NGHIÊN CỨU CÁC PHƯƠNG PHÁP LÂY NHIỄM VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes VÀO CÂY CÀ ĐỘC DƯỢC (Datura innoxia Mill.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU CÁC PHƯƠNG PHÁP LÂY NHIỄM
VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes
VÀO CÂY CÀ ĐỘC DƯỢC (Datura innoxia Mill.)

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN THỊ ĐỨC THI

Niên khóa

: 2005 – 2009

Tháng 8 năm 2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU CÁC PHƯƠNG PHÁP LÂY NHIỄM
VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes

VÀO CÂY CÀ ĐỘC DƯỢC (Datura innoxia Mill.)

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. NGUYỄN VŨ PHONG

NGUYỄN THỊ ĐỨC THI

Tháng 8 năm 2009


LỜI CẢM ƠN
Con thành kính ghi ơn ba má đã sinh ra, nuôi nấng con thành người và
luôn là chỗ dựa tinh thần cho con trong cuộc sống. Con xin cảm ơn gia đình về
tất cả.
 Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
Thầy Nguyễn Vũ Phong, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên
và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt thời gian thực hiện
khóa luận. Cảm ơn thầy rất nhiều. Cầu chúc mọi việc tốt đẹp luôn đến với thầy.
Tiến sĩ Trần Thị Lệ Minh và Tiến sĩ Bùi Minh Trí đã cung cấp nguyên
liệu cho em thực hiện đề tài.
Các thầy cô, anh chị và các bạn sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm
Khoa Công Nghệ Sinh Học và Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa sinh – Viện
Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường của Trường Đại học Nông Lâm
đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận.
Và rất cảm ơn bạn Nhàn, bạn Thoan, bạn Trang, các bạn phòng 13A, cư
xá B, ký túc xá Đại học Nông Lâm và tập thể lớp Công nghệ sinh học K31 thân
yêu đã giúp đỡ và cùng tôi chia sẻ bao niềm vui, nỗi buồn trong suốt 4 năm đại

học. Chúc mọi người luôn hạnh phúc và thành đạt.
Xin chân thành cảm ơn!

Nguyễn Thị Đức Thi

iii


TÓM TẮT
Cây cà độc dược có khả năng sản xuất các alkaloid tropane ở bộ phận rễ, hai
alkaloid chủ yếu ở rễ là scopolamine và hyoscyamine, tuy nhiên với số lượng không
đáng kể. Một trong những con đường để tăng cường sản xuất các hợp chất alkaloid là
nuôi cấy các rễ tóc “hairy root” biến đổi di truyền thông qua vi khuẩn Agrobacterium
rhizogenes cung cấp số lượng sinh khối lớn. Ở Việt Nam, đến nay vẫn chưa có kết quả
nghiên cứu về chuyển gen và khảo sát hàm lượng alkaloid tropane trên cà độc dược
được công bố. Xuất phát từ tình hình nghiên cứu trên, đề tài “Nghiên cứu các
phương pháp lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào cây cà độc dược
(Datura innoxia Mill.)” được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô Khoa
Công nghệ Sinh học và Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa sinh – Viện nghiên
cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường từ tháng 3 đến tháng 7 năm 2009.
Sau 10 ngày lây nhiễm bằng phương pháp đồng nuôi cấy mẫu lá và đoạn
thân với dịch vi khuẩn, toàn bộ mẫu chết. Giảm thời gian ngâm mẫu trong dịch
vi khuẩn đồng thời tăng thời gian rửa mẫu và nồng độ kháng sinh sẽ làm tăng tỷ
lệ mẫu sống.
Sau 30 ngày tiêm trực tiếp dịch vi khuẩn lên thân cà độc dược, đặt cây
trong điều kiện nhiệt độ thấp và ẩm độ cao đã tạo được rễ tóc.
Sau 3 tuần nuôi đoạn chồi trên rock wool chứa dịch vi khuẩn đã tạo được
rễ từ vết cắt tiếp xúc với dịch vi khuẩn.
Cần tiếp tục xác định có hay không sự hiện diện của các gen rol, ntpII,
h6h ở các rễ tạo ra nhằm khẳng định tính hiệu quả của các phương pháp lây

nhiễm đã thực hiện.

iv


SUMMARY
. Thesis “Study methods for infecting Datura (Datura innoxia Mill.) with
Agrobacterium rhizogenes” was carried out at Nong Lam University, August,
2009.
Datura can produce medicinal secondary metabolites at root. Two mainly
produced alkaloid tropanes are hyoscyamine and scopolamine. However, they
have little quantity. Transformed hairy roots cultures are one of the approaches
to enhance alkaloid production. In Vietnam, results of scientific researches on
genetic engineering and alkaloid content in Datura have not announced yet. In
that research situation, thesis “Study methods for infecting Datura (Datura
innoxia Mill.) with Agrobacterium rhizogenes” was carried out.
After 10 days coculture of leaf discs and stem sections with
Agrobacterium rhizogenes, all samples died. Decereasing the time to incubate
samples with bacterial solution and increasing the time to wash and
concentration of antibiotic cefotaxime would enhance the live rate of samples.
Injecting Datura with bacterial solution and keeping Datura in highhumidity levels and low temperature were induced hairy roots 30 days after
infection.
Hairy roorts were emerged at slanting cuts 3 weeks after infecting stem
sections with bacterial solution in rock wool plugs.
Further studies are needed to determine whether the presence of rol, ntpII
and h6h genes at roots were created or not to affirm effect of infective methods
were done.

v

MỤC LỤC
Nội dung

Trang

Lời cảm ơn ................................................................................................ iii
Tóm tắt ..................................................................................................... iv
Summary..................................................................................................... v
Mục lục..................................................................................................... vi
Danh mục các chữ viết tắt .......................................................................... ix
Danh sách các hình...................................................................................... x
Danh sách các bảng .................................................................................... xi
Chương 1 Mở đầu...................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................ 1
1.2. Yêu cầu của đề tài ................................................................................ 2
1.3. Nội dung thực hiện ............................................................................... 2
Chương 2 Tổng quan tài liệu..................................................................... 3
2.1. Giới thiệu về cây cà độc dược ............................................................... 3
2.1.1. Vị trí phân loại .................................................................................. 3
2.1.2. Đặc điểm của cây cà độc dược ........................................................... 3
2.1.3. Tác dụng ........................................................................................... 4
2.1.4. Tính độc ............................................................................................ 4
2.1.5. Các hợp chất thứ cấp ......................................................................... 4
2.2. Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ..................................................... 6
2.2.1. Vị trí phân loại .................................................................................. 6
2.2.2. Đặc điểm chung ................................................................................. 6
2.2.3. Ri plasmid và T-DNA ........................................................................ 7
2.2.4. Các gen rol ...................................................................................... 10
2.2.5. Quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật................................... 11

