Khảo sát khả năng tạo sẹo và tái sinh chồi in vitro của mẫu cấy cây hoa lài (Jasminum sambac)

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO SẸO VÀ TÁI SINH CHỒI
IN VITRO CỦA MẪU CẤY CÂY HOA LÀI
(Jasmine sambac)

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: ĐIỀN THỊ TUYẾT NHUNG

Niên khóa

: 2005 – 2009

Tháng 08/2009


BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO SẸO VÀ TÁI SINH CHỒI
IN VITRO CỦA MẪU CẤY CÂY HOA LÀI
(Jasmine sambac)

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. NGUYỄN THỊ KIM LINH

ĐIỀN THỊ TUYẾT NHUNG

Tháng 08/2009
ii


LỜI CẢM ƠN
Để đi được đến chặng đường này có lẽ phải kể đến công ơn dưỡng dục to lớn
của Pá và Mẹ tôi. Những người đã không ngại khó khăn, gian khổ nuôi dạy tôi thành
người. Con xin gửi lời cám ơn từ tận đáy lòng đến Pá và Mẹ.
Em cũng xin cảm ơn đến tất cả quý thầy cô tại trường Đại học Nông Lâm
Thành phố Hồ Chí Minh đã truyền đạt những kinh nghiệm và kiến thức quý báu làm
hành trang mà em mang theo suốt cuộc đời.
Em xin cảm ơn thầy TS. Lê Đình Đôn đã cho phép em được tiến hành đề tài tại
Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Cám ơn
thầy vì những kiến thức thầy truyền đạt, những quan tâm, lo lắng, hỗ trợ sinh viên
chúng em trong giai đoạn khó khăn ở giai đoạn cuối của Đại Học.
Bên cạnh đó, để hoàn thành được luận văn này cũng có phần đóng góp không
nhỏ của cô ThS. Nguyễn Thị Kim Linh. Em xin gửi lời cám ơn chân thành đến cô. Cô
đã rất nhiệt tình giúp đỡ em trong quá trình học hỏi các thao tác tại phòng thí nghiệm,

trong thời gian làm luận văn. Em xin cám ơn cô vì tất cả, những kiến thức, kinh
nghiệm cô truyền đạt, những quan tâm, hỗ trợ em để em hoàn thành tốt khóa luận tốt
nghiệp này.
Em cũng xin cám ơn chị KS. Tô Thị Nhã Trầm vì những hướng dẫn, gợi ý, kinh
nghiệm chị đã truyền đạt cho em trong suốt thời gian từ khi em vừa tham gia nghiên
cứu tại phòng thí nghiệm của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm
Thành phố Hồ Chí Minh. Xin cám ơn anh Trung đã hỗ trợ em mẫu lài để em có vật
liệu tiến hành thí nghiệm. Cám ơn các thầy cô, anh chị trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh
Học, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ em trong quá trình làm
đề tài
Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn chân thành đến Trần Thế Anh Khoa và Đào Hoa
Viên, hai người bạn rất thân đã hỗ trợ tôi rất nhiều về mặt tinh thần , luôn bên cạnh tôi
trong những lúc khó khăn nhất trong suốt quá trình học Đại học.

iii


TÓM TẮT
Tên đề tài: “Khảo sát khả năng tạo sẹo và tái sinh chồi in vitro của mẫu cấy cây
hoa lài (Jasminum sambac)”. Đề tài được tiến hành tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô
Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Nông Lâm, Thành phố Hồ Chí Minh từ
17/02/2009 đến 15/07/2009.
Lài là loài thân bụi thường được thấy ở những vùng ấm áp trên thế giới. Mùi
hương của lài được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp nước hoa, mỹ phẩm và trong
y học. Ở Việt Nam, lài đã được trồng từ nhiều năm nay nhưng chúng ngày càng bị
thoái hóa giống. Vì thế chúng tôi nghiên cứu đến khả năng tạo seo và tái sinh chồi của
cây hoa lài Jasmine sambac.
Ở thí nghiệm khảo sát thời gian nồng độ Javel và thời gian khử trùng mẫu đến
khả năng sống và sinh trưởng của mẫu. Sau thí nghiệm chúng tôi nhận thấy nồng độ
Javel 30 % với thời gian khử trùng trong 20 phút là thích hợp cho việc khử trùng mẫu

lá cây hoa lài.
Và môi trường MS có bổ sung 1mg/l 2,4-D kết hợp với việc nuôi cấy trung
gian trong môi trường MS có chứa 1,5% đường trong 3 tuần là thích hợp cho hình
thành mô sẹo từ lá cây hoa lài. Còn sự hình thành mô sẹo ở đoạn thân cây hoa lài, môi
trường MS có bổ sung 0,2 mg/l BA và 1 mg/l NAA là thích hợp cho hình thành mô
sẹo.
Đối với ảnh hưởng các chất kích thích sinh trưởng BA và NAA lên sự nảy chồi
từ đoạn thân mang chồi nách thì chồi nách chưa hình thành sau 8 tuần nuôi cấy trên
môi trường MS.
Khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng BA và TDZ lên sự cảm
ứng lên chồi từ mô sẹo. Sau khi quan sát dưới kính hiển vi, chúng tôi nhận thấy mô
sẹo ở giai đoạn phôi hình cầu nhưng chưa thấy chồi xuất hiện. Sau khi thực hiện đế tài
chúng tôi nhận thấy nồng độ auxin nội sinh của cây hoa lài Jasmine sambac là khá cao
vì thế cần lưu ý đến vấn đề trên khi nghiên cứu giống lài này giống lài này.

iv


SUMMARY
Thesis titled “Investigation on the ability of callus formation and shoot
regeneration in vitro of Jasmine sambac explants”. The thesis was carried out at the
Department of Biotechnology, Nong lam University Ho Chi Minh City from 17th
February, 2009 to 15th July, 2009.
Jasmine sambac is a shrub, distributed in the warmer parts of the world. The
odour of jasmine flower is used widely in perfume, cosmetic industry and
pharmacological field. Jamine have been planted in Vietnam from many year.
However, they have been regenerated recently. Thus, we investigate the ability of
callus formation and shoot regeneration in vitro of Jasmine sambac explants. As a
result, we suceed in forming callus from the leaf and stem explants but forming shoots
is needed to study more.

