 16
3.4.1. Phương pháp lấy mẫu..................................................................................... 16
3.4.2. Phương pháp phân lập mẫu dựa vào đặc điểm hình thái ................................. 16
3.4.3. Phương pháp ly trích DNA............................................................................. 17
3.4.4. Phản ứng PCR................................................................................................ 18
3.4.5. Giải trình tự và phân tích số liệu .................................................................... 21
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 22
4.1. Kết quả phân lập mẫu ruồi đục quả Bactrocera carambolae ............................. 22
4.2. Hoàn thiện quy trình ly trích DNA.................................................................... 24
4.3. Kết quả thực hiện phản ứng PCR ...................................................................... 28
4.3.1. Thí nghiệm 1: Sử dụng primer 16S. ............................................................... 28
4.3.2. Thí nghiệm 2: Sử dụng primer C2KD ............................................................ 29
4.4. Giải trình tự và phân tích số liệu ....................................................................... 30
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................... 35

5.1. Kết luận ............................................................................................................ 35
5.2. Đề nghị............................................................................................................. 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................... 36
PHỤ LỤC

vii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
B.

Bactrocera

bp

Base pair

Ctv

Cộng tác viên

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxynucleotide triphosphate

EDTA

Ethylene diaminetetra acetic acid

FAO

Food and Agriculture Organization

mtDNA

Mitochondrial DNA

NCBI

National Center for Biotechnology Information

OD

Optical density

OTU

Operational Taxonomic Unit

PCR

Polymerase chain reaction

RNA

Ribonucleic acid

rRNA

Ribosomal Ribonucleotide acid

Ta

Annealing temperature

TAE

Tris Glacial Acetic Acid EDTA

TE

Tris EDTA

Tm

Melting temperature

Ts

Transition

Tv

Transversion

UI

Unit International

UV

Ultra Violet

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Tám loài ruồi đục quả được quan tâm nhất trong xuất khẩu.............................. 4
Bảng 2.2 Tám loài ruồi đục quả có tầm ảnh hưởng quan trọng đến nền kinh tế................ 6
Bảng 3.1 Tên, trình tự và vùng khuếch đại của primer................................................... 16
Bảng 3.2 Chế độ chiếu sáng trong Biotron .................................................................... 16
Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái của B. dorsalis và B. carambolae..................................... 17
Bảng 3.4 Thành phần hóa chất PCR theo hướng dẫn của nhà sản xuất........................... 19
Bảng 3.5 Thành phần hoá chất PCR sử dụng iQ super mix (Bio-rad) ............................ 19
Bảng 3.6 Giá trị nồng độ primer thay đổi trong phản ứng PCR...................................... 20
Bảng 3.7 Giá trị nồng độ các chất thay đổi trong phản ứng PCR ................................... 20
Bảng 4.1 Tỉ lệ ruồi đục quả B.dorsalis và B. carambolae thu được ngoài đồng ruộng ... 23

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Hình dạng và vòng đời của ruồi đục quả........................................................... 3
Hình 2.2 Ruồi đục quả .................................................................................................... 5
Hình 2.3 Cấu tạo mtDNA dạng vòng. .................................................................................... 7
Hình 2.4 Ruồi đục quả Bactrocera correcta (Bezz)....................................................... 10

Hình 4.1 Mẫu trái cây có dấu hiệu nghi ngờ chứa trứng hay ấu trùng ruồi đục quả........ 22
Hình 4.2 Lồng ruồi đã được nhân nuôi thành ruồi trưởng thành trong Biotron .............. 22
Hình 4.3 Biotron và thiết bị theo dõi ẩm độ, nhiệt độ trong Biotron .............................. 23
Hình 4.4 Sự khác nhau về kích thước giữa đời con F1 và đời bố mẹ P .......................... 24
Hình 4.5 Các bộ phận của ruồi đục quả dùng để ly trích DNA ...................................... 25
Hình 4.6 Sơ đồ quy trình ly trích DNA cải tiến từ mẫu ruồi đục quả ............................. 26
Hình 4.7 Kết quả điện di DNA mẫu ly trích theo quy trình 1 và quy trình cải tiến 2...... 27
Hình 4.8 Kết quả điện di DNA mẫu ly trích từ các bộ phận của ruồi đục quả. ............... 27
Hình 4.9 Sản phẩm PCR với nồng độ hoá chất theo hướng dẫn của nhà sản xuất .......... 28
Hình 4.10 Sản phẩm PCR trong thí nghiệm dùng iQ super mix (Bio-rad) ..................... 28
Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm PCR giữa hai thí nghiệm 1a và 1b ........................ 29
Hình 4.12 Cây phả hệ ruồi đục quả Bactrocera carambolae (consensus tree)................ 31
Hình 4.13 Cây phả hệ ruồi đục quả Bactrocera carambolae (radiation tree).................. 32

x


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ruồi đục quả là loài gây hại nghiêm trọng ở nhiều quốc gia trên thế giới. Nó
không chỉ ảnh hưởng xấu đến sản lượng trái cây tươi và một số mặt hàng thực vật mà
còn là hàng rào lớn giới hạn về tiềm năng xuất khẩu trị giá hàng triệu đô la trong nền
thương mại quốc tế (Rejesus và ctv, 1991; Khalid Mahmood, 2003).
Đặc biệt, những loài trong phức hợp Bactrocera dorsalis là những loài ruồi gây
hại về kinh tế ở Châu Á nói chung và khu vực Đông Nam Á nói riêng. Việc nhận dạng
chính xác các loài trong phức hợp này gặp rất nhiều khó khăn và dẫn đến không ít sai
lầm trong các bài nghiên cứu trước đây (Drew và Hancock, 1994). Nhiều nhà khoa học
đã đưa ra các khoá phân loại khác nhau giúp định danh chính xác hơn các loài ruồi này
( Hardy, 1969; Hardy và Adachi, 1954; Hardy, 1973, 1974, 1982, 1983). Song song

với so sánh hình thái chuẩn, một số nghiên cứu đã sử dụng một số kỹ thuật khác như
kỹ thuật hiển vi điện tử quét, phân tích thành phần hoá học của chất dẫn dụ con đực,
điện di enzyme mô (Ooi, 1991; Smith và ctv, 2003) và dữ liệu về cây kí chủ (cây
thương mại và cây hoang dại). Smith và ctv (2003); Muraji và Nakahara (2002) đã xây
dựng được mối quan hệ về nguồn gốc của 18 loài ruồi đục quả ở vùng Đông Nam Á
bằng phương pháp sinh học phân tử trên một số gen thuộc DNA ty thể. Theo
Korneyev (1999); Han và ctv (2002), việc định danh nên kết hợp quan sát hình thái và
lập cây phả hệ sẽ cho kết quả chính xác hơn.
Tại Việt Nam, các nhà khoa học bước đầu đã tìm hiểu hình thái và biện pháp xử
lý ruồi đục quả ở các giai đoạn phát triển khác nhau trong trái cây xuất nhập khẩu tại
Việt Nam (Nguyễn Thị Chắt và Huỳnh Trí Đức, 2002; Nguyễn Hữu Đạt và Nguyễn
Văn Tuất, 2007). Qua khảo sát thành phần ruồi đục quả tại các tỉnh phía Nam bước
đầu ghi nhận được 18 loài, có 4 loài gây hại quan trọng là B. correcta, B. dorsalis, B.
carambolae, B. cucurbitae và thiệt hại kinh tế do ruồi đục quả gây ra ước tính từ 40100% sản lượng trái cây nhiệt đới (Drew và Romig, 1999 - 2000). Tuy nhiên, các
nghiên cứu về sinh học phân tử về các loài ruồi này vẫn chưa được thực hiện nhiều tại
Việt Nam gây không ít khó khăn cho công tác kiểm dịch thực vật.

1


Chính vì thế, trong thời gian từ tháng 2/2009 đến tháng 7/2009, chúng tôi đã thực
hiện đề tài “Xây dựng cây phả hệ của ruồi đục quả Bactrocera carambolae ở miền
Nam Việt Nam dựa trên trình tự gen 16S rRNA”. Kết quả đạt được giúp xác định mối
quan hệ giữa các loài ruồi đục quả và bổ sung thêm cơ sở dữ liệu để nghiên cứu về loài
ruồi đục quả này.
1.2. Yêu cầu
-

Định danh được loài ruồi đục quả B. carambolae dựa vào đặc điểm hình thái.

-

Xây dựng cây phả hệ và phân tích được mối quan hệ giữa các mẫu B. carambolae

đã phân lập trong nghiên cứu với các loài ruồi đục quả Bactrocera khác trên thế giới.
1.3. Nội dung đề tài
-

Phân lập và định danh ruồi đục quả B. carambolae dựa vào đặc điểm hình thái.

-

Xác định trình tự một số vùng gen trên DNA ty thể làm cơ sở để định danh ruồi
đục quả B. carambolae.
 Xây dựng quy trình ly trích DNA.
 Thực hiện phản ứng PCR trên hai vùng gen 16S rRNA và cytochrome oxidase
II + tRNALys + tRNAAsp (CO2KD) thuộc DNA ty thể.
 Giải trình tự, phân tích số liệu, xây dựng cây phả hệ và phân tích mối quan hệ
của ruồi đục quả B. carambolae đã phân lập với các loài ruồi đục quả Bactrocera
khác trên thế giới.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về ruồi đục quả
2.1.1. Ruồi đục quả
Theo Báo cáo số 35231 VN về Kế hoạch Hành động về An toàn thực phẩm và
Sức khỏe nông nghiệp của Việt Nam, ruồi đục quả gây hại trên nhiều chủng loại rau

quả và là dịch hại nguy hiểm nhất. Ở những nơi có mật độ quần thể cao, mức độ nhiễm
ruồi có thể lên tới 100% trái cây. Ví dụ, loài B. dorsalis (Hendel) có phổ kí chủ rộng
với trên 117 cây chủ, thiệt hại kinh tế ước tính từ 40-100% sản lượng trái cây nhiệt
đới, đặc biệt là ở các tỉnh phía Bắc. Kết quả điều tra vùng trồng cây ăn quả trên toàn
quốc năm 1999-2000 đã xác định được 30 loài ruồi đục quả.
Ấu trùng ruồi đục quả có thể sống trong trái cây đã thu hoạch vì vậy có thể xuất
hiện bên trong trái cây được đóng gói để xuất khẩu. Do ruồi đẻ trứng bên trong quả
nên rất khó phát hiện trái cây nhiễm ruồi trong quá trình phân loại, đóng gói và kiểm
tra. Ấu trùng ruồi đục quả cũng có thể sống sót trong quá trình bảo quản và vận
chuyển do đặc tính chống chịu được với nhiệt độ thấp và sẵn có nguồn dinh dưỡng dồi
dào. Ruồi trưởng thành bị chết sau vài ngày nếu không có thức ăn. Khả năng xâm
nhập, hình thành và lây lan một loài ruồi đục quả mới vào nước nhập khẩu là rất cao
nếu có nhiều kí chủ phù hợp và điều kiện khí hậu thuận lợi.

Hình 2.1 Hình dạng và vòng đời của ruồi đục quả
(Nguồn: FFTC Survey of Asian Cornborer and Fruitfly
in Southeast Asian Countries, 1998).

3


Hầu hết các loài ruồi đục quả phát hiện ở Việt Nam đều là đối tượng kiểm dịch
thực vật của các quốc gia có thị trường rau quả rất lớn như Úc, Nhật Bản và Hoa Kì.
Các nước này cấm nhập khẩu trái cây chưa qua chế biến và xử lý. Liên minh Châu Âu
cho phép nhập trái cây tươi từ Việt Nam trên cơ sở kiểm tra và chứng nhận không có
các đối tượng kiểm dịch thực vật. Do vậy, để tiếp cận với các thị trường cao cấp này,
cần thực hiện chương trình diệt trừ ruồi đục quả và xử lý rau quả theo phương pháp
được nước nhập khẩu chấp thuận.
Các loài ruồi đục quả có tác động lớn nhất tới khả năng tiếp cận thị trường là
B. dorsalis, B. carambolae, B. correcta, B. cucurbitae. Tuy nhiên, bất cứ loài ruồi nào

khác mà kết quả phân tích nguy cơ dịch hại chứng minh được mức độ rủi ro nghiêm
trọng đối với nước nhập khẩu thì cũng là đối tượng phải xử lý bằng biện pháp kiểm
dịch thực vật. Theo Quyết định số 117/2000/QĐ/BNN-BVTV ngày 20/11/2000 ban
hành Danh mục đối tượng kiểm dịch thực vật của nước Cộng hoà Xã hội chủ nghĩa
Việt Nam, ruồi đục quả là một trong những sinh vật có tiềm năng gây hại nghiêm
trọng cho tài nguyên thực vật.
Bảng 2.1 Tám loài ruồi đục quả được quan tâm nhất khi xuất khẩu (Nguồn ACIAR, 2000)
Ruồi đục quả

Cây kí chủ

Bactrocera dorsalis
(Hendel)

Mãng cầu, khế, điều, quả có múi, bòn bon, na, thanh
long, vả, ổi, roi, táo ta, vải, dưa gang, xoài, dưa, đu đủ,
đào, lê hồng, mận, bưởi, hồng xiêm, táo tây.

Bactrocera correcta
(Bezzi)

Sơri, khế, Coccinia sp., thanh long, ổi, roi, táo ta, dưa
gang, xoài, đào, mận hồng, hồng xiêm.

Bactrocera pyrifoliae
(Drew và Hancock)

Ổi, dưa gang, đào, lê.

Bactrocera cucurbitae

(Coquillett)

Mướp đắng, bí, Coccinia sp., dưa chuột, Cucurbita sp.,
ổi, dưa gang, dưa, bưởi, bí đỏ.

Bactrocera tau
(Walker)

Mướp đắng, bí, su su, dưa chuột, Cucumis melo, ổi,
dưa gang, lucuma, đu đủ.

Bactrocera latifrons
(Hendel)

ớt đỏ, ớt, cà tím dài, roi, lucuma, hồng, Solanum spp.

Bactrocera carambolae
(Drew và Hancock)

Roi

Bactrocera calophylli
(Perkins và May)

Táo ta

4


2.1.2. Ruồi đục quả Bactrocera

2.1.2.1. Phân loại
Giới: Animalia
Ngành: Arthropoda
Lớp: Insecta
Bộ: Diptera
Họ : Tephrididae
Giống: Bactrocera

Hình 2.2 Ruồi đục quả (www.agnet.org).

2.1.2.2. Lịch sử phát triển
Bactrocera là một nhóm côn trùng quan trọng đã gây thiệt hại lớn trong nền sản
xuất rau quả. Cũng giống như nhiều giống khác trong họ Tephritidae, nhóm này có
một lịch sử phát triển rất phức tạp. Từ khi nhóm này được nhận biết đầu tiên vào năm
1835, sự phân loại đã có nhiều thay đổi (Drew, 1972; Hardy, 1995, 1976) và vị trí của
giống này đã được chứng minh trong nghiên cứu của Drew (1989).
Giống Bactrocera là một trong những giống lớn nhất trong họ Tephrididae với
khoảng 500 loài đã được mô tả và xếp vào trong 28 giống phụ (Drew, 1989; Drew and
Hancock, 2000). Trước đây, trong giống Bactrocera có Dacus (một giống phụ có tầm
quan trọng ảnh hưởng đến kinh tế), và một vài loài khác (ví dụ: Bactrocera dorsalis,
Bactrocera tryoni, Bactrocera cucurbitae,…) có khả năng tấn công và gây ảnh hưởng
về mặt kinh tế đối với các mặt hàng trái cây (White và Elson-Harris, 1992).
Bactrocera và Dacus được cho rằng là hai nhóm tương đồng cao với nhau dựa vào
những đặc điểm hình thái: sự thay đổi vân cánh, độ rộng của các ô giữa cánh, đặc điểm
của đốt bụng thứ 6 ở con cái, đặc điểm đốt bụng thứ 5 ở cả hai giới (Munro, 1984;
White, 2000) và DNA ty thể (Muraji và Nakahara, 2002; Smith và ctv, 2003).
Theo báo cáo của Drew và Hancock (1994), ở Châu Á có 42 loài đã được xếp
vào phức hợp Bactrocera dorsalis, trong đó có 8 loài có tầm ảnh hưởng quan trọng
đến nền kinh tế. Chìa khóa để phân biệt các loài trong phức hợp này có thể dựa vào
nhiều yếu tố như vị trí thu mẫu, cây kí chủ, chất dẫn dụ con đực và khu vực phân bố.

Phức hợp B. dorsalis đã xâm chiếm những vùng khác nhau trên thế giới. Năm
1946, B. dorsalis được phát hiện ở Hawaii và tràn lan khắp các vùng trái cây khác
nhau trong vòng hai năm. Năm 1975, ruồi đục quả khế B. carambolae được tìm thấy ở

5


Surinam (Van Sauers-Muller, 1991) và đã trở thành đối tượng nghiên cứu của nhiều
nhà khoa học (Hancock, 1990).

Bảng 2.2 Tám loài ruồi đục quả trong phức hợp B. dorsalis có tầm ảnh hưởng quan
trọng đến nền kinh tế (Drew và Hancock, 1994)
Ruồi đục quả

Chất dẫn dụ

Nguồn gốc

B. carambolae sp. n.

Methyl eugenol

India, Thailand, Peninsular Malaysia,
East Malaysia, Singapore, Indonesia.

B. caryeae (Kapoor)

Methyl eugenol

India, Sri Lanka.

B. dorsalis (Hendel)

Methyl eugenol

India, Sri Lanka, Myanmar, China, Taiwan,
Thailand, Laos, Vietnam, Cambodia.

B. kandiensis sp. n.

Methyl eugenol

Sri Lanka.

B. occipitalis (Bezzi)

Methyl eugenol

Philippines, East Malaysia.

B. papayae sp. n.

Methyl eugenol

Thailand, Peninsular Malaysia, East
Malaysia, Singapore, Indonesia.

B. philippinensis sp. n.

Methyl eugenol

Philippines.

B. pyrifoliae sp. n.

Methyl eugenol

Thailand.

Trong 8 loài ruồi đục quả trên thì B. dorsalis là loài được thu nhận nhiều nhất
tại Việt Nam và có hình thái rất giống với B. carambolae. Chính vì thế chúng tôi lấy B.
carambolae làm đối tượng trong các thí nghiệm của nghiên cứu này. Đây là loài nghi
ngờ mới xuất hiện tại Việt Nam đã gây hại nghiêm trọng đến nền nông nghiệp ở nước
ta và là một trong những đối tượng kiểm dịch thực vật hàng đầu ở nhiều quốc gia có
thị trường tiêu thụ lớn.
2.2. Các phương pháp nghiên cứu về ruồi đục quả
Nhiều nghiên cứu đã cung cấp một số phương pháp định danh ruồi đục quả thuộc
phức hợp B. dorsalis gồm có phương pháp truyền thống dựa vào đặc điểm hình thái và
phương pháp sinh học phân tử.
2.2.1. Dựa vào đặc điểm hình thái
Để định danh theo phương pháp truyền thống người ta có thể dựa vào những đặc
điểm hình thái đặc trưng như hình dạng, màu sắc của vân cánh, mảnh lưng ngực, các
đốt chân, đặc điểm trên các đốt bụng, kích thước ống đẻ trứng ở con cái, chiều dài thể
giao cấu hoặc phân tích lớp vỏ hydrocarbon. Ngoài ra, ruồi đục quả còn được xác định

6


dựa vào chất dẫn dụ con đực bao gồm methyl eugenol và cue lure. Nhiều nghiên cứu
đã kết hợp nhiều yếu tố để cho kết quả định danh chính xác hơn. Tuy nhiên, phương

pháp này cũng gặp nhiều khó khăn do một số loài trong phức hợp B. dorsalis có hình
thái rất giống nhau.
2.2.2. Dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử
Một số kỹ thuật sinh học phân tử đã được sử dụng để đạt được độ chính xác cao
hơn so với phương pháp truyền thống. Kỹ thuật PCR và PCR-RFLP trên một số vùng
gen đã được tiến hành và thu được một số kết quả đáng kể. Các vùng gen được sử
dụng chủ yếu là vùng DNA mã hóa ribosome, 18S+ITS1, ITS1, ITS2 và một số vùng
gen trên mtDNA như D-loop+12S, 16S…Gần đây, kỹ thuật EPIC (exon primed intron
crossing)-RFLP phát triển trên cơ sở phương pháp kiểm tra microarray cũng đã được
sử dụng (Anthony R. Clarke và ctv, 2005). Việc xác định trình tự DNA kết hợp với
các phương pháp sinh tin học là hướng phát triển mới hứa hẹn để định danh chính xác
ruồi đục quả (Korneyev, 1999).
2.3. Tổng quan về DNA ty thể
2.3.1. DNA ty thể

Hình 2.3 Cấu tạo mtDNA dạng vòng (Sutovsky và ctv, 1999).
Ở động vật, vật liệu di truyền có trong nhân và một số ít trong ty thể. Do ty thể
nằm trong tế bào chất của giao tử cái (trứng) vì thế các gen trên DNA ty thể (mtDNA)
tuân theo quy luật di truyền theo tế bào chất (Birky và cộng sự, 1989). MtDNA ít bị
tác động của môi trường nên ít bị biến dị di truyền (Spinger và Douzery, 1996). Theo

