Sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền của các dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria basiana

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***



TRẦN NHƢ NGỌC

SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA
DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium
anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ
SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI



LUẬN VĂN: KĨ SƢ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC






Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2006


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA
DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium
anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ
SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI


LUẬN VĂN: KĨ SƢ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
VÕ THỊ THU OANH TRẦN NHƢ NGỌC
KHÓA: 28



Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2006


MINISTRY OF EDUCATION AND TRAING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
FACULTY OF BIOTECHNOLOGY

***000***




RFLP ANALYSIS OF POLYMORPHISMS IN
Metarrhizium anisopliae AND Beauveria bassiana
ACCOSIATED WITH INSECT


GRADUATION THESIS
MAJOR: BIOTECHNOLOGY



PROFESSOR STUDEN
VÕ THỊ THU OANH TRẦN NHƢ NGỌC
TERM: 28





HCMC 9/2006

iii
LỜI CẢM TẠ

Xin chân thành gửi lời cảm tạ đến:
 Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.

 Ban chủ nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô
đã truyền đạt kiến thức cho chúng tôi.
 ThS. Võ Thị Thu Oanh đã hƣớng dẫn tận tình cho tôi trong suốt quá
trình thực tập và giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
 TS. Bùi Minh Trí –Trƣởng trung tâm phân tích Hóa – Sinh trƣờng Đại
Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
 Phòng thí nghiệm Hóa – Sinh thuộc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm
Trƣờng Đại Học Nông Lâm.
 Các anh chị làm việc tại Trung Tâm Phân Tích Hóa – Sinh, đặc biệt gửi
lời cảm ơn chân thành đến chị Hƣng đã hết lòng giúp đỡ, chia sẽ và
động viên tôi trong suốt thời gian làm khóa luận.
 Các bạn sinh viên thực tập tại phòng 105 – khu Phƣợng Vĩ Trƣờng Đại
Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi.
 Các bạn bè thân yêu của lớp Công Nghệ Sinh Học K28 đã chia sẻ cùng
tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ
tôi trong thời gian thực tập.













TĨM TẮT

Đề tài nghiên cứu:“ sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền của
hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana” ký sinh trên cơn trùng
gây hại ” đƣợc thực hiện từ ngày 20 tháng 2 năm 2005 đến ngày 15 tháng 8 năm 2005
tại trƣờng Đại Học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
Đề tài do Trần Nhƣ Ngọc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của ThS. Võ Thị Thu
Oanh
Đối tƣợng nghiên cứu là nấm Metarrhizium anisopliae và nấm Beauveria
bassiana ký sinh trên cơn trùng gây hại. Nấm này có tác dụng tiết ra độc tố làm ngừng
hoạt động của ruột, phá vở các hoạt động bình thƣờng của cơn trùng dẫn đến cơn trùng
bị chết khơ
Mục đích đề tài nhằm xác định đoạn gen gây độc Pr1 của những dòng nấm
Metarrhizium anisopliae và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 của nấm Beauveria bassiana
giúp chọn lọc đúng những dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana
có tính độc đảm bảo hoạt tính diệt cơn trùng lâu dài và hiệu quả nhằm phục vụ cho sản
xuất nơng nghiệp .
Các nội dung nghiên cứu bao gồm:
1. Phục hồi các chủng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassian
trên một số cơn trùng gây hại .
2. Dùng kỹ thuật PCR phát hiện gen protease (Pr1) và vùng ITS1 – 5.8S –
ITS2 liên quan đến tính độc của hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và
Beauveria bassiana..
3. Sau khi thực hiện phản ứng PCR ta sử dụng kỹ thuật RFLP thực hiện phản ứng
enzyme cắt giới hạn để phát hiện sự đa hình trong phạm vi vùng IST1-5.8S-IST2 của nấm
Beauveria bassiana và vùng Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae
4. Giải trình tự đoạn gen Pr1 và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 so sánh trình tự này
với các mẫu trên ngân hàng gen thế giới (genbank).
Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
1.Phục hồi các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria trên mơi PGA:

Sau quá trình phục hồi các nguồn nấm trên môi trƣờng PGA(Potato-Glucose-
Agar),kết quả chúng tôi đã thu đƣợc một số dòng nấm sau khoảng 7-10 ngày nuôi cấy :
RNBT1.7 ,DONG 3.1, BXĐTG6, RMTĐ3 ,PULQ2, NNPT7, SR, BRVT6 ,BHBD6
,SCLLLA1, BDTN4 ,BDQ96 .
2.Nhân sinh khối các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria trong môi trƣờng
lỏng Czapek – Dox trong khoảng thời gian từ 3-5 ngày , thu đƣợc sinh khối nấm ,rửa
lại với nƣớc cất rồi phơi khô , nghiền trong nitơ lỏng ,cuối cùng chúng tôi đƣợc nấm ở
dạng khô và chúng tôi bảo quản nấm -80
0
C cho đến khi sử dụng .
3.Tiến hành ly trích nấm đã bảo quản ở trên bằng dịch ly trích ,kết quả trích
đƣợc DNA của 12 dòng nấm Metarrhizium và Beauveria ,sau đó là tinh sạch DNA của
các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria nhằm tạo sản phẩm sạch ,ít tạp trong sản
phẩm PCR.Sau tinh sạch vẫn giữ đƣợc DNA của 12 mẫu nấm.
4.Thực hiện phản ứng PCR trên các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria , kết
quả thu đƣợc sản phẩm PCR của 6 dòng nấm Beauveria
5.Phân tích RFLP , thực hiện phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn trên 6
dòng nấm Beauveria ,enzyme cắt Alu I, Hae III trên các sản phẩm PCR .kếtquả chƣa
nhận thấy rõ sự đa dạng di truyền của các dòng nấm do mức độ tƣơng đồng giữa các
dòng nấm khá cao .Tuy nhiên thu đƣợc kích thƣớc các band trên gel so với Ladder là
hoàn toàn trùng khớp với kích thƣớc band DNA chuẩn của các dòng nấm Beauveria .

MỤC LỤC


CHƢƠNG
TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ ..................................................................................................................... iii
Tóm tắt ........................................................................................................................... iv
Mụclục ............................................................................................................................ vi
Danh sách chữ viết tắt .................................................................................................... ix
Danh sách các bảng ......................................................................................................... x
Danh sách các hình ........................................................................................................ xi

1. MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1
1.1.Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1
1.2.Mục đích và yêu cầu đề tài ................................................................................... 1
1.2.1.Mục đích ...................................................................................................... 1
1.2.2.Mục tiêu ...................................................................................................... 2
1.3.Yêu cầu nghiên cứu ............................................................................................... 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................................... 3
2.1.Vai trò của biện pháp phòng trừ sinh học.............................................................. 3
2.2.Giới thiệu về nấm ký sinh ...................................................................................... 4
2.2.1.Giới thiệu về nấm Metarrhizium anisopliae .............................................. 5
2.2.2.Giới thiệu về nấm Beauveria bassiana vuille............................................. 6
2.3.Hiệu quả phòng trừ bằng chế phẩm nấm ............................................................... 8
2.4.Sơ lƣợc về phƣơng thức xâm nhiễm ...................................................................... 9
2.5.Hoạt tính sinh học ................................................................................................ 11

2.6.Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc ............................................................. 11
2.6.1.Nghiên cứu trong nƣớc ............................................................................. 11
2.6.2.Nghiên cứu ngoài nƣớc ............................................................................ 12
2.7.Vai trò của protease Pr1 và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 ........................................ 14
2.8.Phản ứng PCR ..................................................................................................... 14
2.8.1.Giới thiệu chung về PCR .......................................................................... 14
2.8.2.Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả PCR ................................................... 15
2.8.3.Các ứng dụng của phƣơng pháp PCR ...................................................... 16
2.8.4. Những hạn chế của phƣơng pháp PCR ................................................... 16
2.9. Đọc trình tự bằng máy đọc tự động .................................................................. 17
2.10.Phân tích RFLP ................................................................................................. 17
3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................. 19
3.1.Thời gian và địa điểm ........................................................................................ 19
3.1.1.Thời gian .................................................................................................. 19
3.1.2.Địa điểm .................................................................................................. 19
3.2. Vật liệu và hóa chất .......................................................................................... 19
3.2.1.Vật liệu ..................................................................................................... 19
3.2.1.1.Mẫu thí nghiệm............................................................................. 19
3.2.1.2.Các Primer dùng trong thí nghịêm ............................................... 19
3.2.2.Hóa chất và môi trƣờng ........................................................................... 19


3.2.2.1.Các hóa chất dùng chiết tách DNA từ khối sợi nấm ................... 19
3.2.2.2. Các hóa chất dùng trong điện di .................................................. 20
3.2.2.3. Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR ..................................... 20
3.2.2.4.Môi trƣờng ................................................................................... 20
3.2.3.Các thiết bị chính ...................................................................................... 21
3.3.Nôi dung nghiên cứu ......................................................................................... 21
3.4.Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 21
3.4.1.Phục hồi các chủng nấm ........................................................................... 21

