XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG DIACETYL TRONG CÁC LOẠI BIA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ

Niên khoá: 2010 - 2012
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH
ĐỊNH LƯỢNG DIACETYL TRONG CÁC
ĐỊNH LƯỢNG DIACETYL TRONG CÁC
LOẠI BIA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC
LOẠI BIA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC
KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ
KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ
Chuyên ngành: HÓA HỌC PHÂN TÍCH
Người hướng dẫn khoa học
TS. ĐẶNG VĂN KHÁNH
Học viên thực hiện
HỒ THANH TUẤN
1


Bia là loại nước uống đặc biệt có độ cồn thấp, hương
thơm, bọt mịn và được rất nhiều người ưa chuộng. Trong quá
trình lên mem bia, ngoài các sản phẩm chủ yếu là cồn và
CO2 còn tạo rất nhiều sản phẩm phụ khác như rượu bậc cao,
este, andehit, glyxerin trong đó có diacetyl.

Diacetyl là chất độc gây kìm hãm sự trao đổi chất, có ảnh
hưởng đến sự sinh sản, độ lắng, độ đục… làm cho men tạo ra
mùi vị lạ, khó chịu, gây đau đầu và ảnh hưởng đến hệ thần
kinh của người tiêu dùng.

Phương pháp GC/MS kết hợp kỹ thuật chiết pha rắn
(SPE) và tạo dẫn xuất với 1,2-diaminobenzen có giới hạn phát

hiện thấp cỡ nồng độ ppb và có độ chính xác cao. Do đó,
chúng tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình định
lượng diacetyl trong các loại bia bằng phương pháp sắc ký khí
ghép khối phổ”
2

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN LÝ THUYẾT
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
CHƯƠNG II. NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3

1.1. TỔNG QUAN VỀ DIACETYL
Giới thiệu tính chất hóa lý của diacetyl và độc tính của nó.
Sự hình thành diacetyl trong quá trình lên men bia
1.2. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ
Trình bày nguyên lý về GC/MS, một số bộ phận quan trọng
trong máy GC/MS. Giới thiệu về khối phổ, cơ chế phân mảnh
1.3. KỸ THUẬT CHIẾT PHA RẮN (SPE)
Tổng quan về phương pháp chiết pha rắn SPE, cơ chế hấp phụ
và kỹ thuật tiến hành
4

2.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
(1). Lựa chọn các điều kiện tiến hành sắc ký khối phổ: cột
tách, tốc độ khí mang, nhiệt độ interface, chương trình nhiệt độ
lò, kiểu bơm mẫu.
(2). Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích qua các đại
lượng như độ lặp lại, độ đúng, độ thu hồi, giới hạn phát hiện và
giới hạn định lượng.

Khảo sát chất lượng qui trình phân tích bằng cách so sánh
phương pháp đang nghiên cứu với phương pháp chuẩn theo
TCVN 6058:1995
(3). Áp dụng thực tế : áp dụng phương pháp đã lựa chọn để
định lượng các loại bia hiện đang lưu hành trên thị trường Thừa
Thiên Huế.
5

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Lấy mẫu và bảo quản mẫu
Lấy mẫu ngẫu nhiên ở quầy, nhà hàng, các đại lý… mẫu
được đựng trong chai hoặc lon kín có ngày sản xuất và được
bảo quản nơi thoáng mát
2.2.2. Quy trình xử lý mẫu
Lấy khoảng 10-50 mL mẫu thử cho vào cốc có mỏ có dung
tích 125 mL, thêm khoảng 1-5 mL dung dịch 2,3-hexandion và
1-2 mL dung dịch 1,2-diaminobenzen, đun cách thủy 300C
trong khoảng 15 phút, cho qua cột SPE đã được hoạt hóa, sau
đó rửa giải bằng dung môi diclometan. Dung dịch sau khi qua
cột, được làm làm khô bằng khí N2 tới cạn. Hòa tan cắn với
dung môi etylaxetat, lọc qua màng lọc 0,45 µL và tiêm vào máy
GC/MS.
6