7


Desalle và ctv (1987), ở côn trùng, sự thay thế các nucleotide thường xảy ra trên các
gen ty thể. Đó là sự đồng hoán và dị hoán (Derancourt và ctv, 1967; Brown và ctv,
1979). Tỉ lệ đồng hoán (transition) nhanh hơn 17 lần so với tỉ lệ dị hoán (transversion)
(Kondo và ctv, 1993; Simon và ctv, 1994). Tuy là vùng biến động nhưng những vùng
gen trên ty thể vẫn bảo tồn ở cấp độ loài. Dựa vào những đặc điểm nêu trên, mtDNA
được ứng dụng rộng rãi trong các kỹ thuật sinh học phân tử. Đặc biệt là vùng mã hóa

các phân tử ribosomal RNA (16S rRNA và 12S rRNA) rất được quan tâm ứng dụng
phục vụ công tác nghiên cứu sự phát sinh và định danh loài do chúng có tính bảo tồn
cao, kích thước vừa phải thuận lợi cho việc phân lập, giải trình tự và phân tích trình
tự vật liệu di truyền.
Ngày nay, DNA ty thể được sử dụng nhiều trong định danh một số loại côn trùng.
Nhiều nhà khoa học tiến hành xem xét mối quan hệ giữa các loài thông qua việc giải
trình tự một số gen trên DNA ty thể (Smith và ctv, 2003; Muraji và Nakahara,
2001;…). Các gen thường được sử dụng là gen 16S rRNA. Một số lượng lớn các loài
đã được xác định dựa vào phương pháp giải trình tự gen trên mtDNA như các loài
trong họ Tephrididae (Han và ctv, 2002), Bactrocera spp. (Muraji và Nakahara, 2001,
2002), phức hợp B. dorsalis (Muraji và ctv, 2008), Acidiella spp. (Han và Ro, 2002);…
Tuy nhiên chỉ có một vùng ngắn của mtDNA được dùng để nghiên cứu giải trình tự
(Han và McPheron, 1997). Do vậy, quan hệ giữa các loài vẫn chưa được xác định và
tìm hiểu được hoàn toàn.
2.3.2. Gen 16S rRNA - thước đo tiến hóa
Từ năm 1967, Zuckerkand và Pauling đã đưa ra ý kiến cho rằng các phân tử sinh
học có thể là “tài liệu của lịch sử tiến hoá” hay “thước đo tiến hoá”. Để là một thước
đo tiến hóa, phân tử được chọn phải có các đặc điểm sau: phân tử phải có mặt ở tất cả
các sinh vật khảo sát, không được truyền qua lại giữa các loài, trình tự của phân tử này
phải có độ bảo tồn và biến động thích hợp trong khoảng cách tiến hóa khảo sát và có
kích thước đủ lớn để chứa nhiều thông tin. Mặc dù các tRNA có mặt ở hầu hết các vi
sinh vật nhưng chúng không được chọn làm thước đo tiến hóa do có kích thước quá
nhỏ (khoảng 75 ribonucleotide).
Năm 1977, Woese và ctv đã xác định 16S rRNA là phân tử rất thích hợp làm
thước đo tiến hóa. 16S rRNA là phân tử cổ, là thành phần của bộ máy tổng hợp protein
có từ lâu đời. Hơn nữa, các rRNA là những phân tử có chức năng không thay đổi, phân

8

bố ở hầu hết các hệ thống sống và có độ bảo tồn vừa phải cho phép phản ánh sự liên
quan tiến hóa giữa các loài sinh vật.
Ba loại rRNA là thành phần của ribosome đều có một số tính chất để có thể
được chọn làm thước đo tiến hóa. Tuy nhiên, 5S rRNA có kích thước quá nhỏ (khoảng
120 ribonucleotide), mang ít thông tin của quá trình tiến hóa nên ít được chọn. 23S
rRNA là phân tử lớn (có khoảng 2900 ribonucleotide), có đầy đủ các tính chất để có
thể làm thước đo tiến hóa. Tuy nhiên, kích thước của 23S rRNA lớn nên thao tác
nghiên cứu trên phân tử này không thuận lợi lắm. Phân tử 16S rRNA có kích thước
vừa phải, khoảng 1500 ribonucleotide, thuận lợi cho các thao tác nghiên cứu nên hiện
nay, phân tử này được coi như “tiêu chuẩn vàng” cho phân loại học. Tuy nhiên, RNA
đòi hỏi phải rất cẩn trọng trong thao tác do dễ bị phân hủy nên khuynh hướng hiện nay
là sử dụng gen mã hóa cho RNA trong các nghiên cứu.
Tuy là những vùng biến động, nhưng những vùng này lại là những vùng bảo tồn
ở cấp độ loài. Sự bảo tồn và biến động ở các cấp độ khác nhau đã giúp cho gen 16S
rRNA luôn là sự lựa chọn đầu tiên của các nhà nghiên cứu khi tiến hành định danh vi
khuẩn hay xác định mối quan hệ họ hàng giữa hai hay nhiều loài vi khuẩn. Cho đến
nay, số lượng các gen 16S rRNA đã được giải trình tự lên đến hơn 10000. Điều này
cho thấy có sự quan tâm rất lớn của các nhà khoa học đến đối tượng này.
2.3.3. Cytochrome oxidase II
Cytochrome oxidase II (COII) là một phần thuộc DNA ty thể. Theo Simon và
ctv (1994), chúng tôi sử dụng cytochrome oxidase II trên vùng DNA ty thể để xây
dựng phả hệ phân tử dựa vào nhiều yếu tố.
- DNA ty thể ở côn trùng là duy nhất, di truyền theo dòng mẹ (Harrison, 1989).
- Trình tự nucleotide COII đã được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về phả
hệ phân tử ở côn trùng (Willis và ctv, 1992; Liu và Beckenbach, 1992; Beckenbach và
ctv, 1993; Brown và ctv, 1994; Brower, 1994a; Sperling và Hickey, 1994; Simon và
ctv, 1994) cung cấp nền tảng cho hệ thống so sánh.
- Sự tiến hoá của COII đã được nghiên cứu trong sắp xếp vị trí các sinh vật khác
nhau từ sinh vật tiền nhân đến thực vật và cả động vật có xương sống, và quan hệ cấu
trúc trong protein COII đã được thể hiện (Saraste, 1990).

