Ứng dụng chỉ thị phân tử liên kết gần trong chọn giống lúa chịu ngập chìm

Ứng dụng chỉ thị phân tử liên kết gần trong
chọn giống lúa chịu ngập chìm

Vũ Thị Thu Hằng

Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên
Khoa Sinh học
Luận văn Thạc sĩ ngành: Di truyền học; Mã số: 60 42 70
Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Lƣu Thị Ngọc Huyền
Năm bảo vệ: 2011


Abstract. Tổng quan về ảnh hƣởng của biến đổi khí hậu, nƣớc biển dâng đến sản
xuất lúa gạo; các vùng trồng lúa ở Việt Nam có khả năng bị ngập theo kịch bản biến
đổi khí hậu. Nghiên cứu về cơ chế tính chống chịu ngập của cây lúa: gen chịu gập
của cây lúa và cơ chế hoạt động; sinh lý học tính chịu ngập của cây lúa; di truyền
tính chịu ngập của cây lúa. Tìm hiểu một số loại chỉ thị phân tử thƣờng đƣợc sử
dụng trong nghiên cứu Genome và chọn giống thực vật, đồng thời nghiên cứu chọn
tạo giống chụi ngập trên thế giới và ở Việt Nam. Nghiên cứu về giống lúa cho gen:
IR64Sub1 và giống lúa nhận gen: AS996 trong môi trƣờng chịu ngập nƣớc ở Việt
Nam. Trình bày các phƣơng pháp nghiên cứu: phƣơng pháp lai hữu tính -lai trở lại
giữa giống cho và nhận gen chịu ngập nƣớc; phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số;
phƣơng pháp PCR với mồi SSR; phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8%;
phƣơng pháp điện di trên gel polyacylamide; phƣơng pháp xử lý số liệu. Đƣa ra kết
quả nghiên cứu và thảo luận: tách chiết và tinh sạch ADN tổng số; khảo sát đa hình
giữa hai giống bố mẹ; quy tụ gen chịu ngập chìm SuB1 vào giống lúa AS996.

Keywords. Di truyền học; Phân tử; Giống lúa chịu ngập chìm; Cây lúa

Content
MỞ ĐẦU

Cây lúa (Oryza Sativa) là một trong những cây lƣơng thực quan trọng cho khoảng 2/3
dân số thế giới. Theo thống kê của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ, thế giới có khoảng 156,1 triệu
ha đất dùng cho việc trồng lúa, sản lƣợng là 697,9 triệu tấn, 90% diện tích này thuộc các
nƣớc châu Á với 651 triệu tấn thóc chiếm 92% tổng sản lƣợng lúa gạo thế giới. (Bộ Nông
nghiệp và PTNT, 2010)[3]
Trên thế giới, an ninh lƣơng thực không chỉ là vấn đề với các nƣớc nghèo mà nó đang
trở thành vấn đề có tính toàn cầu. Dân số thế giới liên tục tăng (khoảng 7 tỷ ngƣời năm 2011)
trong khi diện tích đất dành cho việc trồng lúa hầu nhƣ không tăng mà ngày càng giảm do đất
đƣợc chuyển sang sử dụng cho các mục đích khác nhƣ xây dựng khu công nghiệp, trƣờng
học, nhà ở, khu du lịch
Bên cạnh đó, các dấu hiệu về sự biến đổi khí hậu hiện nay đã có thể nhận thấy nhƣ
trái đất đang nóng lên, băng tan ở hai cực, bão lũ xảy ra thƣờng xuyên. Ở Việt Nam nhiệt độ
trung bình hàng năm tăng 0,1
0
C và mực nƣớc biển tăng 2,5 – 3,0 cm mỗi năm trong thập kỷ
qua. Tính đến cuối thế kỷ 21, nhiệt độ ở Việt Nam sẽ tăng khoảng 2,3
0
C và mực nƣớc biển
tăng 75 cm tính theo mức trung bình các năm 1980 – 1999.
Đối với gen chống chịu ngập cho đến nay các nhà khoa học ở Viện Nghiên cứu Lúa
Quốc tế đã xác định đƣợc một số các chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen có thể ứng dụng
trong chọn giống, sử dụng phƣơng pháp MABC để chọn giống chịu ngập chìm. Để góp phần
tạo ra giống lúa có khả năng chịu ngập chìm ứng phó với biến đổi khí hậu trong thời gian tới,
ứng dụng kết quả nghiên cứu vào sản xuất, chúng tôi thực hiện đề tài: ―Ứng dụng chỉ thị
phân tử liên kết gần trong chọn giống lúa chịu ngập chìm”.
Đề tài đƣợc đề ra với mục tiêu cụ thể sau:
- Sử dụng phƣơng pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp lai trở lại để quy tụ
gen chịu ngập (Sub1) đã đƣợc xác định trƣớc vào giống lúa năng suất cao đang đƣợc trồng
phổ biến ở Việt Nam với thời gian ngắn đáp ứng nhu cầu giống trong sản xuất.
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Các giống lúa nghiên cứu
- Giống lúa cho gen: IR64Sub1 là giống chịu ngập chìm là Giống lúa chống chịu ngập
đầu tiên tại Philippines đã đƣợc công nhận trong cuộc Họp Hội đồng thƣ ký lần thứ 27 ngày 7
tháng 7 năm 2009.
- Giống lúa nhận gen: AS996 là giống lúa chất lƣợng cao đƣợc bộ Bộ môn Di truyền
chọn giống Viện nghiên cứu Lúa ĐBSCL, đƣợc công nhận giống chính thức theo Quyết định
số 5310 QĐ/BNN-KHCN, ngày 29 tháng 11 năm 2002 của Bộ Nông Nghiệp & PTNT.
- Một số giống lúa đang đƣợc trồng phổ biến ở Việt Nam nhƣ Q5c, Q5l, OM5472, FL478,
IR64SUB1, AS996, KDDB, BT.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị thí nghiệm
- 372 chỉ thị SSR phân bố rải rác trên12 NST (phụ lục 1)
- Các vật tƣ, hóa chất sinh học phân tử chuyên dụng (phụ lục 2)
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Phƣơng pháp lai hữu tính đối với các giống lúa cho và nhận gen kháng. Kết hợp với
phƣơng pháp lai trở lại để chọn lọc và làm thuần nhanh những dòng mang gen kháng và nền
gen tối đa của giống nhận gen.
- Tách chiết và tinh sạch ADN theo phƣơng pháp CTAB cải tiến
- Chọn lọc cây con mang gen kháng thông qua phƣơng pháp PCR đối với các chỉ thị
SSR liên kết với QTL quy định tính chịu ngập chìm (Sub1). Chọn lọc nền gen thông qua
phƣơng pháp PCR đối với các chỉ thị phân bố trên 12 NST lúa.
- Điện di trên gel agarose 0,8% nhuộm Ethidium Bromide.
- Điện di trên gel polyacrylamide biến tính 4,5% nhuộm bạc.
- Điện di trên gel polyacrylamide không biến tính 6% nhuộm Syber safe.
- Phân tích dữ liệu trên chƣơng trình Graphical Genotyper (Van Berloo, 2008)[89].
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ADN TỔNG SỐ
Tách chiết ADN là bƣớc đầu tiên khá quan trọng trong mọi nghiên cứu về sinh học
phân tử. Nếu có ADN đủ độ tinh sạch là điều kiện tốt cho các bƣớc nghiên cứu tiếp theo.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn phƣơng pháp tách chiết ADN bằng CTAB. Nồng độ và

độ tinh sạch của ADN đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% cùng với ADN
chuẩn. Nhuộm gel bằng dung dịch ethidum bromide và ghi nhận kết quả trên máy soi cực
tím.