2.3. Một số nghiên cứu chuyển gen bằng vi khuẩn A. rhizogenes ............... 13
2.3.1. Phương pháp đồng nuôi cấy mẫu với vi khuẩn ................................. 14
2.3.2. Phương pháp tiêm vi khuẩn vào nốt lá mầm của cây......................... 15
2.3.3. Phương pháp nuôi đoạn chồi trong dịch vi khuẩn ............................. 16

vi


Chương 3 Phương pháp nghiên cứu........................................................ 17
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ....................................................... 17
3.2. Vật liệu .............................................................................................. 17
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................... 17
3.2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ........................................................... 18
3.2.2.1. Nuôi cấy in vitro và lây nhiễm mẫu cà độc dược với vi khuẩn ....... 18
3.2.2.2. Xác định gen rolA bằng phản ứng PCR ......................................... 18
3.2.3. Môi trường nuôi cấy ........................................................................ 19
3.2.3.1. Môi trường dùng trong nuôi cấy in vitro cà độc dược .................... 19
3.2.3.2. Môi trường dùng để nuôi vi khuẩn ................................................ 20
3.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 20
3.3.1. Phương pháp 1: Lây nhiễm mẫu lá, thân cà độc dược với vi khuẩn ... 20
3.3.1.1. Chuẩn bị vật liệu nuôi cấy............................................................. 20
3.3.1.2. Chuẩn bị vi khuẩn......................................................................... 21
3.3.1.3. Đồng nuôi cấy mẫu với vi khuẩn ................................................... 21
3.3.1.4. Rửa mẫu ....................................................................................... 21
3.3.2. Phương pháp 2: Tiêm dịch vi khuẩn vào thân cây cà độc dược ......... 21
3.3.2.1. Chuẩn bị vật liệu lây nhiễm .......................................................... 21
3.3.2.2. Chuẩn bị vi khuẩn......................................................................... 22
3.3.2.3. Lây nhiễm .................................................................................... 22
3.3.3. Phương pháp 3: Nuôi đoạn chồi cây cà độc dược trên rock wool ...... 22
3.3.3.1. Chuẩn bị vật liệu lây nhiễm .......................................................... 22

3.3.3.2. Chuẩn bị vi khuẩn......................................................................... 22
3.3.3.3. Lây nhiễm .................................................................................... 23
3.3.3.4. Xác định gen rolA của rễ được tạo ra bằng phản ứng PCR ............ 24
Chương 4 Kết quả và thảo luận .............................................................. 26
4.1. Xác định gen rolA của vi khuẩn A.rhizogenes LBA9402 ..................... 26
4.2. Phương pháp 1: Lây nhiễm mẫu lá, thân cà độc dược với vi khuẩn ...... 26
4.3. Phương pháp 2: Tiêm dịch vi khuẩn vào thân cây cà độc dược ............ 31
4.3.1. Lây nhiễm ex vitro........................................................................... 31
4.3.2. lây nhiễm in vitro ............................................................................ 33
4.4. Phương pháp 3: Nuôi đoạn chồi cây cà độc dược trên rock wool ......... 33
vii


Chương 5 Kết luận và đề nghị................................................................. 36
5.1. Kết luận ............................................................................................. 36
5.2. Đề nghị .............................................................................................. 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................ 37

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A. rhizogenes

: Agrobacterium rhizogenes

A. tumefaciens

: Agrobacterium tumefaciens

chv

: chromosomal virulence

ctv

: cộng tác viên

DNA

: Deoxyribonucleotic acid

LB

: Left border

MS

: Murashige & Skoog, 1962

OD

: Optical density (độ hấp thu quang phổ)

ORF

: Open reading Frame

PCR

: Polymerase Chain Reaction

RB

: Right border

Ri plasmid

: Root inducing plasmid

rol

: resistance to osmotic lysis

Ti plasmid

: Tumor inducing plasmid

TL – DNA

: Transferred left DNA

TR – DNA

: Transferred right DNA

Vir

: Virulence

YMB

: Yeast Mannitol Broth

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR và lượng cho một phản ứng ....................... 24
Bảng 4.1 Số mẫu sống ở thí nghiệm 1 ................................................................ 27
Bảng 4.2 Số mẫu sống ở thí nghiệm 2 ........................................................ 28
Bảng 4.3 Số mẫu sống ở thí nghiệm 3 ....................................................... 30

x


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cây và quả cà độc dược ........................................................................... 4
Hình 2.2 Biểu hiện kiểu hình của thực vật được chuyển gen ......................... 7
Hình 2.3 Cấu trúc Ri plasmid của A. rhizogenes ........................................ 10
Hình 2.4 Lây nhiễm A. rhizogenes vào cây con Phaseolus spp. ................. 15
Hình 2.5 Rễ tóc được tạo ra ở Phaseolus spp. ........................................... 16
Hình 2.6 Rễ tóc tạo ra từ đoạn chồi M. truncatula trên rock wool.............. 16
Hình 3.1 Plasmid pLAL21 ........................................................................ 18
Hình 3.2 Phương pháp nuôi đoạn chồi trên rock wool ............................... 23
Hình 4.1 Kết quả điện di trên gel agarose 1%............................................. 26
Hình 4.2 Mẫu lá cà độc dược sau 5 ngày lây nhiễm với vi khuẩn ............... 29
Hình 4.3 Mẫu lá cà độc dược sau 8 ngày lây nhiễm với vi khuẩn ............... 29

