XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG MELAMINE TRÊN SỮA, THỨC ĂN GIA SÚC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ (Gas Chromatography Mass Spectrometry)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG
MELAMINE TRÊN SỮA, THỨC ĂN GIA SÚC BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ
(Gas Chromatography - Mass Spectrometry)

Ngành học:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện: PHẠM THỊ THANH VÂN
Niên khóa:

Tháng 08/2009

2005 – 2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG

MELAMINE TRÊN SỮA, THỨC ĂN GIA SÚC BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ
(Gas Chromatography - Mass Spectrometry)

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. PHÙNG VÕ CẨM HỒNG

PHẠM THỊ THANH VÂN

KS. HUỲNH VĨNH KHANG

Tháng 08/2009


LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn
Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện
cho tôi trong suốt thời gian học tập.
Các Thầy Cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các Thầy Cô đã trực tiếp
giảng dạy trong suốt bốn năm qua.
ThS. Phùng Võ Cẩm Hồng và KS. Huỳnh Vĩnh Khang đã tận tình hướng dẫn, dìu
dắt và động viên em trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp.
KS. Trịnh Thị Phi Ly đã dành cho em nhiều sự hỗ trợ cần thiết, tận tình giúp đỡ
em vượt qua những khó khăn và cung cấp nhiều kiến thức qúy báu.
Các Thầy cô, anh chị tại Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghê Môi Trường –
Trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM luôn tận tình hướng dẫn, giảng dạy và giúp đỡ
tôi.

Cùng toàn thể lớp CNSH 31 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời
gian làm đề tài.
Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều
kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường.
Tháng 08 năm 2009
Phạm Thị Thanh Vân

iii


TÓM TẮT
Melamine xuất hiện trong thực phẩm nhất là sữa bột cho trẻ em và thức ăn cho
các thú cưng gây nguy cơ tử vong và sạn thận cao là vấn đề đáng lo ngại, tạo ra tâm
trạng hoang mang, lo lắng cho người dân, các doanh nghiệp làm ăn chân chính bị thiệt
hại không ít. Xuất phát từ tình hình trên, được sự cho phép của Bộ môn Công Nghệ
Sinh Học – Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây
dựng quy trình phân tích hàm lượng melamine trên sữa, thức ăn gia súc bằng phương
pháp sắc ký khí ghép khối phổ (Gas Chromatography – Mass Spectrometry)”.
Melamine là một hợp chất hữu cơ có hàm lượng đạm cao được thêm vào thực
phẩm là một hành vi gian lận nhằm làm tăng độ đạm tổng số. Khi melamine được hấp
thụ lâu ngày trong cơ thể và với nồng độ cao có thể gây nên các bệnh về sỏi thận và
sỏi bàng quang. Việc cố tình thêm melamine vào thức ăn cho vật nuôi là nguyên nhân
của những cái chết hàng loạt trên chó và mèo. Chúng tôi đã đưa ra quy trình phân tích
hàm lượng melamine trên sữa, thức ăn gia súc trên thiết bị GC-MS sử dụng hệ thống
Aligent 6890 GC, 5973 MS, bộ bơm mẫu tự động 7689 với cột mao quản
Aligent ZB-5ms 30 m × 0,25 mm × 0,25 µm. Dựa trên quy trình đã công bố bởi cơ
quan quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (U.S.FDA), 2008, áp dụng trên các
loại vật liệu khô (sữa bột, thức ăn gia súc…). Mẫu được chiết với hỗn hợp
Diethyamine/H2O/Acetonitrile (DEA/H2O/ACN) và được tạo dẫn xuất Trimethysilyl
(dẫn xuất TMS) trước khi đưa vào phân tích trên hệ thống GC-MS. Khoảng tuyến tính

được xây dựng ở nồng độ từ 50 ppb đến 1000 ppb. Giới hạn phát hiện (LOD) của
melamine đạt được là 15 ppb.

iv


SUMMARY
The illicit additives melamine in milk power and pet food caused people to
worry, the damage of the truth businesses. Prom that situation, had been permitted of
Faculty of Biotechnology – Nong Lam University, we had been made the topic:
“Procedured development for the detecting and quantifing melamine content in milk
powder, pet – food by Gas Chromatography – Mass Spectrometry”.
Melamine is a nitrogen rich organic compound which has been added to food
and feed to fraudulently increase the apparent protein content. Dietary long term
exposure to high levels of melamine may lead to kidney and bladder diseases. The
illicit additives melamine in pet-food have caused the death of cats and dogs in the
United States in 2007. To apply a GC-MS method publishing by the U.S. Food and
Drug Administration (U.S.FDA), we have achieved the improved procedure for
detecting and quanlifing melamine content in milk-powder, pet-food using Aligent
6890 GC, 5973 MS, 7683 series injector with a 30 m × 0,25 mm × 0,25 µm Aligent
ZB-5ms capillary column. The procedure was developed to screen various kinds of
matrice for the presence of melamine. Samples are extracted using a mixture of
Diethylamine/Water/Acetonitrile (DEA/H2O/ACN) and the analytes are subsequently
converted to Trimethylsilyl derivatives (TMS derivatives) before injection. The linear
range is from 50 ppb to 1000 ppb for melamine and the limit of detection is 15 ppb.

v


MỤC LỤC

Trang
LỜI CẢM ƠN............................................................................................................... iii
TÓM TẮT......................................................................................................................iv
SUMMARY....................................................................................................................v
MỤC LỤC .....................................................................................................................vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..........................................................................ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG ...........................................................................................x
DANH SÁCH CÁC HÌNH............................................................................................xi
Chương 1 MỞ ĐẦU .......................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................................1
1.2. Yêu cầu ....................................................................................................................2
1.3. Nội dung thực hiện ..................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU..............................................................................3
2.1. Giới thiệu về melamine ...........................................................................................3
2.1.1. Melamine là gì ......................................................................................................3
2.1.2. Sự ra đời và phương pháp tổng hợp melamine ....................................................3
2.1.3. Mục tiêu sử dụng của melamine...........................................................................4
2.1.4. Vì sao melamine lại đi vào chuỗi thực phẩm .......................................................4
2.1.5. Melamine gây độc ra sao......................................................................................5
2.1.6. Có quy định về sử dụng melamine hay không .....................................................6
2.1.7. Có cách nào để nhận diện melamine hay không ..................................................8
2.2. Giới thiệu chung về phương pháp sắc ký ................................................................9
2.2.1. Lịch sử phương pháp sắc ký.................................................................................9
2.2.2. Nguyên tắc căn bản phương pháp sắc ký .............................................................9
2.2.3. Phân loại các phương pháp sắc ký......................................................................10
2.3. Một số phương pháp sắc ký sử dụng trong phân tích melamine...........................12
2.3.1. Sắc ký lỏng cao áp..............................................................................................12
2.3.2. Sắc ký lỏng ghép khối phổ .................................................................................13
2.3.3. Sắc ký khí ghép khối phổ ...................................................................................13
2.3.3.1. Ứng dụng GC-MS ...........................................................................................14

vi


2.3.3.2. Cấu tạo và hoạt động GC-MS .........................................................................15
2.3.3.3. Ưu và nhược điểm của việc kết hợp GC và MS..............................................18
2.3.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến việc tách mẫu........................................................19
2.3.3.5. GC-MS trong phân tích melamine ..................................................................19
2.4. Tình hình phân tích melamine ở Việt Nam ...........................................................20
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................................22
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .........................................................................22
3.2. Vật liệu ..................................................................................................................22
3.2.1. Đối tượng thí nghiệm..........................................................................................22
3.2.2. Hóa chất sử dụng ................................................................................................22
3.2.3. Dụng cụ và thiết bị .............................................................................................23
3.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................24
3.3.1. Xác định hàm lượng đạm tổng số trong mẫu đem phân tích..............................24
3.3.2. Chuẩn bị mẫu......................................................................................................25
3.3.2.1. Quy trình được công bố bởi U.S.FDA ............................................................25
3.3.2.2. Quy trình cải tiến từ quy trình được công bố bởi U.S.FDA............................26
3.3.3. Điều kiện chạy máy ............................................................................................26
3.3.3.1. Điều kiện GC...................................................................................................26
3.3.3.2. Điều kiện MS...................................................................................................26
3.3.4. Đánh giá quy trình ..............................................................................................25
3.3.4.1. Chuẩn bị chuẩn ................................................................................................27
3.3.4.2. Xác định hiệu suất thu hồi ...............................................................................28
3.3.4.3. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) melamine................................................29
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.....................................................................30
4.1. Kết quả đo hàm lượng đạm tổng số bằng phương pháp Kjeldahl.........................30
4.2. Nhận diện tín hiệu từ sắc ký đồ .............................................................................30
4.3. Quy trình chuẩn bị mẫu phân tích theo công bố của U.S.FDA.............................33

4.4. Quy trình phân tích hàm lượng melamine trên nền sữa ........................................34
4.5. Quy trình phân tích hàm lượng melamine trên nền thức ăn gia súc......................38
4.6. Giới hạn phát hiện (LOD) melamine của phương pháp........................................41
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .........................................................................43
5.1. Kết luận..................................................................................................................43
vii


5.2. Đề nghị ..................................................................................................................44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................45
PHỤ LỤC

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ACN

: Acetonitrile

BSTFA

: Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide

C

: Nồng độ (ppb)

DACP

: 2,6-Diamino-4-chloropyrimidine (chất nội chuẩn)

DEA

: Diethylamine

EFSA

: Tiêu chuẩn thực phẩm Châu Âu

EIA

: Enzyme Immunoassay

ELISA

: Enzyme Linked Immunosorbent Assay

GC-MS

: Gas Chromatography Mass Spectrometry (Sắc ký khí ghép khối phổ)

H2SO4dd

: Acid sunfuric đậm đặc

HPLC

: High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng cao áp)

LC-MS-MS: Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần
LOD

: Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)

S/N

: Signal-to-Noise ratio (Tỉ số tương đối của tín hiệu so với nhiễu nền)

S

: Diện tích peak

SIM

: Selected ion monitoring (Chế độ quét chọn lọc)

SPE

: Solid phase extraction (Cột chiết pha rắn)

Sylon BFT : 99 % BSTFA + 1% TMCS
TB

: Trung bình

TCMS

: Trimethylchlorosilane

TDI

: Tolerable daily intake (Ngưỡng hấp thu hằng ngày có thể chịu được)

TMS

: Trimethylsilyl

UV

: Ultra Violet

WHO

: Tổ chức Y tế thế giới

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Các phương pháp sắc ký cơ bản ...................................................................11
Bảng 2.2 12 sở y tế được kiểm nghiệm melamine.......................................................21
Bảng 3.1 Điều kiện MS (SIM) .....................................................................................26
Bảng 3.2 Melamine và melamine tri-TMS trước và sau khi tạo dẫn xuất...................27
Bảng 3.3 Thêm chuẩn melamine vào mẫu...................................................................27
Bảng 3.4 Quy trình U.S.FDA và quy trình cải tiến......................................................28
Bảng 4.1 Kết quả đo hàm lượng đạm tổng số trong mẫu đem phân tích.....................30
Bảng 4.2 Kết quả xây dựng đường chuẩn 5 điểm melamine tri-TMS.........................34
Bảng 4.3 Kết quả phân tích melamine trên sữa ...........................................................37

Bảng 4.4 Tương quan tỉ lệ trung bình C, V Melamine tri-TMS, Nội chuẩn trên sữa..37
Bảng 4.5 Kết quả xây dựng đường chuẩn dựa trên nồng độ melamine tri-TMS.........38
Bảng 4.6 Kết quả phân tích melamine trên thức ăn gia súc........................................40
Bảng 4.7 Tương quan tỉ lệ trung bình C,V Melamine tri-TMS, Nội chuẩn ................40
Bảng 4.8 Thời gian lưu và diện tích của các nhiễu nền ...............................................41

x


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cấu trúc phân tử melamine.............................................................................3
Hình 2.2 Quá trình tách trong sắc ký. ............................................................................6
Hình 2.3 Kết hợp melamine và acid cyanuric .............................................................10
Hình 2.4 Các bộ phận chính của máy HPLC...............................................................12
Hinh 2.5 Liên hợp GC-MS. .........................................................................................14
Hình 2.6 Cấu tạo chính của máy sắc ký khí. ...............................................................15
Hình 2.7 Thành phần cơ bản của hệ thống khối phổ. ..................................................16
Hình 2.8 Sơ đồ phổ khối. .............................................................................................17
Hình 3.1 Nền mẫu sử dụng làm thí nghiệm.................................................................22
Hình 3.2 Máy sắc ký khí ghép khối phổ Aligent.........................................................23
Hình 3.3 Quá trình tạo dẫn xuất melamine tri-TMS với Sylon BFT...........................28
Hình 4.1 Melamine tri-TMS 1000 ppb (11,16 phút), DACP 1000 ppb (10,29 phút)..31
Hình 4.2 Phổ khối của melamine tri-TMS ở phút 11,2 ...............................................31
Hình 4.3 Phổ khối của chất nội chuẩn (DACP) ở phút 10,3........................................31
Hình 4.4 Melamine tri-TMS 1000 ppb (11,91 phút), DACP 1000 ppb (11,07 phút)..32
Hình 4.5 Phổ khối của melamine tri-TMS ở phút 11,9 ...............................................32
Hình 4.6 Phổ khối của chất nội chuẩn (DACP) ở phút 11,07......................................32
Hình 4.7 Melamine tri-TMS 100 ppb, DACP 1000 ppb theo quy trình U.S.FDA......33
Hình 4.8 Melamine tri-TMS 100 ppb, DACP 1000 ppb theo quy trình cải tiến .........33

Hình 4.9 Melamine tri-TMS 500 ppb ở phút 11,22.....................................................34
Hình 4.10 Đồ thị đường chuẩn 5 điểm melamine tri-TMS với R2 = 0,9612 ...............34
Hình 4.11 Mẫu sữa không thêm melamine, thêm nội chuẩn .......................................36
Hình 4.12 Dung môi chiết mẫu, không thêm melamine, thêm nội chuẩn ...................36
Hình 4.13 Melamine tri-TMS 250 ppb, DACP 1000 ppb trên nền sữa.......................36
Hình 4.14 Sơ đồ đường chuẩn melamine trên sữa với R2 = 0,9989 ............................37
Hình 4.15 Đồ thị đường chuẩn 5 điểm melamine tri-TMS với R2 = 0,9987 ...............38
Hình 4.16 Melamine tri-TMS 500 ppb ở phút 11,9.....................................................39
Hình 4.17 Mẫu thức ăn không thêm melamine, thêm nội chuẩn.................................39
Hình 4.18 Melamine tri-TMS 250 ppb, DACP 1000 ppb trên thức ăn gia súc...........39
xi


Hình 4.19 Đồ thị đường chuẩn melamine trên thức ăn với R2 = 0,9993 .....................40
Hình 4.20 Melamine tri-TMS tại LOD = 15 ppb.........................................................42
Sơ đồ 3.1 Quy trình chuẩn bị mẫu được công bố bởi U.S.FDA ..................................25

xii


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay, sữa được sử dụng phổ biến như nguồn cung cấp năng lượng và các
dưỡng chất cần thiết cho cơ thể. Sữa bột là sản phẩm được sử dụng nhiều nhất ở trẻ
nhỏ do nhu cầu cuộc sống hiện đại trẻ không được bú mẹ đầy đủ và sự chạy theo
những thông tin quảng cáo của rất nhiều hãng sữa trên thị trường. Mức sống người dân
ngày càng cao, nhu cầu nuôi thú kiểng trở thành thú vui của rất nhiều người, thức ăn
cho các loại vật nuôi này cũng rât đa dạng. Vụ việc nhiễm melamine trong sữa, thức ăn
gia súc đã gây xôn xao dư luận vào thời điểm cuối năm 2008, đầu năm 2009. Hàng

ngàn trẻ em bị bệnh, một số đã thiệt mạng vì uống sữa nhiễm hóa chất này. Thức ăn
gia súc nhiễm melamine đã gây ra sỏi thận và suy thận cấp ở chó và mèo. Đặt ra nhu
cầu bức thiết là phải có một phương pháp có thể xác định chính xác chất này trong
thực phẩm để có những giải pháp kịp thời, tránh ảnh hưởng tới sức khỏe con người và
vật nuôi.
Việc phân tích chính xác melamine trong nền mẫu không phải là dễ dàng kể cả
khâu tách chiết melamine ra khỏi nền mẫu và ở khâu vận hành thiết bị. Cho đến nay,
ngoài việc sử dụng phương pháp ELISA để sàng lọc thì chỉ có ba kỹ thuật tương đối
hiện đại để phân tích melamine trong thực phẩm: phương pháp sắc ký lỏng HPLC với
đầu dò UV chỉ thích hợp khi dùng để phân tích một hàm lượng melamine tương đối
lớn. Còn hai phương pháp nữa là sắc ký khí ghép khối phổ và sắc ký lỏng ghép khối
phổ. Với những phương pháp này, người ta cũng có thể gặp trở ngại khiến kết quả đạt
thấp hơn trị số thực, nếu không giải quyết tốt vấn đề chiết tách melamine ra khỏi
protein thực phẩm.
Từ thực tế trên, chúng tôi đã xây dựng quy trình phân tích hàm lượng melamine
trên sữa và thức ăn gia súc bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS), dựa
trên quy trình đã được công bố bởi U.S.FDA, 2008.

1


1.2. Yêu cầu
Tạo đựợc mẫu đưa vào phân tích có độ tinh sạch cao.
Sử dụng thiết bị GC-MS của Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi
Trường – Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM để tiến hành phân tích định lượng
melamine.
1.3. Nội dung thực hiện
 Dựng đường chuẩn 5 điểm melamine.
 Đo hàm lượng đạm tổng số trên 2 nền mẫu đem phân tích.
 Xây dựng quy trình phân tích, xác định hiệu suất thu hồi của melamine trên

nền sữa.
 Xây dựng quy trình phân tích, xác định hiệu suất thu hồi của melamine trên
nền thức ăn gia súc.
 Tìm giới hạn phát hiện (LOD) của melamine.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về melamine
2.1.1. Melamine là gì ?
Melamine (tên đầy đủ 1,3,5-triazine-2,4,6-triamine) là một bazơ hữu cơ có công
thức hóa học C3H6N6 tạo thành từ 3 phân tử cyanamide (CN2H2). Nếu tính tỷ lệ các
nguyên tố cacbon (C), nitơ (N) và hydro (H) thì nitơ chiếm tới 66% tính theo khối
lượng. Melamine tan ít trong nước, có khả năng giải phóng N khi gặp nhiệt độ cao và
được sử dụng làm chất chống cháy.
Melamine còn là dẫn chất của thuốc trừ sâu cyromazine và có thể được hình
thành trong cơ thể động vật có vú từ cyromazine. Có nghiên cứu cho rằng melamine
cũng được hình thành từ cyromazine khi cyromazine có mặt trong mô thực vật
(Nguyễn Bá Tiếp, 2008).

Hình 2.1 Cấu trúc phân tử melamine.
2.1.2. Sự ra đời và phương pháp tổng hợp melamine
Melamine được nhà hóa học Đức Justus von Liebig tổng hợp lần đầu năm 1834.
Trước đây, đầu tiên người ta biến calci Cyanamid thành ra dicyandiamide, sau đó đốt
lên quá nhiệt độ nóng chảy để tạo melamine. Ngày nay người ta dùng ure để chế tạo
melamine theo 2 bước:
- Dùng phản ứng đẳng nhiệt để biến ure thành acid cyanic và ammoniac
6(NH2)2CO → 6HCNO + 6NH3

- Acid cyanic trùng hợp hóa tạo ra melamine và carbon dioxid
6HCNO → C3H6N6 + 3CO2 (Nguyễn Bá Tiếp, 2008).

3


2.1.3. Mục tiêu sử dụng của melamine
Melamine không phải là chất phụ gia thực phẩm trong tất cả các loại thực phẩm
và đồ uống. Nó được sản xuất ra để phục vụ cho các lĩnh vực công nghiệp như:
Melamine được sử dụng để sản xuất ra melamine resin (một loại polymer công
nghiệp).
Melamine cũng được sử dụng để sản xuất keo dán gỗ trong công nghệ gỗ.
Trong ngành công nghiệp chất dẻo, người ta cũng sử dụng melamine để sản xuất
dụng cụ gia đình như: ca nhựa, dĩa nhựa, kính mica… nhờ có phản ứng melamine
formaldehyde tạo ra một loại polymer tổng hợp chịu nhiệt, chống cháy, làm chất chậm
cháy. Melamine cũng là thành phần chính trong màu mực in trên các dụng cụ bằng
chất dẻo.
Trong lĩnh vực xây dựng, melamine cũng được sử dụng trong sản xuất beton chịu
lực, vì nó làm giảm hàm lượng nước, hạn chế tạo xốp để làm tăng độ bền của beton.
Do sở hữu hàm lượng nitơ cao nên ngay từ những năm 50, melamine được sử
dụng làm phân bón. Tuy nhiên, do phản ứng thủy phân melamine nên tác dụng của nó
đối với đất trồng rất hạn chế. Melamine cũng có mặt trong thuốc có gốc asen được
dùng trong điều trị xoắn trùng châu Phi. Đã từ lâu người ta dùng melamine như một
nguồn cung cấp nitơ không phải là protein cho động vật nhai lại (tuy nhiên, quan điểm
về ứng dụng này còn chưa nhất quán).
Dẫn xuất của melamine là acid cyanuric, cũng được sản xuất ra với số lượng lớn
để làm nguyên liệu sản xuất chất dẻo cùng với melamine, sản xuất thuốc nhuộm, thuốc
diệt cỏ và làm thuốc chống khuẩn, nó còn được sử dụng để làm chất ổn định, tẩy uế
nước trong các bể bơi…(Dương Thanh Liêm, 2008).
2.1.4. Vì sao melamine lại đi vào chuỗi thực phẩm ?

Melamine không phải là hợp chất tự nhiên (natural chemicals), nó là chất tổng
hợp nhân tạo. Vậy nó đi vào thực phẩm có thể bằng hai con đường:
Con đường thứ nhất, khi chúng ta sử dụng dụng cụ có liên quan với chất dẻo để
chế biến hoặc chứa đựng thực phẩm trong các hoàn cảnh nhiệt độ và pH khác nhau, có
thể melamine từ dụng cụ đó đi vào thực phẩm, hoặc vào trong nước, rồi từ nước đi vào
thực phẩm. Tất nhiên con đường này thì lượng melamine vào thực phẩm không thể
nhiều được, không thể gây ra ngộ độc trên phạm vi rộng lớn như ngộ độc do sữa bột

4


Trung Quốc vừa qua và cũng không thể gây ra cái chết hàng vạn chó mèo trên phạm vi
thế giới do ăn thức ăn công nghiệp nhiễm melamine trong những năm vừa qua.
Con đường thứ hai, do gian lận thương mại. Điều này có thể khẳng định là chắc
chắn, vì cứ đưa 1% melamine vào trong sữa bột thì làm tăng lên 4,13% protein thô.
Việc kiểm tra hàm lượng protein trong sữa, người ta cũng chỉ kiểm tra protein thô,
những nhà sản xuất gian lận lợi dụng điều này để làm mau đầy két tiền nhà mình và
gây ra những cái chết đáng thương của trẻ thơ và hàng chục ngàn trẻ em Trung Quốc
phải nhập viện để điều trị. Đây mới là con đường melamine đi vào chuỗi thực phẩm
gây ngộ độc thực phẩm trên phạm vi rộng lớn vừa qua (Dương Thanh Liêm, 2008).
Tuy nhiên, kết quả phân tích những mẫu sữa hay sản phẩm từ sữa cho thấy, hầu
hết nồng độ melamine đều cỡ vài mg/kg trở xuống. Nồng độ thấp nhất được thông báo
là 7 µg/kg - rất nhỏ, còn mẫu có nồng độ cao nhất là trên 1000 mg/kg, tức là chưa đến
một độ đạm. Qua các cách đo melamine và phối kiểm lại các kết quả công khai, dù kết
quả đo được có thể nhỏ hơn thực tế, nhưng khó có thể cho rằng một mẫu có hàm lượng
melamine lớn nhằm tăng độ đạm lại cho kết quả phân tích rất nhỏ như vậy. Theo GS.
Chu Phạm Ngọc Sơn (Trung tâm dịch vụ và phân tích thí nghiệm, 2 Nguyễn Văn Thủ,
Q 1, Tp.HCM), nói một cách khác, các nhà khoa học đã tìm thấy những mẫu sữa và
sản phẩm từ sữa chứa hàm lượng melamine nhỏ cỡ vài mg/kg trở xuống. Trong trường
hợp này, cho melamine vào sữa có thể nhằm mục tiêu khác thay vì tăng độ đạm.

Thêm một câu hỏi được đặt ra: "Phải chăng melamine với 3 nhóm amin (-NH2)
có thể kết hợp với phân tử protein, tạo thành khối lớn hơn có tác dụng tăng độ nhớt
khiến người mua có cảm giác là sữa đặc hơn” (Hương Cát, 2008).
2.1.5. Melamine gây độc ra sao ?
Theo tài liệu mới nhất mà Văn phòng đại diện WHO tại Việt Nam vừa công bố,
dựa trên những nghiên cứu ngẫu nhiên về thức ăn vật nuôi có nhiễm melamine với sự
phát triển của sỏi thận và suy thận cấp sau đó ở chó và mèo, đã cho thấy rằng,
melamine và các chất cấu trúc tương tự như nó, như axit cyanuric có thể kết hợp với
nhau tạo ra tinh thể. Với liều lượng cao, đạt ngưỡng tập trung, thì tinh thể này sẽ hình
thành và gây tác hại.

5


Những nghiên cứu tiếp theo trên động vật cho thấy, khi chúng được cho ăn hỗn
hợp của melamine và axit cyanuric, sẽ hình thành chất rắn trong ống thận, cuối cùng
làm tắc nghẽn, gây ra suy thận và hoại thận.

Hình 2.2 Kết hợp melamine và acid cyanuric
(Thanh Loan, 2008).
Về độc tính, melamine không được trao đổi chất, mà nhanh chóng bài tiết qua
nước tiểu. Tuy chưa có dữ liệu về độc tính của melamine qua đường miệng ở người,
nhưng các nhà khoa học đã thấy có tác hại trên chuột. Tệ hại hơn, Trung tâm Quốc tế
nghiên cứu ung thư (IARC) đã có kết luận rằng có bằng chứng trên động vật thí
nghiệm cho thấy, melamine có sản sinh chất gây ung thư trong cùng điều kiện mà nó
sản sinh ra sỏi bàng quang (Thanh Loan, 2008).
2.1.6. Có quy định về sử dụng melamine hay không ?
Melamine được sử dụng trong công nghiệp nhựa, sản xuất keo dán và các sản
phẩm chịu nhiệt, dụng cụ nhà bếp, làm chất chống cháy… chứ không phải là chất phụ
gia thực phẩm. Mục đích của việc đưa melamine vào thức ăn cho động vật và thực

phẩm chỉ nhằm làm tăng hàm lượng nitơ để được các phương pháp đánh giá cho là có
hàm lượng đạm cao. "Đạm" ở đây là "đạm giả", không những không có giá trị dinh
dưỡng mà còn gây hại. Mỹ và các quốc gia thuộc EU không cho phép sử dụng
melamine làm phụ gia trong thức ăn động vật và thực phẩm cho người trong bất cứ
giai đoạn nào của quá trình chế biến. Mặc dù bản thân melamine không có tính độc
cao nhưng hỗn hợp melamine và acid cyanuric sẽ có khả năng tạo tinh thể rất lớn và
gây sỏi thận.

6


Melamine không được thêm vào có chủ định nhưng mẫu xét nghiệm vẫn có
melamine? Trường hợp này có thể do melamine từ bao gói, dụng cụ chứa đã xâm nhập
vào thực phẩm với hàm lượng rất thấp. Các cuộc điều tra đang được tiến hành để xác
định có thể dò thấy melamine ở mức nào từ loại xâm nhập này.
Cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (U.S.FDA) và Cơ quan Tiêu
chuẩn thực phẩm châu Âu (EFSA) đã tiến hành đánh giá nguy cơ sơ bộ năm 2007.
U.S.FDA đã công bố một đánh giá an toàn/nguy cơ tạm thời về melamine và các chất
có cấu trúc tương tự (cyanuric acid, ammelide và ammeline) và đã xác lập ngưỡng hấp
thụ hàng ngày có thể chịu được (TDI) đối với người là 0,63 mg melamine/1 kg trọng
lượng cơ thể mỗi ngày (Hải Yến, 2008).
TDI được định nghĩa là lượng tối đa ước tính của một chất con người có thể phơi
nhiễm hàng ngày trong suốt thời gian sống mà không gây nguy cơ lớn về sức khỏe.
Ngày 3/10/2008, U.S.FDA cũng đã công bố đánh giá mới về nguy cơ/an toàn đối
với melamine và các hợp chất liên quan tới melamine trong thực phẩm, kể cả sữa bột
trẻ em.
EFSA đã đưa ra một tuyên bố tạm thời và khuyến nghị mức TDI là 0,5 mg/1 kg
trọng lượng cơ thể mỗi ngày cho tổng cộng cả melamine và các chất tương tự (WHO:
Melamine và Axit Cyanuric) (Hải Yến, 2008).
Bộ Y tế Canada tuyên bố một đánh giá về nguy cơ melamine trong thực phẩm

chứa sữa và các thành phần dẫn xuất từ sữa. Theo đó, xác lập ngưỡng TDI là 0,35 mg
melamine/1 kg trọng lượng cơ thể mỗi ngày.
Như vậy, nếu sử dụng TDI là 0,5 mg melanine/1 kg trọng lượng cơ thể, tổng mức
melamine phơi nhiễm mỗi ngày có thể chịu được của một người nặng 50 kg là 25 mg
melamine. Lúc đó, ngưỡng này sẽ được coi là ’’mức lo ngại’’.
Theo tài liệu của WHO, tháng 9/2008 EU đã đưa ra giới hạn 2,5 mg melamine/kg
sản phẩm chứa sữa hoặc sản phẩm sữa có nguồn gốc từ Trung Quốc. Hong Kong đưa
ra giới hạn 1 mg melamine/kg sản phẩm sữa và thức ăn cho trẻ em dưới 36 tháng tuổi,
phụ nữ có mang và phụ nữ đang nuôi con bằng sữa mẹ, giới hạn 2,5 mg/kg cho các sản
phẩm khác. New Zealand cũng đưa ra giới hạn tương tự Hong Kong.
5/12/2008, WHO quyết định đưa ra ngưỡng melamine trong thực phẩm.
Theo đó, mức hấp thụ hàng ngày có thể chịu được (TDI) là 0,2 mg melamine/
1 kg trọng lượng cơ thể. Như vậy một người nặng 50 kg có thể hấp thụ 10 mg
7


