THIẾT KẾ VÀ CHỌN LỌC CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR ỨNG DỤNG TRONG CHỌN GIỐNG ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merr.) KHÁNG BỆNH RỈ SẮT (Phakopsora pachyrhizi)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THIẾT KẾ VÀ CHỌN LỌC CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR ỨNG
DỤNG TRONG CHỌN GIỐNG ĐẬU TƯƠNG
(Glycine max (L.) Merr.) KHÁNG BỆNH
RỈ SẮT (Phakopsora pachyrhizi)

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN NGỌC CẨM

Niên khoá

: 2005 – 2009

Tháng 8/2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THIẾT KẾ VÀ CHỌN LỌC CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR ỨNG
DỤNG TRONG CHỌN GIỐNG ĐẬU TƯƠNG
(Glycine max (L.) Merr.) KHÁNG BỆNH
RỈ SẮT (Phakopsora pachyrhizi)

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

ThS. TRƯƠNG QUỐC ÁNH

NGUYỄN NGỌC CẨM

TS. BÙI MINH TRÍ

Tháng 8/2009


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên con xin gởi lời cảm ơn đến ba mẹ đã luôn yêu thương và ủng hộ con
trong mọi quyết định. Xin cảm ơn tất cả mọi người đã giúp em học hỏi được nhiều
điều trong cuộc sống .
Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành
phố Hồ Chí Minh, Ban lãnh đạo Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã dạy em những kiến thức hay và phong cách làm việc tốt cho em trong suốt 4
năm học cùng tập thể cán bộ và quý thầy cô Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp
Miền Nam đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập.
Em xin trân trọng biết ơn thầy Trương Quốc Ánh và thầy Bùi Minh Trí đã hết

lòng hướng dẫn và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài
tốt nghiệp và anh Lý Hậu Giang - Phòng Công nghệ sinh học- Viện Khoa học Kỹ
thuật Nông nghiệp Miền Nam, đã chỉ dẫn tận tình cho em trong suốt quá trình thực
tập. Anh Nguyên, chị Lý, chị Loan cùng với các anh chị ở Trung tâm Công nghệ sinh
học thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ em trong lúc khó khăn. Các bạn lớp
CNSH K05, Nhiên, Trang và Hưng đã cùng học tập, chia sẻ, cổ vũ và giúp đỡ nhau
trong suốt thời gian học.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2009

Nguyễn Ngọc Cẩm

iii


TÓM TẮT
Việc chọn lọc chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng bệnh có ý nghĩa quan trọng
trong chọn giống đậu tương kháng bệnh rỉ sắt do nấm Phakopsora pachyrhizi, từ đó ta
có được công cụ để chọn giống chính xác hơn và đáng tin cậy hơn. Vì lý do đó đề tài
“Thiết kế và chọn lọc chỉ thị phân tử SSR ứng dụng trong chọn giống đậu tương
(Glycine max (L.) Merr.) kháng bệnh rỉ sắt (Phakopsora pachyrhizi)” đã được thực
hiện từ tháng 04 năm 2009 đến tháng 07 năm 2009 tại Viện Khoa học Kỹ thuật Nông
nghiệp Miền Nam với nội dung như sau:
Tìm SSR trong vùng trình tự các gen kháng rỉ sắt Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4,
Rpp5 dựa trên các công bố trước đây để chọn lọc những SSR có khả năng cho đa hình
cao. Sau đó thiết kế primer cho các SSR đã chọn lọc. Thực hiện phản ứng PCR với các
cặp primer đã thiết kế trên các giống bố mẹ (HL203, DT2000, Stuart99084B-28, PI
516287A). Sử dụng các marker đã cho đa hình trên bố mẹ để thực hiện phản ứng PCR
với quần thể con lai BC4F1 nhằm xác định marker cho đa hình liên kết với gen kháng.
Kết quả đạt được:
Marker A3 (

) cho đa hình giữa

giống bố mẹ kháng và nhiễm bệnh rỉ sắt đậu tương đồng thời đa hình này cũng xuất
hiện trên quần thể con lai BC4F1, do đó A3 có khả năng liên kết với tính kháng bệnh rỉ
sắt đậu tương quy định bởi gen kháng Rpp5, có tiềm năng lớn trong ứng dụng chọn tạo
giống mang tính kháng bệnh rỉ sắt.
Tính kháng bệnh rỉ sắt đậu tương của hai giống kháng DT2000 và Stuart
99084B-28 có khả năng được điều khiển bởi gen kháng đơn Rpp5 dựa trên phản ứng
kháng với nấm Phakopsora pachyrhizi và đa hình kiểu gen được tìm thấy.

iv


SUMMARY
Molecular marker which links to soybean rust (Phakopsora pachyrhizi)
resistant locus is very important to soybean breeding. The application of these marker
accelerate the breeding process and offers a straightforward aid in the selection of
resistant genotypes by MAS. Therefore, the study “Application of SSR markers in
selection of soybean rust (Phakopsora pachyrhizi) resistant varieties” was carried out
from April 1st 2009 to July 30th 2009 at Institute of Agricultural Science for Southern
Viet Nam with following contents:
Base on consensus map of Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4, Rpp5 from previous
studies, seaching for SSRs and then selecting highest potential polymorphic SSRs to
design primers. Designed primers has been used to run PCR reactions with parents
(HL203, DT2000, Stuart99084B-28, PI 516287A) to identify the polymorphic
markers. After all, the polymorphic marker has been used to run PCR reactions on
BC4F1 to definite the ability to closely link to soybean rust resistant locus.
Results obtained from study:
A3 marker (

) was polymorphic in

our set of susceptible and resistant parents. This allelic variant is also found in two
BC4F1 populations. Therefore, A3 is a potential marker that has the ability to closely
link to Rpp5 locus.
Soybean rust resistance phenotypes of DT2000 and Stuart 99084B-28 can
gorverned by locus Rpp5 due to their resistance responses and their allelic variants.

v


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn................................................................................................................iii
Tóm tắt...................................................................................................................... iv
Summary.................................................................................................................... v
Danh sách các chữ viết tắt ......................................................................................viii
Danh sách các bảng .................................................................................................. ix
Danh sách các hình .................................................................................................... x
Chương 1 MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề.......................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu........................................................................................... 2
1.1.1. Mục tiêu.......................................................................................................... 2
1.2.1. Yêu cầu ........................................................................................................... 2
1.3. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................ 3
2.1. Giới thiệu chung về cây đậu tương.................................................................... 3
2.1.1. Phân loại cây đậu tương ................................................................................. 3
2.1.2. Đặc điểm cây đậu tương ................................................................................. 3