Hình 3. Kết quả kiểm tra ADN tổng số tách chiết theo phương pháp CTAB trên gel
agarose 0,8%.
Giếng số 1: Lambda ADN nồng độ chuẩn (200ng/

l), Các giếng từ 2 -17: ADN mẫu nghiên
cứu.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
16 17
Kết quả tách chiết ADN cho thấy phƣơng pháp tách chiết ADN bằng CTAB cho hiệu
quả cao, 100% số mẫu ADN đủ độ tinh sạch. Nồng độ trong khoảng từ 200 – 300ng/l khi so
sánh với lambda ADN chuẩn nồng độ 200ng/l giếng số 1. Các mẫu ADN không bị đứt gãy,
việc loại bỏ RNA bằng RNase tiến hành khá tốt thể hiện các băng điện di gọn, rõ. Những
mẫu ADN này đủ điều kiện để sử dụng cho những thí nghiệm sinh học phân tử tiếp theo.
3.2. KHẢO SÁT ĐA HÌNH GIỮA HAI GIỐNG BỐ MẸ
Đa hình giữa hai giống lúa có thể đƣợc phát hiện bằng chiều dài khác nhau của các
đoạn lặp lại đƣợc khuyếch đại bởi phản ứng PCR khi sử dụng cùng một cặp mồi SSR.
Giống IR64Sub1 có mang gen chịu ngập Sub1. Nhằm mục đích tìm kiếm chỉ thị có
thể sử dụng để phát hiện gen chịu ngập trong các cá thể con lai tiến hành phản ứng PCR với
ADN của các giống lúa 1.Q5c; 2.Q5l; 3.OM5472; 4. IR64Sub1; 5.FL478; 6.KDDB;
7.AS996, 8. BT. Sử dụng 372 chỉ thị SSR trên 12 nhiễm sắc thể kết quả có 53 chỉ thị cho
băng đa hình giữa giống AS996 và IR64Sub1 đƣợc nêu ở bảng 7.
Bảng7. Các chỉ thị SSR cho đa hình giữa giống cho và nhận gen chịu ngập

Tt
Tên mồi
NS
T
Trình tự xuôi
Trình tự ngược
Kích
thước
1
RM237
1
caaatcccgactgctgtcc
tgggaagagagcactacagc
130
2
RM10115
1
acaagacgaggtaacacgcaagc
gcgaaggatcaacgatgatatgg
245
3
RM7075
1
tgtgaagcacatccagtgatcc
gggatgagtgacacttgttaatgg
317
4
S01132a
1
caatgacgacgcatgtatgt

tgcttgaatgtttttcgagg
196
5
RM6
2
gtcccctccacccaattc
tcgtctactgttggctgcac
163
6
RM154
2
gacggtgacgcactttatgaacc
cgatctgcgagaaaccctctcc
271
7
RM341
2
caagaaacctcaatccgagc
ctcctcccgatcccaatc
172
8
RM109
2
gccgccggagagggagagagag
ccccgacgggatctccatcgtc
97
9
RM300
2
gcttaaggacttctgcgaacc

caacagcgatccacatcatc
121
10
RM6318
2
tgctgcttctgtccagtgag
ggatcataacaagtgcctcg
199
11
RM60
3
agtcccatgttccacttccg
atggctactgcctgtactac
165
12
RM3867
3
tttgactggaacatcgagctc
atcccctctacaccgtaccc
120
13
SO3068
3
gggatgggagaagggaataa
gccagctaggatgttgaagg
178
14
RM307
4
gtactaccgacctaccgttcac

ctgctatgcatgaactgctc
174
15
RM124
4
atcgtctgcgttgcggctgctg
catggatcaccgagctcccccc
271
16
R4M13
4
tacacggtagacatccaaca
atgatttaaccgtagattgg
169
17
R4M17
4
agtgctcggttttgttttc
gtcagatataattgatggatgta
169
18
RM3367
4
ggatccatccatccactgac
ggatatgtgctgctgtgtgc
126
19
RM437
5
acaccaaccagatcagggag

tgctcgtcaatggtgagttc
275
20
RM18877
5
accactgctgcaaagaacattgg
gcgagaataagatgagacacaagag
g
190
21
R5M20
5
ctcgctgtttactgactgg
tttgatgtactgcctgctct
175
22
S06061
6
gtcagtcgaggagtcggaga
ggcgtacagcacaaaacaca
178
23
S06065a
6
ccccttcatcattgcaactt
agtctctccatcacccgtct
164
24
RM508
6

ggatagatcatgtgtggggg
acccgtgaaccacaaagaac
235
25
RM19840
6
ttatacacagatgacgcacacg
tgggttaagggacacacttagg
200
26
RM3635
7
cgtgagagcgtgagagacag
actttggtgttccctccctc
109
27
RM18
7
ttccctctcatgagctccat
gagtgcctggcgctgtac
157
28
S07053
7
cgaaactttgggacgaaatg
cgtccaccattcactgtcac
223
29
RM149
8

ggaagcctttcctcgtaacacg
gaacctaggccgtgttctttgc
253
30
RM310
8
ccaaaacatttaaaatatcatg
gcttgttggtcattaccattc
105
31
RM337
8
gtaggaaaggaagggcagag
cgatagatagctagatgtggcc
192
32
RM105
9
gtcgtcgacccatcggagccac
tggtcgaggtggggatcgggtc
134
33
RM215
9
caaaatggagcagcaagagc
tgagcacctccttctctgtag
148
34
RM257
9

cagttccgagcaagagtactc
ggatcggacgtggcatatg
147
35
RM316
9
ctagttgggcatacgatggc
acgcttatatgttacgtcaac
192
36
RM23662
9
gagaggacgatggcactattgg
cgaggaacttgattcgcatgg
149
37
RM24013
9
tccatcttcctctcctagagcttcc
ctccctgtcccgagttagtgc
192
38
R9M10
9
ctttggattcaggggga
aacttgaaacggaggcag
135
39
RM7175
9

acagtaaacgtggtgcctcc
agaagtagcctcgaggaccc
105
40
ART5
9
cagggaaagagatggtgga
ttggccctaggttgtttcag
159
41
SC3
9
gctagtgcagggttgacaca
ctctggccgtttcatggtat
165
42
R9M30
9
cacatggcaccaacctcc
gccaagtcattcactactctgg
123
43
RM296
9
cacatggcaccaacctcc
gccaagtcattcactactctgg
123
44
RM228
10

ctggccattagtccttgg
gcttgcggctctgcttac
154
45
RM271
10
tcagatctacaattccatcc
tcggtgagacctagagagcc
101
46
RM25271
10
agacgctactcccacctgtaacc
atatcattgccgcaacacaagc
185
47
S11117C
11
caaccatgtctatgatcgatgt
ggctgtctccatgttgaggt
205
48
RM287
11
ttccctgttaagagagaaatc
gtgtatttggtgaaagcaac
118
49
RM206
11

atatgagttgctgtcgtgcg
caacttgcatcctcccctcc
134
50
RM224
11
atcgatcgatcttcacgagg
tgctataaaaggcattcggg
157
51
RM17
12
tgccctgttattttcttctctc
ggtgatcctttcccatttca
184
52
RM7558
12
cagtagcaggctcccttttg
atcaggaacaccagagacgg
149
53
RM7102
12
ttgagagcgtttttaggatg
tcggtttacttggttactcg
169
Tổng số 53 chỉ thị cho đa hình giữa giống cho gen (IR64 Sub1) và giống nhận gen
(AS996) đã đƣợc sử dụng để đánh giá xác định kiểu gen ở các thế hệ con lai.

Hình 4. Kết quả khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với
chỉ thị RM17; RM186; RM257; RM510
ADN: 1.Q5c; 2.Q5l; 3.OM5472; 4. IR64Sub1; 5.FL478; 6.KDDB; 7.AS996









Để lựa chọn gen đích (Sub1) tiến hành khảo sát một nhóm chỉ thị nằm ở vị trí của gen và
về hai phía của gen Sub1 trên nhiễm sắc thể số 9. Đã xác định đƣợc hai chỉ thị là ART5 và SC3
cho đa hình. Hai chỉ thị này liên kết rất chặt với gen Sub1. Chỉ thị ART5 đƣợc thiết kế từ vùng
promoter của gen Sub1 ở vị trí 6,3 Mb và chỉ thị SC3 ở ở vị trí 6,6Mb trên nhiễm sắc thể số 9.
Sau đó, để lựa chọn các cá thể tái tổ hợp tiến hành sử dụng 10 chỉ thị cho đa hình trên
nhiễm sắc thể số 9, những chỉ thị này nằm về hai phía của gen Sub1 có khoảng cách gần nhất là
1,8 Mb ở đầu trên tại vị trí của R9M10 và 2,8Mb ở đầu dƣới tại vị trí của RM24013 so với gen
Sub1 (vị trí của gen Sub1 là 6.3–6.6 Mb hoặc 4.4–6.8 cM). (Xu et al. 2006)[93]
Những mồi cho đa hình trên các nhiễm sắc thể còn lại không liên kết với gen Sub1
đƣợc sử dụng để kiểm tra nền di truyền của giống nhận gen. Kết quả đánh giá đa hình đƣợc
tổng kết lại ở bảng 8.
Bảng 8. Các bước chọn lọc sử dụng chỉ thị SSR cho đa hình trong các quần thể lai trở
lại
Các bước chọn lọc
Các mồi đa hình sử dụng cho quần thể

BC
1
F
1
đến BC
3
F
1

1
Lựa chọn cá thể
mang gen đích (Sub1)
ART5, SC3
2
Lựa chọn cá thể tái tổ
RM23662, RM316, R9M10, RM24013, RM105, RM7175,



Hình 5. Kết quả khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với
chỉ thị RM18; RM118; RM152; RM223; RM284
ADN: 1.Q5c; 2.Q5l; 3.OM5472; 4. IR64Sub1; 5.FL478; 6.KDDB; 7.AS996
hợp
RM257, RM215, RM296, R9M30
3
Lựa chọn nền di
truyền cây nhận gen
RM6, RM17, RM18, RM60, RM109, RM124, RM149,
RM154, RM206, RM224, RM228, RM237, RM311,
RM287, RM300, RM307, RM310, RM341, RM6318,

RM7558, RM10115, RM7102, RM25271, SO6061,
SO6065A, SO7053, S1117C, SO1132A, R4M13, R4M17,
R5M20, RM7075, SO3068, RM3367, RM3867, RM437,
RM508, RM19840, RM3635, RM337, RM7102.

3.3. QUY TỤ GEN CHỊU NGẬP CHÌM SUB1 VÀO GIỐNG LÚA AS996
3.3.1. Xác định con lai F
1

Thế hệ F
1
lai tạo đƣợc 22 cá thể. Các cá thể này đƣợc trồng, tách chiết ADN để xác
định cây lai nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử.
Để xác định các cá thể F
1
mang gen kháng, tiến hành phản ứng PCR với AND của mẹ
(AS996) và bố (IR64Sub1) và các con lai F
1
với hai chỉ thị cho đa hình liên kết chặt với gen
Sub1 là SC3, ART5. Kết quả kiểm tra xác định cá thể mang gen đƣợc minh họa ở hình 10.








Trong tổng số 22 cá thể F
1

đƣợc đánh số từ 1-22 tƣơng ứng từ giếng số 3 đến giếng số
24, ghi nhận có 11 mẫu ADN của 11 cá thể có mang 2 băng: 1 băng đặc trƣng cho AS996,
một băng đặc trƣng cho IR64Sub1 là các cá thể số: 4, 5, 6, 7, 9, 16, 17, 19, 20, 21, 22. Các cá
thể này đƣợc chọn làm mẹ để tiến hành lai trở lại với giống nhận gen tạo thế hệ BC
1
F
1
.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Hình 10. Kiểm tra cá thể mang gen kháng ở thế hệ F
1
với chỉ thị
SC3
Giếng số 1: AS996, giếng số 2: IR64Sub1, giếng 3-24 con lai F
1






3.3.2. Quy tụ gen Sub1 vào giống AS996 ở thế hệ BC
1
F
1
Dựa trên bản đồ vùng QTL chịu ngập thì chỉ thị tốt nhất trong khu vực Sub1 là ART5
đƣợc thiết kế từ vùng promoter của gen và SC3 đƣợc thiết kế ở phía dƣới của gen Sub1 trên
NST số 9 đƣợc sử dụng để lựa chọn những cá thể mang gen. Phản ứng PCR đƣợc tiến hành
giữa ADN các giống lúa AS996, IR64Sub1 và các con lai với hai chỉ thị trên.
Tổng số 497 cá thể của quần thể BC

1
F
1
đƣợc tiến hành tách chiết ADN và
kiểm tra sự có mặt của gen đích (Sub1) bằng hai chỉ thị liên kết chặt là ART5 và SC3. Kết
quả đƣợc minh họa ở hình 11 và 12.




Kết quả trên hình 11 thể hiện khi phân tích các cá thể BC
1
F
1
với chỉ thị SC3 những cá
thể dị hợp tử mang 2 băng của cả giống nhận gen ở giếng số 49 và giống cho gen ở giếng số
50 là các giếng số 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 16, 18, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 42,
44, 48.
Giếng số 5, 11, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 24, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 41, 46, 47 chỉ
mang băng của giống nhận gen, những cá thể này không mang gen kháng đƣợc loại bỏ ở các
bƣớc sàng lọc sau.






Hình 11. Kết quả sàng lọc các cá thể BC
1
F

1
(AS996/IR64Sub1) với
chỉ thị SC3. Giếng 1, 26: 25bp ladder, 2-25 và 27-48: các cá thể
BC
1
F
1

Giếng 49:AS996, giếng 50: IR64Sub1


Hình 12. Kết quả sàng lọc các cá thể BC
1
F
1
(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị
ART5.Giếng 1, 50: 25bp ladder, giếng 2:AS996, giếng 3:IR64Sub1, 4-49:
các cá thể BC
1
F
1


Kết quả trên hình 12 thể hiện khi phân tích các cá thể BC
1
F
1
với chỉ thị ART5 những
cá thể dị hợp tử mang 2 băng của cả giống nhận gen ở giếng số 2 và giống cho gen ở giếng số
3 là các giếng số 5, 6, 7, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 22, 23, 24,26, 27, 33, 34, 39, 45, 47, 48.

Kết quả thu đƣợc 165 cá thể BC
1
F
1
dị hợp tử với cả hai chỉ thị ART5 và SC3. Những
cá thể dị hợp tử mang cả hai băng của giống nhận gen và giống cho gen với cả hai chỉ thị
ART5 và SC3 đƣợc lựa chọn để chọn lọc các cá thể tái tổ hợp. Sàng lọc cá thể tái tổ hợp từ
165 cá thể dị hợp tử mang gen đích Sub1 tiến hành sử dụng 10 chỉ thị cho đa hình trên nhiễm
sắc thể số 9.
Kết quả phân tích để sàng lọc cá thể tái tổ hợp trên NST 9.







Sàng lọc các cá thể BC
1
F
1
với chỉ thị RM23662 ở hình 13 cho thấy cá thể tái tổ hợp
mang băng đồng hợp tử giống nhận gen ở giếng số 44 và giếng số 46.

Hình 13. Sàng lọc các cá thể BC
1
F
1
(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị RM23662
Giếng 1,26: 25bp ladder, 2-25 và 27-48: các cá thể BC
1
F
1
giếng 49:AS996,
giếng 50: IR64Sub1



Hình 14. Sàng lọc các cá thể BC
1
F
1
(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị RM24013
Giếng 1,26,51: 25bp ladder, 2-25 và 27-48: các cá thể BC
1
F
1
, giếng 49:AS996, giếng50:IR64Sub1
Sàng lọc các cá thể BC
1
F
1
với chỉ thị RM240113 ở hình 14 cho thấy cá thể tái tổ hợp

mang băng đồng hợp tử giống nhận gen ở giếng số 14, 27, 34, và giếng số 46.
Tƣơng tự sàng lọc các cá thể BC
1
F
1
với chỉ thị RM7175 ở hình 15 cho thấy cá thể tái
tổ hợp mang băng đồng hợp tử giống nhận gen ở giếng số 2, 6, 10, 11, 14, 15, 16, 18, 20, 24,
27, 30, 31, 32, 33, 34, 40, 42 và giếng số 46.
Sử dụng 10 chỉ thị lựa chọn đƣợc tổng số 14 cá thể tái tổ hợp, trong đó 5/14 cá
thể tái tổ hợp mang trao đổi chéo tại vị trí của R9M10 và RM24013; 9/14 cá thể tái tổ hợp tại
1 đầu của NST tại vị trí của RM24013. Kết quả này đã xác định đƣợc đoạn trao đổi chéo
mang gen Sub1 ở cả hai đầu trên và dƣới của gen Sub1 đã đƣợc chuyển vào các dòng BC
1
F
1
.
Kết quả 14 cá thể tái tổ hợp đƣợc lựa chọn để tìm cá thể mang nền di truyền cây mẹ lớn nhất
là các cá thể số 5, 6, 39, 62, 63, 103, 153, 166, 215, 327, 340, 412, 422, 428.
Đối với thế hệ BC
1
F
1
, tổng số 26 chỉ thị cho đa hình không liên kết với gen
Sub1 trên 11 nhiễm sắc thể còn lại để lựa chọn nền di truyền của cây nhận gen.
Số liệu của từng cá thể đƣợc đƣa vào phân tích trên chƣơng trình Graphical
Genotyper để lựa chọn. Các cá thể nào mang gen đồng hợp tử cây mẹ nhiều nhất sẽ đƣợc lựa
chọn để lai tạo thế hệ BC
2
F
1

. Kết quả đƣợc nêu ở bảng 10, hình 16, và hình 17.
Bảng 10. Tỉ lệ phần trăm alen giống nhận gen của 14 cá thể BC
1
F
1
tái tổ hợp
Cây số
5
6
39
62
63
103
153
166
215
327
340
412
422
428
A
66.67
54.17
62.50
41.67
54.17
45.83
58.33
45.83

66.67
58.33
66.67
72.00
75.00
72.00
H
25.00
45.83
37.50
58.33
45.83
33.33
41.67
54.17
33.33
41.67
33.33
24.00
25.00
24.00
R%
79.17
77.08
81.25
70.83
77.08
62.50
79.17
72.92

83.33
79.17
83.33
84.00
87.50
84.00

Từ kết quả trên cho thấy 14 cá thể tái tổ hợp có mang gen Sub1 và chứa tối đa
nền gen của giống nhận gen từ 62,5% đến 87,5%. Các cá thể có nền di truyền cao nhất là
P422 với 87,5% ngoài ra còn có các cá thể P412 (84%) P428 (84%), P215 (83,33) và P39
(81,25).
Kết quả đã lựa chọn đƣợc 5 cá thể BC
1
F
1
có mang vùng gen Sub1 và chứa tối đa nền
gen của giống nhận gen (R%) trong khoảng từ 80 - 86% để tiếp tục lai tạo thế hệ BC
2
F
1
. Gen
Sub1 là một trong những gen chính quy định tới 70% tính chống chịu ngập chìm trong hầu
hết các giống lúa đã đƣợc các nhà khoa học IRRI thử nghiệm từ trƣớc tới nay.
3.3.3. Quy tụ gen Sub1 vào giống AS996 ở thế hệ BC
2
F
1
Từ 5 cá thể BC
1
F

1
đƣợc lựa chọn đã lai tạo đƣợc quần thể thế hệ BC
2
F
1
với
506 cá thể. Tiến hành tách chiết ADN, làm phản ứng PCR với các bƣớc nhƣ ở thế hệ BC
1
F
1
.
Kết quả đƣợc minh họa ở hình 18 và hình 19





Khi phân tích các cá thể BC
2
F
1
với chỉ thị SC3 những cá thể dị hợp tử mang 2 băng
của cả giống cho gen và giống nhận gen là giếng số 4, 5, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19,
22, 25, 27, 29, 31, 35, 36, 39.
Những giếng còn lại các cá thể chỉ cho 1 băng của giống nhận gen là AS996 những cá
thể này không mang gen Sub1.



Khi phân tích các cá thể BC

2
F
1
với chỉ thị ART5 những cá thể dị hợp tử mang 2 băng
của cả giống là giếng số 3, 5, 10, 16, 18, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
42, 47, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 59, 60, 61.
Những giếng còn lại mang băng của AS996.
Hình 18. Sàng lọc các cá thể BC
2
F
1
(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị SC3
1.AS996, 2. IR64Sub1, các giếng ký hiệu từ C1-C41: các cá thể BC
2
F
1








Hình 19. Sàng lọc các cá thể BC
2
F
1
(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị ART5
ADN: 1AS996, 2. IR64Sub1, Các giếng ký hiệu từ C67-C328: Các cá thể BC

2
F
1






Sau bƣớc sàng lọc gen đích với hai chỉ thị ART5 và SC3 để kiểm tra sự có mặt
của gen đích Sub1 trong các cá thể con lai thu đƣợc 245 cá thể dị hợp tử mang hai băng của
cả giống cho và nhận gen.
Sau đó,Tiến hành chọn lọc các cá thể tái tổ hợp bằng 10 chỉ thị kề hai bên gen Sub1
trên nhiễm sắc thể số 9 đƣợc nêu ở bảng 8 với 245 cá thể mang gen. Kết quả đƣợc minh họa
từ hình 20 đến hình 22.


Sàng lọc các cá thể BC
2
F
1
với chỉ thị RM316 ở hình 20 cho thấy cá thể tái tổ hợp
mang băng đồng hợp tử giống nhận gen ở giếng số 55, 56, 57, 66.




Sàng lọc các cá thể BC
2
F

1
với chỉ thị RM105 ở hình 21 cho thấy cá thể tái tổ
hợp mang băng đồng hợp tử giống nhận gen ở giếng số 8, 12, 14, 17, 19, 25, 31, 45.51.
Sau khi sàng lọc với 10 chỉ thị trên NST số 9 chọn ra đƣợc 17 cá thể tái tổ
hợp.
Kết quả cá thể có nền gen cây nhận gen cao nhất là 93,75 % là cá thể số P442
-11 và P442 -14. Cá thể có nền gen cây nhận gen thấp nhất là 89,7% ở cá thể số P39-80.
Hình 21. Sàng lọc các cá thể BC
2
F
1
(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị
RM105
ADN: 1.AS996, 2. IR64Sub1, giếng 3-53: các cá thể BC
2
F
1








Hình 20. Sàng lọc các cá thể BC
2
F
1
(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị RM316

1.AS996, 2. IR64Sub1, C3-C189:Các cá thể BC
2
F
1

1 2 3
Ngoài ra, còn có các cá thể P442-12, P422-3, P39-17, P39-25 có nền gen cây nhận gen là
92,25%. Các cá thể có mang gen Sub1 và có nền gen cây nhận gen cao nhất là P442 -11 và
P442 -14. P442-12, P422-3, P39-17, P39-25 đƣợc chọn để lai tạo quần thể BC
3
F
1
.
3.3.4. Quy tụ gen Sub1 vào giống AS996 ở thế hệ BC
3
F
1

Tƣơng tự nhƣ với quần thể BC
2
F
1
cho thế hệ BC
3
F
1
với 445 cá thể. Sử dụng
hai chỉ thị ART5 và SC3 là hai chỉ thị liên kết chặt với gen Sub1 để lựa chọn cá thể mang gen
Sub1 ở thế hệ BC
3

F
1
. Kết quả đƣợc minh họa ở hình 23 và 24




Khi phân tích các cá thể BC
3
F
1
với chỉ thị SC3 những cá thể dị hợp tử mang 2 băng
của cả giống cho gen ở giếng số 49 và giống nhận gen ở giếng số 50 là giếng số 3, 5, 6, 8, 10,
14, 17, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 30, 31, 32, 33, 35, 39, 40, 41, 42, 43, 46, 47.
Những giếng còn lại các cá thể đều mang băng của giống nhận gen AS996.