melamine mỗi ngày mà không nguy hại tới sức khỏe. Mức này thấp hơn các mức TDI
trước kia mà một số nước đặt ra.
12/12/2008 Bộ Y tế Việt Nam ban hành ngưỡng melamine tối đa là 1 mg/kg đối
với thực phẩm dành cho trẻ dưới 36 tháng tuổi và 2,5 mg/kg với các thực phẩm khác,
tương đương với một số nước như Mỹ, Trung Quốc, Australia, New Zealand...
Bộ Y tế ban hành ngưỡng này giúp các doanh nghiệp ổn định sản xuất, người tiêu
dùng đỡ hoang mang nhưng đồng thời cũng khẳng định tuyệt đối cấm mọi hình thức
cố ý đưa melamine vào trong thực phẩm.
2.1.7. Có cách nào để nhận diện melamine hay không ?
Với tính ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực đặc biệt trong công nghiệp nên
các phương pháp định tính, định lượng melamine cũng như các dẫn chất của melamine
đã được sử dụng rộng rãi. Tuy vậy, việc phát triển các phương pháp dùng tìm dấu vết
và định lượng melamine trong thức ăn, trong mô của động vật được chú ý sau khi vụ
phát hiện thức ăn nhiễm melamine nhập từ Trung Quốc (tháng 3 năm 2007). Phương

pháp được dùng phổ biến hiện nay là sắc ký lỏng (Liquid Chromatography) và sắc ký
lỏng cải biến, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký khối phổ (Mass Spectrometry,
MS), HPLC kết hợp với MS (HPLC-MS-MS). Phương pháp dựa trên nguyên lý phản
ứng miễn dịch kết hợp enzyme (EIA) cũng được ứng dụng để tìm melamine trong thức
ăn. Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm (Mỹ) sử dụng kỹ thuật sắc ký khí ghép
khối phổ (Gas Chromatography Mass Spectrometry, GC-MS) để tìm melamine trong
thực phẩm. Khối phổ hồng ngoại cũng được ứng dụng tìm tinh thể chứa melamine
trong mô động vật ... (Nguyễn Bá Tiếp, 2008).

8


2.2. Giới thiệu chung về phương pháp sắc ký
2.2.1. Lịch sử phương pháp sắc ký
Nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet) phát
minh ra kĩ thuật sắc ký vào năm 1903 khi ông đang nghiên cứu về chlorophyll. Từ ngữ
“chromatography” xuất phát từ chữ “chroma” trong tiếng Latinh có nghĩa là chất màu,
nó vừa là tên của Tsvet trong nghĩa tiếng Nga, và vừa là màu của các sắc tố thực vật
ông phân tích vào lúc bấy giờ. Tên này vẫn tiếp tục được dùng dù các phương pháp
hiện đại không còn liên quan đến màu sắc (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
Sắc ký phân bố lỏng được đề xướng vào năm 1942 bởi các nhà hóa sinh Archer
John Porter Martin và Richard Laurence Millington Synge. Các nhà bác học này đã
nghiên cứu lí thuyết chung đầu tiên của sắc ký và đã giả thuyết rằng: việc tổ hợp pha
di động khí với pha tĩnh lỏng có những ưu điểm quan trọng. Sau đó trong sắc ký còn
có một chỗ trống nữa, và mặc dù một số trong các biến dạng khác nhau đã trở nên phổ
biến, tuy nhiên không có công trình nào về ứng dụng của sự tổ hợp chất khí với chất
lỏng đã được công bố, cho đến năm 1952 khi Archer John Porter Martin cùng với
Richard Laurence Millington Synge đã mô tả phương pháp này. Công trình này như
một làn sóng bùng nổ tạo ra một bước ngoặc cho sự phát triển của sắc ký và nó được
tiếp tục phát triển cho đến ngày nay. Ngay vào năm 1956, các phòng thí nghiệm hóa

học hữu cơ khắp thế giới đã dùng phép sắc ký khí – lỏng. Ngày nay, mỗi năm, tài liệu
về sắc ký có đến hàng nghìn công trình và còn lớn hơn về sự ứng dụng của phương
pháp này. Về mặt triển vọng, những công trình ban đầu của Martin và Synge là những
công trình có tính quyết định trong sự phát triển của sắc ký phân bố và vào năm 1954
họ đã được nhận giải thưởng nobel về hóa học (Hồ Viết Quý, 2006).
2.2.2. Nguyên tắc căn bản phương pháp sắc ký
Sắc ký là một phương pháp vật lý để phân tách, phân li, phân tích các chất dựa
vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và pha tĩnh. Có nhiều nguyên
nhân đưa đến sự phân bố khác nhau giữa nhau của các chất, nhưng chính sự lặp đi lặp
lại hiện tượng hấp phụ - phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển động
qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký.
Hầu hết các phương pháp sắc ký đều được dựa theo nguyên lý trên, và hiệu quả
của từng phương pháp phụ vào sự chọn lựa giữa pha động pha tĩnh.

9


Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha tĩnh và pha
động tương ứng với tính chất của chúng (tính hấp phụ, tính tan). Trong các hệ thống
sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký. Các chất
khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha tĩnh và pha động. Trong quá trình pha động
chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi
lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ
chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn với pha
này. Nhờ vậy mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký (Archer J.P.
Martin, 1952).