2.2. Bệnh rỉ sắt đậu tương......................................................................................... 5
2.2.1. Triệu chứng bệnh RSĐT do nấm P. Pachyrhizi............................................. 5
2.2.2. Tác nhân gây bệnh RSĐT............................................................................... 5
2.2.3. Tình hình nhiễm bệnh RSĐT và phương thức kiểm soát trên thế giới .......... 6
2.2.4. Tình hình nhiễm bệnh RSĐT và phương thức kiểm soát bệnh ở Việt Nam .. 9
2.2.5. Một số nghiên cứu về gen kháng bệnh rỉ sắt trên đậu tương.......................... 9
2.3. Chọn giống với hỗ trợ của chỉ thị phân tử....................................................... 11
2.4. Chỉ thị phân tử SSR và ứng dụng trong chọn tạo giống.................................. 12
2.4.1. Chỉ thị phân tử SSR ...................................................................................... 12
2.4.2. Những lý do để chọn SSR cho MAS đối với cây đậu tương........................ 12
2.5. Dòng đẳng gen (NIL) ...................................................................................... 14
2.5.1. Cách tạo dòng NIL ....................................................................................... 14
vi


2.5.2. Ưu điểm của dòng NIL................................................................................. 15
2.5.3. Khuyết điểm của dòng NIL .......................................................................... 15
2.6. Sơ lược các nghiên cứu có liên quan............................................................... 15
2.6.1. Trên thế giới ................................................................................................. 15
2.6.2. Trong nước ................................................................................................... 16
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................... 17
3.1. Thời gian và địa điểm ...................................................................................... 17
3.2. Vật liệu và hóa chất ......................................................................................... 17
3.2.1. Vật liệu nghiên cứu....................................................................................... 17
3.2.2. Hóa chất........................................................................................................ 18
3.2.3. Thiết bị và dụng cụ ....................................................................................... 19
3.3. Phương pháp tiến hành .................................................................................... 19
3.3.1. Vị trí thiết kế primer cho SSR marker.......................................................... 19
3.3.2. Cơ sở dữ liệu và các phần mềm sử dụng để thiết kế primer ........................ 21
3.3.3. Các bước thiết kế primer cho SSR marker ................................................... 22

3.4. Ly trích DNA tổng số từ lá đậu tương............................................................. 28
3.5. Thực hiện phản ứng PCR ................................................................................ 29
3.6. Đọc kết quả phản ứng PCR ............................................................................. 29
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................... 31
4.1. Kết quả ly trích DNA ...................................................................................... 31
4.2. Kết quả các SSR tìm được............................................................................... 32
4.3. Kết quả thiết kế primer .................................................................................... 35
4.4. Kết quả thực hiện phản ứng PCR .................................................................... 36
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 41
5.1. Kết luận............................................................................................................ 41
5.2. Đề nghị ............................................................................................................ 41
Tài liệu tham khảo .................................................................................................. 42
Phụ lục

vii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BC

: Backcross

cM

: centi Morgan

ctv

: cộng tác viên

DNA

: Deoxyribonucleotide acid

dNTP

: Deoxyribonucleoside triphosphate

DP

: Donor parent

HR

: Hypersensitive Response

MAS

: Marker Assisted Selection

NILs

: Near Isogenic lines

OD

: Optical Density

PCR

: Polymerase Chain Reaction

QTL

: Quantitative Trait Loci

RB

: Reddish-Brown

RP

: Recurrent Parent

Rpp

: R gene against Phakopsora pachyrhizi

RSĐT

: Rỉ sắt đậu tương

Taq

: Thermus aquaticus

AVRD

: Asian Vetererian Research Department

SSR

: Simple Sequence Repeat

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang
Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR..................................................................... 29
Bảng 4.1 Nồng độ DNA các dòng đậu nành BC4F1............................................... 31
Bảng 4.2 Kết quả thống kê SSR tìm được trên vùng gen Rpp5............................. 32
Bảng 4.3 Kết quả thống kê SSR tìm được trên vùng gen Rpp4............................. 33
Bảng 4.4 Kết quả thống kê SSR tìm được trên vùng gen Rpp2............................. 33
Bảng 4.5 Kết quả thống kê SSR tìm được trên vùng gen Rpp1............................. 34
Bảng 4.6 Kết quả thống kê SSR tìm được trên vùng gen Rpp3............................. 34
Bảng 4.7 Kết quả các trình tự primer thiết kế được............................................... 34
Bảng 4.8 Kết quả chạy PCR của 7 cặp primer A1, A2, A3, B1 , B2, B3, C1 ....... 37

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Hoa, lá, quả, hạt và rễ của cây đậu tương ................................................. 4
Hình 2.2 Bào tử thứ cấp và hạ bào tử của nấm P. pachyrhizi................................. 6
Hình 2.3 Vết bệnh RSĐT gây bởi nấm Phakopsora pachyrhizi .............................. 7
Hình 2.4 Các phản ứng điển hình của cây đối với nấm rỉ sắt P.pachyrhizi........... 11
Hình 3.1 Bản đồ liên kết của gen kháng rỉ Rpp1 ................................................... 19

Hình 3.2 Bản đồ liên kết của gen kháng rỉ Rpp2 và Rpp4..................................... 20
Hình 3.3 Bản đồ liên kết của gen kháng rỉ Rpp3 ................................................... 20
Hình 3.4 Bản đồ liên kết của gen kháng rỉ Rpp5 ................................................... 21
Hình 3.5 Giao diện trang web ................................................. 23
Hình 3.6 Giao diện thẻ Soybean Breeders Toolbox .............................................. 23
Hình 3.7 Vị trí của các marker Satt288 và Satt191 trên bản đồ liên kết ............... 24
Hình 3.8 Vùng trình tự sử dụng cho thiết kế primer SSR của Rpp4 ..................... 24
Hình 3.9 Dạng trình tự bảo tồn thu được............................................................... 25
Hình 3.10 Dạng kết quả kiểm tra primer bằng Primerselect ................................. 27
Hình 3.11 Giao diện trang .......................................... 28
Hình 3.12 Giao diện thẻ BLAST ........................................................................... 28
Hình 4.1 Kết quả điện di DNA trên gel 0.8 %....................................................... 31
Hình 4.2 Sản phẩm PCR của các giống bố mẹ với các marker A1, A3, B1, B2... 38
Hình 4.3 Băng điện di sản phẩm PCR của quần thể BC4F1 (HL103 x DT2000) .. 39
Hình 4.4 Băng điện di sản phẩm PCR của quần thể BC4F1 (HL103 x Stuart) ...... 40