In the investigating the Javel concentration for surface sterilization of the
explants and sterilize time for survival rate and development of explants experiment,
30% of Javel in 20 minutes is suitable for decontaminating the leaves explants of
Jasmine sambac.
Besides, the Jasmine leaf explants were cultured in Murashige and Skoog (MS)
medium with 1 mg/l of 2,4-D, then subcultured in MS containing 1,5% of sugar in 3
weeks is suitable for callus formation. And the callus formation from stem explants of
Jasmine sambac, the MS medium with 0,2 mg/l of BA and 1mg/l of NAA is suitable
for forming callus.
The shoot induction from nodal segment explants have not emerged in the
medium experiment after 8 weeks of culture.
Investigate the effect of BA and TDZ growth regulator on shoot induction from
callus. When observed in microscope, the calli are in globular stage but the shoots
haven’t been appeared yet. After carrying out the experiments, we recorded that the
endogenous auxin of the Jasmine sambac is fairly high. That is the important thing we
need to pay attention when doing other experiments.

v


MỤC LỤC
TRANG
Lời cảm ơn.............................................................................................................iii
Tóm tắt...................................................................................................................iv
Summary................................................................................................................v
Mục lục ..................................................................................................................vi
Danh sách các chữ viết tắt .....................................................................................viii
Danh sách các bảng ...............................................................................................ix
Danh sách các hình ................................................................................................x
Chương 1 MỞ ĐẦU.............................................................................................1

1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................1
1.2. Yêu cầu đề tài............................................................................................2
1.3. Giới hạn đề tài...........................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................3
2.1. Nguồn gốc và phân bố ..............................................................................3
2.2. Đặc điểm hình thái ....................................................................................4
2.3. Giá trị .......................................................................................................6
2.3.1. Giá trị kinh tế .........................................................................................6
2.3.2. Giá trị y học............................................................................................6
2.3.4. Giá trị sử dụng........................................................................................7
2.4. Nhân giống cây hoa lài bằng phương pháp giâm cành .............................8
2.4.1. Chọn giống và cách nhân giống.............................................................8
2.4.2. Chuẩn bị đất ...........................................................................................9
2.4.3. Chăm sóc................................................................................................9
2.5. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật................................................9
2.5.1. Khái niệm...............................................................................................9
2.5.2. Các phương pháp nhân giống vô tính in vitro ......................................9
2.6. Mô sẹo và sự hình thành mô sẹo từ các mô hay cơ quan thực vật ...........9
2.6.1. Mô sẹo....................................................................................................9
2.6.2. Sự sinh phôi từ tế bào soma ...................................................................10

vi


2.6.3. Sự hình thành chồi từ mô sẹo.................................................................10
2.7.1. Auxin ...............................................................................................................11
2.7.2. Cytokinin .........................................................................................................12

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........................14
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................14

3.2. Vật liệu......................................................................................................14
3.2.1. Vật liệu và điều kiện thí nghiệm ...........................................................14
3.2.2. Các thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật .............................14
3.2.3. Hóa chất .................................................................................................15
3.2.3.1. Thành phần môi trường MS (Murashige và Skook, 1962).................15
3.2.3.2. Các chất điều hòa sinh trưởng.............................................................15
3.2.3.3. Các hóa chất khác ...............................................................................15
3.2.4. Xử lý thống kê ..............................................................................................16
3.3. Phương pháp nghiên cứu ..........................................................................16
3.4. Nội dung nghiên cứu................................................................................16
3.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ Javel và thời gian khử trùng mẫu......16
3.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát tác động 2,4-D lên sự tạo sẹo từ lá cây lài ......18
3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát sự tạo sẹo từ đoạn thân của cây hoa lài...........19
3.4.4. Thí nghệm 3: Khảo sát sự nảy chồi từ đoạn thân mang chồi nách ........20
3.4.5. Thí nghệm 4: Khảo sát sự cảm ứng tạo chồi từ mô sẹo.........................22
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...........................................................23
4.1. Kết quả khử trùng mẫu cấy ban đầu .........................................................23
4.2. Kết quả thí nghiệm khảo sát sự tạo mô sẹo từ lá cây hoa lài....................24
4.3. Kết quả thí nghiệm khảo sát sự tạo sẹo từ đoạn thân cây hoa lài .............31
4.4. Kết quả thí nghiệm khảo sát sự nảy chồi từ đoạn thân mang chồi nách...34
4.5. Kết quả thí nghiệm khảo sát sự cảm ứng lên chồi từ mô sẹo ...................36
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .........................................................38
5.1. Kết luận .....................................................................................................38
5.2. Đề nghị......................................................................................................38
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................39
PHỤ LỤC........................................................................................................40

vii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D

: 2,4 – dichlorophenoxy acetic acid

2-iP (IPA) : N6-(2-isopentyl) adenin
N6-(Δ2-isopentyl) adenosine
6-(3methyl-2-butenylamino) purine
BAP (BA) : 6-benzylaminopurine
Benzyladenine
N-(phenylathyl)-1H-purine(e)-6-amine
IAA

: Auxin tự nhiên

IBA

: 1H – indol – 3 – buyric acid
: 3 – indolebutyric acid
: 4 – (indol – 3 – yl)butyric acid

Kinetin

: 6-furfurylaminopurine
N-(2-furfurylmethyl)-1H-purine(e)-6-amine

NAA

: 1 – naphthalene acetic acid

TDZ

: 1-phenyl-3-(1,2,3 thiadizol-5-yl)

Zeatin

: 4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenylaminopurin
6-(4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl)-aminopurine
2-methyl-4-(1H-purine-6-ylamino)-2 buten-1-ol