Tướng động

Tách

Tướng tĩnh

Mẫu
(rắn, lỏng, khí)

Hình 2.3 Quá trình tách trong sắc ký.
2.2.3. Phân loại các phương pháp sắc ký
Trong phương pháp sắc ký pha động phải là các lưu thể còn pha tĩnh là các chất ở
trạng thái lỏng hoặc rắn. Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký
thành hai nhóm sắc ký khí và sắc ký lỏng. Dựa vào cơ chế trao đổi của các chất giữa
pha động và pha tĩnh mà người ta lại chia các phương pháp sắc ký thành nhóm nhỏ
hơn (Archer J.P. Martin, 1952).
Tùy theo trạng thái tập hợp của các pha, loại tương tác và sự hình thành sắc ký
mà người ta phân biệt các loại sắc ký như sau:

10


Bảng 2.1 Các phương pháp sắc ký cơ bản (Phùng Võ Cẩm Hồng, 2008)
Tướng tĩnh

Tướng động Tính chất

Phương pháp sắc ký
Hấp phụ, Phân bố (pha thuận, pha

Rắn

Lỏng

Sắc ký lỏng

đảo),
Trao đổi ion, Rây phân tử.
Hấp phụ, Phân bố (pha thuận, pha

Lỏng

Lỏng

Sắc ký lỏng

đảo),
Trao đổi ion, Rây phân tử

Rắn

Khí

Sắc ký khí

Hấp phụ, Phân bố, Rây phân tử.

Lỏng

Khí

Sắc ký khí

Hấp phụ, Phân bố, Rây phân tử.

11


2.3. Một số phương pháp sắc ký sử dụng trong phân tích melamine
2.3.1. Sắc ký lỏng cao áp (High Performance Liquid Chromatography)
Năm 1967, Horvath C. là tác giả đầu tiên đã tạo máy HPLC để nghiên cứu về
nucleotide. Ngày nay, với các ưu điểm như áp suất cao, độ phân giải cao, vận tốc sắc
ký nhanh. HPLC được áp dụng trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu đa dạng như phân
tích dược phẩm, các dung dịch sinh lý, polimer thiên nhiên hoặc tổng hợp, các loại dư
lượng trong môi trường, nhiều loại hợp chất vô cơ, các loại nguyên tố hiện diện trong
mẫu phân tích ở dạng vết… Hơn nữa, các loại đầu dò dùng cho HPLC không làm hư
hại mẫu phân tích, nên sau khi phân tích, có thể thu hồi mẫu để thực hiện các loại
nghiên cứu khác như phân tích phổ, thử nghiệm hoạt tính sinh học…(Nguyễn Kim Phi
Phụng, 2007).
HPLC dựa vào pha động (dạng lỏng) để phân tách các thành phần trộn lẫn vào
nhau. Những thành phần này đầu tiên được hòa tan vào trong dung môi và sau đó dưới
tác dụng của áp suất cao, chúng sẽ bị lôi kéo di chuyển qua cột sắc ký. Trong cột, hỗn
hợp sẽ được phân tách thành những cấu tử của chúng.
Sự tương tác giữa chất tan với pha động và pha tĩnh có thể phụ thuộc vào sự chọn
lựa khác nhau cả dung môi và pha tĩnh. Kết quả HPLC sẽ thu được nhiều cấu tử khác
nhau mà các kỹ thuật sắc ký khác không thực hiện được và nó dễ dàng phân tách số
lượng lớn các chất hoá học trộn lẫn vào nhau.

Pha động

Hệ thống
chuyển dung
môi

Hệ thống
bơm mẫu

Cột

Chuẩn bị
mẫu
Hình 2.4 Các bộ phận chính của máy HPLC.

12

Detector

Hệ thống xử
lý dữ liệu


HPLC-UV có thể cung cấp thông tin định lượng (thường sử dụng UV ở bước
sóng 240 nm). Mẫu được chiết với hỗn hợp acetonitrile/H2O và được phân tích bởi sắc
ký lỏng ghép cặp ion (ion-pair HPLC). Chỉ thích hợp khi dùng để phân tích một hàm
lượng melamine tương đối lớn (WHO/HSE-FOS, 2 October 08).
2.3.2. Sắc ký lỏng ghép khối phổ
LC-MS-MS là phương pháp đáng tin cậy nhất dùng trong định lượng melamine
với nồng độ thấp trong nhiều loại mẫu phân tích. Nó cho độ nhạy và độ chọn lọc cao
trong phạm vi rộng các sản phẩm khác nhau. Mẫu được chiết với hỗn hợp
acetonitrile/H2O. Chất chiết được làm sạch với methylene chloride bằng cột SPE.
Melamine được tách ra từ cột SPE với hỗn hợp ammonium hydroxide/methanol, làm
khô, được tái tạo lại với chất nội chuẩn và hỗn hợp acetonitrile/H2O, đem phân tích
trên hệ thống LC-MS-MS. Yêu cầu sự trang bị máy móc phức tạp, thông qua sử dụng
chất đồng vị đánh dấu những tiêu chuẩn định lượng đáng tin cậy ở nồng độ thấp đến

mức có thể (WHO/HSE-FOS, 2 October 08).
2.3.3. Sắc ký khí ghép khối phổ
Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (Gas Chromatography - Mass
Spectometry, GC-MS) là một trong những phương tiện hữu ích dùng để xác định thành
phần, cấu trúc hóa học của hợp chất cần khảo sát. Các cấu tử được tách khỏi cột sắc ký
sẽ lần lượt được đưa vào nguồn ion của máy khối phổ. Tại đó chúng được phân mảnh
và được tách khối nhờ một từ trường rồi đi vào bộ nhân quang để chuyển hóa thành tín
hiệu điện. Ứng với mỗi một peak trên sắc ký đồ sẽ nhận được một khối phổ riêng biệt
và hoàn chỉnh (Phạm Hùng Việt, 2005).

13