Khi phân tích các cá thể BC
3
F
1
với chỉ thị ART5 những cá thể dị hợp tử mang 2 băng
của cả giống nhận gen và giống cho gen là giếng số 5, 6, 10, 16, 17, 19, 22, 23, 24, 25, 28,
31, 32, 34, 35, 36, 38, 41, 43, 44, 45, 50, 51.

Hình 24. Sàng lọc các cá thể BC
3
F
1
(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị ART5 giếng 1,
27: 25bp ladder, giếng 2:AS996, giếng 3:IR64Sub1, 4 26, 28-49: các cá
thể BC
1
F
1
.
Hình 23. Sàng lọc các cá thể BC
3
F
1
(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị SC3 Giếng 1:
25bp ladder, 2-48: các cá thể BC
3
F
1
, giếng 49:AS996, giếng 50: IR64Sub1

Các giếng còn lại các cá thể chỉ cho băng của AS996
Lựa chọn những cá thể dị hợp tử với cả hai chỉ thị chúng tôi xác định đƣợc 124 cá thể
mang gen Sub1. Sau đó, 124 cá thể mang gen này tiếp tục sàng lọc với các chỉ thị trên NST
số 9 để tìm ra các cá thể tái tổ hợp.

Sàng lọc các cá thể BC
3
F
1
với chỉ thị RM7175 ở hình 25 cho thấy tất cả các cá thể là
tái tổ hợp mang băng đồng hợp tử của giống nhận gen.




Sàng lọc các cá thể BC
3
F
1
với chỉ thị RM24013 ở hình 26 cũng cho thấy tất cả các cá
thể là tái tổ hợp mang băng đồng hợp tử của giống nhận gen.
Sàng lọc từ 10 chỉ thị cho đa hình trên NST số 9 với 124 cá thể. Kết quả chọn đƣợc 22
cá thể tái tổ hợp. Những cá thể này đƣợc tiếp tục chọn lọc nền di truyền của giống nhận gen.
Hình 25. Sàng lọc các cá thể BC
3
F
1
(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị 7175
Giếng1:25bp ladder, 4-45:Các cá thể BC
3
F
1
, giếng 2,46 :AS996, giếng3,47:

IR64Sub1
Hình 26. Sàng lọc các cá thể BC
3
F
1
(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị RM24013
Giếng 47: 25bp ladder,3-44: Các cá thể BC
3
F
1,
giếng1, 45:AS996, giếng2, 46:
IR64Sub1

Sử dụng 19 chỉ thị trên 11 nhiễm sắc thể còn lại. Thí nghiệm này đƣợc minh họa ở hình số 28
đến hình số 30.









Sàng lọc các cá thể BC
3
F
1
ở hình 3.26 với chỉ thị RM10115 trên NST số 1 và Chỉ thị
S11117C trên NST số 11 nhận thấy tất cả các cá thể đều mang băng đồng hợp tử giống nhận

gen là AS996 .




Sàng lọc các cá thể tái tổ hợp BC
3
F
1
ở hình 29 với chỉ thị R4M17 trên NST số 4 còn 3
cá thể ở giếng số 3, 4, 5, vẫn mang băng của giống cho gen. Chỉ thị R5M20 trên NST số 5 thì
các cá thể đều mang băng đồng hợp tử của giống nhận gen
Sàng lọc các cá thể BC
3
F
1
ở hình 30 với chỉ thị RM341 trên NST số 2 và chỉ thị
RM228 trên NST số 10 cũng nhận thấy tất cả các cá thể đều mang băng đồng hợp tử giống
nhận gen là AS996 .

Hình 28. Sàng lọc các cá thể BC
3
F
1
(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị RM10115 (trái)
Giếng1,25: 25bp ladder, giếng 2:AS996, giếng 3: IR64Sub1 4-24:các cá thể BC
3
F
1
.

S1117C (phải) giếng1: 25bp ladder, giếng 2:AS996, giếng 3: IR64Sub1 4-24:các cá thể
BC
3
F
1
.

Hình 29. Sàng lọc các cá thể BC
3
F
1
(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị R4M17 và R5M20
Giếng1,26 AS996, giếng 2,27: IR64Sub1;3-22, 28-49: các cá thể BC
3
F
1
,
giếng25: 25bp

Số liệu của từng cá thể đƣợc đƣa vào phân tích trên chƣơng trình Graphical
Genotyper để lựa chọn cá thể BC
3
F
1
. Các cá thể nào mang gen đồng hợp tử cây mẹ nhiều
nhất sẽ đƣợc lựa chọn để lai cho lai tạo thế hệ BC
4
F
1.
1: chrom1 2: chrom2 3: chrom3 4: chrom4 5: chrom5 6: chrom6 7: chrom7 8: chrom8 9: chrom9 10: chrom10 11: chrom11 12: chrom12

15
45
57
144
164
176
177
178
189
201
216
239
251
252
255
318
320
321
354
356
357
404
Consensus
Legend
. A B H

Hình 31. Biểu đồ 12NST của 22 cá thể thế hệ BC
3
F
1

(AS996/IR64 Sub1)

Kết quả xác định đƣợc hai cá thể P422-14-164 và P422-14-178 có nền gen cây
nhận lên đến 96.29% so với AS996 ban đầu, cá thể số 422-14-177 là tốt nhất với 100% alen
từ AS996 trong tổng số 53 chỉ thị sử dụng. Tất cả 3 cá thể này một mặt đƣợc dùng để tự thụ
cho gen Sub1 đồng hợp tử BC
3
F
2
, đồng thời tiếp tục lai tạo quần thể BC
4
F
1.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1/ Khảo sát đa hình giữa hai giống bố mẹ AS996xIR64Sub1 thu đƣợc 53 chỉ
thị đa hình trong tổng số 372 chỉ thị. Xác định đƣợc 11 cá thể mang gen Sub1 từ 22 cá thể F
1

từ tổ hợp lai AS996 x IR64Sub1.
2/ Kết quả sàng lọc 497 cá thể BC
1
F
1
thu đƣợc 165 cá thể mang gen Sub1, từ
đó chọn lọc đƣợc 14 cá thể tái tổ hợp mang gen Sub1 và chứa tối đa nền gen giống nhận gen
từ 62,5%- 87,50%. Trong đó, cá thể có nền gen của giống nhận gen cao nhất là P422 với
87,50%.
3/ Kết quả sàng lọc 506 cá thể BC

2
F
1
thu đƣợc 245 cá thể mang gen Sub1, xác
định đƣợc 17 cá thể tái tổ hợp mang gen Sub1 và hai trong số 17 cá thể này chứa nền gen của
giống nhận gen cao nhất là cá thể P442 -11 và P442 -14 đạt 93,75 %.
4/ Kết quả sàng lọc 445 cá thể BC
3
F
1
thu đƣợc 124 cá thể mang gen Sub1 trong đó có
22 cá thể tái tổ hợp. Dòng BC
3
F
1
có nền di truyền cây nhận gen cao nhất là P422-14-177 với
100% alen từ AS996 trên tổng số 53 chỉ thị đã phân tích.
Kiến nghị
Các dòng BC
4
F
1
và BC
3
F
2
sẽ tiếp tục đƣợc nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử, đánh giá
ngập nhân tạo, kết hợp với chọn giống truyền thống để tạo các dòng AS996- Sub1 có thể
trồng ở các vùng ngập nƣớc, lũ lụt góp phần vào công tác chọn tạo giống lúa ứng phó với
biến đổi khí hậu.