9


2.4. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về Bactrocera spp
2.4.1. Nghiên cứu trong nước
Nguyễn Thị Chắt và Huỳnh Trí Đức (2004) thuộc Khoa Nông học, Đại học
Nông Lâm Tp.HCM đã nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh học và kí chủ ruồi
đục quả B. correcta (Bezz) trên địa bàn một số tỉnh phía Nam năm 2001-2002 cho
thấy vòng đời của của B. correcta khoảng 22,7 ngày và có phổ kí chủ rộng khoảng 15
loài cây trồng.

a

c

b

d

Hình 2.4 Ruồi đục quả Bactrocera correcta (Bezz).
(a) bụng ruồi; (b) ruồi đục quả B.correcta; (c) ngực ruồi; (d)
cánh ruồi. (Nguyễn Thị Chắt và Huỳnh Trí Đức, 2002).

Nguyễn Hữu Đạt và Nguyễn Văn Tuất (2007) đã tiến hành nghiên cứu so sánh
khả năng chịu nhiệt của các pha phát triển tiến hoá nhộng của ba loài ruồi đục quả phổ
biến ở miền Nam B. dorsalis, B. correcta, B. cucurbitae và thử nghiệm phương pháp
sử dụng hơi nóng xử lý ruồi đục quả B. dorsalis (Hendel) hại xoài sau thu hoạch. Kết
quả đạt được là thông số nhiệt độ xử lý ruồi đục quả B. dorsalis (Hendel) trên xoài
bằng không khí nóng là 46,50C trong vòng 20 phút.

Tuy nhiên, hiện nay trong nước những nghiên cứu phân tử về loài ruồi đục quả
chưa được thực hiện nhiều. Do đó, cần có nhiều nghiên cứu để đi sâu vào tìm hiểu về
genome của các loài ruồi đục quả này tạo cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu sau.
2.4.2. Nghiên cứu ngoài nước
Drew (1989) đưa ra sự phân loại giống phụ Bactrocera căn cứ vào việc có hay
không sự thay đổi trong phân tử DNA ở các hình thái biểu hiện. Drew phân chia loài

10


Bactrocera

thành

4

nhóm gồm Bactrocera,

Queenslandacus,

Zeugodacus,

Melanodacus. Sự phân loại các nhóm này dựa trên hai đặc điểm biểu hiện của con đực
với chất dẫn dụ, hình thái ở đốt bụng thứ 5 và kích thước của ống đẻ trứng. Sự phân
loại này đã không phản ánh được lịch sử tiến hoá của giống ở mức độ cần thiết.
Mặc dù, Drew và Hancock (1994) đã mô tả được 52 loài (gồm 40 loài mới) trong
phức hợp B. dorsalis ở Châu Á, sự khó khăn trong việc nhận dạng vẫn còn tồn tại
trong viêc định danh 5 loài có giá trị kinh tế quan trọng là B. philippinensis (Drew và
Hancock), B. occipitalis (Bezzi), B. carambolae (Drew và Hancock), B. papayae
(Drew và Hancock), B. dorsalis (Hendel). Điểm chủ yếu phân biệt các loài này là hình

dạng vệt đen trên đốm bụng. Tuy nhiên, đặc điểm này thường bị biến đổi và có giá trị
trung bình trong sự phân biệt giữa các loài. Iwaizumi và ctv (1997) và Iwahashi (2001)
cũng đã nghiên cứu phức hợp này ở Thái Lan dựa vào chiều dài thể giao cấu và hình
dạng của vân cánh.
Drew (2007) đã nghiên cứu phức hợp B. dorsalis ở vùng Đông Nam Á dựa vào
sự chuyển tiếp về hình thái và quan niệm loài về sinh học. Đây là khoá phân loại khá
chính xác và rõ ràng. Các hình thái biểu hiện khác nhau dùng để nhận dạng các loài
thể hiện chủ yếu ở hình dạng đường vân cánh, chân và đốm bụng ở đốt III-V trên mặt
lưng bụng ruồi đục quả.
White (2000) đã phân tích số lượng các nhánh trong cây phả hệ của các tiểu quần
thể của loài Bactrocera dựa vào sự biểu hiện hình thái. White (2000) đã nghiên cứu 37
hình thái từ 51 loài quan trọng về mặt kinh tế, đại diện có 9 giống phụ Bactrocera. Sự
phân tích cho rằng Bactrocera là loài á huyết thống. Sự đề xuất của White (2000) về
hệ thống phát sinh loài tuy còn hạn chế, chưa có sự chắc chắn trong sự phân chia các
loài, tăng thêm sự nghi ngờ về hệ thống phân loại của Drew (1989), Drew và Hancock
(2000) và cần có sự nghiên cứu xa hơn dựa trên các biểu hiện độc lập như giải trình tự
DNA và phân tích hệ thống phát sinh loài một cách chặt chẽ hơn. Mặc dù, dữ liệu về
nucleotide đã được sử dụng để nghiên cứu mối quan hệ trong sự phát sinh loài của các
loài côn trùng khác quan trọng về mặt kinh tế (ví dụ: Anastrepha và Rhagoletis), gần
đây một số nghiên cứu xa hơn về sinh học phân tử trong sự phát sinh loài mới được
công bố trên các loài ruồi đục quả Bactrocera.
Muraji và Nakahara (2001) lần đầu tiên giải trình tự DNA ty thể (16S rRNA +
12S rRNA; ~1600 bp) để nghiên cứu sự tiến hóa của Bactrocera. Nghiên cứu được