x


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Việt Nam là một trong những nước có truyền thống trồng đậu tương lâu đời,
cây đậu tương đã có vị trí kinh tế không thể thay thế được trong cơ cấu cây trồng vì ít
kén đất, nhu cầu tổng tích ôn thấp hơn các loại hoa màu khác đồng thời là cây công
nghiệp ngắn ngày có giá trị dinh dưỡng cao (Vinh, 1994). Tuy nhiên hiện nay sản
lượng đậu tương vẫn chưa đủ để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ mà phải nhập khẩu nguyên
liệu từ 1-1,2 triệu tấn/năm đồng thời năng suất đậu tương bị hạn chế rất nhiều do điều
kiện sản xuất khó khăn trong đó bệnh RSĐT (Phakospora pachyrhizi) là một trong
những yếu tố hạn chế chính (). Các nhà chọn giống đã cố gắng

tìm nhiều phương pháp để tạo ra các giống có khả năng kháng bệnh ổn định tuy nhiên
trong thực tế sản xuất, áp lực chọn lọc giống kháng, thuốc bảo vệ thực vật đã phá vỡ
cân bằng cân bằng tự nhiên và tính kháng này thường không bền vững. Cùng với sự
phát triển mạnh mẽ của nghành sinh học phân tử, quy trình chọn giống với hỗ trợ của
chỉ thị phân tử (MAS) tỏ ra rất hiệu quả, chính xác và tiết kiệm công sức, thời gian
đáng kể nhờ việc phát hiện nguồn gen mới chuyển nạp thông qua các chỉ thị liên kết
với những gen đó. Simple Sequence Repeat (SSR) với đặc tính phân tán đều trên khắp
bộ gen, tính đa hình và lặp lại cao đã đáp ứng được nhiều yêu cầu đặt ra của các nhà
nghiên cứu trong chọn tạo giống. Mặt khác, các giống đậu tương được tuyển chọn từ
trước đến nay với mục tiêu chủ yếu là năng suất cao, đánh giá tính kháng bệnh qua
chọn lọc tự nhiên và dựa vào kiểu hình để đánh giá kiểu gen. Cho đến nay ở nước ta
vẫn chưa có nghiên cứu nào sử dụng MAS để chọn tạo giống đậu tương kháng bệnh rỉ
sắt, các giống đậu tương hiện phổ biến trong sản xuất hiện mới chỉ có khả năng chống
chịu bệnh ở mức trung bình, chưa có giống kháng rỉ cao.
Vì những lý do nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Thiết kế và chọn lọc chỉ thị
phân tử SSR ứng dụng trong chọn giống đậu tương (Glycine max (L.) Merr.) kháng
bệnh rỉ sắt (Phakopsora pachyrhizi)” với mục tiêu: Thiết kế và chọn lọc marker SSR
cho đa hình có khả năng liên kết với gen kháng bệnh RSĐT để ứng dụng trong chọn
tạo giống đậu tương kháng bệnh rỉ sắt.

1


1.2. Mục tiêu và yêu cầu
1.2.1. Mục tiêu
Chọn lọc marker có khả năng cho đa hình liên kết với gen kháng bệnh RSĐT
trên quần thể BC4F1 của các tổ hợp lai HL203 x DT2000, HL203 x Stuart99084B-28,
HL203 x PI 516287A nhằm ứng dụng trong chọn giống đậu tương mang gen kháng
bệnh rỉ sắt.
1.2.2. Yêu cầu

Thu nhận và ly trích DNA quần thể BC4F1.
Nắm vững các nguyên lý, quy tắc thiết kế primer SSR, phản ứng PCR.
Nắm vững vùng trình tự và đặc điểm các gen kháng bệnh RSĐT.
Phát hiện và phân tích đa hình tìm thấy từ các primer thiết kế được.
1.3. Nội dung nghiên cứu
Ly trích DNA 3 quần thể BC4F1 của 3 tổ hợp lai HL203 x DT2000,
HL203 x Stuart99084B-28, HL203 x PI 516287A.
Tìm SSR trong vùng trình tự của các gen kháng rỉ sắt Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4,
Rpp5 dựa trên các công bố trước đây, chọn lọc những SSR có khả năng cho đa hình
trên các giống đậu tương nghiên cứu (HL203, DT2000, Stuart99084B-28, PI
516287A).
Thiết kế primer cho các SSR đã chọn lọc.
Chạy PCR với các cặp primer đã thiết kế trên giống bố mẹ để xác định marker
cho đa hình trên các dòng bố mẹ (HL203, DT2000, Stuart99084B-28, PI 516287A)
Thực hiện phản ứng PCR sử dụng các marker đã cho đa hình trên bố mẹ với
quần thể con lai BC4F1 từ các tổ hợp lai sau để xác định con lai có khả năng mang
gene kháng bệnh rỉ sắt:
HL203 x DT2000
HL203 x Stuart99084B-28
HL203 x PI 516287A

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về cây đậu tương
2.1.1. Phân loại cây đậu tương
Đậu tương (2n = 40) thuộc:
Bộ: Fabales

Họ: Fabaceae
Chi: Glycine L.
Phụ chi: Soja
Loài: Glycine max (L.) Merrill
2.1.2. Đặc điểm cây đậu tương
Các giống đậu tương gieo trồng (Glycine max (L.) Merr.) thường có thân đứng,
hạt màu vàng, xanh lục hay nâu đen, trọng lượng 100 hạt biến động từ 5-35 gam. Vỏ
hạt dễ ngấm nước và dính với phôi ở tể hạt, màu sắc của tể hạt thay đổi tùy theo giống
và là đặc điểm để phân biệt giống. Lá có 2 dạng là lá đơn và lá kép, lá đơn xuất hiện
ngay sau khi tử diệp mở ra, lá kép hiện diện khi cây trưởng thành. Các chồi ở nách lá
từ mắt thứ năm trở lên thường phát triển thành chồi hoa. Chồi hoa phát triển thành
chùm hoa, số hoa trên chùm là 3-15 bông, thường có hai màu (trắng hoặc tím) được
quyết định bởi sắc tố anthocyamine. Rễ gồm có rễ cái và nhiều rễ con. Những nốt sần
có chứa nhiều vi khuẩn Rhizobium japonicum cộng sinh với rễ đậu tương có khả năng
tổng hợp được đạm Nitơ tự do của không khí thành đạm hữu cơ cung cấp cho cây và
làm giàu chất đạm cho đất. Quả thường có màu đen hoặc vàng rơm tùy thuộc sự có
mặt của các sắc tố carotein, xanthophin, anthocyamine nhiều hay ít; có dạng hình trụ
hoặc dẹp, có eo. Toàn bộ thân cành lá đều được bao phủ bởi một lớp lông tơ màu xám
trắng hay nâu vàng, lông tơ có thể thưa, dày, nằm hay đứng tùy theo giống. Đặc tính
của lông và hoa rất cần thiết khi lai tạo (Phạm Văn Biên và ctv., 1992).
Nhiều kết quả nghiên cứu về đậu tương của thế giới đã chứng minh, đới khí hậu
từ 100 – 200C Bắc bán cầu là khu vực có tiềm năng năng suất đậu tương cao nhất trên