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng 3.1 Bảng mô tả thí nghiệm khử trùng mẫu ................................................... 16
Bảng 3.2 Bảng mô tả thí nghiệm nuôi cấy mô sẹo từ lá cây hoa lài...................... 18
Bảng 3.3 Bảng mô thí nghiệm nuôi cấy mô sẹo từ đoạn thân cây hoa lài............. 19
Bảng 3.4 Bảng mô tả thí nghiệm nuôi cấy đoạn thân mang chồi nách.................. 21
Bảng 3.5 Bảng mô tả thí nghiệm cảm ứng nảy chồi từ mô sẹo ............................. 22
Bảng 4.1 Kết quả khử trùng mẫu cấy ban đầu ....................................................... 23
Bảng 4.2 Kết quả về nuôi cấy mô sẹo từ mẫu lá cây lài sau 6 tuần nuôi cấy ...... 24
Bảng 4.3 Trọng lượng của mô sẹo từ mẫu lá cây hoa lài sau 6 tuần nuôi cấy...... 26
Bảng 4.4 Kết quả nuôi cấy mô sẹo từ đoạn thân cây lài sau 6 tuần nuôi cấy ....... 31
Bảng 4.5 Kết quả trọng lượng mô sẹo sau 6 tuần nuôi cấy .................................. 32

ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH

TRANG

Hình 2.1 Jasmine sambac ...................................................................................... 3
Hình 2.2 Một số loại giống lài thường được trồng ................................................ 5
Hình 2.3 Các sản phẩm từ tinh dầu hoa lài ............................................................ 8
Hình 4.1 Mô sẹo trong thí nghiệm 2 sau 2 tuần nuôi cấy..................................... 27
Hình 4.2 Mô sẹo trong thí nghiệm 2 sau 3 tuần nuôi cấy...................................... 27
Hình 4.3 Mô sẹo trong thí nghiệm 2 sau 6 tuần nuôi cấy...................................... 28
Hình 4.4 Mô sẹo trong thí nghiệm 2 sau 3 tuần nuôi cấy trung gian..................... 30
Hình 4.5 Mô sẹo trong thí nghiệm 3 sau 6 tuần nuôi cấy...................................... 33
Hình 4.6 Mô sẹo trên môi trường MS sau 2 tuần nuôi cấy trung gian .................. 34
Hình 4.7 Đoạn thân mang chồi nách trong thí nghiệm 3 sau 6 tuần nuôi cấy....... 35
Hình 4.8 Mặt cắt mô sẹo sau 8 tuần nuôi cấy ........................................................ 37

x


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Lài là loài thân bụi thường được thấy ở những vùng ấm áp trên thế giới. Lài
được phân bố ở những vùng trũng của xứ nhiệt đới, nhưng phần lớn lại tập trung xung
quanh vùng Himalayas, Trung Quốc và Malaysia. Khoảng 40 loài được tìm thấy ở Ấn
Độ. Nhưng chỉ có ba hoặc bốn loài có hoa tỏa hương được ứng dụng trong thương
mại, từ hoa tươi ly trích tinh dầu để sản xuất nước hoa (Ambasa, 1986; Chadha, 1978).

Chúng là J. auricularum, J .flexible, J. officinale và J. sambac.
Tinh chất của Jasmine sambac có mùi hương kéo dài và mạnh mẽ. Ở miền Nam
Ấn Độ, nó được gọi là “Ánh trăng của vườn hoa” hay “Vua của các loài hoa”.
Mùi hương của hoa lài là độc nhất vô nhị mà không có bất cứ chất hóa học tổng
hợp hay tinh chất ly trích từ thiên nhiên trước đó có thể thay thế được. Mùi hương của
lài đặc biệt quan trọng trong công nghiệp nước hoa và mỹ phẩm. Sabita Bhattacharya
và Shnghamitra Bhattacharyya (1996) đã nghiên cứu thành công phương pháp tái sinh
Jasmine officinale L. từ chồi nách.
Các nghiên cứu về lĩnh vực dược lý cho thấy hoạt tính kháng ung thư của dịch
chiết J.officinale trên ung thư biểu mô ở người (Dhar và cộng sự, 1988; Satyavati và
cộng sự, 1987). Các phần khác nhau của cây như lá, thân, vỏ và rễ cây cũng rất hữu
dụng và quan trọng trong công nghiệp dược phẩm. Tất cả đều chứa Manitol. Jasminum
grandiflorum có tính lợi tiểu và điều hòa kinh nguyệt. Dịch thu được từ lá cây xay
nhuyễn có thể đắp lên vết chai. Ngoài ra, có thể nhai lá của nó để làm dịu và trị các vết
loét trong miệng. Các lá đều chứa resin, acid salicylic và một alkaloid gọi là jasmine.
Dịch chiết từ lá cây lài cho thấy hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus
(Bhawasar và cộng sự, 1965).
Ngoài ra, Jasmine grandiflorum và Jasmine sambac là hai loại thường được sử
dụng rộng rãi ở Ấn Độ để trị rối loạn chức năng da. Đã có nhiều nghiên cứu về mùi
hương và tinh dầu hoa lài được tiến hành trên diện rộng nhưng các bài báo cáo có liên
quan đến kỹ thuật nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô lại rất ít (Jonard 1989;
Khoder và ctv, 1979)
1


Ở Việt Nam, lài được trồng nhiều tại các tỉnh miền Đông và Tây Nam Bộ (chủ
yếu là Jasmine sambac). Nhưng gần đây, giống lài này ngày càng thoái hóa nghiêm
trọng do người dân thiếu kỹ thuật chăm sóc, đất nhiễm phèn nặng, các nhà chức năng
thì chưa quan tâm, trong khi các nhà khoa học thì chưa có các nghiên cứu cụ thể để
phục tráng giống lài này. Trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu về nhiều giống

lài khác nhau nhưng riêng Jasmine sambac thì vẫn chưa được quan tâm. Vì thế tôi
thực hiện đề tài “Khảo sát khả năng tạo sẹo và tái sinh chồi in vitro của mẫu cấy cây
hoa lài (Jasminum sambac)”.
1.2. Yêu cầu đề tài
Trong đề tài này bước đầu khảo sát khả năng tái sinh từ các loại mẫu lá, thân và
chồi nách. Từ đó đề ra phương pháp tái sinh cây tối ưu nhằm tạo ra bộ giống để cải tạo
chất lượng giống lài có một bộ giống hoàn chỉnh làm cơ sở tạo cây chịu phèn, các
nghiên cứu về các hoạt chất thứ cấp và nhân giống cây hoa lài.
1.3. Nội dung thực hiện
Đề tài được tiến hành qua các giai đoạn:
 Tạo sẹo: mẫu mô sẹo được hình thành từ mẫu lá và mẫu thân cây hoa lài.
 Cảm ứng tạo chồi: từ đoạn thân mang chồi nách và từ mô sẹo đã tạo được ở các
thí nghiệm trước.
 Giải phẫu mô sẹo: quan sát mẫu mô sẹo dưới kính hiển vi với độ phóng đại
40x10 sau 8 tuần nuôi cấy trong môi trường cảm ứng tạo chồi.
1.4. Giới hạn đề tài
Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn nên chúng tôi chưa thực hiện được các thí
nghiệm nhân nhanh chồi và tạo cây hoàn chỉnh.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Nguồn gốc và phân bố
Cây hoa lài thuộc :
Ngành ngọc lan: Magnoliophyta
Lớp ngọc lan : Magnoliposida
Bộ

: Lamiales

Họ

: Oleaceae

Giống

: Jasminium
Hình 2.1 Jasmine sambac - Trại thực
nghiệm Đại học Nông Lâm, Thành phố
Hồ Chí Minh .

Cây hoa lài (Jasminum sp.) với khoảng 200 loài sống chủ yếu ở vùng nhiệt đới
và những vùng có khí hậu ẩm thuộc Châu Âu, Chấu Á, Châu Phi. Phần lớn loài này
sinh trưởng theo dạng dây leo trên cây hoặc các giá thể khác.
Ở Việt Nam, cây hoa lài đã có mặt hàng thế kỷ nay ở làng hoa Ngọc Hà (Hà
Nội), làng hoa Gò Vấp, Hóc Môn (Thành phố Hồ Chí Minh).
Ở miền Nam mước Pháp có hai loài là Jasminum officinale và Jasminum
grandiflorum. Jasminum officinale là loài lài hoang dại thường sống trên các vùng núi
cao, còn Jasminum grandiflorum thường được gọi là lài Tây Ban Nha, được trồng để
chiết xuất tinh dầu tự nhiên. Jasminum grandiflorum.đã có mặt ở vùng Grasse của
Pháp khoảng 200 năm, dùng để sản xuất nước hoa nổi tiếng thế giới.
Jasminum officinale mọc ở chân núi Himalayas và vùng đồng bằng Ganges,
được trồng thương mại ở vùng có khí hậu ôn hòa của Ấn Độ đặc biệt là Uttar Pradesh
và Andhra Pradesh. Đây là loài nổi tiếng ở Anh vì có hương thơm vô cùng quyến rũ.
Jasminum sambac L. Ait: tiểu mộc có thể trườn, nhánh có cạnh, có lông thưa, lá
có viền xoan, dày, ít hay không có lông, cuống ngắn. Phát hoa có 3-12 hoa, đài có tai
nhọn, rìa có lông, có khi không lông, vành thường đôi, hoa trắng, có hai tiểu nhụy.

3


Jasminum anodontum Gagn: dây leo, không lông, lá có phiến hình bầu dục,
thon dài 4-7 cm, lúc khô màu hoe, gân phụ rất mảnh, 3-4 cặp, mang 2-7 hoa ở nách lá
và ngọn nhánh (Phạm Hoàng Độ, 2003).
Trên thế giới cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu về việc tái sinh các giống
lài như tái sinh Jasmine officinale từ lá, thân và đỉnh sinh trưởng (Khoder va cộng sự,
1979), Nhân giống nhanh Jasmine officinale L. bằng phương pháp nuôi cấy chồi nách
(Sabita Bhattacharya và Shnghamitra Bhattacharyya, 1997), Nuôi cấy mô và phân tích
hóa sinh của Jasmine grandiflorum Linn ( K.Susuula Gomathi và ctv, 1999).
2.2. Đặc điểm hình thái
Lài là cây thân gỗ nhỏ thường thấy ở những vùng ấm áp trên thế giới thường
mọc thành bụi, có nhánh phát triển vươn dài tạo thành dây leo, thường cao 0,5 – 3m.
Lá bóng cả hai mặt, phiến lá hình bầu dục hơi trái xoan, mọc đối. Lá dài 3 – 7
cm, rộng 20 – 25 cm. Ở kẽ lá có gân phụ, mỗi bên 5 – 6 gân phụ, lồi ở giữa, cong đột
ngột ở mép, gân con hình mạng lưới (Trịnh Thị Phi Ly, 2005). Cây có ba lá chét (lá
kép) hay có hình lông chim với tối đa là chín lá chét.
Hoa trắng (một số giống có hoa vàng), mọc thành cụm ở nách lá hay ngọn cây,
có nhiều giống khác nhau, có hoa thơm nên cây hoa lài được trồng để lấy hoa ướp trà
(trà lài), ly trích tinh dầu làm nước hoa và trồng làm cảnh. Các giống lài trồng để lấy
hoa hiện nay chủ yếu có nguồn gốc ở Ấn Độ và Trung Quốc. Tràng hoa của hoa lài
thường có 5 – 6 thùy. Hoa có mùi hương nồng nàn và kéo dài. Cây thường nở hoa vào
mùa hè và mùa xuân.
2.3. Giá trị kinh tế, các tác dụng và ứng dụng của cây hoa lài
2.3.1. Giá trị kinh tế
Hiện nay, giá 01 kg hoa lài hơn 20.000 đồng, có lúc tăng đến hơn 100.000
đồng/kg. Theo tính toán của nông dân, cứ mỗi công đất trồng cây hoa lài thì một ngày
thu hoạch được gần 10 kg bông lài. Với mức giá 20.000 đồng/kg thì một công đất mỗi
ngày nông dân có nguồn lãi hơn 50.000 đồng. Do ngày nào cũng có thu nhập như thế

nên tính ra trong một năm, cây hoa lài cho hiệu quả kinh tế rất cao (Chu Trinh, 2007).
2.3.2. Giá trị y học
Hoa lài, còn gọi là hoa nhài. Theo y học cổ truyền thì loài hoa này có tính ấm,
có công dụng điều hòa chứa năng gan, mật, hệ tiêu hóa, giải cảm,…

4


Các nhà khoa học thuộc các trường đại học Wheeling Jesiut, Mỹ phát hiện rằng
nếu có một ít hương lài trong phòng ngủ, sẽ giúp cho người ta ngủ ngon hơn.
Tinh dầu hoa lài được dùng để sản xuất các loại nước hoa nổi tiếng đồng thời
dùng để pha trộn làm dầu massage hoặc pha loãng để tắm làm giảm căng thẳng thần
kinh, stress và trạng thái bồn chồn.
Tinh dầu hoa lài thích hợp với da khô, da nhờn, da bị kích thích, làm gia tăng
tính đàn hồi và thường làm căng những vết nhăn do sẹo.
Giải quyết các vần đề về hô hấp như xoa dịu cơn ho, tình trạng khan giọng,
viêm thanh quản, làm giảm sự đau nhức cơ và bong gân.
Dầu hoa nhài còn có tác dụng chữa đau và giúp tinh thần sảng khoái hơn, cụ thể
như: giúp làm giảm đau hay làm dịu cơn đau, chống nhiễm trùng, làm da sạch và mát,
giảm co thắt cơn ho hay bệnh ruột rút, cân bằng và giữ ổn định tinh thần, giải độc và
trấn tĩnh, giảm cảm xúc khi hồi hộp hay xúc động, mang đến sự thoải mái và yên tĩnh
cho cơ thể,…()
2.3.4. Giá trị sử dụng
Trong mỹ phẩm và nước hoa: chỉ có một số loại lài được dùng, các chủng lài
này được gọi là “thượng đẳng hoa” có mùi thơm ngọt, dịu dàng, quyến rũ và nồng nàn.
Hiện nay Ấn Độ và Ai Cập là hai đất nước sản xuất tinh dầu hoa nhài lớn nhất
thế giới. Ở miền Nam Ấn Độ, Jasmine sambac tiếp tục giữ vai trò cực kì quan trọng
trong lĩnh vực kinh doanh liên quan đến các loài hoa. Hoa lài được thu hái với số
lượng lớn và lượng tinh dầu mà nó tạo ra cực kì có giá trị, chuyên dùng trong các loại
nước hoa cao cấp như Channel Five, Joy,…(Shivaexports, 2008).

Trong hương trà: hoa lài được dùng trong sản xuất các loại trà lài, có mùi
hương đặc biệt.
Hoa lài ứng dụng trong sản xuất xà phòng, sữa dưỡng thể, dầu gội, thuốc trị
liệu,…có mùi thơm dịu và bền.
Hương hoa lài được ứng dụng tạo gạo hương lài, loại gạo duy nhất của Thái
Lan được Mỹ nhập khẩu. Khi nấu chín, nó sinh ra hương thơm ngát từ hoa lài
().
Ở Trung Quốc, Ấn Độ và Ai Cập đã sử dụng hoa lài làm thuốc chống suy
nhược thần kinh và chất kích thích. Người Hinhdu xâu thành vòng đeo vào cổ trong
các nghi thức tôn giáo (Trịnh Thị Phi Ly, 2005).
5


Jasminum officinal

Jasminum nudiflorum





Jasminum nitidum

Jasminum grandiflorum





Jasminum angulaire

Jasminum odoratissimum





Hình 2.2 Một số loại giống lài thường được trồng trên thế giới.

6


Gạo hương lài

Tinh dầu hoa lài





Nước hoa hương lài

Sữa dưỡng thể hương lài





Hình 2.3 Các sản phẩm từ tinh dầu hoa lài.

2.4. Nhân giống cây hoa lài bằng phương pháp giâm cành
2.4.1. Chọn giống và cách nhân giống
Chọn những bụi lài phát triển tốt, không sâu bệnh để làm giống, trên những dây
lươn bò ngang hoặc đứng, dùng dây sắc cắt xéo thành những hom dài 20-25 cm (3 đốt
lá). Sau khi cắt khoảng 3 – 4 giờ, mặt cắt đã se thì giâm hom vào bầu đất đựng trong
túi nilon 7 x 10cm, phía dưới đáy đục một số lỗ nhỏ để thoát nước.
Bầu đất để giâm hom gồm có đất mùn tơi xốp, trộn đều với phân chuồng mục
và tro trấu theo tỉ lệ 2 ÷ 1 ÷ 1. Giâm mỗi bầu một hom, cắt xéo cho hom ngập sâu 7 – 8
cm (chừa 2 đốt lá) rồi ém chặt đất. Sau đó xếp bầu thành từng luống dưới giàn che
nắng, tưới nước mỗi ngày 3 lần. Khi mầm nách dài 3 cm thì dỡ dần giàn che và tưới

7


mỗi ngày 1 lần. khi hom nhú mầm thì hòa loãng phân NPK (20 – 20 – 15) tưới mỗi
tuần 1 lần. Khi hom giâm được 3 – 3,5 tháng thì đem trồng.
Trong vòng 1 tuần sau khi trồng, tưới mỗi ngày 2 – 3 lần, sau đó mỗi ngày tưới
một lần, bảo đảm cho đất luôn ẩm. Khi cây trưởng thành, vào mùa khô khoảng 5 – 7
ngày tưới một lần, vào mùa mưa chỉ tưới bổ sung (Hai Quang, 2006).
2.5. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Thuật ngữ nuôi cấy mô tế bào thực vật được dùng một cách rộng rãi để nói về
việc nuôi cấy tất cả các phần của thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong điều kiện
vô trùng (Nguyễn Đức Lượng, 2003).
Hệ thống nhân giống vô tính và nuôi cấy mô bắt đầu với một mảnh nhỏ cây
trồng không bị nhiễm vi sinh vật đặt trong môi trường dinh dưỡng. Chồi mới hay
callus mà mẫu cấy này tạo ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền (Trần
Thị Dung, 2007).
Theo Trần Thị Dung (2007), có 4 phương pháp: nhân giống bằng sự tăng sinh
chồi nách, nhân giống qua nuôi cấy chồi đỉnh., nhân giống bằng chồi bất định hay phôi
vô tính trực tiếp trên mẫu cấy., nhân giống vô tính qua nuôi cấy callus để phát sinh