3.4.2.Chủân bị môi trƣờng lỏng ....................................................................... 22
3.4.3.Phƣơng pháp ly trích DNA ....................................................................... 22
3.4.4.Phƣơng pháp tinh sạch DNA .................................................................... 23
3.4.5.Thực hiên phản ứng PCR ......................................................................... 24
3.4.5.1.Nấm Metarrhizium anisopliae ..................................................... 24
3.4.5.2.Nấm Beauveria bassiana vuille ................................................... 25
3.4.6.Điện di và đọc kết quả ............................................................................. 26
3.4.6.1.Điện di trên gel agarose .............................................................. 26
3.4.6.2.Đọc kết quả điện di .................................................................... 26
3.4.7.Thành phần phản ứng đọc trình tự .......................................................... 27
3.4.7.1.Tinh sạch sản phẩm PCR ............................................................ 27
3.4.7.2.Thành phần phản ứng đọc trình tự ............................................ 27
3.4.8.Tinh sạch sản phẩm đọc trình tự .............................................................. 28
3.4.9.Điện di và ghi nhân kết quả ..................................................................... 29
3.4.10. Phân tích RFLP ..................................................................................... 29
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................................. 30
4.1. Kết quả phục hồi và nhân sinh khối nấm .......................................................... 30
4.2. Kết quả ly trích DNA ....................................................................................... 30
4.3. Kết quả tinh sạch DNA .................................................................................... 32
4.4. Kết quả PCR ..................................................................................................... 33
4.5. Kết quả phân tích RFLP ................................................................................... 34
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................. 36
5.1.Kết luận............................................................................................................... 36
5.2.Đề nghị .............................................................................................................. 36
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 37

DANH SÁCH CÁC HÌNH


HÌNH TRANG
Hình 2.1 Chế phẩm sinh học từ nấm Beauveria và Metarrhizium ...................... 9
Hình 2.2 Nấm Beauveria bassiana vuille ký sinh trên ong .......................... 13
Hình 4.1 Nấm Beauveria và Metarrhizium ...................................................... 30
Hình 4.2 Kết quả ly trích ................................................................................... 31
Hình 4.3 Kết quả tinh sạch ................................................................................ 32
Hình 4.4:Kết quả PCR ....................................................................................... 34
Hình 4.5:Kết quả phân tích RFLP ..................................................................... 35

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BDQ96 : Bọ dừa Quận 9 6
BDTN4 : Bọ dừa Tây Ninh 4
SCLLLA1 : Sâu cuốn lá lúa Long An 1
RNBT1.7 : Rầy nâu Bến Tre 1.7
DONG3.1 : Dòng 3.1
BXĐTG6 : Bọ xít đen Tiền Giang 6
RMTĐ3 : Rầy mềm Thủ Đức 3
PULQ2 : Rệp vải mềm nâu tím Quận 2
SR : Sâu róm
BRVT6 : Bọ rầy Vũng Tàu 6
BHBD6 : Bọ hà Bình Dƣơng 6
PM : pico mol
Ng : nano gram
nm : nano mol
g : micro gram
m : micro mol
M : micro mol/lít
l : micro lít
TE : tris EDTA
dNTP : deoxyribonucleotide – 5 – trphosphate
TAE : tris acetic EDTA
UI : unit international
bp : base pair
Kb : kilo base
CZA : Czapek – Dox
SDS : Sodium dodecyl sulphate
PGA : Potato glucose agar
SDA : Soduim dedocyl sulphate

RFLP : Restriction Fragment Lengh Polymorphism
RAPD : Random Amlification of Polymorphic DNA
Tm : melting temperature
PCR : Polymerase Chains Reaction
RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism
EDTA : Ethylene Diamine Tetracetic Acid
ITS : Intenal Transcribed Spacer
Taq : Thermus aquaticus
TAE : Tricacetic ethylene diamine tetra acetat
TE : Tris ethylene diamine tetra acetate





ix



DANH SÁCH CÁC BẢNG


BẢNG TRANG
Bảng 3.1:Thành phần phản ứng PCR ở nấm Metarrhizium ................................ 24
Bảng 3.2:Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR ở nấm Metarrhizium .............................. 25
Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR ở nấm Beauveria .................................... 25
Bảng 3.4:Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR ở nấm Beauveria .................................... 26
Bảng 3.5:Thành phần phản ứng đọc trình tự ....................................................... 28
Bảng 3.6:Quy trình chung phản ứng cắt .............................................................. 29

1

Phần 1. MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay với tốc độ phát triển nhƣ vũ bão của khoa học và công nghệ đã kéo
theo hàng loạt những thay đổi trong đời sống xã hội của con ngƣời: kinh tế, chính trị,
xã hội,… rồi đến đời sống vật chất, tinh thần,… Thông qua đó đặt ra một vấn đề hết
sức cấp thiết làm sao giải quyết tốt vấn đề lƣơng thực thực phẩm cho con ngƣời. Thực
tế cho thấy việc áp dụng thành công trong khoa học – công nghệ vào sản xuất nông
nghịêp nhằm nâng cao năng xuất cây trồng đã đƣợc ứng dụng từ nhiều năm nay và đã
đem lại nhiều kết quả đáng kể nhƣ: tạo giống bƣởi không hạt, bƣởi da xanh có chất
lƣợng tốt, mùi vị ngon, ngọt và không xử lý hóa chất (Viện Cây Ăn Quả Miền Nam);
hay tạo giống lúa ngắn ngày có khả năng chống chịu tốt, hạt gạo mềm, dẻo, thơm, đặc
biệt là năng suất tăng so với nhiều giống trