ỨNG DỤNG KĨ THUẬT PCR VÀ REPPCR SO SÁNH SỰ KHÁC BIỆT DI TRUYỀN CỦA CÁC CHỦNG Pasteurella multocida GÂY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG PHÂN LẬP TẠI MIỀN NAM VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ỨNG DỤNG KĨ THUẬT PCR VÀ REP-PCR SO SÁNH
SỰ KHÁC BIỆT DI TRUYỀN CỦA CÁC CHỦNG
Pasteurella multocida GÂY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG
PHÂN LẬP TẠI MIỀN NAM VIỆT NAM

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: TRỊNH THỊ KIM LIÊN

Niên khóa

: 2005 – 2009

Tháng 8/2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ỨNG DỤNG KĨ THUẬT PCR VÀ REP-PCR SO SÁNH

SỰ KHÁC BIỆT DI TRUYỀN CỦA CÁC CHỦNG
Pasteurella multocida GÂY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG
PHÂN LẬP TẠI MIỀN NAM VIỆT NAM

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI

TRỊNH THỊ KIM LIÊN

Tháng 8/2009


LỜI CẢM ƠN
Con cảm ơn bố mẹ đã nuôi con khôn lớn và lao động vất vả để tạo mọi điều kiện
tốt nhất cho con có được ngày hôm nay. Con và các em luôn làm cho bố mẹ buồn
phiền nhiều. Con muốn gửi đến bố mẹ cuốn luận văn tốt nghiệp của con, đây cũng là
đề tài nghiên cứu đầu tiên của con, hy vọng sẽ là bước khởi đầu đền đáp công ơn của
bố mẹ. Con luôn muốn ở bên cạnh gia đình mình.
Và trên tất cả con muốn cảm ơn Bà, người đã cho con tuổi thơ đầy niềm vui và
mơ ước.
Xin bày tỏ lòng biết ơn đến Thầy Nguyễn Ngọc Hải, đã luôn giúp đỡ em với nụ
cười, lòng tận tụy và những lời khuyên quý giá. Em muốn gửi lời chúc sức khỏe và
hạnh phúc đến Thầy và gia đình.
Cảm ơn anh Nguyễn Mạnh Thắng đã hỗ trợ rất nhiều trong quá trình nghiên cứu.
Em cảm ơn các anh chị và các bạn trong phòng thí nghiệm đã giúp đỡ nhiệt tình
cho em hoàn thành tốt đề tài.
Cảm ơn người bạn thân của tôi đã luôn ủng hộ tôi trong quá trình làm đề tài.

Em xin cảm ơn nhà trường và Viện công nghệ sinh học và môi trường đã tạo điều
kiện tốt nhất cho em hoàn thành đề tài tốt nghiệp.
Hồ Chí Minh, 15/ 7/ 2009
TRỊNH THỊ KIM LIÊN

iii


TÓM TẮT
Nghiên cứu của chúng tôi “Ứng dụng kỹ thuật kỹ PCR và REP-PCR so sánh sự
khác biệt của các chủng Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng phân lập tại
miền Nam Việt Nam” đã áp dụng kỹ thuật PCR và REP-PCR để xác định và phân biệt
8 chủng vi khuẩn Pasteurella multocida, trong đó có 3 chủng phân lập từ gia cầm
bệnh ở miền Nam Việt Nam, 2 chủng vaccine phân lập từ gia cầm (chủng Tg và V), 1
chủng công cường độc vaccine tụ huyết trùng gia cầm (chủng Pa) và 1 chủng P.
multocida phân lập từ bò và 1 chủng P. multocida phân lập từ heo.
Phản ứng multiplex PCR với 3 cặp primer KMT, CAPA, CAPB xác định được
3 chủng phân lập từ gia cầm bệnh và 3 chủng vaccine (chủng Tg, V và Pa) đều thuộc
serotype A với các sản phẩm khuếch đại có kích thước 460 bp của cặp primer KMT và
1044 bp của cặp CAPA. Chủng P. multocida phân lập từ bò và chủng P. multocida
phân lập từ heo thuộc serotype B với sản phẩm PCR đặc hiệu 460 bp và 760 bp cho
cặp KMT và CAPB tương ứng.
Đồng thời, tiến hành phản ứng multiplex HSB – PCR với 2 cặp primer KMT và
HSB dùng xác định các serotype B:2, B:5 hoặc B:2,5 đối với 2 chủng thuộc serotype B
nói trên đã xác định cả 2 chủng phân lập từ bò hoặc heo này thuộc serotype B:2.
Nghiên cứu đã thực hiện kỹ thuật REP – PCR với cặp primer REP nhằm phân
biệt tất cả 8 chủng. Kết quả cho thấy các chủng P. multocida phân lập từ gia cầm ở các
tỉnh có sự khác biệt di truyền với các chủng làm vaccine và khác với các chủng gây
bệnh ở bò, heo. Kết quả này cũng cho thấy một phương pháp hiệu quả và nhanh để
phân biệt các chủng gây bệnh tụ huyết trùng gia cầm và có tiềm năng trong nghiên cứu

dịch tễ học.