References

Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn Duy Bảy, Nguyễn H.T., Bùi Chí Bửu và Bùi Bá Bổng (2001), Chọn giống nhờ
Marker và Phân tích QTL, Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, tr. 44 - 58.
2. Bộ Tài nguyên và Môi trƣờng (2009), ―Chƣơng trình mục tiêu quốc gia ứng phó với biến
đổi khí hậu‖ Kịch bản biến đổi khí hậu, nước biển dâng cho Việt Nam, Hà Nội tháng 6
năm 2009.
3. Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn (2009), Quy hoạch sử dụng đất lúa cho từng
vùng trên cả nước.
4. Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn (2010), Số liệu ước tính của USDA.
5. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2000), Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống
cây trồng, Di truyền phân tử I, NXB Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh.
6. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2003), Cơ sở di truyền tính chống chịu đối với
thiệt hại do môi trƣờng của cây lúa, Nxb Nông nghiệp TPHCM.
7. Lƣu Minh Cúc, Nguyễn Thị Kim Liên, Vũ Thị Thu Hằng, Nguyễn Quang Đàm, Phạm Thị
Minh Hiền, Lƣu Thị Ngọc Huyền, Vũ Đức Quang (2010). ―Khảo sát đa dạng di truyền
một số giống lúa nếp bằng chỉ thị phân tử SSR‖. Tạp chí khoa học và công nghệ nông
nghiệp Việt Nam số 6 (19), trang 2-6.
8. Nguyễn Văn Cƣờng, Tổng quan về BĐKH và tác động của chúng đến hoạt động của con
ngƣời, Viện Nghiên cứu và Đào tạo Phát triển Công nghệ.
9. Trịnh Đình Đạt (2006), Công nghệ sinh học tập 4, Nxb Giáo dục.
10. Nguyễn Thị Lan Hoa, Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Nguyễn Thanh Quân, Phạm Thị Hoa,
Nguyễn Thị Nhài, Nguyễn Thị Tân Phƣơng, Trịnh Minh Hợp, Nguyễn Duy Bảy,
Nguyễn Văn Giang, Nguyễn Thị Thanh Thủy (2009), ―Phân tích và xác định các chỉ thị
phân tử đa hình phục vụ lập bản đồ các nhóm liên kết genome và xác định vị trí gen
kháng bệnh xanh lùn ở cây bông cỏ (Gossypium arboreum L.)‖, Tạp chí Công nghệ
Sinh học Việt Nam, 8 (1), tr. 69-74.
11. Đào Xuân Học Thứ trƣởng Bộ NN và PTNT, Bài trình bày Hội thảo Việt Nam thích ứng

với biến đổi khí hậu, Hội An – Quảng Nam 31/7/2009.
12. Lê Thị Ánh Hồng (2002), Bệnh học phân tử thực vật, Nxb Nông nghiệp.
13. Hội thảo về Biến đổi Khí hậu, Kịch bản biến đổi khí hậu nước biển dâng cho việt nam,
Hội An, 31/7/2009 phần II.
14. Lƣu Thị Ngọc Huyền (2003), Nghiên cứu lập bản đồ gen kháng rầy nâu ở giống lúa
CR203 và ứng dụng trong chọn giống, Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp, Viện Di truyền
Nông nghiệp Việt Nam.
15. Lƣu Thị Ngọc Huyền, Vũ Đức Quang, Lƣu Minh Cúc, Phạm Thị Minh Hiền, Vũ Thị Thu
Hằng, Nguyễn Thị Trang, Đinh Văn Thành (2010), ―Chỉ thị phân tử trợ giúp trong chọn
giống lúa kháng rầy nâu‖. Tạp chí khoa học và công nghệ nông nghiệp Việt Nam số 6
(19), trang 11-17.
16. Nguyễn Thị Lang (2002), Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học,
Nxb Nông nghiệp, TPHCM.
17. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu (2004), ―Ứng dụng marker phân tử đánh dấu gen mùi
thơm trên lúa‖, Di truyền học và Ứng dụng (2).
18. Lã Tuấn Nghĩa, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý (2004), Cơ sở lý thuyết và ứng dụng công
nghệ gen trong chọn giống cây trồng. Anh tuấn
19. Lã Tuấn Nghĩa (2011), chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn có năng suất chất lƣợng
cao bằng chỉ thị phân tử, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2+3/2011.
20. Nguyễn Đức Ngữ, ―Biến đổi khí hậu và khô hạn, hoang mạc hóa‖ Báo cáo tại Hội thảo
BĐKH toàn cầu và giải pháp ứng phó của Việt Nam, Hà Nội, 26-29/2/2008.
21. Nguyễn Kỳ Phùng, Bùi Chí Nam, Đánh giá tác động nước dâng do biến đổi khí hậu đến
dải ven biển tỉnh khánh hòa, Hội ĐTM Việt Nam và Phân viện Khí tƣợng Thủy văn và
Môi trƣờng phía nam.
22. Susmita Dasgupt, Benoit Laplante, Craig Meisner,

David Wheeler,

Jianping Yan (2007),

Ảnh hưởng của mực nước biển dâng cao ở các nước đang phát triển Phân tích so sánh

,
Bài nghiên cứu Chính sách của Ngân hàng Thế giới 4136 tháng 2 năm 2007.

23. Lê Duy Thành (2000), Cơ sở di truyền chọn tạo giống thực vật, Nxb ĐHQG Hà Nội.
24. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Bài giảng công nghệ sinh học, Trƣờng Đại
học Nông nghiệp I Hà Nội, Viện Sinh học Nông nghiệp, tr. 61.
25. Lê Anh Tuấn (2009), Tổng quan về nghiên cứu biến đổi khí hậu và các hoạt động thích
ứng ở miền Nam Việt Nam, Viện Nghiên cứu Biến đổi Khí hậu – Trƣờng Đại học Cần
Thơ.

Tài liệu tiếng Anh
26. Abdelbagi M. Ismail, Evangelina S. Ella, Georgina V. Vergara and David J. Mackill
(2009), Mechanisms associated with tolerance to flooding during germination and
early seedling growth in rice (Oryza sativa), Annals of Botany 103: 197–209.
27. Armour J.A L. and Jeffreys A J. (1992). ―Biology and application of human minisatellite
loci‖. Curr. Opin. Genet. Dev. 2, pp. 850 - 856.
28. Bert Collard and David Mackill (2005), Marker assisted breeding for rice
improvement, MAB lecture of plant breeding genitics and Biotechnology division,
IRRI.
29. Botstein D., White R.L., Skolnick.M. and Davis R.W. (1980) ―Construc tion of a
genetic linkage mapin man using restriction fragement length polymorphisms‖.
Amer. J. Hum. Genet. 32, pp. 314 - 331.
30. Caldo, RA and Sebastian, LS (1998), ―Molecular diversity of philippine improved rice
varieties and their progenitors using RAPD and SSR markers‖, Agricultural
biotechnology, 72, pp. 79 - 81.
31.Chang TT, JT Armenta-Soto, CX Mao, R Peiris, and C Loresto (1985), ―Genetic studies
on the components o drought resistance in rice (Oryza sativa L.)‖, Paper presented at
the ins. Rice Genetics symposium, 27-3 May 1985. IRRI. Los Banos, Philippines.

32. Chen D., Dela Vina M., et al (1999), ―Molecular mapping of the blast resistance gene, Pi-
44(t), in a line derived from a durably resistance rice cultivar,‖ Theor. Appl. Genet, 97,
pp. 345 - 355
33. Chen X. M., Line R. F., Leung H. (1998), "Genome scanning for resistance gene analogs
in rice, barley and wheat by high- resolution electrophoresis", Theor. Appl. Genet., 97,
pp. 345-355.
34. C. N. Neeraja, R. Maghirang-Rodriguez, A. Pamplona, S. Heuer, B. C. Y. Collard E. M.
Septiningsih, G. Vergara, D. Sanchez, K. Xu, A. M. Ismail, D. J. Mackill (2007), ―A
marker-assisted backcross approach for developing submergence-tolerant rice
cultivars‖, Theor Appl Genet (2007) 115:767–776.
35. Choudhury MA (1975), ―Genetics and breeding of deepwater rice‖, In Proceeding of the
Int. Seminaron deepwater rice 197, Bang ladesh. pp. 83-86.
36. Church, J.A., Gregory, J.M., Huybrechts, P., Kuhn, M., Lambeck, K., Nhuan, M.T., Qin,
D., Woodworth, P.L., (2001) ―Changes in sea level‖ In: Houghton, J.T., Ding,
Y.,
Griggs, D.J., Noguer, M., van der Linden, P.J., Xiaosu, D. (eds.), Climate
Change
2001, The Scientific Basis. Cambridge University Press, Cambridge, pp. 639-
693.
37. Collard BCY and Mackill DJ (2008), ―Marker assisted selection: an approach for
precision plant breeding in the twenty-first century‖ Phil Trans Roy Soc Lond B Biol
Sci 363: 557—572.
38. Collard B.C.Y, Vera-Cruz C.M., McNally K.L., Virk P.S., and Mackill D.J. (2008), ―Rice
Molecular Breeding Laboratories in the Genomics Era: Current Status and Future
Considerations‖ Internat. J. Plant Genomics, vol. 2008, article ID 524847, pp.25.
39. Cruz, R.V., H. Harasawa, M. Lal, S. Wu, Y. Anokhin, B. Punsalmaa, Y. Honda, M.
Jafari, C. Li and N. Huu Ninh (2007) Asia. Climate Change 2007: Impacts, Adaptation
and Vulnerabilit,. Contribution of Working Group II to the Fourth Assessment Report
of the Intergovernmental Panel on Climate Change, M.L. Parry, O.F. Canziani, J.P.
Palutikof, P.J. van der Linden and C.E. Hanson, Eds., Cambridge University Press,

Cambridge, UK, pp.469-506.
40. Devos K.M. and Gale M.D. (1992), ―The use of random amplified polymorphic DNA
markers in wheat‖. Theor. Appl. Genet. 84: 567-572.
41. Emes MJ, CP Wilkins, PA Smith, K Kurkanchanakul, K Hawker, WA Charlton, EG
Cutter (1988), ―Starch utilization by deep water rice during submergence‖, In;
Proceedings of the 1987 International DeepWater Rice Workshop, 20-30 Oct,
Bangkok, Thailand. IRRI, Philippines. pp. 319-326.
42. Frisch M., Bohn M. and Melchinger A.E. (1999), ―Comparision of selection strategies for
marker-assisted backcrossing of a gene‖, Crop Sci, 39, pp.1295-1301.
43. Grant M. R., et al. (1995), ―Structure of the Arabidopsis RPM1 gene enabling dual specificity
disease resistance‖, Science, 269: 843-846.
44. Hamada H. and Kakunaga T. (1982), ―Potential Z-DNA forming sequences are highly
dispersed in Human genome”, Natural 298:396 – 398.
45. Haque QA, D HilleRisLambers, NM Tepora, QD de la Cruz (1989), ‗Inheritance of
submergence tolerance in rice‖, Euphytica 41: 247-251.
46. Hoanh, C.T., H. Guttman, P. Droogers and J.Aerts. (2004), ―Will we produce sufficient
food under climate change? Mekong Basin (South-east Asia)‖, Climate Change in
Contrasting River Basins: Adaptation Strategies forWater, Food, and Environment,
J.C.J.H. Aerts and P. Droogers, Eds., CABI Publishing,Wallingford, pp.157-180.
47. IPCC (2007) The 4th assessement report of the Intergovernmental Panel on Climate
Change.
48. Ishikawa R., Morishima H., Kinoshita T., Harada T. and Nuzeki M. (1991) ―Linkage
analysis of nine Isozyme gens on the conventional linkage map in rice‖. Jpn. J. Breed.
41, pp. 265 - 272.
49. Inouye J, and VT Xuan. 1973. On the growth habits of floating single and double -
Transplanting rice plants in South Vietnam. I. Mesocotyl elongation in darkness. Ipn. J.
Trop. Agric. 17 (2): 75 - 80.
50. Jackson BR and BS Vergara (1979), ―Progress in deepwater rice research‖ int. deepwater
rice workshop, Pages 3 - 12 in proceeding of the 1978, Aug. 17-19, 1978. Calentta,
India.

51. Jackson BR and BS Vergara (1979), ―Progress in deepwater rice research in proceeding
of the 1978 int‖, deepwater rice workshop, Aug. 17-19, 1978, Calentta, India, pp. 3 –
12.
52. Jena S, Sahoo P, Mohanty S, Das AB (2004 ) ―Identification of RAPD markers, in situ
DNA content and structural chromosomal diversity in some legumes of the mangrove
flora of Orissa‖, Genetica, 122; No. 3; pp. 217-226.
53. Julia Bailey-Serres, Takeshi Fukao, Pamela Ronald, Abdelbagi Ismail, Sigrid Heuer,
David Mackill (2010), Submergence Tolerant Rice: SUB1’s Journey from Landrace to
Modern Cultivar, This article is published with open access at Springerlink.com
54. Kadam SS, J Singh, SL Mehta (1973), ―Changes in isoenzymes in embryo and endosperm
of normal and opaque-2 Zea mays during inhibition‖, Phytochemistry 12: 1221-1225.
55. K. M. Iftekharuddaula, M. A. Newaz, M. A. Salam, H. U. Ahmed, M. A. A. Mahbub, E.
M. Septiningsih, B. C. Y. Collard, D. L. Sanchez, A. M. Pamplona, D. J. Mackill
(2010), Rapid and high-precision marker assisted backcrossing to introgress the SUB1
QTL into BR11, the rainfed lowland rice mega variety of Bangladesh, Springer
Science+Business Media B.V. 2010.
56. Krishnayya GR, RM De, SB Lodh (1990) ―Physiological basis for submergence tolerance
in rice‖ Oryza 27:286-290.
57. Lang NT. (1999) ―QTL mapping for salt tolerance in rice. Final report‖ Japan
Fellowship.
58. Mackill D. J. and Bonman J. M. (1992), "Inheritance of blast resistance in near- isogenic
lines of rice", Phytopathol., 82, p p.746-749.
59. Mazaredo AM and BS Vergara (1982), ―Physiological differences in rice varieties
tolerant of and susceptible to complete submergence‖, In proceeding of the 1981 int.
deepwater rice workshop. IRRI, Los Banos Philippines. pp. 327-342.
60. Ministry of Planning and Investment (MPI) (2009), Statistical Yearbook of Vietnam 2008.
Hanoi. pp.819.
61. Ministry of Natural Resources and Environment (MONRE) (2009), Climate change, sea
level rise scenarios for Vietnam, Hanoi, pp. 34.
62. Mishra SB (1995), Genetics of submergence tolerance and elongation ability of flood-