Hình 4.4 Mẫu lá sau lây nhiễm với vi khuẩn A. rhizogenes 11325 .............. 30
Hình 4.5 Cà độc dược 24 ngày sau khi tiêm vi khuẩn ................................ 31
Hình 4.6 Cà độc dược 21 và 30 ngày sau khi tiêm vi khuẩn ....................... 32
Hình 4.7 Rễ tóc xuất hiện sau 3 tháng lây nhiễm ....................................... 33
Hình 4.8 Rễ cà độc dược 21 ngày sau lây nhiễm........................................ 34
Hình 4.9 Rễ cà độc dược 21 ngày sau lây nhiễm qua kính hiển vi .............. 34

xi


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Thực vật là nguồn cung cấp phong phú các hợp chất thứ cấp có tính chất

dược liệu. Việc nghiên cứu sản xuất các hợp chất thứ cấp ứng dụng trong y học
và mỹ phẩm ngày càng được quan tâm và đang trở thành một lĩnh vực phát triển
năng động (Sato và ctv, 2001) (trích dẫn bởi Dechaux C. và ctv, 2005), hứa hẹn
triển vọng to lớn cho sản xuất ở quy mô công nghiệp.
Cà độc dược (Datura innoxia Mill.) là cây thân thảo đa niên nằm trong họ
cà (Solanaceae), được trồng chủ yếu ở vùng khí hậu nhiệt đới (Nam Mỹ, Ấn Độ,
Úc) và mọc hoang dại nhiều nơi ở Việt Nam. Trong cây chứa nhiều alkaloid có
hoạt tính y dược, chủ yếu là scopolamine. Cà độc dược được dùng làm một số
thuốc chữa bệnh gia truyền như giảm ho, giảm đau bao tử, chống say tàu xe,
chống phong tê thấp, đau giây thần kinh tọa, đau răng…đặc biệt có tác dụng
ngừa hen suyễn. Tuy nhiên vì tính độc mạnh nên ít được lưu ý và ngày càng bị
tiêu diệt do mọc hoang.
Đã có nhiều nghiên cứu trên cây cà độc dược với mục đích tăng cường sự

tích lũy các hợp chất alkaloid như trồng trong hệ thống thủy canh có tác động
của các yếu tố sinh học và phi sinh học (Trần Thị Lệ Minh, 2005), nuôi cấy tế
bào (Nguyễn Thị Thanh Uyên, 2006), tái sinh cơ quan và tích trữ alkaloid
(Rawia Zayeda và ctv, 2006)... Nuôi cấy rễ tóc “hairy root” biến đổi di truyền
thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes cũng là một trong những con
đường để tăng cường sự tích lũy các hợp chất alkaloid, cung cấp số lượng sinh
khối lớn tạo điều kiện thuận lợi cho sản xuất và thu nhận các hợp chất thứ cấp
với số lượng lớn (Wilson, 1997) (trích dẫn bởi Dechaux C. và ctv, 2005). Các rễ
tóc phát triển ổn định và có thể tăng trưởng nhanh trong môi trường nuôi cấy
thích hợp mà không cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng (Boitel-Conti và
ctv, 2000) (trích dẫn bởi Dechaux C. và ctv, 2005). Hơn nữa các rễ tóc còn tạo ra
nhiều hợp chất thứ cấp có giá trị cao và số lượng lớn so với rễ cây bình thường.
Các nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến chuyển gen (Sangwan và
1


ctv, 1991), chiến lược tăng cường tích trữ scopolamine bằng tăng sinh khối rễ
tóc cà độc dược trong bioreactor (Dechaux C. và ctv, 2005) đã góp phần tăng
cường sự tích lũy hợp chất alkaloid trong cây cà độc dược.
Ở Việt Nam, đến nay vẫn chưa có kết quả nghiên cứu về chuyển gen và
khảo sát hàm lượng alkaloid tropane trên cà độc dược được công bố. Dựa trên
kết quả về việc xây dựng hệ thống tái sinh cây cà độc dược (Nguyễn Thị Thu
Hòa, 2008), đề tài “Nghiên cứu các phương pháp lây nhiễm vi khuẩn
Agrobacterium rhizogenes vào cây cà độc dược (Datura innoxia Mill.)” được
tiến hành.
1.2.

Yêu cầu của đề tài
Thực hiện lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes với mẫu cà độc

dược bằng các phương pháp khác nhau.
1.3.

Nội dung thực hiện
+ Kiểm tra sự hiện diện của gen rolA ở vi khuẩn A. rhizogenes.
+ Lây nhiễm mẫu với dịch vi khuẩn ở các nồng độ và thời gian lây nhiễm
khác nhau.
+ Tiêm trực tiếp dịch vi khuẩn ở các vị trí lây nhiễm trên thân khác nhau.
+ Nuôi đoạn chồi cà độc dược trên tấm rock wool chứa dịch vi khuẩn
trong điều kiện ẩm độ cao.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.

Giới thiệu về cây cà độc dược

2.1.1. Vị trí phân loại
Giới:

Plantae

Ngành:

Magnoliophyta

Lớp:

Magnoliopsida

Bộ:

Solanales

Họ:

Solanaceae

Chi:

Datura

Loài:

Datura innoxia Mill.

( />2.1.2. Đặc điểm của cây cà độc dược
Cà độc dược (Datura innoxia Mill.) là cây thân thảo cao 1 – 2 m, sống
hằng năm, phần gốc của thân hoá gỗ. Thân và cành non màu xanh lục hay tím,
có nhiều lông tơ ngắn. Lá đơn, mọc so le; phiến lá nguyên, hình trứng nhọn, gốc
phiến lá không đều. Hoa to, mọc đứng, thường đơn độc, ít khi xếp từng đôi ở
nách lá; đài hoa liền nhau, hình ống, màu xanh; cánh hoa màu trắng, dính liền
với nhau thành hình phễu có thể dài đến 20cm nhưng vẫn thấy có 5 thuỳ; có 5
nhị dính trên cánh hoa; bầu trên, có 2 lá noãn, hàn liền nhau, chứa nhiều noãn.
Quả hình cầu, màu lục, đường kính khoảng 3cm, có nhiều gai mềm mỏng ở mặt
ngoài, khi chín nở làm 4 mảnh. Hạt nhiều, màu nâu nhạt.
Cà độc dược được trồng chủ yếu ở vùng khí hậu nhiệt đới (Nam Mỹ, Ấn

Độ, Úc). Ở nước ta, cây mọc hoang khắp nơi và cũng được trồng làm cảnh và
làm thuốc. Trồng bằng hạt trước mùa mưa. Người ta đã tạo ra nhiều giống trồng
với lá có màu khác nhau: xanh, tía hay tim tím, hoa đơn hay hoa đôi. Có thể thu
hái

hoa

vào

mùa

thu;

thu

hái

lá

quanh

năm

(-

hueuni.edu.vn/dongy/show_target.plx?url=/thuocdongy/C/CaDocDuoc.htm&key=&ch
ar=C).