iv


SUMMARY
Our investigation “Application of the PCR and REP – PCR technique to
differentiate Pasteurella multocida strains that cause fowl cholera isolated from the
South of Vietnam” applied PCR and REP – PCR technique to differentiate 8 strains of
Pasteurella multocida including 3 strains isolated from poultry, 1 P. multocida strain
isolated from cattle and 1 strain from swine, and 3 P. multocida vaccinal strains (strain
Tg, V, Pa),
The Multiplex Capsular PCR typing system with the primers KMT (KMT1T7
and KMT1SP6), CAPA (CAPA – FWD and CAPA – REV), CAPB (CAPB – FWD
and CAPB – REV) that was carried out and the results showed that 3 strains isolated
from poultry and 3 vaccinal strains belong to capsular serogroup A of P. multocida
which gave specific amplicons of 460 bp and 1044 bp. And the strain isolated from
cattle and another one from swine belong to serogroup B with amplicons of 460 bp
and 760 bp.
Also, the multiplex HSB – PCR with the primers KMT (KMT1T7 and
KMT1SP6) and HSB (KTT72 and KTSP61) that identified serotype B:2, B:5 or B:2,5
causing haemorrhagic septicaemia (HS), determined rapidly 2 P. multocida isolates
from cattle and from swine as serotype B:2, B:5 or B:2,5 with an amplicon
approximately 620 bp.
The REP – PCR revealed different genotypic profiles between all of 8 strains of
P. multocida investigated. The results also indicated that molecular methods of
detection and typing are rapid in comparison with conventional methods for
epidemiological investigations of fowl cholera outbreaks.

v

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN................................................................................................................ iii
TÓM TẮT.......................................................................................................................iv
SUMMARY.....................................................................................................................v
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................ viii
DANH SÁCH CÁC BẢNG ............................................................................................x
DANH SÁCH CÁC HÌNH.............................................................................................xi
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................1
1.1.

Đặt vấn đề ..........................................................................................................1

1.2.

Mục đích ............................................................................................................2

1.3.

Yêu cầu ..............................................................................................................2

1.4.

Nội dung thực hiện.............................................................................................2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU...............................................................................3
2.1.

Giới thiệu bệnh tụ huyết trùng ...........................................................................3

2.2.

Vi khuẩn Pasteurella multocida ........................................................................4

2.2.1.

Đặc điểm hình thái .............................................................................................4

2.2.2.

Đặc tính sinh hóa................................................................................................5

2.2.3.

Sức đề kháng của vi khuẩn Pasteurella multocida ............................................6

2.3.

Định danh Pasteurella multocida ......................................................................6

2.4.

Vaccine phòng bệnh tụ huyết trùng gia cầm....................................................10

2.5.

Tổng quan về kỹ thuật PCR và REP – PCR ....................................................10

2.5.1.

Kỹ thuật PCR....................................................................................................10

2.5.2.

Kỹ thuật REP – PCR ........................................................................................13

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................16
3.1.

Thời gian và địa điểm ......................................................................................16

3.2.

Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................16

3.3.

Vật liệu và thiết bị thí nghiệm..........................................................................16

3.3.1.

Vật liệu .............................................................................................................16

3.3.2.

Thiết bị và dụng cụ...........................................................................................17

3.4.3.

Hóa chất............................................................................................................18
vi


3.4.

Phương pháp nghiên cứu .................................................................................18

3.4.1.

Quy trình ly trích DNA vi khuẩn......................................................................18

3.4.2.

Quy trình thực hiện...........................................................................................19

3.4.2.1. Multiplex PCR..................................................................................................19
3.4.2.2. Phản ứng multiplex HSB-PCR (M - HSB – PCR)...........................................21
3.4.2.3. REP-PCR (Repetitive extragenic palindromic PCR) .......................................21
3.4.2.4. Quy trình điện di...............................................................................................22
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................................24
4.1.

Kết quả phản ứng Multiplex PCR....................................................................24

4.2.

Kết quả phản ứng REP – PCR .........................................................................29

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................34

5.1.

Kết luận ............................................................................................................34

5.2.

Đề nghị.............................................................................................................34

PHỤ LỤC

vii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
o

C

Celcious

bp

base pair

CEF

Chicken embryo fibroblast

Cs

cộng sự

dNTPs

Deoxynucleoside triphosphate

DNA

Deoxyribonucleic acid

ELISA

Enzyme linked immuno - sorbent assay

FAO

Food and Agriculture Organization

G

Gram(s)

HS

Haemorragic septicaemia

IHA

Indirect haemagglutination

kDa

Kilo -Dalton

LPS

Lipopolysaccharide

M

Molar

Mg

Milligram (s)

M - HSB – PCR

Multiplex Haemorragic septicaemia type B PCR

ml

Milliliter (s)

mM

Milimolar

MW

Molecular weight (s)

µm

micrometer

µl

microliter

ng

Nanogram (s)

OD

Optimal density

OMP (s)

Outer membrane protein (s)

OIE

Office International des Epizooties

PAGE

Polyacrylamide gel electrophoresis

PCR

Polymerase chain reaction

PFGE

Pulse field gel electrophoresis

PMT

Pasteurella multocida toxin
viii


pmole

Picomole(s)

P. multocida

Pasteurella multocida

RAPD

Randomly Amplified Polymorphic DNA

REP – PCR

Repetitive extragenic palindromic – PCR

SDS

Sodium dodecyl sulphate

TBE

Tris Borate EDTA buffer

THT

Tụ huyết trùng

UV

Ultra violet

V

Volts

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Các hệ thống hiện nay phân loại theo huyết thanh học ..................................6
Bảng 2.2 Kết quả định type các chủng P. mutocida gây bệnh tụ huyết trùng ................8
Bảng 3.3 Các cặp primer sử dụng trong nghiên cứu.....................................................18
Bảng 3.4 Thành phần hóa chất phản ứng PCR .............................................................21
Bảng 3.5 Chu trình nhiệt của phản ứng ........................................................................21
Bảng 3.6 Quy trình thực hiện HSB-PCR .....................................................................22