prone rice. Plant Breeding, Genetics and Biochemistry Division. IRRI, Philippines.
pp.16.
63. Mohanty HK, GS Khush. (1985), ―Diallel analysis of submergence tolerance in rice,
Oryza sativa‖, Theo Appl Genet 70: 467-473.
64. Mohanty HK, B Suprihatno, GS Khush, WR Coffman, and BS Vergara (1982)
―Inheritance of submergence tolerance in deepwater rice‖, In: Proceeding of the 1981
int. deepwater rice workshop. IRRI, Los Banos Philippines, pp.121-134.
65. Mohan M, Nair S, Bhagwat A, Krishna TG, Yano M, Bhatia CR, Saki T (1997), ―Genom
mapping, molecular markers and marker- assisted selection in crop plants‖, Molecular
Breeding 3: 87 - 103.
66. Murty KG, KK Nanda (1974), ―Changes in peroxidase isoenzymes of Phaseolus mungo
hypocotyl cutting rooting‖, Phytochemistry 13:1089-1093.
67. Nandi S, PK Subudhi, D Senadhira, NL Manigbas, S sen-Mandi, N Huang (1997),
―Mapping QTLs for submergence tolerance in rice by AFLP analysis and selective
genotyping‖ Mol Gen Genet, 255: 1-8.
68. Napvi N I., Bonman J.M., Mackil D J., Nelson F J. .and Chattoo B B. (1995).
―Identification of RAPD markers linded to a major blast resistance gene in rice‖, Mol.
Breed. 1:341 – 348.
69. Oka HI (1975), ―Floating rice, an ecotype adapted to deepwater paddies‖, Review from
the viewpoint of breeding, pp. 277-287. from rice in Asia. National Institute of genetics.
Mishima, Japan.
70. Rai RSV, KS Murty (1976), Effect of submergence on some physiological changes in rice
seedlings, Ind. J. Exp. Biol. 14:369-370.
71. Rai RSV, KS Murty (1979), Note on the effect of complete submergence of RVBP
carboxylase activity on rice seedlings. Indian J. Aric. Res. 13: 61-63
72. Ramiah K, and K Ramaswami (1941), ―Floating habit in rice‖, Indian J. Agric. Sci. 11: 1-
8.
73. S. Abdolhamid Angaji , Endang M. Septiningsih, D. J. Mackill, Abdelbagi M. Ismail
(2009), QTLs associated with tolerance of flood during germination in rice (Oryza
sativa), Springer Science+Business Media B.V. 2009.

74. Saha Ray PK, D HilleRisLambers, NM Tepora (1993), ―Combination of stem elongation
ability with submergence tolerance in rice‖ Euphytica 68:11-16
75. Saghai Maroof MA, Soliman KM, Jorgensen RA, Allard RW (1984) ―Ribosomal DNA
spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location ,
and population dynamics‖, Proc Natl Acad Sci USA (81): 8014-8018.
76. Sarkar RK, Panda D, Reddy JN, Patnaik SSC, Mackill DJ, Ismail AM (2009),
―Performance of submergence tolerant rice genotypes carrying the Sub1 QTL under
stressed and non-stressed natural field conditions‖ Indian J Agric Sci. in press.
77. Septiningsih EM., Pamplona AM., Sanchez DL., Maghirang-Rodriguez R, Neeraja CN,
Vergara GV, Heuer S, Ismail AM, Mackill DJ (2009), Development of submergence-
tolerant rice cultivars: The Sub1 gene and beyond, Ann. Bot. 103:151-160.
78. Singh S, Mackill DJ, Ismail AM (2009), Responses of SUB1 rice introgression lines to
submergence in the field: Yield and grain quality, Field Crops Res 113: 12–23.
79. Setter TL, I Waters, H Greenway, BJ Atwell, T Kupkanchanakul (1987), ―Carbohydrates
status of terrestrial plants during flooding. In: Crawford RMM (Ed.)‖, Plant Life in
Aquatic and Amphibious Habitats. British Ecological Society Symposium, No. 5.
Blackwell Scientific Publications, Oxford. 411-433.
80. Setter TL, MB Jackson, I Waters, I Wallace, H Greenway (1988), ―Foodwater carbon
dioxide andethylene concentrations as factors in chlorosis development andreduced
growth of completely submerged rice‖ In: Proceedings of the 1987 International
Deepwater Rice Workshop, Bangkok, Thailand, IRRI, pp. 301-310.
81. Setter TL, E Ellis, EV Laureles, ES Ella, D Senadhira, SB Mishra, S Sarkarung, S Datta
(1997), Physiology and genetics of submergence tolerance in rice, Annals of Botany
79:67-77.
82. Sripongpankul K. (1998), Gene mapping andquantitative trait loci analysis of flood
tolerance in rice (Oryza sativaL.) PhD Thesis. University of The Philippines, Los
Banos (UPLP), IRRI, Philippines,pp. 137.
83. Suprihatno B, WR Coffman (1981), ―Inheritance of submergence tolerance in rice (Oryza
sativa L.)‖, SABRAO 13, pp.98-108.
84. Takeshi Fukao and Julia Bailey-Serres (2008), Submergence tolerance conferred by

Sub1A is mediated by SLR1 and SLRL1 restriction of gibberellin responses in rice,
Department of Botany and Plant Sciences, Center for Plant Cell Biology, University of
California, Riverside, CA 92521, This article contains supporting information online at
www.pnas.org/cgi/content/full/
0807821105/DCSupplemental.
85. Takeshi Fukao, Kenong Xu, Pamela C. Ronald, and Julia Bailey-Serresa (2006), ―A
Variable Cluster of Ethylene Response Factor–Like Ge Regulates Metabolic and
Developmental Acclimation Responses to Submergence in Rice‖, The Plant Cell, Vol.
18, 2021–2034.
86. Thach TD (1994) The genetic association between elongation ability and submergence
tolerance in rice (Oryzsativa L.,. MSc Thesis, Central Luzon State University, Nueva
Ecija, Philippines. pp.65.
87. Thomson M.J., Ismail A.M., McCouch S.R., Mackill D.J. (2009), ―Abiotic Stress
Adaptation in Plants: Physiological, Molecular and Genomic Foundation‖, Marker
Assisted Breeding. Chapter 20. Springer Science & Business Media: 451-469.
88. Thomson MJ, Marjorie DO, James E, Rahman MA, Sajise AG, Adorada AL, Raiz ET,
Blumwald E, Seraj ZI, Singh RK, Gregorio GB & Ismail MA (2010), Characterizing
the Saltol Quantitative Trait Locus for Salinity Tolerance in Rice. Rice DOI
10.1007/s12284-010-9053-8.
89. Van Berloo R (2008), GGT 2.0: versatile software for visualization and analysis of
genetic data,. J Hered 99:232–236.
90. Wang Z., Second G. and Tanksley S.D. (1992), ―Polymorphism and phylogenetic
relationship among species in the Genus Oryza as determined by analysis of nuclear
RFLPs‖. Theor. Appl. Genet. 83, pp. 565 - 581.
91. Williams J.G, et al (1990), "DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are
useful as genetic marker", Nucleic Acid Research, 18, 6531-6535.
92. Wassmann, R., Hien, N. X., Hoanh, C. T., and Tuong, T. P. (2004), ―Sea level rise
affecting the Vietnamese Mekong Delta: Water elevation in the flood season and
implications for rice production‖, Climatic Change. 66, 89-107.
93. Wu K.S. and Tanksley S.D. (1993), ―Abuudance, polymorphism and genetic mapping of

microsatellite in rice‖. Mol. Gen. Genet. 241, pp. 225 - 235.
94. Xu K, DJ Mackill (1995), ―RADP and RFLP mapping of a submergence tolerance locus
in rice‖, Rice Genetics Newsletter 12: 244-245
95. Xu K, Xu X, Fukao T, Canlas P, Maghirang-Rodriguez R, Heuer S, Ismail AM, Bailey-
Serres J, Ronald RC, Mackill DJ. 2006. Sub1A is an ethylene-response-factor-like gene
that confers submergence tolerance to rice. Nature 442:705-708.
96. Yamada N. (1959), Physiological basis of resistance of rice plant against overhead
flooding, [in Japanese, English summary] Bull, National Institute Agricultural Science
Ser. No. 9: pp.110.
97. www.combatclimatechange.ie
98. .
99. http://www. Nongthon.com.vn
100. www.gramene.org
101.
102. www.philrice.gov.ph.