2.2.3. Nghiên cứu quy trình phân tích
2.2.4. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích
* Xây dựng đường chuẩn
* Độ lặp lại
* Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
2.2.5. Đánh giá phương pháp nghiên cứu

* Dùng chuẩn F (chuẩn Fisher) để so sánh độ lặp lại của hai
phương pháp: phương pháp nghiên cứu và phương pháp
chuẩn theo TCVN 6058:1995,
* Dùng chuẩn t (chuẩn Student) để so sánh hai giá trị trung
bình của phương pháp GC/MS với phương pháp đối chiếu:
phương pháp chuẩn theo TCVN 6058:1995
7

3.1. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ
3.1.1. Lựa chọn cột tách
Bảng 3.2. So sánh khả năng tách của 2,3-dimetylquinoxalin và 2-
metyl-3-n-propylquinoxalin trên hai cột DB-5MS và InertCap
5MS/Sil
STT
Loại cột
Thời gian lưu
của pic 2,3-
dimetylquinoxal
in (phút)
Thời gian lưu
của pic 2-metyl-
3-n-
propylquinoxali
n (phút)
Hệ số
tách
1 InertCap 5
MS/Sil
7,098 8,890 1,252
2 DB-5MS 9,013 11,117 1,233

8

Hình 3.1. Sắc đồ phân tích hỗn hợp trên cột InertCap 5MS/Sil
Hình 3.2. Sắc đồ phân tích hỗn hợp trên cột DB-5MS
9

3.1.2. Khảo sát tốc độ dòng khí mang
Sau khi lựa chọn cột DB-5MS để tiến hành phân tích và giữ
nguyên ĐKTN như hình 3.2. Chúng tôi tiến hành tiêm hỗn hợp
chuẩn đã được tạo dẫn xuất 2,3-dimetylquinoxalin và 2-metyl-3-n-
propylquinoxalin vào máy sắc ký khí ghép khối phổ với tốc độ khí
mang lần lượt là 1,2; 1,5; 1,7 mL/phút. Kết quả phân tích được
trình bày ở bảng 3.3
Bảng 3.3. So sánh khả năng tách của 2,3-dimetylquinoxalin và 2-
metyl-3-n-propylquinoxalin ở ba tốc độ dòng khác nhau
STT
Tốc độ dòng
(mL/phút)
Thời gian lưu của
pic 2,3-
dimetylquinoxalin
(phút)
Thời gian lưu của pic
2-metyl-3-n-
propylquinoxalin
(phút)
Hệ số
tách
1 1,7 8,608 9,052 1,052
2 1,5 9,047 11,097 1,226

3 1,2 10,605 12,749 1,202
10

Hình 3.3. Sắc đồ khảo
sát ở tốc độ dòng 1,7
ml/phút
Hình 3.4. Sắc đồ khảo
sát ở tốc độ dòng 1,5
ml/phút
Hình 3.5. Sắc đồ khảo
sát ở tốc độ dòng 1,2
ml/phút
11

3.1.3. Lựa chọn các điều kiện tiến hành sắc ký để phân tích dẫn xuất của
diaxetyl trong bia
Bảng 3.4. Chương trình nhiệt độ phân tích hỗn hợp 1,2-dimethylquinoxaline và
2-methyl-3-n- propylquinoxaline trên hệ thống GC/MS
Chương
trình
Nhiệt độ
MS
interface
(
0
C)
Nhiệt độ
buồng
tiêm mẩu
(

0
C)
Chương trình nhiệt độ lò
Tốc độ
tăng nhiệt
độ
(
0
C/phút)
Nhiệt độ
đạt tới
Thời gian
giữ
(phút)
Tổng thời
gian
(phút)
1 250 250
60 1
29,330 250 0
20 300 5
2 250 250
60 1
25,020 200 1
30 300 5
3 250 250
40 1
28,510 200 0
20 250 5
12