3


toàn cầu, với năng suất trung bình trên 1600 kg/ha. Nằm trong đới khí hậu trên, nước
ta có nhiều khả năng đẩy mạnh sản xuất đậu tương. Theo quy hoạch của nhà nước,
vùng sản xuất đậu tương hàng hóa sẽ tập trung chủ yếu ở Đông Nam Bộ, đồng bằng
sông Cửu Long sau đó là Tây Nguyên, miền núi và trung du Bắc Bộ. Mặc dù đậu

tương Việt Nam có lịch sử phát triển lâu đời hơn các nước châu Âu, châu Mỹ, song
trải qua một thời gian dài cây đậu tương vẫn chiếm một vị trí khá khiêm tốn trong nền
sản xuất nông nghiệp. Nhiều năm trước đây và cho tới hiện nay công tác nghiên cứu
khoa học đối với cây đậu tương vẫn chưa phát triển tương xứng với vị trí, khả năng và
tiềm lực của cây đậu quý giá này (Phạm Văn Biên và ctv., 1994).

Hình 2.1 Hoa, lá, quả, hạt và rễ của cây đậu tương ( />Đậu tương là cây công nghiệp – cây thực phẩm ngắn ngày có năng suất sinh
tổng hợp protein cao và hàm lượng protein 38 – 45 % thuộc loại cao nhất trong các hạt
thực vật, dầu béo 18 – 23 % chỉ thấp hơn lạc trong các cây đậu đỗ. Với biên độ thích
ứng nhiệt độ, bức xạ rộng hơn, ít kén đất hơn và có tổng tích ôn đòi hỏi thấp hơn nhiều
loại cây trồng khác, cây đậu tương đã có vị trí kinh tế không thể thay thế trong cơ cấu
cây trồng, cải tạo đất và góp phần phá vỡ chu kỳ sâu bệnh trong luân canh trên tất cả
các vùng sinh thái từ Bắc vào Nam. Tuy nhiên năng suất đậu tương nước ta so với
4


bình quân thế giới chỉ bằng 43%. Các phân tích cho thấy tiềm năng phát triển đậu
tương nước ta còn rất lớn cả về qui mô lẫn năng suất (Mai Quang Vinh, 1994).
2.2. Bệnh rỉ sắt đậu tương (RSĐT)
Bệnh RSĐT gây ra bởi nấm Phakopsora pachyrhizi là nguyên nhân làm tổn thất
sản lượng nghiêm trọng trên đậu tương ở châu Á. Bệnh lây lan thông qua hạ bào tử
của nấm P.pachyrhizi được mang đi bởi gió và có thể phát triển nhanh chóng do điều
kiện thúc đẩy sự phát triển tốt của cây đậu tương cũng là điều kiện tối thích cho sự
phát triển của bệnh RSĐT. Sự phân tán nhanh chóng của P. pachyrhizi và khả năng
tiềm tàng cho những tổn thất sản lượng nghiêm trọng đã làm nó trở thành bệnh trên lá
có sức tàn phá lớn nhất trên đậu tương (Miles và ctv., 2003).
2.2.1. Triệu chứng bệnh RSĐT do nấm P. pachyrhizi
Triệu chứng điển hình nhất của bệnh rỉ sắt trên đậu tương gieo trồng là những
vết nâu đến nâu đen đa giác từ 2 đến 5 mm2. Bên trong mỗi vết bệnh là một hoặc nhiều
vết nứt, lỗ bào tử tròn. Bào tử được phóng thích qua những lỗ tròn hở. Vết bệnh được

tìm thấy trên cuống lá, trên vỏ hạt và cả thân cây nhưng xuất hiện phổ biến nhất trên
lá. Khi mức độ nhiễm bệnh tăng lên, hiện tượng rụng lá non và trưởng thành sớm của
cây trở nên phổ biến (Mile và ctv., 2003).
2.2.2. Tác nhân gây bệnh RSĐT
Nấm gây bệnh là Phakopsora pachyrhizi.
Họ: Melampsoraceae
Bộ: Uredinales
Lớp nấm đảm: Basidiomycetes
Dạng bào tử phổ biến nhất của nấm P. pachyrhizi là hạ bào tử. Dạng bào tử này
rất phổ biến, được tìm thấy trong tất cả các mùa và được tạo ra rất nhiều, sẵn sàng
được phân tán bởi gió và nhiều vòng đời bào tử được tái thiết.
Tiến trình xâm nhiễm bắt đầu khi hạ bào tử nảy mầm tạo ra một ống mầm mọc
xuyên qua bề mặt lá một khoảng 5 đến 400 µm cho đến khi hình thành một đĩa bám.
Các móc từ đĩa bám xâm nhiễm vào tế bào biểu bì trực tiếp bằng cách đâm xuyên qua
lớp cu-tin. Nấm bệnh RSĐT này và một số loài họ hàng là những loài duy nhất có khả
năng xâm nhập trực tiếp tế bào biểu bì, thông thường các loại nấm gây bệnh rỉ sắt khác
xâm nhập vào lá thông qua lỗ mở của khí khổng. Việc xâm nhập trực tiếp vào tế bào

5


biểu bì của P. pachyrhizi đã bổ sung vào sự hiểu biết về phổ cây chủ rất rộng của loại
nấm RSĐT này và hệ quả là việc cần thiết phải phát triển tính kháng của cây trồng.
Sau 5 đến 8 ngày hạ bào tử xâm nhiễm vào cây, bào tử thứ cấp sẽ xuất hiện. Hạ
bào tử có thể phát triển đến 4 tuần sau khi chủng bệnh, bào tử thứ cấp có thể mọc trên lề
vết nhiễm đầu tiên thêm 8 tuần. Do đó, từ một vết nhiễm ban đầu, sự hình thành bào tử
có thể kéo dài đến 15 tuần sau. Ngay cả ở điều kiện khô ráo, khả năng tạo bào tử rộng
rãi của mầm bệnh này cho phép nó tồn tại bền bỉ và duy trì mối đe dọa. Nếu điều kiện
tái nhiễm không được duy trì liên tục, chất gây nhiễm tiềm tàng từ lần nhiễm đầu tiên
vẫn tồn tại và có thể tái thiết đại dịch. Sự nhiễm thành công phụ thuộc vào môi trường

trên bề mặt lá. Sự nhiễm cần tối thiểu 6 giờ trong môi trường tự nhiên và phát triển tối
đa ở 10 đến 12 giờ. Nhiệt độ 15 đến 28°C là lý tưởng cho sự nhiễm (Mile và ctv., 2003).