Bảng 3.7 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR................................................................22
Bảng 3.8 Thành phần hóa chất của phản ứng REP-PCR ..............................................23
Bảng 3.9 Chu trình nhiệt của phản ứng REP-PCR .......................................................23
Bảng 4.10 Sự khác biệt kích thước các band sản phẩm của các chủng P. mutocida....31

x


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Vi khuẩn Pasteurella multocida nuôi cấy trên môi trường thạch máu............4
Hình 2.2 Vaccine tụ huyết trùng...................................................................................10
Hình 2.3 Quy trình phản ứng PCR ...............................................................................13
Hình 2.4 Quy trình của REP – PCR genomic fingerprinting .......................................14
Hình 2.5 Phương pháp REP – PCR ..............................................................................15
Hình 3.6 Sơ đồ quy trình thực hiện nghiên cứu............................................................20
Hình 4.7 Sơ đồ cấu trúc gene của vùng locus tổng hợp capsule ..................................26
Hình 4.8 Multiplex PCR xác định serotype capsule của Pasteurella multocida..........27
Hình 4.9 Phản ứng multiplex PCR ...............................................................................28
Hình 4.10 Kết quả của phản ứng REP – PCR ..............................................................30

xi


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ở nước ta, ngành chăn nuôi rất phát triển, ước tính tổng đàn gia cầm của cả nước
năm 2008 tăng gần 10% so với năm 2007. Bình quân tổng số gia cầm thường xuyên
đạt 247,3 triệu con, trong đó tổng đàn gà là 179 triệu con. Đồng Bằng Sông Cửu Long,
Tây Nguyên, Đông Nam Bộ là các vùng có tỷ lệ tăng trưởng lớn nhất tương ứng là

17,9; 17,1 và 13,4%. (TS.Nguyễn Thanh Sơn, 2008, />Do đó việc ngăn ngừa và kiểm soát dịch bệnh được đặt ra.
Bệnh tụ huyết trùng gia cầm (Flow Cholera hoặc Avian pasteurellosis) là một
bệnh thường xảy ra ở gia cầm, có thể gây bệnh cho tất cả các loài cầm và phân bố khắp
thế giới. Bệnh đặc trưng bởi nhiễm trùng huyết, thường là cấp tính, chết nhanh và gây
thiệt hại nặng nề cho chăn nuôi. Tác nhân gây bệnh là vi khuẩn Pasteurella multocida.
Hiện nay bệnh tụ huyết trùng còn xảy ra rất phổ biến, gây nhiều thiệt hại cho
ngành chăn nuôi ở nhiều nước, đặc biệt là các nước vùng nhiệt đới thuộc Châu Á và
Châu Phi. Các nước trên thế giới đã nghiên cứu nhiều về bệnh này để phòng ngừa và
hạn chế tối đa tác hại do bệnh. Ở Việt Nam, bệnh xảy ra ở nhiều tỉnh thành trong cả
nước với tỷ lệ bệnh và tỷ lệ chết rất cao ở gia cầm. Theo số liệu thống kê của Cục thú
y, tình hình bệnh tụ huyết trùng gia cầm 6 tháng đầu năm 2009 tại các tỉnh phía Nam,
xảy ra chủ yếu ở 3 tỉnh: Tiền Giang, Bến Tre, Đồng Tháp với 11 huyện, 45 xã. Số ổ
dịch: 71, tổng số bệnh 15.440 con, tổng số chết 1.114 con, chiếm tỷ lệ vẫn khá cao
7,21% (Nguyễn Mạnh Thắng, 2009), chứng tỏ các biện pháp phòng bệnh và điều trị có
cải tiến tốt hơn trước, nhưng vẫn chưa đạt hiệu quả. Thực tế cho thấy bệnh gây chết
đột ngột nên rất khó điều trị kịp thời, do đó đối với bệnh THT, việc phòng bệnh bằng
vaccine là cấp thiết và có hiệu quả kinh tế nhất.
Vaccine tụ huyết trùng gia cầm hiện nay có 2 loại keo phèn và nhũ dầu do công
ty thú y TW2 Navetco sản xuất. Tuy nhiên bệnh vẫn xảy ra và gây thiệt hại cho ngành
chăn nuôi gia cầm, giả thiết đặt ra có thể là do hiệu lực bảo hộ của vaccine chưa cao,

1


hoặc do biện pháp tiêm phòng kém, hoặc có thể do sự không tương đồng kháng
nguyên của chủng làm vaccine với các chủng vi khuẩn P. multocida gây bệnh thực địa.
Từ nhu cầu đánh giá hiệu quả của vaccine tụ huyết trùng, xác định các serotype
gây bệnh tụ huyết trùng gia cầm và điều tra sự khác biệt di truyền của các chủng vi
khuẩn phân lập thực địa và chủng làm vaccine, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Ứng
dụng kỹ thuật PCR và REP-PCR so sánh sự khác biệt của các chủng Pasteurella

multocida gây bệnh tụ huyết trùng phân lập tại miền Nam Việt Nam”.
1.2. Mục đích
Thực hiện phản ứng PCR và REP-PCR để xác định serotype và phân tích sự khác
biệt di truyền hay sự tương đồng của các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida thực
địa và chủng làm vaccine. Từ đó có phương hướng nâng cao hiệu quả của vaccine tụ
huyết trùng.
1.3. Yêu cầu
Thực hiện các phản ứng Multiplex PCR, multiplex HSB-PCR, REP-PCR.
Phân tích, đánh giá kết quả nghiên cứu.
1.4.