11


thực hiện trên 18 loài Bactrocera từ 4 giống phụ và đã cho thấy rằng B. (Bactrocera )
là á huyết thống (các loài bắt nguồn từ một tổ tiên chung nhưng không bao gồm tất cả
các con cháu của cùng một tổ tiên chung) và B. (Zeugodacus) là cùng một dạng tổ tiên.

Takao Ebina và Kenji Ohto (2006) đã nghiên cứu các biểu hiện hình thái và các
marker PCR – RFLP trong các thể lai khác loài giữa B. carambolae và B. papayae
thuộc phức hợp B. dorsalis.
Ngoài ra, tính trạng quan tâm của Bactrocera và Dacus là sự thu hút bằng chất
hoá học. Chất thường dùng là Methyl-eugenol (4-allyl-1,2-dimethoxybenzene) và cuelure 4 (p-acet-oxyphenyl)-2-butanone (White, 2000). Các loài trong nhóm Bactrocera
được thu hút bằng methyl-eugenol hoặc cue-lure, trong khi hầu hết các loài trong
nhóm Zeugodacus và Dacus được thu hút với cue-lure (White và Hancock, 1997). Xây
dựng cây phả hệ tốt có thể giúp ta hiểu rõ hơn sự tiến hóa trong cách đáp ứng với chất
dẫn dụ của loài Bactrocera (Smith và ctv, 2002). Suk- Ling Wee và Keng-Hong Tan
(2007) đã tiến hành nghiên cứu thời gian tích lũy các chất phenylpropanoid trong cơ
thể ruồi đục quả đực B. dorsalis và B. carambolae sau khi sử dụng methyl eugenol để
phân biệt hai loài ruồi đục quả này.
2.5. Polymerase Chain Reaction (PCR)
2.5.1. Khái niệm
Đây là phương pháp nhằm khuếch đại một đoạn phân tử DNA nào đó một cách
đặc hiệu in vitro nhờ sự xúc tác của enzyme Taq polymerase từ một lượng DNA mẫu
rất nhỏ. Đây là một kỹ thuật trong sinh học phân tử để tạo dòng DNA rất đơn giản và
hiệu quả. Bằng kỹ thuật PCR, hàng triệu đoạn DNA đặc hiệu và đồng nhất sẽ được thu
nhận từ DNA mẫu.
2.5.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR
Phản ứng PCR được thực hiện qua 25 - 35 chu kỳ. Mỗi chu kỳ bao gồm các
bước: denature (biến tính DNA), annealing (gắn mồi), extension (kéo dài).
- Biến tính: 94 - 960C, thời gian dài ngắn tùy theo độ dài DNA mẫu. Đây là bước
làm biến tính DNA mẫu từ sợi kép thành sợi đơn.
- Bắt cặp: 50 – 600C, 30 giây. Đây là bước primer gắn đặc hiệu vào sợi DNA đích
(sợi đơn). Nhiệt độ trong bước này tùy thuộc vào độ dài của cặp primer.
- Kéo dài: 720C, 60 – 90 giây. Đây là bước kéo dài primer nhờ hoạt động của Taq
polymerase. Nhiệt độ 720C là tối ưu cho hoạt động của Taq polymerase.

12

- Sau 25 - 35 chu kỳ, tiếp tục ủ ở 720C trong 5 - 15 phút để hoàn thiện các sản phẩm PCR.
2.5.3. Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR
- DNA mẫu: có thể là DNA, mRNA, cDNA, plasmid, phage từ động vật, thực vật,
nấm, vi khuẩn. Kết quả PCR tốt nhất khi DNA mẫu tinh sạch nhất và với dung lượng
thích hợp. Khi DNA tinh khiết, lượng DNA được tính theo công thức :
1 OD260nm = 50 ng/l (đối với DNA sợi kép) = 40 ng/l (đối với DNA sợi đơn).
- Primer (mồi): là một đoạn acid nucleic có trình tự liên kết đặc hiệu với đoạn DNA
cần khuếch đại. Phản ứng PCR sử dụng một cặp primer đặc hiệu bao gồm F-primer
(mồi xuôi) và R-primer (mồi ngược). Cặp primer quyết định sự thành công của kỹ thuật
PCR. Nếu primer được thiết kế đúng thì đoạn DNA đích sẽ được khuếch đại chính xác.
- dNTPs: dATP, dCTP, dTTP, dGTP được sử dụng với nồng độ như nhau.
- Dung dịch buffer: Tạo môi trường thuận lợi nhất để Taq polymerase hoạt động.
- Taq polymerase: ban đầu, khi chưa sử dụng loại enzyme Taq - polymerase người ta
phải thêm DNA polymerase trong từng chu kỳ nhân bản, vì DNA polymerase cần cho
quá trình tổng hợp DNA không chịu được nhiệt độ lớn hơn 900C ở giai đoạn biến tính
của DNA. Năm 1988 người ta phát hiện được loại Taq polymerase, một DNA
polymerase bền với nhiệt, được cô lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối
nước nóng, với enzyme này chỉ cần cho một lần Taq polymerase là đủ.
- Ion kim loại Mg++: Tạo điều kiện thuận lợi cho Taq polymerase hoạt động.
2.5.4. Ứng dụng của kỹ thuật PCR
Hiện nay, thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử, với
nhiều ứng dụng trong sinh học, trong y khoa, trong nông nghiệp …Trong nghiên cứu
genomic có nhân bản vô tính với PCR, recombinant PCR, multiplex PCR …Trong
nghiên cứu y học thì dùng để phát hiện, chẩn đoán được nhiều loại bệnh do virus, vi
khuẩn, ký sinh trùng … gây ra. Trong nông nghiệp dùng để chọn lọc giống cây trồng
nhờ DNA marker (MAS), kiểm tra kết quả chuyển gen …
2.5.5. Ưu và nhược điểm của kỹ thuật PCR
- Ưu điểm: Cho kết quả nhanh, nhạy, thực hiện được với một lượng nhỏ DNA.