3

Hình 2.1 Cây và quả cà độc dược (; ).
2.1.3. Tác dụng
Hoa cà độc dược có vị cay, tính ôn, có độc, có tác dụng ngừa suyễn, giảm
ho, phong thấp đau nhức, ngực bụng lạnh đau, trẻ em cam tích. Còn dùng làm
thuốc tê trong phẫu thuật. Lá là vị thuốc chặn cơn hen suyễn, giảm đau bao tử,
chống say tàu xe. Ngoài ra còn điều trị phong tê thấp, cước khí (sưng chân), đau
dây thần kinh toạ, đau răng, động kinh... Người ta thường dùng lá cuộn thành
điếu hay thái nhỏ vấn thành điếu thuốc để hút (chữa ho, hen suyễn), dùng lá hơ
nóng đắp điều trị đau nhức, tê thấp, hoặc phơi khô tán bột mịn
(; ).
2.1.3. Tính độc
Cà độc dược có độc tính cao. Khi bị ngộ độc, có hiện tượng giãn đồng tử,
mờ mắt, tim đập nhanh, giãn phế quản, môi miệng khô, khô cổ đến mức không
nuốt và không nói được, chóng mặt, giảm thậm chí mất hẳn trí nhớ, mê sảng, rối
loạn phát âm cuối cùng có thể bị ức chế liệt thần kinh trung ương. Chất độc tác
động vào hệ thần kinh trung ương, có thể gây tử vong do hôn mê.
Việc dùng cà độc dược phải được thực hiện rất cẩn trọng, nhất thiết phải
theo chỉ định của bác sĩ. Những người thể lực yếu, có bệnh tim mạch không
được dùng. Nếu dùng sai, cà độc dược sẽ gây tử vong và nhiều tai biến nguy
hiểm ( />2.1.5. Các hợp chất thứ cấp
Thực vật có thể sản xuất những chất giống như những chất mà các sinh
vật khác sử dụng cho quá trình trao đổi chất cơ bản. Tuy nhiên, chúng khác với

4


những sinh vật khác ở chỗ sự đa dạng rất lớn các hợp chất phụ. Những hợp chất
này được gọi là hợp chất thứ cấp, chúng không cần thiết cho quá trình sống của
tế bào và thường chỉ được tạo ra ở một số loại tế bào nhất định, ở một lúc nào đó

hay như một đáp ứng với các tín hiệu bên ngoài. Tại sao cây lại sản xuất những
hợp chất này đến nay chưa rõ hết được. Trong nhiều trường hợp, thực vật tạo ra
các hợp chất thứ cấp để chống lại các nhân tố vô sinh và hữu sinh tác động lên
nó. Trong các trường hợp khác, hợp chất thứ cấp không có chức năng thật sự và
hiện diện như một kết quả của sự ngẫu nhiên trong quá trình phân kỳ tiến hóa
của các tính trạng không có tính chất rõ rệt cho sự tồn tại
Lượng hợp chất thứ cấp được tạo ra thường rất nhỏ. Nhưng chúng có khả
năng tiềm ẩn họat tính sinh học rất mạnh ngay cả khi chúng được sản xuất thấp
hơn 1% trọng lượng mô thực vật. Một số hợp chất thứ cấp: các acid hữu cơ,
phenol, tannin, alkaloid, tinh dầu, ..().
Cà độc dược có khả năng sản xuất các alkaloid tropane ở rễ. Về mặt hóa
học, các phân tử của các hợp chất này có cấu trúc hai vòng đặc trưng và bao
gồm atropine, scopolamine và hyoscyamine. Về mặt dược học, chúng là những
chất chống cholin mạnh nhất hiện có, nghĩa là chúng ngăn cản các tín hiệu thần
kinh được các chất truyền tải tín hiệu thần kinh nội sinh là acetylcholin (ACh)
truyền tải. Các triệu chứng của việc sử dụng quá liều có thể là khô miệng, giãn
đồng tử, mất điều hòa, bí tiểu, ảo giác, co giật, hôn mê và tử vong. Mặc dù là
chất cực độc, nhưng các tropane vẫn là một loại dược phẩm quan trọng khi sử
dụng đúng liều chỉ định (một lượng cực nhỏ).
Trong cây cà độc dược chứa nhiều alkaloid (hàm lượng toàn phần từ 0,20,5%), chủ yếu là scopolamine, ngoài ra còn có hyoscyamine, atropine,
norhyoscyamine với tỷ lệ ít hơn. Người ta đã tìm được những chất khác như
saponine, cumarine, flavonoid, tanin và chất béo. Lá chứa nhiều hyoscyamine.
Nhựa chứa dầu cố định 12% và allantoin. Hoa và rễ chứa nhiều scopolamine và
hyoscyamine với lượng ít hơn ().
Scopolamine thông thường được sử dụng như một tác nhân trong nhãn
khoa, có tác dụng làm giãn đồng tử và vì thế làm cho việc kiểm tra mắt được
thuận tiện hơn. Chúng cũng có thể dùng làm chất chống gây nôn đối với những