Nội dung thực hiện
Thí nghiệm 1: thực hiện phản ứng single PCR với cặp primer KMT (KMT1T7 và

KMT1SP6) để khẳng định 8 mẫu nghiên cứu đều thuộc chủng P. multocida.
Thí nghiệm 2: tiến hành phản ứng multiplex PCR với cả 3 cặp primer KMT
(KMT1T7 và KMT1SP6), CAPA (CAPA – FWD và CAPA – REV), CAPB (CAPB –
FWD và CAPB – REV) xác định serotype của các mẫu dương tính ở thí nghiệm 1.
Thí nghiệm 3: Phân tích sự khác biệt di truyền giữa các chủng bằng kỹ thuật
REP-PCR.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu bệnh tụ huyết trùng
Bệnh tụ huyết trùng (Pasteurellosis) xảy ra ở Châu Âu trong suốt nửa sau thế kỷ
XVIII. Mailet (1836) là người đầu tiên dùng danh từ “Flow Cholera” để gọi tên bệnh
tụ huyết trùng gia cầm.

Louis Pasteur (1877) xác định được vi sinh vật gây bệnh toi gà và đặt tên là
Bacillus avisepticus. Pasteur đã phân lập vi khuẩn và nuôi cấy được canh khuẩn thuần
khiết trong môi trường nước thịt gà. Trong những nghiên cứu tiếp theo, Pasteur đã sử
dụng vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng gia cầm để thực hiện những thí nghiệm mang
tính cổ điển của mình, làm giảm độc lực để chế tạo vaccine phòng bệnh.
Các bệnh bại huyết thỏ, toi gà và bại xuất huyết trên các loài gia súc khác đều có
mầm bệnh tương tự nhau về mặt hình thái và sinh bệnh học (Kitt và Huppe, 1885).
Merechant và Rosenbusch (1937) dựa trên đề nghị của Kitt, xếp các loài vi khuẩn gây
bệnh bại huyết thỏ, toi gà, bại huyết, xuất huyết trên gia súc vào một loài duy nhất là
Pasteurella multocida.
Rhoades and Rimler (1991) đưa ra kết luận Pasteurella multocida là nguyên
nhân bệnh tụ huyết trùng gia cầm (Flow Cholera hoặc Avian pasteurellosis), một bệnh
thường xảy ra ở gia cầm, có thể gây bệnh cho tất cả các loài cầm và phân bố khắp thế
giới, chủ yếu tại các nước có mùa mưa ẩm rõ rệt như ở các nước Ấn Độ, Indonexia,
Thái Lan, Malaixia, Việt Nam.... Bệnh đặc trưng bởi nhiễm trùng huyết, thường là cấp
tính, chết nhanh và gây thiệt hại nặng nề cho chăn nuôi. Các chủng thuộc serotype A
của P. mutocida là nguyên nhân chính của bệnh tụ huyết trùng gia cầm.
Ở nước ta bệnh có ở khắp nơi, bệnh có tính chất lẻ tẻ, đôi khi thành vùng dịch, có
thể xảy ra quanh năm. Ở các tỉnh đồng bằng Nam Bộ vào mùa mưa khí hậu nóng ẩm,
nhiều đầm lầy nên bệnh thường xảy ra tập trung từ tháng 3 đến tháng 9 (Nguyễn Xuân
Bình, 1993). Ở miền Bắc và miền Trung theo điều tra của Lê Tạo và Nguyễn Ngọc
Thiên (1995) bệnh xuất hiện thường từ tháng 8, tháng 9 đến tháng 3 năm sau.

3


2.2. Vi khuẩn Pasteurella multocida
2.2.1.

Đặc điểm hình thái

Vi khuẩn P. multocida có dạng hình gậy ngắn, nhỏ, đôi khi có một vài dạng cầu
trực khuẩn hoặc dạng sợi. P. multocida bắt màu rõ ở hai đầu, Gram (-), không di động,
không hình thành nha bào. Kích thước vi khuẩn từ 0,6 – 2,5 μm x 0,2 – 0,4 μm.
Kích thước của vi khuẩn thay đổi phụ thuộc vào nguồn gốc của chúng. Khi nuôi
cấy ở nhiệt độ thấp, vi khuẩn có kích thước nhỏ hơn; trong môi trường có thêm đường
thì vi khuẩn lớn hơn. Hình thái của vi khuẩn có xu hướng không ổn định trong quá
trình nuôi cấy, cấy truyền nhiều lần vi khuẩn có dạng hình sợi nhiều hơn. Hình thái
của vi khuẩn còn thay đổi tùy theo sự hình thành của capsule. Các vi khuẩn có capsule
thường có kích thước lớn hơn vi khuẩn không có capsule. Vỏ capsule của vi khuẩn
phát triển tốt trong môi trường cơ bản có thêm 0,5% glucose trong điều kiện hiếu khí,
capsule thường không phát triển trong môi trường không có đường ở nhiệt độ 280C.
Đặc tính bắt màu của vi khuẩn P. multocida cũng không cố định. Vi khuẩn trong
các bệnh phẩm, các canh khuẩn mới phân lập thường bắt màu lưỡng cực rõ rệt. Cấy
truyền nhiều lần làm giảm đặc tính bắt màu lưỡng cực của vi khuẩn.
Khuẩn lạc của vi khuẩn có nhiều biến thể, hình dạng và kích thước của khuẩn lạc
phụ thuộc vào thành phần môi trường nuôi cấy. Trên môi trường agar – tryptose có
chứa đường thì khuẩn lạc có kích thước khoảng 1mm (đường kính), hơi lồi ở giữa và
có sắc cầu vồng. Khi nuôi cấy dài hoặc để lâu ở nhiệt độ phòng khuẩn lạc trở nên trắng
hơn, mọc sâu hơn vào môi trường thạch.