Hình 2.2 Bào tử thứ cấp và hạ bào tử của nấm P. pachyrhizi (Jircas Working report 58)
2.2.3. Tình hình nhiễm bệnh RSĐT và phương thức kiểm soát trên thế giới
Bệnh RSĐT được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1902 ở Nhật Bản, và sau đó
được phát hiện ở những vùng khác của châu Á và châu Úc năm 1934 (Kochman,
1977), Ấn Độ năm 1951 (Sharma và Mehta, 1996), Hawaii năm 1994 (Killgore và
Heu, 1994), và châu Phi năm 1996 (Akinsanmi và ctv., 2001). Tại Nam Mỹ, bệnh
được báo cáo lần đầu tiên vào năm 2001 ở Paraguay và Brazil (Yorinori và ctv, 2005),
vào những năm kế tiếp bệnh lan đến Argentina, Bolivia và Colombia (Rossi, 2003).
Những tác giả này ước lượng thiệt hại do RSĐT gây ra dao động từ 10 đến 80% sản
lượng đậu tương. Ở Mỹ, bệnh RSĐT xuất hiện lần đầu tiên vào tháng 11 năm 2004

6


(Schneider và ctv, 2005), nhưng điều kiện môi trường không thuận lợi cho sự phân tán
của loại nấm bệnh này nên tổn thất sản lượng đã được ngăn chặn (Sconyers và
ctv.,2006).

Hình 2.3 Vết bệnh RSĐT gây bởi nấm Phakopsora pachyrhizi (Nguồn hình ảnh do
Mile và ctv. cung cấp ( (a) Ở mặt trên của
một lá đậu tương, (b) Trên một lá mầm; (c) Trên cuống lá; (d) Ở mặt dưới của lá; (e) Trên
thân cây đậu tương; (f) Vết bào tử nấm trên lá khi vừa xuất hiện.

7


Đến thời điểm năm 2003, tức là 100 năm sau lần đầu tiên phát hiện ra bệnh

RSĐT, hầu hết các nghiên cứu kiểm soát bệnh đều tập trung vào việc sử dụng thuốc
diệt nấm và tính kháng của cây chủ. Một số kỹ thuật trồng trọt được đề nghị để giảm
thiểu tác động của bệnh. Những đề nghị này khác nhau, nhưng đều dựa trên nguyên
tắc tránh những điều kiện làm thúc đẩy sự phát triển của nấm gây bệnh RSĐT. Những
nghiên cứu về kiểm soát sinh học rất hạn chế. Trong khi đó điều kiện tối ưu cho sự
phát triển của cây đậu tương cũng là điều kiện tối ưu cho sự phát triển của nấm bệnh.
Thêm vào đó, có rất nhiều vấn đề cần giải quyết liên quan đến việc sử dụng hóa chất
để kiểm soát bệnh RSĐT. Những phương pháp sử dụng thuốc diệt nấm như hiện tại
không đủ sức kiểm soát mầm bệnh. Vào đầu mùa vụ, mầm bệnh được tìm thấy ở
những lá phía dưới của cây nơi vết bệnh và dịch chất gây nhiễm bệnh tồn tại. Khi cây
bắt đầu ra hoa, bệnh phát triển dần lên trên, các lá phía dưới của cây chết đi và rụng
xuống. Đây cũng là giai đoạn các tán cây phát triển rậm rạp và nó ngăn không cho
thuốc diệt nấm được phun phía đầu tán ngấm xuống dưới. Đồng thời đa phần các
thuốc diệt nấm không ngấm qua cây, hoặc nếu ngấm được nó cũng không thể đi xuống
những phần dưới của cây (Mile và ctv, 2003). Đặc tính phân tán và phát triển của nấm
P. pachyrhizi cộng với những phương thức kiếm soát bệnh chưa thực sự hiệu quả đã
đẩy nhanh tình trạng nhiễm bệnh RSĐT lên khắp các lục địa.
Mặc dù sử dụng thuốc diệt nấm có thể giảm bớt tổn thất sản lượng, việc dùng
cây trồng có tính kháng hoặc chống chịu được xem là phương thức tốt nhất để kiểm
soát bệnh xét theo những yếu tố như giảm giá thành, sự thuận tiện trong quản lý và
những ảnh hưởng đến môi trường do thuốc diệt nấm (Garcia và ctv., 2008).
Cho đến nay các nhà nghiên cứu đã định vị được năm gen kháng bệnh RSĐT
trên bản đồ liên kết của đậu tương. Tuy nhiên, việc sử dụng các gen kháng đơn để
kiểm soát bệnh có thể gặp một số vấn đề do tính kháng đặc hữu của nó (Yamaoka và
ctv., 2002; Bonde và ctv., 2006). Vào năm 2001 khi RSĐT xuất hiện ở Brazil, tất cả 4
gen kháng Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4 đều kháng hữu hiệu với bệnh, nhưng chỉ vài năm
sau, chỉ Rpp2 và Rpp4 cho phản ứng kháng (Yorinori và ctv., 2005). Do đó việc phát
hiện và tập hợp nhiều gen kháng đơn vào cùng một bộ gen (pyramiding) (Liu và ctv.,
2000) có thể xây dựng tính kháng bền vững của cây trồng đối với RSĐT.