5

người bị hội chứng say tàu xe hoặc những người đang dùng hóa học trị liệu.
Atropine có hiệu ứng kích thích lên hệ thần kinh trung ương và tim, trong khi
scopolamine có tác dụng giảm đau ().
2.2. Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
2.2.1. Vị trí phân loại
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Alpha Proteobacteria
Bộ: Rhizobiales
Họ: Rhizobiaceae
Chi: Agrobacterium
Loài: Agrobacterium rhizogenes
( />2.2.2. Đặc điểm chung
Agrobacterium rhizogenes (trước đây được gọi là Phytomonas rhizogenes)
đã được nhận biết từ hơn 70 năm trước như là một tác nhân bệnh trên tầng lông
hút của rễ cây song tử diệp (hội chứng rễ tóc – hairy root). Agrobacterium
rhizogenes là vi khuẩn Gram âm sống trong đất, hình que, có tính di động,
không sinh bào tử, thuộc chi Agrobacterium. A. rhizogenes có quan hệ rất gần
với Agrobacterium tumefaciens là tác nhân gây khối u trên cây.
Đến nay, những hiểu biết cơ bản về cơ chế phân tử của sự biến nạp gen
thực vật bởi những thành viên của chi Agrobacterium đều là dựa trên những
nghiên cứu tổng quát về A. tumefaciens. Toàn bộ quá trình lây nhiễm được xem
như là tương tự nhau trong cả 2 loài. A. rhizogenes gây nhiễm vào tế bào thực
vật ở vị trí vết thương, do A. rhizogenes bị hấp dẫn bởi hợp chất phenol được
phóng ra từ những tế bào bị tổn thương. Ri plasmid của A. rhizogenes sẽ xâm
nhập vào tế bào thực vật và một đoạn nhỏ của Ri plasmid là T-DNA sẽ được
chuyển và gắn vào bộ gen của tế bào thực vật. Theo cách này T-DNA được duy
trì ổn định trong bộ gen mà nó chuyển vào. Từ vùng bị nhiễm sẽ tạo ra những rễ
nhánh bất thường gọi là rễ tóc (hairy root). Những rễ này có đặc điểm là phát

triển ăn nghiêng, phân nhánh nhiều, tăng trưởng nhanh và đặc biệt là chúng có

6


khả năng phát triển in vitro trong điều kiện không có các yếu tố kích thích tăng
trưởng (Rao và Ravishankar, 2002) (trích dẫn bởi Taylor, 2007). Những đặc tính
này làm cho rễ tóc trở thành một công cụ được sử dụng rộng rãi cho việc sản
xuất các hợp chất thứ cấp, khảo sát chức năng gen, và nghiên cứu sinh học của
rễ nói chung.

Hình 2.2 Biểu hiện kiểu hình của thực vật được chuyển gen bởi A.
rhizogenes. a) Khoai lang: đốt ngắn, lá xoăn và có nhiều chồi bất định ở
mắt (Taylor, 2007); b)Rễ tóc được tạo ra ở cà rốt (Branski R. và ctv,
2006).

Các dòng A. rhizogenes có thể được phân loại vào nhiều nhóm phụ khác
nhau dựa trên kiểu opine mà chúng sản xuất ra. Các dòng A. rhizogenes phổ biến
nhất được xác định đến nay gồm dòng sản xuất agropine (đại diện là Ri plasmid
pRiA4, pRi1855, pRiHRI, pRi15834, và pRiLBA9402), dòng sản xuất mannopine
(địa diện là Ri plasmid pRi8196), dòng sản xuất cucumopine (đại diện là Ri
plasmid pRi2659) và dòng sản xuất mikimopine (đại diện là Ri plasmid
pRi1724). Mikimopine và cucumopine là những chất đồng phân lập thể, nhưng
không có tính tương đồng giữa các gen tổng hợp opine ở mức độ nucleotide.
Trong số các dòng A. rhizogenes khác nhau được biết, K47, K599 và HRI là các
dòng gây độc cao có khả năng lây nhiễm cho nhiều loài thực vật khác nhau
(Taylor, 2007).
2.2.3. Ri plasmid và T-DNA

7

Ri plasmid của A. rhizogenes và Ti plasmid của A. tumefaciens thì tương
tự nhau về cấu trúc. Những nghiên cứu so sánh trình tự của Ri và Ti plasmid cho
thấy các cơ cấu của sự hoạt hóa và sự vận chuyển T-DNA từ vi khuẩn vào tế bào
thực vật được bảo tồn giữa 2 loại plasmid. Trong cả Ri và Ti plasmid, gần vùng
biên giới của T-DNA có 1 chuỗi mã có tính chất lặp lại gồm 24bp, được gọi là
trình tự lề (border sequences). T-DNA nguyên thủy mang một nhóm gen gây ung
thư và dị hóa opine, biểu hiện ở những tế bào thực vật chuyển gen là sự phát
triển của các mô ung thư và sự sản xuất opine, các dẫn xuất amino acid hầu như
chỉ được vi khuẩn sử dụng như là nguồn carbon và nitrogen. Cả Ri và Ti plasmid
đều chứa gen điều khiển quá trình gắn và chuyển T-DNA vào tế bào thực vật và
cho hiện tượng dị hóa các opine trong mô thực vật đã chuyển gen. Tính tương
đồng đáng chú ý giữa Ri và Ti plasmid là vùng vir và cơ cấu quá trình vận
chuyển và xâm nhập của T-DNA (Taylor, 2007).
Mặc dù Ri plasmid (của A. rhizogenes) và Ti plasmid (của A. tumefaciens)
có nhiều điểm tương đồng nhau đó là chúng đều có mang các vùng T-DNA,
vùng vir, gen chuyển hóa opine và vùng ori khởi đầu sao chép trong tế bào vật
chủ nhưng vẫn tồn tại những sự khác nhau là vùng T-DNA của Ti plasmid chứa
các gen tổng hợp auxin, cytokinin và opine trong khi Ri plasmid chỉ mang các
gen tổng hợp auxin và opine. Đây là điểm khác nhau gây ra hiệu quả tác động
khác nhau lên thực vật. Ri plasmid của A. rhizogenes không chứa trình tự
overdrive được tìm thấy trong Ti plasmid của A. tumefaciens. Trình tự overdrive
có kích thước 24 bp với 1 trình tự trung tâm 8 bp được bảo vệ nằm gần lề phải
trên Ti plasmid có tác dụng là làm gia tăng hiệu quả hình thành khối u bằng cách
làm tăng mạnh quá trình vận chuyển T-DNA. Ri plasmid của A. rhizogenes sở
hữu trình tự lặp lại 8 bp – gọi là trình tự kích thích vận chuyển T-DNA (TSS),
nó làm gia tăng hiệu quả biến nạp T-DNA vào hệ gen thực vật. TSS gồm 12
trình tự lặp lại 5-TGCCTTCG-3 trong dòng sản xuất mikimopine, 6 trình tự lặp
lại 5-ATTAGTTC-3 trong dòng sản xuất mannopine, 5 trình tự lặp lại