Bảng 3.5. Điều kiện sắc kí khí ghép khối phổ xác định diacetyl trong bia
Thông số Điều kiện
Cột tách
DB-5 MS: dài 30m, đường kính 0,25mm, pha tĩnh
chứa (5%-phenyl)-metyl polysiloxan với bề dày
0,25 µm.
Khí mang Heli tinh khiết 99,99999%
Tốc độ dòng 1,5 mL/phút
Kiểu bơm mẩu Splitless, mẩu được bơm tự động với thể tích 1µl
Nhiệt độ MS interface 250
0
C
Nhiệt độ injector 250
0
C
Điện thế detectơ 1,2 kV
Chế độ ion hóa va đập điện
tử
EI với năng lượng 70 eV
Chế độ Full Scan, dải quét 50 ÷ 500 amu
Chương trình nhiệt độ
Nhiệt độ đầu 40
0
C (giữ đẳng nhiệt trong 1 phút);
tăng 10
0
C phút đến 200
0
C; tăng 20

0
C phút đến
250
0
C (giữ đẳng nhiệt trong 5 phút)
13

Hình 3.8. (a) các mảnh phổ của hợp chất 2,3-dimetylquinoxalin
(b)các mảnh phổ của hợp chất 2-metyl-3-n-propylquinoxalin
Hình 3.7. Phổ Scan
1,2-dimetylquinoxalin
và 2-methyl-
3nPropylquinoxaline
14

3.2. KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH DIACETYL VÀ
TẠO DẪN XUẤT SỬ DỤNG CỘT CHIẾT PHA RẮN (SPE)
3.2.1. Quá trình tách chiết
- Hoạt hóa cột chiết : Cột chiết C18 có dung tích 3 mL, chứa
200mg pha rắn C18 đựơc hoạt hóa với 3 mL metanol/nước với tỉ
lệ 9/1 (V/v) tiếp sau là 3 mL nước cất.
- Nạp mẩu vào cột : Mẩu được nạp vào cột với tốc độ được
điều chỉnh bằng áp suất của bơm hút chân không đảm bảo tốc độ
dòng khoảng 1mL/phút.
- Rửa giải :
3.2.2. Khảo sát thể tích dung môi rửa giải hàm lượng diacetyl qua
cột C18
Với lượng diacetyl ban đầu là 200 µg/L, sau khi tiến hành tạo
dẫn xuất và cho qua cột C18 có thể tích là 3 mL để tiến hành khảo
sát thể tích rửa giải khác nhau. Kết quả khảo sát được thể hiện ở

bảng 3.6.
15

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát thể tích dung môi diclometan rửa giải qua cột C18
Thể tích dung môi rửa giải (mL) 2 3 5 7
Lượng diacetyl thu hồi
(µg/L )(n = 3)
Lần 1 151,5 181.2 190.5 184.4
Lần 2 162.2 195.6 191.4 180.2
Lần 3 148,4 182.5 189.5 200.5
Trung bình 154,0 186,4 190,5 188,4
Độ thu hồi (%) 77,0 93,3 95,3 94,2
Hình 3.9. Hiệu suất thu hồi diacetyl ở các thể tích dung môi rửa
giải
khác nhau sau khi qua cột C18
16

3.3. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP
3.3.1. Độ ổn định của hệ thống sắc ký
Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng 3.7
X
X
( (
STT
Nồng
độ
nghiên
cứu
Tỷ lệ diện
tích pic

± SD) STT
Nồng
độ
nghiên
cứu
Tỷ lệ
diện tích
pic
± SD)
1
20 µg/L
0,37
0,37 ± 0,01
RSD% = 1,71
13
100
µg/L
0,69
0,69 ± 0,01
RSD% = 1,09
2 0,37 14 0,70
3 0,38 15 0,69
4 0,37 16 0,69
5 0,36 17 0,70
6 0,37 18 0,68
7
50 µg/L
0,53
0,53 ± 0,01
RSD% = 0,97

19
200
µg/L
1,07
1,06 ± 0,01
RSD% = 1,39
8 0,54 20 1,08
9 0,53 21 1,05
10 0,54 22 1,06
11 0,53 23 1,07
12 0,53 24 1,04
17