8


2.2.4. Tình hình nhiễm bệnh RSĐT và phương thức kiểm soát bệnh ở Việt Nam
Ở Việt Nam, bệnh rỉ đã được phát hiện từ thập niên 1940 và hiện nay bệnh đã
gây hại trên tất cả các vùng trồng đậu tương từ Bắc vào Nam. Bệnh gây thiệt hại nặng
làm năng suất đậu tương giảm tới 40 -50 % hoặc có trường hợp gần như không cho thu
hoạch như tại Xuân Lộc (Đồng Nai năm 1981); Phúc Thọ (Hà Tây năm 1982). Do có
điều kiện khí hậu nhiệt đới ẩm, ở nước ta bệnh rỉ sắt đã gây hại quanh năm. Ở các tỉnh
phía Bắc, bệnh gây hại nặng trong vụ Xuân. Ở Phía Nam bệnh gây hại nặng từ cuối vụ
Hè Thu, chuyển sang gây hại nặng trong vụ Thu Đông, đặc biệt tại các tỉnh Đông Nam
Bộ và Tây Nguyên trong cuối mùa mưa có nhiều sương mù vào tháng mười. Ở Việt
Nam, các giống đậu tương hiện trồng trong sản xuất cũng có mức độ nhiễm bệnh nặng
nhẹ khác nhau. Đặc biệt giống DH4 bị nhiễm rất nặng, có nơi có lúc hoàn toàn không
cho thu hoạch do bệnh hại nặng. Một số giống ngắn ngày (đa số là giống nhập nội) và
một số giống dài ngày (đa số là giống địa phương) bị bệnh nhẹ. Giống địa phương
Nam Vang phổ biến ở các tỉnh phía Nam cũng ít bị bệnh rỉ sắt (Phạm Văn Biên và
ctv., 1992). Các giống đậu tương được tuyển chọn từ trước đến nay với mục tiêu chủ
yếu là năng suất cao, đánh giá tính kháng bệnh qua chọn lọc tự nhiên và dựa vào kiểu
hình để đánh giá kiểu gen. Cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào về sử dụng chỉ thị
phân tử để chọn tạo giống đậu tương kháng bệnh ở Việt Nam, các giống đậu tương
hiện phổ biến trong sản xuất hiện mới chỉ có khả năng chống chịu bệnh RSĐT ở mức
trung bình, chưa có giống kháng bệnh cao. Giống DT 2000 mới được ghi nhận kháng
bệnh rỉ tại Việt Nam lại có thời gian sinh trưởng dài, không phù hợp với điều kiện sinh
thái Nam Bộ. Do đó cần kết hợp đặc tính kháng bệnh rỉ của giống DT 2000 với đặc
tính năng suất cao của giống ngắn ngày HL 203 (giống mới đang phổ biến ở Tây
Nguyên) bằng phương pháp lai hữu tính, hồi giao nhiều lần, kết hợp sử dụng chỉ thị
phân tử để hỗ trợ chọn tạo giống nhằm tăng tính chính xác và rút ngắn thời gian (Bùi
Chí Bửu và ctv., 2009).
2.2.5. Một số nghiên cứu về gen kháng bệnh rỉ sắt trên đậu tương

Bộ gen đậu tương (G.max (L.) Merr) có 20 nhiễm sắc thể và hiện đã xác định
được 20 nhóm liên kết nằm trên 20 nhiễm sắc thể này. Với nỗ lực của nhiều nhóm
nghiên cứu, hiện ta có một bản đồ đậu tương hợp nhất với 20 nhóm liên kết chứa tổng
số 1488 chỉ thị, bao gồm 1006 SSR, 723 RFLP, 73 RAPD (Iqbal và Lightfoot, 2004).

9


Đối với tính kháng bệnh rỉ sắt hiện đã có năm locus kháng Rpp1, Rpp2, Rpp3,
Rpp4, Rpp5 được xác định vị trên bản đồ liên kết của đậu tương. Trong đó Rpp1 liên
hệ đến phản ứng miễn dịch, do đó không có dấu hiệu nào có thể thấy được trên cây
(Miles và ctv., 2006). Đáp ứng kháng điều phối bởi các locus Rpp2-Rpp5 giới hạn sự
phát triển của nấm bệnh và sự hình thành bào tử qua dạng vết RB cho thấy một phản
ứng kháng dạng siêu nhạy cảm (Hypersensitive-like Response - HR) (Bonde và ctv.,
2006; Garcia và ctv., 2008). Vết TAN đi kèm sự hình thành bào tử là đặc trưng cho
tương tác mẫn cảm với nấm rỉ sắt (Bromfield và Hartwig, 1980; Bromfield, 1984;
Miles và ctv., 2006). Các nguồn gen kháng đã được xác định đều có phản ứng đặc
trưng với một số dòng nấm P. pachyrhizi nhất định (Bonde và ctv.,2006).
Cho đến nay, tất cả các locus kháng RSĐT được ước lượng đã bị vượt qua bởi
ít nhất một mẫu phân lập của nấm RSĐT (Miles và ctv., 2006; Yamaoka và ctv.,
2002). Chẳng hạn khi Rpp2 và Rpp4 vẫn giữ được hiệu quả đối với mẫu phân lập nấm
RSĐT của Brazil thì Rpp1 và Rpp3 bị đánh bại vào năm 2003, chỉ 2 năm sau khi phát
hiện RSĐT ở Brazil. Các locus Rpp2 và Rpp4 được phát hiện lần lượt ở các dòng PI
230970 và PI 459025 và biểu hiện như là một alen trội đơn (Bromfield và Hartwig,
1980; Hartwig, 1986).
Tính kháng rỉ đơn gen là tính trạng dễ mất đi ở nhiều loài. Ở lúa mì, tính kháng
rỉ có bản chất đặc hiệu với một số nòi nấm bệnh, không tồn tại lâu và thường xuyên
liên hệ với những loại tính kháng khác để có tính kháng bền vững hơn (Kolmer, 1996).
Gần đây, những nỗ lực được thực hiện bởi các chương trình gây giống để đưa các
locus kháng RSĐT vào những giống đậu tương canh tác ưu việt, và việc tập hợp nhiều

locus kháng lại với nhau có thể dẫn đến tính kháng RSĐT bền vững hơn, có thể khắc
phục được lịch sử thất bại của nhiều cơ chế kháng đơn gen ở thực vật, đặc biệt ở
những gen dẫn đến đáp ứng siêu nhạy cảm (Niks và Rubiales 2002). Khó khăn cơ bản
của tiến trình này là để chọn lọc những cây mang nhiều hơn một locus kháng bằng
phương pháp truyền thống, và những kỹ thuật có thể hỗ trợ việc lai nhập gen của nhiều
locus có thể rất hữu dụng ở phương thức này. Các chỉ thị DNA có một tiềm năng to
lớn trong việc hỗ trợ chọn lọc các kiểu gen kháng trong chương trình gây giống và
đang được sử dụng trong nhiều loại cây trồng, bao gồm cả đậu tương (Concibido và
ctv., 2004), chúng có thể làm dễ dàng hóa việc quy tụ nhiều locus kháng khác nhau

10


trong một loại cây trồng với mong muốn đạt được kháng bềnh vững hơn đối với P.
pachyrhizi trong tương lai (Silva và ctv., 2008).