5-TTGTTCAA-3 trong dòng sản xuất agropine, và 16 trình tự lặp lại
5-GTTCGTCA-3 trong dòng sản xuất cucumopine của A. rhizogenes.
Một sự khác nhau đáng chú ý nữa giữa A.tumafaciens và A. rhizogenes là
trong Ri plasmid của A. rhizogenes không có gen virE1 và virE2. VirE2 là 1 sợi
8


đơn DNA –gắn kết protein và virE1 là chất ức chế kèm theo của nó. Chức năng
của virE2 là bảo vệ sợi đơn T-DNA khỏi sự tấn công của nuclease và kích thích
nhân của nó nhập vào tế bào thực vật. Gen virE rất quan trọng cho sự sự phát
sinh bệnh của A. tumefaciens nhưng không phải là thiết yếu cho sự cảm ứng rễ
tóc. A. rhizogenes có chứa gen GALLS trên Ri plasmid, có thể thay thế chức
năng của gen virE2 trong A. tumefaciens. Tuy nhiên, cơ chế mà GALLS protein
có thể thay thế chức năng virE2 trong A. rhizogenes vẫn chưa được hiểu rõ
(Taylor, 2007).
Tất cả các dòng A. rhizogenes đều chứa một vùng T-DNA trên Ri plasmid
mang những gen liên quan đến sự khởi đầu và phát triển rễ (rol-gen), những gen
liên quan đến sự tổng hợp opine, và những gen chưa rõ chức năng. Một T-DNA
thứ 2 có thể xuất hiện chứa những gen liên quan đến sự tổng hợp auxin (aux1
hoặc iaaM và aux2 hoặc iaaH) cùng với các gen chưa rõ chức năng khác. Ri
plasmid có hai T-DNA, T L và TR , được gọi là “split" T-DNA. Ri plasmid của
dòng sản xuất cucumopine và mannopine chỉ có một vùng T-DNA, dòng sản
xuất agropine có một split T-DNA chứa hai vùng T-DNA, TL và TR , mỗi vùng có
kích thước khoảng 15-20 kb. Cả TL -DNA và T R -DNA đều được biến nạp và hợp
nhất một cách độc lập trong hệ gen cây chủ, sự vận chuyển TL -DNA chủ yếu là
để cảm ứng rễ tóc.

Hình 2.3 Cấu trúc Ri plasmid của A. rhizogenes (Taylor, 2007).
2.2.4. Các gene rol
9

Một vài vị trí trên TL-DNA của Ri plasmid có chứa các gen thiết yếu cho
sự cảm ứng rễ tóc (được gọi là gen rol). TL -DNA của agropine Ri plasmid có ít
nhất 4 vị trí chứa các gen rolA, rolB, rolC, rolD tương ứng với các khung đọc
mở (Open reading frame – ORF) 10, 11, 12, 15. Từ những năm 90, sự kết hợp
của rolA, rolB và rolC đã được chứng minh là đủ để tạo ra kiểu hình rễ tóc, phụ
thuộc loài thực vật và kiểu mô.
TR -DNA chỉ được tìm thấy trong Ri plasmid của A. rhizogenes dòng sản
xuất agropine gồm có các gen (aux1, aux2, RolB TR, mas1, mas2 và ags) điều
khiển quá trình tổng hợp opine và auxin. Các gen aux được coi là đóng vai trò
phụ trong cảm ứng rễ tóc và không thiết yếu cho sự sản xuất rễ tóc. Các dòng A.
rhizogenes sản xuất opine như mannopine, cucumopine, hay mikimopine chuyển
một đoạn T-DNA đơn tương đồng với agropine TL -DNA nhưng không có gen
rolD. T-DNA của dòng sản xuất cucumopine và mannopine không có cá gen aux
mà chỉ có gen rol là đủ cho việc tạo ra kiểu hình rễ tóc.
Gen rolA đóng vai trò quan trọng trong sự hình thành rễ tóc vì sự biểu
hiện của rolA trong cây chuyển gen ổn định tạo ra kiểu hình biến dạng cao: lá
xoăn, xanh đậm, đốt dài, có hiện tượng lùn hoặc bán lùn, hóa già chậm. Gen
rolA có liên quan đến sự thay đổi sinh lý hormone gồm cả sự can thiệp vào
gibberellin. Trình tự gen rolA của nhiều dòng A. rhizogenes khác nhau dài
khoảng 279 – 423bp. RolA cũng có thể liên quan đến sự mất cân bằng mức độ
hormone thực vật.
Phụ thuộc vào dòng vi khuẩn, gen rolB sẽ có kích thước từ 762 – 837bp
và mã hóa một protein có 259 – 279 amino acid. Gen rolB sử dụng một cấu trúc
promoter trong cây chuyển gen ức chế sự cảm ứng và hoại tử rễ bất định, cả
trong mô sẹo và lá cây con. Sự biểu hiện của rolB cần thiết cho hoạt động tăng
trưởng của rễ tóc vì mức độ biểu hiện cao hay thấp sẽ làm yếu sự tăng trưởng
của những cơ quan này.
Gen rolC từ nhiều T-DNA Ri plasmid khác nhau thì tương tự nhau về kích

thước vào khoảng 540 bp và mã hóa protein có 179-181 amino acid. Cây chuyển
gen có biểu hiện rolC thì thấp và giảm tính trội ngọn, lá mũi mác, hoa tự sớm.
Sự bất hoạt của các gen rol đưa đến sự thay đổi hình thái học của rễ hoặc loại bỏ
sự hình thành rễ tóc. Sự biểu hiện của rolC ảnh hưởng đến sự cân bằng của các
10


cytokinin dạng tự do và kết hợp, cũng như auxin và gibberellin trong tế bào thực
vật. Sự biểu hiện rolC cũng làm giảm đáng kể mức độ acid abscisic (ABA),
polyamine, và ethylene.
Gen rolD chỉ được tìm thấy trong Ri T-DNA của dòng sản xuất agropine.
Nó có kích thước 1.032bp và mã hóa một protein có 344 amino acid, đó là một
ornithine cyclodeaminase enzyme xúc tác sự chuyển hóa ornithine thành proline.
Sự biểu hiện của rolD trong cây chuyển gen sẽ kích thích ra hoa sớm, làm tăng
số lượng hoa và có thể có liên quan đến sức sản xuất của cây. Thêm vào đó, sự
tích lũy proline có thể là một phản ứng bảo vệ liên quan đến stress (Taylor,
2007).
2.2.5. Quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật
Quá trình cắt đoạn T-DNA ra khỏi plasmid và vận chuyển nó vào tế bào
thực vật trước hết phụ thuộc vào sản phẩm của các gen vir. Vi khuẩn xâm nhiễm
tại bất kỳ vị trí tổn thương nào trên thân cây. Cây có vết thương do sự hỏng ngẫu
nhiên của màng tế bào thực vật hoặc do vi khuẩn tiết ra hỗn hợp những chất
được mã hóa bởi các gen vir. Hoạt động của các gen này được hoạt hóa bởi hợp
chất phenolic của cây (ví dụ như acetosyringone, catechol, các dẫn xuất của
chalcone...). Ngoài ra, các monosaccharide như glucose, arabinose có mặt trong
môi trường cũng làm tăng khả năng gây cảm ứng nhóm gen vir.
Protein virA đóng vai trò quan trọng trong việc quyết định loại cây chủ bị
nhiễm bởi Agrobacterium. Trong thực tế, Agrobacterium không có khả năng
xâm nhập vào cây một lá mầm, có thể protein virA không nhận biết các tín hiệu
do cây một lá mầm tiết ra. Nói chung, Agrobacterium chỉ gây hại ở cây hai lá

mầm, vì vậy các nhà nghiên cứu cho rằng Agrobacterium chỉ có thể đưa T-DNA
vào hệ gen các cây hai lá mầm. Tuy nhiên gần đây nhiều tác giả đã chứng minh
khi nhiễm vi khuẩn, các cây một lá mầm cũng có thể sản xuất opine và vì thế có
thể khai thác khả năng biến nạp gen của Agrobacterium vào cây một lá mầm.
Hiện nay, người ta cũng đã thành công trong việc chuyển gen vào một số cây
một lá mầm như lúa, mía... qua trung gian A. tumefaciens.
Khi cây nhiễm A. rhizogenes, do T-DNA hợp nhất vào trong genome của
cây chủ bắt đầu hoạt động và sản xuất ra auxin, opine, toàn bộ sinh trưởng của

11


cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra rất nhiều rễ tóc. Opine
được sử dụng như một loại thức ăn nhờ gen chuyển góa opine trên Ri plasmid.
Để gắn T-DNA vào tế bào thực vật, đầu tiên vi khuẩn A. rhizogenes phải
tiếp xúc với thành tế bào thực vật bị tổn thương. Quá trình này được thực hiện
nhờ các gen chvA và chvB. Gen chvB mã hóa một protein liên quan đến hình
thành β-1,2 glucan mạch vòng, trong khi đó gen chvA xác định một protein vận
chuyển, định vị ở màng trong của tế bào vi khuẩn. Protein vận chuyển giúp vận
chuyển β-1,2 glucan vào khoảng giữa thành tế bào và màng sinh chất. β-1,2
glucan giữ vai trò quan trọng để vi khuẩn Agrobacterium tiếp xúc với thành tế
bào thực vật. Nếu không có sự tiếp xúc này, sẽ không có sự dẫn truyền T-DNA.
Các sản phẩm protein của vùng vir có tác dụng cho việc dẫn truyền T-DNA từ vi
khuẩn vào tế bào thực vật. Các loại protein đó rất cần thiết cho quá trình cắt TDNA khỏi plasmid, cảm ứng thay đổi màng tế bào thực vật mà chúng tiếp xúc,
tham gia di chuyển phần T-DNA qua màng vi khuẩn tới tế bào chất của tế bào
thực vật, vận chuyển tới nhân rồi cuối cùng xâm nhập vào genome của cây chủ.
Thực chất, chỉ riêng T-DNA của plasmid được chuyển vào genome tế bào
thực vật, mà không còn phần nào khác. Quá trình dẫn truyền chỉ do sản phẩm
của các gen vir và gen chv quyết định mà không liên quan đến các gen khác trên
T-DNA. Tuy nhiên, chuỗi DNA 25 bp (RB và LB của T-DNA) có vai trò là vị trí

cảm ứng cho các sản phẩm của tổ hợp các gen vùng vir, đặc biệt là protein từ
gen virE mang chúng dẫn truyền vào tế bào thực vật. Chúng hoạt động như các
tín hiệu nhận biết và khởi động quá trình dẫn truyền. Trước hết gen virA trong tổ
hợp gen vùng vir được phosphoryl hóa nhờ tác động của các hợp chất phenol
như acetosyringone giải phóng ra từ các tế bào thực vật tổn thương. Sản phẩm
của quá trình này lại tiếp tục phosphoryl hóa gen virG. Sản phẩm của gen virG
liên tiếp làm hoạt hóa toàn bộ các gen vir còn lại, mà hai gen cuối cùng được
hoạt hóa là gen virB và virE. Trước đó, khi gen virD được hoạt hóa, sản phẩm
của nó cảm ứng nhận biết RB và LB của T-DNA và làm đứt phần T-DNA ra
khỏi DNA của plasmid thành các sợi đơn. Đồng thời, quá trình phosphoryl hóa
này cũng làm thay đổi thẩm suất màng tế bào thực vật, màng tế bào bị mềm ra
và bị thủng. Các sợi đơn T-DNA được gắn vào protein do gen virE tổng hợp và
dịch chuyển về phía màng tế bào vi khuẩn. Ngay sau đó, sợi T-DNA được trượt
12


từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Cầu nối chính là sự tiếp hợp giữa hai tế bào do
cảm ứng sản phẩm gen virB mà thành. Khi T-DNA đã được chuyển giao vào tế
bào thực vật, chúng nhanh chóng hợp nhất vào genome tế bào thực vật được ổn
định và di truyền như các gen bình thường khác (Nguyễn Hoàng Lộc, 2008).
2.3.