Hình 2.1 Vi khuẩn Pasteurella multocida nuôi cấy trên môi trường thạch máu
( />ws/haemophilus_answers.html).
4


Nếu nuôi cấy lâu ngày khuẩn lạc sẽ nhớt và dính, khi cấy chuyển liên tục thì
capsule bị mất, khuẩn lạc nhỏ hơn, không màu và trong suốt (Rimler, 1992).
Theo Nguyễn Lương (1997) thì khuẩn lạc có tán sắc cầu vồng rất độc và gây
bệnh thể cấp tính, loại khuẩn lạc màu xanh kém độc, thường gặp ở những đàn gia cầm

bị dịch ở địa phương. Vi khuẩn có khuẩn lạc có tán sắc cầu vồng đem nuôi cấy có thể
cho khuẩn lạc màu xanh, vi khuẩn có khuẩn lạc màu xanh cũng đột biến và sinh khuẩn
lạc màu xám. Màu của khuẩn lạc liên quan đến vỏ nhày. Vi khuẩn có khuẩn lạc tán sắc
màu cầu vồng tách rời từng tế bào hoặc từng đôi, không ngưng kết với kháng huyết
thanh. Vi khuẩn có khuẩn lạc màu xanh cũng rời từng tế bào hay từng cặp nhưng cho
ngưng kết với kháng huyết thanh. Khuẩn lạc màu xám chỉ có chuỗi dài vi khuẩn,
không vỏ nhày, không độc.
2.2.2.

Đặc tính sinh hóa

Pasteurella multocida thuộc loại vi khuẩn hiếu khí hay yếm khí tùy nghi. Chúng
phát triển trên các môi trường canh dinh dưỡng, thạch máu hoặc thạch huyết thanh,
nhiệt độ thích hợp từ 36 – 380C, pH: 7,2 – 7,8.
Vi khuẩn mọc yếu trên môi trường thạch thường nhưng mọc tốt trên môi trường
thạch máu và thạch huyết thanh (10% huyết thanh thỏ), trên hai môi trường này vi
khuẩn cho khuẩn lạc nhỏ, tròn, trong, để vài ngày khuẩn lạc chuyển sang trắng ngà.
Trên mặt thạch vi khuẩn có thể có 3 dạng khuẩn lạc: dạng bóng láng, xù xì (R), dạng
nhày (M). Dạng thông thường là dạng S có tính kháng nguyên và độc lực cao. Dạng
biến dị M và R có tính kháng nguyên và độc lực thấp.
Trên môi trường thạch máu vi khuẩn tụ huyết trùng không gây dung huyết, khuẩn
lạc phát triển mạnh, mặt khuẩn lạc tròn, láng, hơi ướt.
Khi soi dung quang, khuẩn lạc trên thạch có thể có các dạng: Dạng màu vàng da
cam chiếm 2/3 diện tích được gọi là FO (Flourescent Orange) có độc lực cao; Dạng
màu xanh chiếm 2/3 diện tích được gọi là FG (Flourescent Greenish) có độc lực thấp;
Những khuẩn lạc không có huỳnh quang được gọi là NF (Not Flourescent), không có
độc lực; Nếu nuôi cấy nhiều lần trên môi trường nhân tạo, khuẩn lạc sẽ chuyển thành
dạng S sang dạng M hoặc R, tính biến dạng này rất lớn. Một đặc điểm đặc trưng của vi
khuẩn tụ huyết trùng là khi nuôi cấy trong môi trường canh dinh dưỡng vi khuẩn sẽ
làm canh trùng đục có mùi tinh dịch.

5


2.2.3.

Sức đề kháng của vi khuẩn Pasteurella multocida

Vi khuẩn Pasteurella multocida bị diệt dễ dàng ở 500C/ 15 phút hoặc 600C/ 10
phút, ánh sáng mặt trời chiếu thẳng cũng diệt được chúng. Dung dịch HgCl2 1/ 5000,
acid phenic 5%, nước vôi 10%, formol 1% đều diệt được vi khuẩn trong 1 – 3 phút.
Crezyl 3%, phenol 0, 5%, diệt vi khuẩn trong vòng 15 phút. Trong đất ẩm thiếu ánh
sáng, giếng nước bẩn có nhiều chất hữu cơ và trong chuồng trại vi khuẩn sống được và
tháng đến một năm, trong xác súc vật chết chúng tồn tại 1 – 3 tháng.
2.3.

Định danh Pasteurella multocida
Theo các tài liệu của FAO và OIE, vi khuẩn P. multocida xác định serotype theo

kháng nguyên capsule (capsule antigens K) gồm 5 serotype capsule A, B, D, E, F và
kháng nguyên thân (somatic antigens O) từ 1 – 16.
Bảng 2.1 Các hệ thống phân loại theo huyết thanh học của vi khuẩn P. multocida
Author

Basis

Types identified

Capsular typing
Carter (1955)

Indirect haemagglutination (IHA)

A, B, C, D

Carter (1961)

IHA

E

Carter (1963)

IHA and passive mouse protection

Excluded type C

Namioka and Murata (1961)

Slide agglutination of fresh cultures A, B, D, E

Rimier and Rhoades (1987)

IHA

F

Somatic typing
Namioka and Murata (1961)

Agglutination of HCI - treated cells 1-11

Namioka and Bruner (1963)
Namioka and Murata (1964)
Heddleston và cs. (1972)

Agar gel precipitation test using 1 - 1-16
hour boiled supematant
(Nguồn: www.aciar.gov.au/system/files/node/2144/MN057+part+2.pdf )