chồi bất định hay phôi vô tính.
2.6. Mô sẹo và sự hình thành mô sẹo từ các mô hay cơ quan thực vật
2.6.1. Mô sẹo
Mô sẹo là khối tế bào phát sinh vô tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan
đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý các chất điều hòa sinh
trưởng thực vật,…) (Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2003). Các tế bào thuộc
các mô hoặc các cơ quan này, trừ các tế bào của mô phân sinh, phải chịu một sự phản
phân hóa có vai trò trước lần phân chia đầu tiên (Halperin, 1969). Sự phản phân hóa
rất quan trọng , nó cho phép một tế bào đã trưởng thành trở lại trạng thái trẻ (trẻ hóa).
Sự trẻ hóa giúp tế bào tái lập khả năng phân chia và tạo phôi soma trong điều kiện
thích hợp (Pierik,1987).
Các tế bào thuộc các mô hoặc cơ quan đã phân hóa của các cây song tử diệp
thường phản phân hóa dưới tác động cả auxin (riêng rẽ hay kết hợp với một cytokinin)
để cho ra mô sẹo. Mô sẹo được tạo ra ngoài nguyên nhân do các tế bào nhu mô chịu sự
phản phân hóa còn do sự phân chia các tế bào tượng tầng, sự xáo trộn trong các mô
phân sinh sơ khởi hay sư xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan (Hunault,1979).
8


2.6.2. Sự sinh phôi từ tế bào soma
Sự sinh phôi từ tế bào soma là một quá trình, qua đó một hay vài tế bào soma,
trong các điều kiện thực nghiệm (bao gồm việc sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng
thực vật), có thể dấn thân vào một sự phân chia theo một trật tự nhất định để cho một
phôi hay gần giống như kiểu sinh phôi từ hợp tử (Bùi Trang Việt, 1994).
Sự sinh phôi từ tế bào soma phải trải qua hai giai đoạn:
1. Mô được nuôi trong môi trường có auxin sẽ tăng sinh nhanh, các tế bào trong
môi trường này sẽ bị khử phân hóa (không còn ở trạng thái phân hóa) và mất
tính hữu cực.
2. Mô sẹo ở giai đoạn 1 sẽ được chuyển vào trong môi trường có ít hoặc không ó
auxin, trong môi trường này tình hữu cực và sự sinh phôi được cảm ứng với

trạng thái phôi từ hình cầu đến trạng thái hình trái tim và trạng thái hình cá đuối
(Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2003).
2.6.3. Sự hình thành chồi từ mô sẹo
Sự phát sinh cơ quan từ mô sẹo tương tự như sự phát sinh cơ quan trực tiếp từ
mẫu cấy. Tế bào của mẫu cấy sẽ phản phân hóa dưới tác động của các chất điều hòa
sinh trưởng thực vật để phân chia hỗn loạn thành mô sẹo. Khi thay đổi thành phần và
nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thì tế bào mô sẹo lại được cảm ứng đã phân hóa
tạo cơ quan, hoặc có thể nói rằng nó vẫn còn giữ lại chương trình phát sinh hình thái
của mẫu cấy. Điều này có thể giải thích cho việc người ta thường sử dụng các mô trẻ
có tế bào đang phân chia mạnh để nuôi cấy tạo cơ quan. Đôi khi trong quá trình nuôi
cấy có sự tạo ra các tế bào sinh mô khác với các tế bào thông thường của mô sẹo.
Trong mô sẹo được tạo ra từ tượng tầng trong củ khoai lang có sự phát sinh vùng mô
phân sinh (Hwang và ctv, 1981).
Theo Thomas và Davey (1975) sự hình thành chồi từ mô sẹo được kích thích bởi:
(1) Các chất sinh trưởng đưa vào môi trường.
(2) Chất được sản sinh ra trong nuôi cấy mô sẹo.
(3) Các chất có chứa sẵn trong mẫu nuôi cấy.
Khả năng hình thành chồi từ mô sẹo phụ thuộc vào số lần cấy chuyền mà các
chất có trong mẫu không có khả năng tổng hợp trong thời gian dài (Gautheret, 1966)
và sự hình thành tế bào xốp (Thorpe, 1980).

9


2.7. Vai trò của các chất kích thích sinh trưởng thực vật
Đó là các hợp chất thường gặp trong các mô của cây trồng, thường xuyên có vai
trò trong sinh trưởng và phát triển của cây. Những hợp chất này thường hoạt động ở
nồng độ thấp và được gọi là chất kích thích sinh trưởng thực vật (hoặc là hormone
thực vật). Các hợp chất tổng hợp hóa học có tác động tương tự lên sinh lý của thực vật,
hoặc là những hóa chất có khả năng thay đổi sự sinh trưởng của thực vật bằng cách