3.3.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Thêm dung dịch diacetyl chuẩn 16,5 µg/L; 32,0 µg/L; 64,0 µg/L vào mẩu trắng.
Xử lý mẩu và tiến hành chạy sắc ký. Tính trung bình của tỷ số chiều cao ứng với
pic của hợp chất 2,3-dimetylquinoxalin so với chiều cao nhiễu đường nền của 3 lần
làm song song tại mỗi nồng độ khảo sát. Tại nồng độ có tỷ số S/N khoảng bằng 10
với RSD khoảng 20%, độ đúng nằm trong khoảng 80- 110% là LOQ của phương
pháp và tỷ số S/N bằng 3 là LOD của phương pháp.
Tiến hành thí nghiệm lặp lại 3 lần ở nồng độ 16,5 µg/L, từ kết quả thu được ở
hình 3.10 và phụ lục 2. Chúng tôi xác định được LOD và LOQ của phương pháp là:
LOQ = 16,5 µg/L và LOD = 5,0 µg/L
PHỤ LỤC 2. Bảng số liệu
phân tích giá trị S/N tại
nồng độ 5 ppb
18

3.3.3. Khoảng nồng độ tuyến tính
Kết quả được trình bày ở bảng 3.8. và hình 3.11

Bảng 3.8. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của diacetyl trong bia
STT
Nồng độ diacetyl
(µg/L)
Tỷ lệ diện tích pic
(2,3-dimetylquinoxalin/2-metyl-3-n-
propylquinoxalin)
Phương trình hồi quy
1 20 0,37 y = 0,0039x +0,3073
R = 0,9995
y : tỷ lệ diên tích pic
x : nồng độ diacetyl
2 50 0,53
3 100 0,69
4 200 1,07
5 500 2,25
Hình 3.11. Đường biễu diễn mối
tương quan giữa tỷ số diện tích
2,3-dimetylquinoxalin/2-metyl-3-n-
propylquinoxalin và nồng độ diacetyl
trong bia
19

3.4. XÂY DỰNG QUI TRÌNH PHÂN TÍCH
Từ các kết quả khảo sát đã nghiên cứu, chúng tôi xây dựng quy trình phân
tích để định lượng diacetyl trong bia bằng phương pháp GC/MS như hình
3.12
20 mL mẫu bia 1 mL dung dịch 2,3-hexandion 1ppm
Tạo dẫn xuất với 1,2-diaminobenzen
SPE

Cắn
1 mL dung dịch
GC/MS
- Cột tách: DB-5MS
- Tốc độ dòng: 1,5 mL/phút
- Nhiệt độ injectơ: 250
o
C
- Nhiệt độ interface: 250
o
C
- Điện thế detectơ: 1,2 kV
- Nhiệt độ đầu 40
o
C (giữ đẳng nhiệt
trong 1 phút); tăng 10
o
C/phút đến
200
o
C; tăng 20
o
C/phút đến 250
o
C
(giữ đẳng nhiệt trong 5 phút)
- Dải quét: 50÷500 amu
- Cách thủy ở 30
0
C trong 15’

- Rửa giải bằng 5 mL CH
2
Cl
2
- Thổi N
2
tới cạn
- Định mức 2 mL Etyl axetat
Hình 3.12. Sơ đồ quy
trình phân tích xác định
diacetyl trong bia bằng
phương pháp GC/MS
20

3.5. ÁP DỤNG THỰC TẾ
3.5.1. Kiểm soát chất lượng qui trình
3.5.1.1. Độ lặp lại và độ thu hồi
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn diacetyl cho vào mẩu trắng với 3 nồng độ
380 µg/L; 470 µg/L; 550 µg/L và dung dịch nội chuẩn 2,3-hexandion nồng
độ 1000 µg/L. Mỗi nồng độ làm song song 3 mẩu. Tiến hành phân tích theo
qui trình đã xây dựng. Kết quả đuợc trình bày ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi của quy trình phân tích
Lượng thêm
vào (µg/L)
Lượng tìm thấy (µg/L)/Rev%
RSD%
(n = 3)
Rev%
380,0 325,2 / 85,58 321,5 / 84,61 327,6 / 86,21 0,95 85,47
470,0 431,2 / 91,74 421,5 / 89,68 439,2 / 93,45 2,06 91,62