- Nhược điểm: Do quá nhạy nên kỹ thuật PCR có thể cho kết quả dương tính giả.
Trong một số trường hợp vi sinh vật gây bệnh đã chết hoặc chưa đủ lượng gây bệnh thì
phản ứng PCR vẫn cho kết quả dương tính.

13


2.6. Phương pháp xây dựng cây phả hệ
2.6.1. Khái niệm
Cây phả hệ là một đồ thị minh họa cho mối quan hệ và nguồn gốc tiến hoá của
các loài thể hiện thông qua hệ thống nhánh và điểm. Khoảng cách di truyền thể hiện sự
khác nhau của các loài do đột biến hay sự phân ly di truyền trong quá trình tiến hoá.
2.6.2. Nguyên tắc phân tích phả hệ
- Hầu hết các sinh vật đều có nguồn gốc phức tạp.
- Một phần của bộ gen là do bố mẹ truyền lại theo chu kỳ sinh sản bình thường.
- Một phần khác của bộ gen được hình thành theo kiểu chuyển vật liệu di truyền ngang
giữa các loài sinh vật với nhau có thể thông qua virus, tải nạp DNA hay cộng sinh,…
- Lịch sử tiến hoá của một gen sẽ không xảy ra đồng thời với lịch sử tiến hoá của gen
khác hay chính sinh vật chứa gen đó.
2.6.3. Một số loại cây phả hệ
- Cladogram có chiều dài nhánh bằng nhau và chỉ biểu hiện mối quan hệ.
- Phylogram có chiều dài tỉ lệ với sự thay đổi (tiến hoá) hay khoảng cách tiến hoá.
- Cây có gốc chỉ có 1 điểm gốc với một con đường duy nhất để dẫn tới những điểm khác.
- Cây không gốc chỉ nêu lên được mối quan hệ giữa các OTUs (đơn vị tiến hoá)
nhưng không chỉ ra được con đường tiến hoá. Cây không gốc có thể chuyển thành cây
có gốc bằng cách sử dụng một OTU outgroup (OTU đã được khảo cổ sinh vật học
chứng minh là đã tách nhóm sớm hơn những OTU còn lại).

14

Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện
Đề tài được thực hiện từ tháng 02/2009 đến 7/2009 tại phòng thí nghiệm Trung
tâm kiểm dịch thực vật sau nhập khẩu II.
3.2. Đối tượng nghiên cứu
Ruồi đục quả nghi ngờ là Bactrocera carambolae được thu trực tiếp từ các vườn
trái cây tại một số tỉnh miền Nam Việt Nam và ruồi đục quả nuôi thuần chủng qua 4
thế hệ trong phòng thí nghiệm. Ký hiệu tên mẫu là B-xx-09-yy với B là Bactrocera, xx
là tỉnh thu nhận mẫu, 09 là năm 2009, yy là thứ tự của mẫu.
3.3. Vật liệu và hoá chất
3.3.1. Thiết bị
- Máy ly tâm (Eppendorf)

- Máy vi tính

- Máy luân nhiệt (Eppendorf - Mastercycle gradient)

- Cân điện tử

- Lò vi sóng

- Tủ mát (nhiệt độ 2 - 80C)

- Bộ điện di (Consort)

- Tủ lạnh - 200C và - 800C

- Máy đọc gel bằng tia UV (UVP)

(Reetech, Brandt, Sanyo)

- Máy ảnh kỹ thuật số (Canon)
- Bồn ủ nhiệt
3.3.2. Dụng cụ
Eppendorf (1,5 ml, 0,2 ml), micropipette các loại, đầu tube các loại, ống đong.
3.3.3. Hoá chất
- Hoá chất ly trích DNA: nitơ lỏng, đệm ly trích (20mM EDTA, 100mM TrisHCl, pH 8.0), 10% SDS, proteinase K 20 mg/ml, 100% ethanol lạnh, 70% ethanol
lạnh, dung dịch TE 1X (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0), phenol, chloroform.
- Hoá chất dùng trong điện di: dung dịch TAE 0,5X, dung dịch nạp mẫu loading
dye, ethidium bromide 10mg/ml và agarose (Sigma).
- Hoá chất dùng trong phản ứng PCR: Taq polymerase 5U/µl, buffer 10X, MgCl2
25mM, dNTP’s 10mM (Bio-rad), primer (Sigma), iQ super mix (Bio-rad) (100 mM KCl, 40
mM Tris-HCl, pH 8.4, 1.6 mM dNTPs, iTaq DNA polymerase 50 units/ml, 6 mM MgCl2).

15