nào đó đều được gọi là chất kích thích sinh trưởng thực vật (Edwin F. George và Paul
D. Sherrington, 1984).
2.7.1. Auxin
Auxin rất thường được dùng trong nghiên cứu nhân giống vô tính, và thường
được kết hợp với môi trường dinh dưỡng để phát triển mô sẹo (callus). Auxin là nhóm
chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng rất thường xuyên trong nuôi cấy mô
tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần dinh dưỡng trong môi
trường nuôi cấy để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa
sự phát sinh hình thái, đặc biệt khi nó được sử dụng phối hợp với cytokinin.
Auxin được tổng hợp không ở dạng tự do, mà liên kết với một acid amin (acid
aspatic ở Pisum, acid glutamic ở cà chua), hay glucid (AIA-glucoz, AIA-thioglucosid,
AIA-inositol). Các dạng liên kết này không có hoạt tính auxin nhưng dẫ dàng phóng
thích auxin theo con đường enzym (bởi sự thủy giải kiềm trong thực nghiệm), là các
dạng dự trữ (không bị phá hủy bởi AIA-oxidase) và vận chuyển của auxin trong tế bào
(Bùi Trang Việt, 2000).
Auxin là một hợp chất tương đối đơn giản: acid indol – 3 – acetic (AIA). Các
chất có cấu trúc gần giống AIA, có thể là dẫn xuất hay tiền chất của AIA, và có cùng
vai trò với AIA trong vài cơ quan đều được gọi là auxin theo nghĩa rộng.
Auxin được tổng hợp theo ngọn thân, trong mô phân sinh (ngọn và lóng) và lá
non (từ các nơi có sự phân chia tế bào nhanh), từ tryptophan được tổng hợp trong lá
trưởng thành dưới ánh sáng. Sau đó auxin di chuyển tới rễ và tích tụ trong rễ (Bùi
Trang Việt, 2000).
Lớp biểu bì của thực vật tương đối không thấm với auxin. Vì thế sự hấp thụ
auxin thông qua các vết cắt trên bề mặt. Khi nuôi cấy trong dịch lỏng, đa số auxin
không được thêm vào môi trường trong một vài ngày.

10


Vai trò của auxin trong nuôi cấy mô tế bào thực vật: kéo dài tế bào và làm mô

sưng phù, phân chia tế bào (hình thành callus) và hình thành rễ bất định, ức chế hình
thành chồi nách và chồi bất định, tạo phôi trong nuôi cấy huyền phù.
Nếu nồng độ auxin thấp: hình thành rễ bất định, nồng độ auxin cao: hình thành
callus. Nên giới hạn sử dụng 2,4-D vì có thể tạo đột biến và có thể ức chế quang tổng
hợp. Các loại auxin thường dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật: IBA, 2,4-D, NAA.
2.7.2. Cytokinin
Cytokinin là nhóm phức tạp nhất trong các hormon thực vật. Cytokinin hình
thành chủ yếu trong hệ thống rễ thực vật. Ngoài ra một số cơ quan còn non đang sinh
trưởng mạnh cũng có khả năng tổng hợp cytokinin như chồi, lá non, quả non, tầng phát
sinh. Đây là chất hoạt hóa sự phân chia tế bào (Misuhashi và ctv, 1969; Mai Trần
Ngọc Tiếng, 1989), đồng thời làm tăng quá trình chuyển hóa acid nucleic và protein
(Vũ Văn Vụ, 2003). Cytokinin được sử dụng khá nhiều trong kỹ thuật nuôi cấy mô.
Những cytokinin thường gặp nhất là kinetin, BA, TDZ.
Đặc điểm của cytokinin: Cytokinin được vận chuyển trong cây không phân cực
như auxin, có thể hướng ngọn, hướng gốc. Cytokinin trong cây có thể ở dạng liên kết
và dạng tự do cũng như ác phytohormone khác. Ở trong cây chúng bị phân giải bằng
enzyme, tạo nên sản phẩm cuối cùng là urê.
Vai trò của cytokinin trong nuôi cấy tế bào thực vật: thúc đẩy sự phân chia tế
bào, đặc biệt khi bổ sung thêm auxin, ở nồng độ cao (1-10mg/l) cytokinin cảm ứng
hình thành chồi bất định nhưng ức chế hình thành rễ, thúc đẩy sự hình thành chồi bất
định nhưng ức chế hình thành rễ, làm chậm sự lão hóa.
Ảnh hưởng đến sự hoạt động sinh lý của cây do nó có ảnh hưởng đến quá trình
trao đổi chất. Cytokinin gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô bao gồm mô
sẹo sinh trưởng trong mô nuôi cấy, hay việc tạo thành các mô bướu ở các cây gỗ lâu
năm (Nester và ctv, 1985; Taiz L. và ctv, 1991).
Các loại cytokinin thường dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật: Zeatin, IPA
(2-iP), dihydrozeatin, Kinetin, BAP (BA), TDZ.

11

Chương 3
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được tiến hành trong thời gian 5 tháng, từ ngày 17/02/2009 đến ngày
15/07/2009 tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, trường
Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu
3.2.1. Vật liệu và điều kiện thí nghiệm
Mẫu lài (Jasmine sambac) làm thí nghiệm được lấy ở vườn ươm trại thực
nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm, Thành phố Hồ Chí Minh.
Các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ 25ºC ± 2 ºC, độ ẩm
60% ± 5%, cường độ ánh sáng 2000 lux. Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn
toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại.
Mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung các chất kích thích sinh
trưởng với các nồng độ khác nhau, 7,8 g/l agar (agar Việt Xô), 30g/l đường (riêng môi
trường nuôi cấy trung gian thì bổ sung 15g/l đường). Môi trường được hấp khử trùng ở
121ºC, 1,2 atm trong 20 phút (đối với bình chứa 250 ml) hoặc 25 phút (đối với bình
chứa 500 ml).
3.2.2. Các thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
Tủ cấy vô trùng, nồi hấp vô trùng, máy cất nước, tủ lạnh, pH kế, phòng tăng
trưởng, dụng cụ thủy tinh, tủ sấy, máy khuấy từ.
3.2.3. Hóa chất
3.2.3.1. Thành phần môi trường MS (Murashige và Skook, 1962)


Khoáng đa lượng

Nồng độ (mg/l)

NH4NO3

1650

KNO3

1900

MgSO4.7H2O

370

KH2PO4

170

CaCl2.H2O

440



Khoáng vi lượng

Nồng độ (mg/l)

H3BO3

6,2

12


ZnSO4.7H2O

8,6

KI

0,83

Na2MoO4.7H2O

0,25

CuSO4.4H2O

0,025

CoCl2.6H2O

0,025



Vitamin

Nồng độ (mg/l)