550,0 528,2 / 96,04 521,2 / 94,76 524,5 / 95,36 0,67 95,39
21

3.5.1.2. So sánh phương pháp nghiên cứu với phương pháp hiện hành theo
TCVN 6058-1995 (UV-Vis)
Tiến hành phân tích hàm lượng diacetyl trong mẩu bia Hue beer Export
(chi tiết về mẩu nêu ở bảng 3.11) bằng hai phương pháp: phương pháp sắc
ký khí ghép khối phổ GC/MS và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử
UV-Vis. Kết quả phân tích được trình bày ở bảng 3.10
1
X
2
X
Bảng 3.10. Kết quả phân tích diacetyl trong bia bằng phương pháp GC/MS và
UV-Vis trong mẩu bia B30
Mẩu
GC/MS UV-Vis
Hàm lượng
diacetyl (ppb)
Số liệu thống
kê
Hàm lượng
diacetyl (ppb)
Số liệu thống
kê
1
48,5
= 48,5
S
1

= 0,32
(n = 5)
47,7
= 49,0
S
2
= 1,04
(n = 5)
2
48,2 49,9
3
48,7 50,2
4
48,3 48,6
5
49,0 48,5
1
X
2
X
22

2
2
2
2 2
1
1,04
0,32
S

S
=
1 2
2 2
1 2
1 2
X X
S S
n n
−
+
2
2 2
1 2
1 2
2 2
2 2
1 2
1 2
1 2
2 5
1 1
S S
n n
f
S S
n n
n n
 
 

 
 
+
 ÷
 
 
= − =
 
 
   
 ÷  ÷
 
   
 
+
 
+ +
 
* Nhận xét:
- Ta có F
tính
=
Nên Hai phương pháp có độ lặp lại khác nhau với p < 0,05. Hay
nói cách khác, phương pháp GC/MS có độ lặp lại tốt hơn phương
pháp UV-Vis với p < 0,05.
- Xét t
tính
=
= 1,03 và khi đó bậc tự do f được tính lại
Do t

tính
= 1,03 < t (p = 0,05; f= 5) = 2,57.
Nên kết quả trung bình của hai phương
pháp tương đương nhau
(p < 0,05).
= 10,56 > F (p = 0,05; f1= f2=4)= 6,39
23

3.5.2. Áp dụng thực tế
Áp dụng qui trình đã được xây dựng và thẩm định được để tiến hành định
lượng một số mẩu bia đang lưu hành trên thị trường thành phố Huế (Chi tiết
về mẩu nêu ở bảng 3.11) thu được kết quả ở bảng 3.12.
Bảng 3.11. Thông tin chi tiết về các mẩu bia
ST
T
Ký hiệu
mẩu
Tên mẩu
Nồng độ
cồn
Ngày sản xuất
1 B25
Tiger beer
5%
01/08/2012
2 B26
Huda beer extra
4,9%
06/02/2012
3 B27

Biere Larue export
4,5%
01/08/2012/SV
4 B28
Festival beer
4,5%
07/03/2012
5 B29
Corona extra (Mexico)
4,6%
05/03/2012
6 B30
Hue beer export
5%
10/12/2012
7 B31
Tiger crystal
4,6%
26/07/2012/AE
8 B32
Huda Beer
4,7%
19/02/2012
9 B33
Heineken
5%
04/08/2012/HE
24

Bảng 3.12. Kết quả phân tích một số mẩu bia thực tế bằng GC/MS

STT
Ký hiệu mẩu
Hàm lượng
diacetyl (ppb)
So sánh với mức qui định
theo QCVN 6-3: 2010/BYT
1
B25 47,8
Đạt
2
B26 47,2
Đạt
3
B27 58,0
Đạt
4
B28 78,5
Đạt
5
B29 46,2
Đạt
6
B30 48,5
Đạt
7
B31 39,1
Đạt
8
B32 68,5
Đạt

9
B33 49,0
Đạt
Kết quả ở bảng 3.12 cho thấy: đã phát hiện được diacetyl
trong các loại bia đang lưu hành trên thị trường Thừa Thiên Huế.
Song hàm lượng của chúng đều đạt yêu cầu so với quy định hiện
hành của Bộ Y Tế (<0,2 mg/L)
25