Hình 2.4 Các phản ứng điển hình của cây đối với nấm rỉ sắt P.pachyrhizi.
(a) Đáp ứng miễn dịch, không có dấu hiệu quan sát được; (b) Dạng vết
bệnh RB vàTAN ; (c) Dạng vết RB, không có bào tử; (d) Dạng vết TAN đi
kèm rất nhiều bào tử (Jircas working report 58).
2.3. Chọn giống với hỗ trợ của chỉ thị phân tử (Marker Assisted Selection – MAS)
Sự kết hợp giữa chọn giống cổ điển và MAS là chiến lược đang được nhiều
quốc gia xem xét và vận dụng một cách hợp lý, để nâng cao hiệu quả chọn lọc giống
phục vụ cho yêu cầu sản xuất. MAS tạo nên các cơ hội để gia tăng cường độ chọn lọc
trong những thế hệ đầu tiên của phương pháp gia phả, trong khi phương pháp cổ
truyền gần như không có chọn lọc hoặc chọn lọc bằng mắt rất yếu để loại bỏ các dòng
xấu nhất. MAS có thể được xem là đặc biệt hữu dụng trong phương pháp gia phả đối
với những tính trạng rất khó và rất đắt tiền để thanh lọc, quan sát con lai, như tính kháng
hạn, tính kháng sâu bệnh hại, tính kháng lạnh (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999).
MAS và chiến lược xây dựng tính kháng bền vững

Tính kháng bệnh bền vững không liên kết với kiểu cơ chế kháng riêng biệt
mà chỉ liên hệ đến số lượng gen có liên quan đến phản ứng kháng, vì lý do đó việc tập
hợp nhiều alen kháng vào một cùng một bộ gen là một phương thức mở đầu cho việc

11


tăng cường cấp độ của tính kháng bệnh. Việc quy tụ nhiều gen kháng đơn với tính đặc
hiệu riêng biệt cho từng nòi mầm bệnh khác nhau đã được đề xuất là một phương thức
để đạt được tính kháng có tính bao hàm toàn diện hơn. Cơ hội lớn từ MAS để chọn lọc
những dòng tốt dựa trên kiểu gen hơn là kiểu hình trở nên thực sự rõ ràng trong trường
hợp kết hợp nhiều gen kháng di truyền đơn khác nhau của những tác động lớn đối với
mầm bệnh vào một kiểu gen đơn (gene pyramiding) vì rất khó khăn để chọn lọc cây
trồng với nhiều gen kháng chỉ dựa trên kiểu hình bởi hoạt động của gen này có thể che
lấp hoạt động của gen khác. Castro và ctv. (2003) đã chứng tỏ hiệu quả kháng được
tăng cường của việc tập hợp ba locus kháng bệnh rỉ sắt sọc trên lúa mạch gây bởi
Puccinia striiformis f. sp. horde nhờ chỉ thị phân tử (Mohler và Singrün, 2004).
2.4. Chỉ thị phân tử SSR và ứng dụng trong chọn giống đậu tương mang gen
kháng bệnh rỉ sắt
2.4.1. Chỉ thị phân tử SSR
Chỉ thị DNA microsatellite dựa trên phản ứng PCR chứa 10-20 đoạn lặp lại tri
hoặc di-nucleotide thể hiện đa hình cao ở đậu tương. Những đoạn này được gọi là các
đoạn trình tự lặp lại đơn giản (Simple sequence repeats- SSRs). Một số locus tiểu vệ
tinh đa hình cao có thể có đến 26 alen (Iqbal và Lightfoot, 2004).
SSR hay microsatellite marker phản ánh thể đa hình trên cơ sở đơn vị lặp lại
của một vùng mục tiêu nào đó của genome. Số lượng và thành phần của
microsattelite thay đổi trên thực vật so với động vật. Ở người, AC và TC là những
đơn vị lặp lại rất phổ biến, nhưng ở thực vật thì AT phổ biến hơn, theo sau đó là AG
hoặc TC. Chuỗi mã nucleotide kế cận chuỗi mã lập lại được dùng để thiết kế primer
nhằm khuếch đại số lượng khác nhau của đơn vị lặp lại trong những giống khác

nhau. Loại đa hình này có tính lặp lại rất cao (highly reproducible). Những primer
như vậy thực sự rất cần cho yêu cầu phát hiện nhanh và chính xác các locus đa hình
(Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999).
2.4.2. Những lý do để chọn SSR cho MAS đối với cây đậu tương
2.4.2.1. Vấn đề sử dụng chỉ thị phân tử trong MAS cho tính kháng bệnh
Cho đến nay, các chỉ thị phân tử đã được phát triển cho hơn 85 gen kháng bệnh đơn
gen khác nhau và cho 5 tính kháng bệnh số lượng khác. Vấn đề chính nằm ở giá trị của
những chỉ thị này đối với MAS. Langride và ctv (2001) đã so sánh những bước khác

12


nhau trong việc công nhận giá trị của chỉ thị cho MAS. Trước hết, những chỉ thị được
phát triển từ một quần thể phải được sử dụng để kiểm tra ở một quần thể khác có
nguồn gốc cha mẹ từ phép lai ban đầu. Trong nhiều trường hợp, các chỉ thị được phát
triển từ quần thể ban đầu không thể ứng dụng để kiểm tra quần thể khác. Do đó, rất
quan trọng để tập trung vào locus kháng với khoảng 10 chỉ thị trong một khoảng cách
gen nhỏ hơn 10 cM (lý tưởng với những chỉ thị định vị ở khoảng cách nhỏ hơn 1cM so
với vị trí gen đích). Điều này sẽ tăng thêm cơ hội tìm thấy ít nhất 1 chỉ thị hữu dụng
cho mọi quần thể gây giống. Vì những lý do này, tính đa hình cao của SSR làm cho
chúng trở thành marker được dùng phổ biến trong MAS (Feuillet và Keller, 2004).
2.4.2.2. Yếu tố then chốt trong triển khai thành công chỉ thị phân tử trong MAS
Các chỉ thị phải đồng phân ly hoặc được định vị trí trên bản đồ đến mức gần
nhất có thể đến gen mục tiêu (trong khoảng 2 cM), để tần suất tái tổ hợp thấp giữa gen
mục tiêu và chỉ thị. Mức độ chính xác của MAS sẽ được chứng minh ở 2 chỉ thị nằm 2
bên gen mục tiêu hơn là 1 chỉ thị đơn lẻ được sử dụng.
Đối với việc sử dụng không giới hạn trong MAS, các chỉ thị sẽ thể hiện tính
đa hình giữa các kiểu gen có mang và không mang gen mục tiêu.
Về mặt hiệu quả chi phí, chỉ thị PCR đòi hỏi phải đảm bảo khả năng xác
định kiểu gen cần thiết cho việc sàng lọc nhanh chóng của các quần thể lớn.