Inositol

100

Nicotinic acid

0,5

Pyridoxin HCl

0,5

Thiamin HCl

0,1

Glycine

2,0



Fe-EDTA

Nồng độ (mg/l)

FeSO4.7H2O

27,8

Na2EDTA.2H2O

37,3

3.2.3.2. Các chất điều hòa sinh trưởng: 2,4-D, BA, NAA, TDZ và các hóa chất khác
như : sodium hypoclorid ( nước javel), xà phòng, đường, agar.
3.2.4. Xử lý thống kê
Số liệu thu thập được sau thí nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm
Stagraphics 7.0.
3.3 Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp tạo mô sẹo từ mẫu lá hoặc thân cây hoa lài Jasmine sambac in vitro
Tạo mô sẹo từ lá hoặc đoạn thân cây hoa lài trên môi trường có kích thích sinh
trưởng. Quá trình hình thành mô sẹo sẽ xảy ra trong bóng tối và mô sẹo được tạo thành
từ những vết thương trong quá trình cắt mẫu.
Sử dụng mẫu nuôi cấy in vitro. Lấy mẫu lá cắt nhỏ thành những mẫu nhỏ
(0,5 cm x 0,5 cm). Đặt vào môi trường sao cho mặt dưới lá tiếp xúc với môi trường.
Còn đối với mẫu thân cây hoa lài thì cắt thành từng đọan nhỏ, mỗi đoạn 0,5 cm, đặt
mẫu nằm ngang, tiếp xúc với môi trường. Sau đó đặt vào trong bóng tối trong 2 tuần.
Khi từ vết cắt bắt đầu xuất hiện sự sùi mô sẹo thì lấy ra để ngoài ánh sáng nhẹ
(50μmol/m2/s) để mô sẹo tiếp tục phát triển.

13


Sau 6 – 8 tuần thì nên cấy chuyền mô sẹo một lần nhưng tránh cấy chuyền quá
nhiều lần vì mô sẹo sẽ chuyển sang vàng và mất nước. Sau đó, lấy mô sẹo để tiến hành
các thí nghiệm tiếp theo.
3.4. Nội dung nghiên cứu
3.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ Javel và thời gian khử trùng mẫu đến khả
năng sống và sinh trưởng của mẫu
Bảng 3.1 Bảng mô tả thí nghiệm khảo sát nồng độ và thời gian khử trùng mẫu

Thời gian ngâm

Số lượng mẫu

Nghiệm thức

Nồng độ Javel

A1

50%

10

48

A2

40%

15

48

A3

30%

20

48

(phút)

3.4.1.1. Các bước tiến hành
Quy trình khử trùng mẫu cấy ban đầu:
 Bước 1: Chọn mẫu
Mẫu được lấy tại vườn ươm trại thực nghiệm trường Đại học Nông Lâm Thành
phố Hồ Chí Minh.
Lấy mẫu vào buổi sáng từ 7h30-9h30 và để mẫu khô trước khi cắt. Chọn những
lá không bị sâu bệnh, không chọn những mẫu non quá vì mẫu sẽ giập, mất sức sống
trong quá trình khử trùng mẫu, cũng không chọn mẫu già quá vì mẫu dễ nhiễm, khó tái
sinh. Chọn những lá ở trên cao, tương đối sạch để hạn chế mầm bệnh từ đất trồng bám
vào. Dùng kéo cắt các nhánh mang mẫu.
Mẫu sau khi cắt được cho vào bao nilon, cột kín miệng để giảm sự mất nước
của mẫu và hạn chế sự nhiễm các vi sinh vật trong quá trình vận chuyển từ vườn ươm
về phòng thí nghiệm.
 Bước 2: Rửa mẫu
Dùng kéo cắt riêng phần thân và lá rồi rửa sạch mẫu dưới vòi nước chảy. Sau
đó rửa mẫu dưới tia nước mạnh.
Tiếp tục ngâm mẫu dưới vòi nước chảy nhẹ trong 10 phút để rửa trôi vi khuẩn
bám trên bề mặt mẫu.

14


Dùng bông gòn thấm xà phòng đã được pha sẵn và rửa mẫu nhẹ nhàng, tránh
làm tổn thương mẫu. Rửa lại mẫu 3 lần với nước sạch.
Mẫu được để dưới vòi nước chảy trong 10 phút trước khi ngâm với xà phòng
loãng trong 30 phút.

Rửa lại mẫu với nước sạch. Sau đó, gắp mẫu vào bình tam giác đã hấp tiệt
trùng, lau sạch thành bình và chuyển vào tủ cấy.
 Bước 3: Khử trùng mẫu trong tủ cấy
Ngâm và lắc mẫu trong cồn 70º trong 30 giây. Rửa sạch mẫu 3 lần bằng nước
cất vô trùng.
Sau khi lắc trong cồn 70º, mẫu được chia làm 3 nhóm. Mỗi nhóm mẫu được
ngâm trong một nồng độ Javel khác nhau theo các thời gian khảo sát khác nhau. Rửa
sạch mẫu 3 lần bằng nước cất vô trùng.
Sau khi khử trùng, lá được cắt thành những mẫu nhỏ có diện tích 1 x 1cm rồi
được cấy vào môi trường đã chuẩn bị sẵn.
Thời gian ghi nhận kết quả là 15 ngày sau khi khử trùng. Dung dịch Javel khử
trùng được sử dụng ở đây là sản phẩm của công ty Navico
3.4.1.2. Chỉ tiêu theo dõi
 Tỉ lệ mẫu sạch (%): là tỉ lệ mẫu không bị nhiễm sau khử trùng so với tổng số
mẫu cấy ban đầu

Tỉ lệ mẫu sạch =

Tổng số mẫu sạch

x 100

Tổng số mẫu thí nghiệm
 Tỉ lệ mẫu sống (%): là tỉ lệ mẫu sống và không bị nhiễm sau khi khử trùng so
với tổng số mẫu cấy.

Tổng số mẫu sống và sạch
Tỉ lệ mẫu sống =
Tổng số mẫu thí nghiệm

15

x 100