6


 Các kỹ thuật xác định serotype của vi khuẩn Pasteurella multocida:
Kỹ thuật ngưng kết hồng cầu thụ động (IHA): do Carter (1995) đề xuất xác định
các nhóm kháng nguyên capsule đặc hiệu. Carter đã nghiên cứu một số lớn các phân
lập vi khuẩn Pasteurella multocida từ các động vật khác nhau và nhận thấy các
serotype A và D được phân lập từ gia cầm và một số động vật khác. Trong nghiên cứu
các ký chủ gia cầm và các loài cầm, Roardes và Rimler (1987) cũng phát hiện các vi
khuẩn thuộc về serotype A, B, D và F bằng phương pháp này.
Kỹ thuật khử bỏ lớp capsule bằng một enzyme mucopolysaccharidase: là kỹ
thuật đặc hiệu giám định sơ bộ các serotype A, D, và F theo De Alwis (1992), và đã
xác định Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng gia cầm thuộc serotype A, D
và F, trong đó phần nhiều là serotype A.
Định type kháng nguyên thân (somatic antigens) được thực hiện bằng kỹ thuật
ngưng kết trong ống nghiệm và kỹ thuật kết tủa khuếch tán trên thạch. Namioka và
Murata (1961) đã dùng kỹ thuật ngưng kết trong ống nghiệm với kháng nguyên xử lý
bằng HCl đã xác định được 11 kháng nguyên thân, ký hiệu từ 1 đến 11. Heddleston và
Reber (1972), bằng kỹ thuật kết tủa khuếch tán trên thạch đã chia kháng nguyên
Pasteurella multocida thành 16 serotype ký hiệu từ 1 đến 16.
Do vậy FAO đã quy định việc xác định serotype vi khuẩn P. multocida theo tất

cả các kháng nguyên capsule và kháng nguyên thân. Từ đó có hai hệ thống định type
vi khuẩn Pasteurella multocida được sử dụng phổ biến là: Hệ thống Namioka – Carter
và hệ thống Carter – Heddleston. Theo các hệ thống này thì vi khuẩn Pasteurella
multocida gây bệnh tụ huyết trùng gia cầm thuộc các serotype 5:A, 8:A, 9:A theo hệ
thống Namioka – Carter, hoặc A:1, A:3 và A:4 theo hệ thống Carter – Heddleston.
Ở Việt Nam chúng ta đang sử dụng hệ thống phân loại Carter – Heddleston và
thấy trên 90% các phân lập Pasteurella multocida gây bệnh ở gia cầm đều thuộc
serotype A:1 (Bảng 2.2).

7


Bảng 2.2 Kết quả định type P. mutocida gây bệnh tụ huyết trùng ở Việt Nam (Phan
Thanh Phượng, 2000)
N0 Tên tác giả
1
2

Năm

Nguyễn Vĩnh phước và 1978
cộng sự
Dương thế long
1995

Nguồn phân lập chủng
vaccine
45 mẫu từ trâu bò chết tại
một số tỉnh phía nam
Tại Sơn La:

Trâu bò chết

Nguyễn Ngã

1996

4

Nguyễn Thanh Phương 1990
Nguyễn Duy Hồng Hà

1990

Nguyễn Xuân Bình

1996

Lê lập

1997

5

Trương Văn Dung

1998

6

Viện thú y gửi chủng

sang CHDC Đức và
Srilanca định type

A, B, D

Lợn chết
Trâu bò chết tại miền Trung
Gà chết tại một số
Bắc
Gà chết tại một số
Nam
Gà chết tại một số
Nam
Gà chết tại một số
Trung

B

B

Gà chết
3

Serotype

A, B, D
B

tỉnh miền
tỉnh miền

tỉnh miền

A:1

tỉnh miền

Trâu bò khỏe mạnh và chết
tại 7 tỉnh phía bắc

A, B, D

Chủng vaccine FgHc lợn

B

Chủng vaccine P52 trâu bò

B

Chủng vaccine IR trâu bò

B

Chủng vaccine Pa1 và
Pa2 THT gà

A:1
D:1 – D:3

Chủng 4T THT

trâu bò: T1 và T2: bò

B:2 – B:6

T3 và T4: trâu

B:2 – B:6

Dê chết

A:1

Gà chết

A:1

8


 Xác định serotype capsule bằng các kỹ thuật sinh học phân tử
Định type P. mutocida bằng các phương pháp truyền thống hiện nay có một hạn
chế lớn, đó là khó khăn trong việc sản xuất các kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên
capsule và somatic của các serotype khác nhau. Các nhà khoa học chỉ tìm thấy tương
đối dễ dàng các kháng thể kháng kháng nguyên đặc hiệu của các serogroup B và E,
còn đối với các serogroup khác thì rất khó. Hơn nữa chủng không có vỏ capsule thì sẽ
không định được serotype.
Do đó gần đây, Townsend và cs (1998) đã phát triển kỹ thuật PCR sử dụng cặp
primer được thiết kế từ trình tự của clone 6b (KTT72 và KTSP61) để phân biệt các
chủng serotype B gây ra bệnh tụ huyết trùng thể bại huyết (HS) với các serotype khác.
Kỹ thuật multiplex PCR đã được Townsend và cs (2001) ứng dụng như một công

cụ nhanh để định serotype capsule A, B, D, E và F dựa trên các primer được thiết kế
theo các trình tự đặc biệt ở các locus sinh tổng hợp capsule của mỗi serogroup. Kỹ
thuật này đã làm sáng tỏ thông tin về các serotype capsule, đồng thời phân biệt rõ giữa
2 serogroup có quan hệ gần là serogroup A và F. Gautam và cs (2004) cũng đưa ra
phương pháp PCR đặc biệt để xác định P. mutocida serogroup A.
Trần Xuân Hạnh và Tô Thị Phấn (2007) cũng đã có những nghiên cứu về mối
quan hệ giữa serotype A:1 của P. multocida có nguồn gốc từ gia cầm và heo bằng kỹ
thuật PCR định type capsule và REP – PCR.
Một số thí nghiệm trên gene ompH mã hóa cho protein màng ngoài OMP bằng
PCR – RFLP trên các mẫu phân lập từ loài cầm cho thấy 7 thành phần khác nhau sau
khi dùng enzyme (EcoRI, HindIII và CfoI endonucleases) cắt các đoạn gene khuếch
đại ompH 1,2 kb của 4 serotype P. mutocida phân lập được. Qua đó cho phép đánh giá
kỹ thuật PCR – RFLP là một phương pháp typing tiềm năng để nghiên cứu sự xâm
nhiễm của vi khuẩn P. mutocida và dịch tễ học. Những nghiên cứu này cho thấy không
phải chỉ có sự hiện diện của vỏ capsule mà còn có những nhân tố khác cũng cần cho
tính gây độc (Ahmad Reza Jabbari và Majid Esmaelizadeh, 2005).
Năm 1996, Carol A. Lichtensteiger và cs ứng dụng PCR để khuếch đại gene

toxA 846 bp của vi khuẩn P. mutocida gây độc phân lập từ các mẫu lâm sàng biểu
hiện bệnh nhanh chóng và chính xác. Kết quả PCR hoàn toàn phù hợp với kết quả thử
nghiệm bằng ELISA và gây chết trên chuột thí nghiệm độc tố.
9


2.4. Vaccine phòng bệnh tụ huyết trùng gia cầm
Theo Nguyễn Mạnh Thắng (2001) giống vi khuẩn Pasteurella multocida chủng
Tg và V được phân lập tại Nam Bộ hiện đang được sử dụng để sản xuất vaccine tụ
huyết trùng vô hoạt phèn chua hoặc nhũ dầu. Giống vi khuẩn tụ huyết trùng gia cầm
chủng Pa1 và Pa2 có nguồn gốc từ Trung Quốc được dùng để kiểm tra hiệu lực
vaccine tụ huyết trùng gia cầm vô hoạt.

-

Hình 2.2 Vaccine tụ huyết trùng gia cầm
(www.navetco.com.vn).
Đặc tính: Là vaccine vô hoạt, chế từ vi khuẩn Pasteurella multocida thuộc

serotype A:1. Vaccine an toàn, tạo đáp ứng miễn dịch tốt.
-

Chỉ định: Dùng để tạo đáp ứng miễn dịch chủ động phòng bệnh tụ huyết trùng

cho gà, vịt, ngan và ngỗng khoẻ mạnh.
-

Thành phần:



Kháng nguyên: Mỗi 1ml vaccine chứa ít nhất 1010 tế bào vi khuẩn Pasteurella

multocida thuộc serotype A:1.


Chất bổ trợ: Dung dịch phèn chua hoặc keo phèn.

2.5. Tổng quan về kỹ thuật PCR và REP – PCR
2.5.1. Kỹ thuật PCR
PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân
tử nhằm nhân bản một đoạn DNA trong ống nghiệm mô phỏng bộ máy sinh tổng hợp

DNA của tế bào sống. Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu sinh
học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền,
nhận dạng vân tay DNA, chuẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác
định huyết thống.

10


 Thành phần phản ứng trong một eppendorf:
- Buffer: Hiệu suất, tính chính xác của enzyme DNA polymerase phụ thuộc nhiều vào
hệ buffer sử dụng. Thông thường nên sử dụng đúng loại buffer tương ứng với enzyme
do nhà sản xuất khuyến cáo.
- Enzyme DNA polymerase: Lượng enzyme cần thiết là phụ thuộc vào lượng DNA
template và kích thước phản ứng PCR.
- Nồng độ Mg2+: Việc tăng nồng độ ion Mg2+ có thể làm xuất hiện thêm các sản phẩm
không đặc hiệu. Tuy nhiên nếu thiếu ion Mg2+ thì dẫn đến lượng sản phẩm PCR thấp.
Nồng độ ion Mg2+ tối ưu phụ thuộc vào loại DNA polymerase, loại DNA template và
thành phần buffer.
- dNTPs là loại hóa chất kém bền cần lưu ý khi sử dụng và bảo quản. Nên chia nhỏ
lượng dNTPs để giảm số lần làm tan, sử dụng lại. Lượng dNTP tối ưu là 200 µM of
mỗi loại dNTP. Việc tăng dNTP không làm tăng đáng kể lượng sản phẩm PCR so với
việc hiệu chỉnh các yếu tố khác.
- DNA Template và primers.
- Chất khác: Đối với các DNA template lớn, giàu GC thì có thể sử dụng các chất biến
tính như DMSO, formamide, glycerol, hoặc betaine trong thành phần PCR. Tuy nhiên,
phải kiểm tra độ tương thích đối với enzyme DNA polymerase. Tăng lượng DMSO
trong PCR sẽ cần giảm nhiệt bắt mồi xuống. Một số buffer đã có chứa sẵn loading
buffer để có thể điện di ngay sau PCR. Tuy nhiên, độ nhạy của PCR với những buffer
này không cao. Đối với các máy luân nhiệt (thermocycler) không có gia nhiệt trên nắp
thì nên bổ xung mineral oil để tránh bay hơi mẫu.