Một số nghiên cứu chuyển gen bằng vi khuẩn A. rhizogenes
Những nghiên cứu vể chuyển gen bằng vi khuẩn A. rhizogenes đã được

thực hiện trên nhiều loài thực vật khác nhau như khoai tây, khoai lang, thuốc lá,
đậu nành, cà độc dược và cả nhân sâm. Ở Việt Nam hiện vẫn chưa có kết quả về
chuyển gen bằng vi khuẩn A. rhizogenes vào cây cà độc dược bằng phương pháp
nuôi cấy tế bào mà mới chỉ có một số nghiên cứu về kích thích sự sinh tổng hợp
các hợp chất thứ cấp của cây cà độc dược bằng phương pháp thủy canh có bổ

sung dịch vi khuẩn vào môi trường (Trần Thị Lệ Minh, 2005). Sau một thời gian
nuôi cây chung với vi khuẩn thấy cây sinh trưởng, phát triển tốt hơn đồng thời
hàm lượng scopolamine và hyoscyamine trong cây cũng cao hơn so với cây đối
chứng.
2.3.1. Phương pháp đồng nuôi cấy mẫu với vi khuẩn
Những nghiên cứu chuyển gen vào cà độc dược trên thế giới đã được thực
hiện từ những năm 1990 nhưng chủ yếu là nhờ vi khuẩn A. tumefaciens.
Sangwan và ctv (1991) đã nghiên cứu một số ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
đến khả năng chuyển nạp gen của A. tumefaciens dòng LBA4404 vào cà độc
dược. Theo đó, dĩa lá là mẫu lây nhiễm tốt nhất so với mẫu thân, cuống lá và rễ.
Dĩa lá được tiền nuôi cấy một ngày và đồng nuôi cấy với vi khuẩn trong 2 ngày
ở 27oC, sẽ cho hiệu quả chuyển nạp tốt nhất lên đến 70%.
Một số nghiên cứu chuyển gen bằng A. rhizogenes đã được thực hiện với
một số loài khác của chi Datura. Năm 1997, Giovannini, Pecchioni, Rabaglio và
Allavena đã nghiên cứu lây nhiễm Datura arborea và Datura sanguinea với vi
khuẩn A. rhizogenes dòng NCPPB 1855. Các mảnh lá được ngâm trong dịch vi
khuẩn 20 phút và đồng nuôi cấy trong hai ngày. Hai tuần sau khi đồng nuôi cấy,
rễ tóc xuất hiện ở cả 2 loài Datura. D. arborea cho tỷ lệ mẫu lá tạo rễ tóc cao
hơn D. sanguinea (88% so với 61%), số rễ trung bình trên một mẫu ở cả hai loài
thì tương tự nhau (6.3%). Các rễ này có rất nhiều rễ phụ và không có tính hướng
đất. Tách từng dòng rễ tóc (hairy root clone) ra nuôi cấy riêng, sau 7 tháng, số
13


chồi bất định xuất hiện từ rễ tóc của D. arborea cũng nhiều hơn D. sanguinea (7
trong 10 hairy root clones của D. arborea so với 1 trong 6 hairy root clones của
D. sanguinea).
Sikuli và ctv (1997), đã nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mô nuôi cấy đến
sự tích lũy sinh khối và sản lượng alkaloid của rễ tóc thu được sau khi gây
nhiễm cây Datura stramonium với chủng Agrobacterium ATCC 15834. Hàm

lượng hyoscyamine ở rễ đạt cực đại sau 6 tuần nuôi cấy khoảng 100mg/l. Bên
cạnh đó, các tác giả này còn nghiên cứu ảnh hưởng của sự cân bằng ion (NO3 -,
SO 42- , H 2PO 4 -, K+ , Ca2+ và Mg 2+ ) đến sản lượng sinh khối và sự tích lũy
hyoscyamine. Nồng độ NO3 - và K+ cao cho sinh khối cao nhất, còn sản lượng
hyoscyamine cao nhất khi SO 4 2- và K + cao (trích dẫn bởi Lê Văn Hoàng, 2008).
Một nghiên cứu khác làm tăng cường tích trữ scopolamine bằng tăng sinh
khối rễ tóc cà độc dược đã được chuyển gen bằng A. rhizogenes dòng 1855 có
plasmid pLAL21 trong bioreactor đã được thực hiện bởi Dechaux C. và ctv
(2005). Rễ tóc được gia tăng sinh khối với môi trường Gamborg’s B5 lỏng trong
bioreactor ở 27 oC, pH môi trường là 5,8. Sau 20 ngày, sinh khối rễ tóc đã lấp
đầy dung tích của môi trường nuôi cấy, hàm lượng alkaloid tropane tăng lên rất
nhiều.
2.3.2. Phương pháp tiêm vi khuẩn vào nốt lá mầm của cây
Đây là một phương pháp lây nhiễm vi khuẩn A. rhizogenes đạt hiệu quả
cao hiện đang được sử dụng nhiều. Estrada-Navarrete và ctv (2006, 2007), đã
thực hiện phương pháp này đối với Phaseolus spp.. Cây con được lây nhiễm với
A. rhizogenes bằng cách dùng kim tiêm tạo vết thương ở nốt lá mầm rồi tiêm
dịch vi khuẩn vào. Giữ cây trong điều kiện ẩm độ cao (hơn 90%) ở 25 oC. 5 – 8
ngày sau, từ chỗ vết thương sẽ phát triển khối u nhỏ và sau một tuần, các rễ tóc
sẽ xuất hiện từ khối u này. Sau 3 tuần, có tới 85 – 100% số cây có xuất hiện rễ
tóc, một tỷ lệ rất cao. Hiệu quả tạo rễ tóc của các dòng A. rhizogenes khác nhau
thì khác nhau.
Phương pháp này cũng đã được thực hiện trên cây đậu nành bởi Kereszt
và ctv (2007). Kết quả là trung bình một cây có thể tạo ra 6 – 7 rễ tóc, với ít nhất
một rễ tóc có mang gen mong muốn.

14