Các SSR mang tỉ lệ đột biến cao của những mẫu DNA nhỏ lặp lại hiện nay là
công cụ hoàn hảo nhất đối với MAS do đáp ứng tất cả những yêu cầu nên trên. Những
bộ sưu tập rộng rãi của các chỉ thị SSR được định vị trên bản đồ đối với cả những phần
biểu hiện và không biểu hiện của bộ gen sẽ trở nên thích hợp trong tương lai gần cho
tất cả các loài cây trồng chính (Mohler và Singrün, 2004).
2.4.2.3. Khả năng khai thác triệt để đa hình có ý nghĩa của SSR
SSRs là một chỉ thị đồng trội (codominant) có tính đa hình cao. SSR cho thấy
nó phân bố hoàn toàn ngẫu nhiên trên khắp bộ gen đậu tương. Chính bởi mức độ đa
hình alen cao của SSR đã làm tăng khả năng khảo sát đa hình giữa bố mẹ của quần thể
thu được từ phép lai của kiểu gen đậu tương được sử dụng. Đồng thời với khả năng
phát hiện dị hợp tử, SSR khai thác triệt để hơn hiệu quả lai giống trong phép lai
chuyển gen (Iqbal và Lightfoot, 2004).

13


2.5. Dòng đẳng gen (NIL) và ứng dụng trong chọn tạo giống
2.5.1. Cách tạo dòng NIL
RP x DP

F1 x RP

BC1 (Nếu là tính trạng trội, áp dụng chọn lọc cho BC1)
(Nếu là tính trạng lặn, tự thụ và áp dụng chọn lọc
trong BC1F2)

Những cá thể được chọn trong BCN được hồi giao với cha mẹ tái tục (RP)
( lặp lại chu kỳ cho 7-10 thế hệ)

NIL

Mục đích của việc phát triển dòng đẳng gen là để phục hồi một dòng gần giống
về mặt di truyền với dòng tái tục, trừ một hoặc một vài gen được chuyển vào từ DP.
Hầu hết NIL được tạo ra bằng cách hồi giao lặp lại hay lai cá thể đời con với một trong
những RP. Cha mẹ phân phối tính trạng quan tâm DP chỉ được sử dụng trong phép lai
đầu tiên. Tất cả phép hồi giao sau đó giữa đời con hồi giao và RP cho một locus đơn
đa hình, chỉ những kiểu gen đồng hợp và dị hợp (tỉ lệ 1:1) được hiện diện trong cá thể
lai hồi giao BCN (N là số thế hệ hồi giao). Do đó, việc sàng lọc kiểu hình của những cá
thể lai thì cần để đảm bảo rằng việc lựa chọn của những cá thể lai hồi giao dị hợp và
duy trì những gen quan tâm trong suốt quá trình hồi giao sau đó. Nếu tính trạng được
qui định bởi allel trội và kiểu hình có thể đánh giá trước khi ra hoa (ví dụ tính trạng
kháng bệnh) thì những cá thể lai hồi giao thế hệ N được chọn lọc được lai trực tiếp với
dòng tái tục. Nếu tính trạng được qui định bởi gen lặn, việc kiểm tra đời con phải được
áp dụng để xác định những con lai dị hợp. Tóm lại, mỗi con lai BCN thì được lai với
cha mẹ tái tục để tạo ra một thế hệ hồi giao mới và cũng cho phép tự thụ phấn để tạo ra
quần thể F2 phân ly BCNF2. Quần thể BCNF2 được sử dụng cho việc kiểm tra đời con
để xác định cá thể BCN nào là những cá thể dị hợp và do đó quần thể BCN+1 được tiến
hành tiếp tục trong việc phát triển dòng đẳng gen.
Nếu không có sự chọn lọc, phần trăm trung bình của những gen từ DP sẽ giảm
với mỗi phép lai hồi giao bằng ½ và có thể được xác định bởi công thức (1/2)n+1, n là
số thế hệ hồi giao. Vì vậy, sau 6 thế hệ hồi giao, quần thể BC6F1 sẽ có 0,8% bộ gen từ
14


DP và 99,2% từ RP và có thể được gọi chính xác là một dòng đẳng gen với RP. Khi
mức độ đẳng gen mong muốn giữa RP và NIL đạt được, NIL được tự thụ và dòng
đồng hợp thực thụ được chọn lọc. Lúc này, RP và NIL thì giống nhau chủ yếu tại tất cả
các locus trừ những gen được chọn lọc và những vùng liền kề bao quanh những gen
được chọn lọc (những gen được duy trì như gen của DP vì được liên kết). Từ bản đồ
liên kết, bất cứ sự đa hình nào được phát hiện giữa NIL và RP đều có thể là gần với
locus quan tâm.

2.5.2. Ưu điểm của dòng NIL
Những thế hệ hồi giao càng về sau thì sẽ giảm những mảng gen liên kết kèm theo làm
cho việc lập bản đồ chặt chẽ hơn của những gen quan tâm.
2.5.3. Khuyết điểm của dòng NIL
Việc chuyển nhiều gen thông qua quá trình tạo dòng đẳng gen đòi hỏi số lượng
lớn đời con hồi giao.
Phải tồn tại sự đa dạng di truyền có thể phát hiện được giữa RP và DP để phát
hiện liên kết giữa marker của 2 allele quan tâm.
Sự phát triển NIL có thể tốn nhiều thời gian, đặc biệt nếu những locus đa và lặn
được chuyển thông qua phương pháp hồi giao.
Bản đồ liên kết hoàn chỉnh không thể được tạo ra từ các NIL (Kole và Abbott, 2008).
2.6. Sơ lược các nghiên cứu có liên quan
2.6.1. Trên thế giới
Với sự thiệt hại sản lượng đậu tương nghiêm trọng mà bệnh RSĐT gây ra trên
khắp thế giới, RSĐT là đối tượng ngày càng có nhiều nghiên cứu về phương pháp
quan sát mức độ nhiễm bệnh, lập bản đồ các gen kháng.
Hyten và ctv. (2007) sử dụng chỉ thị SSR và dòng đẳng gen BC5 từ Williams 82
và PI200492 để định vị locus Rpp1 trên bản đồ.
Hai locus kháng Rpp2 và Rpp4 đã được lập bản đồ liên kết bằng các chỉ thị SSR
bởi Silva và ctv. (2008).
Tháng 5 năm 2008 Garcia và ctv. phát hiện và lập bản đồ locus kháng RSĐT
thứ năm: Rpp5.

15