 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:
-

Biến tính (denaturation)

Việc tăng nhiệt độ hoặc kéo dài thời gian biến tính có thể làm tăng tính đặc hiệu
của PCR nhưng làm giảm tuổi thọ của enzyme DNA polymerase. Đối với những
enzyme DNA polymerase bền nhiệt thường sử dụng nhiệt độ biến tính 94°C - 98°C.
Bao gồm bước biến tính dài lúc khởi đầu và một bước biến tính ngắn trước từng chu
kỳ nhiệt. Đối với các genome lớn như thực vật thường sử dụng bước biến tính dài đến
5 phút. Để làm giảm ảnh hướng đối với enzyme thì có thể bổ sung enzyme DNA
polymerase sau khi biến tính ban đầu. Khi đã tối ưu PCR thì cần giảm tối thiểu thời
11


gian biến tính mỗi chu kỳ để tăng lượng sản phẩm. Thông thường từ 10 giây đến 30
giây. Tốc độ gia nhiệt và chế độ điều khiển nhiệt độ ở mỗi hệ thống luân nhiệt (PCR
machine, thermocylcer) là khác nhau phụ thuộc hãng sản xuất. Một số hệ thống cho
phép thay đổi thông số này khi tối ưu PCR.
-

Bắt cặp (annealing)

Đối với primer dài hơn 22 bp, nhiệt độ bắt mồi thường hoạt động ở Tm thấp nhất +
3°C. Đối với primer nhỏ hơn 22 bp, nhiệt độ bắt mồi thường thấp hơn Tm thấp nhất,
có thể dùng grandient nhiệt độ (touchdown PCR) để tìm nhiệt độ bắt mồi tối ưu
(khoảng cách nhiệt ở mỗi chu kỳ thường là 0, 5°C).
-

Kéo dài (extension)

Nhiệt độ kéo dài thường tiến hành ở 72°C. Tuy nhiên, hoạt tính 5'-3' DNA
polymerase vẫn xảy ra ở nhiệt độ 68°C. Thời gian kéo dài phụ thuộc hoạt độ enzyme
DNA polymerase, chiều dài sản phẩm và loại template.

Hình 2.3 Quy trình phản ứng PCR
( />12


2.5.2. Kỹ thuật REP – PCR
Repetitive – element polymerase chain reaction (REP – PCR) là phương pháp
trực tiếp cho kết quả fingerprinting (PCR fingerprint), sử dụng các cặp primer đặc hiệu
tương ứng với những trình tự DNA lặp lại, có tính bảo thủ cao, phân bố phổ biến trong
hệ gene của vi khuẩn để tạo ra các hình ảnh phân bố DNA riêng cho mỗi loài vi khuẩn.
Những trình tự không mã hóa này ở nhiều copy hiện diện trong bộ gene của phần lớn
các vi khuẩn gram âm và vài vi khuẩn gram dương (Lupski và Weinstock, 1992).
o

Trình tự REP (repetitive extragenic palindromic) 35 – 40 bp, là các đơn vị

palindromic, chứa một loop biến đổi trong cấu trúc stem – loop (Stern và cs, 1984).
o

Trình tự ERIC (enterobacterial repetitive intergenic consensus) 124 – 127 bp,

được mô tả ở trung tâm, cấu trúc palindromic bảo thủ (Hulton và cs, 1991).
o

Trình tự BOX 154 bp: gồm có các tiểu phần subunit bảo thủ khác nhau, được

gọi là boxA, boxB, và boxC (Martin và cs, 1992). Chỉ có trình tự của subunit giống
boxA xuất hiện ở vùng bảo thủ cao trong sự đa dạng của vi khuẩn (Versalovic và cs,
1994). Thành phần BOX là trình tự lặp lại đầu tiên được xác đinh ở vi khuẩn Gram
dương (Martin và cs, 1992).
o

Trình tự Polytrinucleotide (GTG)5.
Những trình tự này xuất hiện tại các vị trí riêng biệt, các vị trí rải rác trên nhiễm

sắc thể, có thể hiện diện trong cả hai hướng trên nhiễm sắc thể, và các cặp primer PCR
đã được thiết kế để "read outward" từ các trình tự REP, ERIC, và từ các subunit boxA
của BOX (Versalovic và cs, 1994). Việc sử dụng các primer ở trên và phản ứng PCR
dẫn đến sự khuếch đại các vùng khác biệt trên genome nằm giữa các trình tự REP,
ERIC hoặc BOX. Các protocol tương ứng được gọi tắt là REP – PCR, ERIC – PCR và
BOX – PCR, được gọi chung là REP – PCR (Versalovic và cs, 1991). Các band
khuếch đại có kích thước phân đoạn trên gel matrix tạo ra các trường mẫu fingerprint
giống như “bar code” (Lupski, 1993), và chức năng giống như một tín hiệu đối với các
chủng vi khuẩn cụ thể. Các “bar code” được phân tích bằng chương trình trên máy tính
như GelCompar để phân biệt các chủng vi khuẩn có mối quan hệ gần, để thiết lập mối
quan hệ sinh dòng giữa các chủng và nghiên cứu sự đa dạng của chủng trong sự khác
nhau của các hệ sinh thái (F.J. de Bruijn, 1997).
13


Hình 2.4 Quy trình của REP – PCR genomic fingerprinting
( />
Hình 2.5 Phương pháp REP – PCR (Anne M. Ridley, 1998). Trong phản ứng PCR, các
primer rep1 và rep2 sẽ khuếch đại vùng bên trong ngay kề các thành phần lặp lại trong giới
hạn sự kéo dài của Taq polymerase. Sản phẩm PCR được điện di và cho các band kết quả
thực hiện fingerprint. Sự khác nhau về kích thước các band thể hiện sự đa dạng trong khoảng

cách giữa các thành phần lặp lại này.

14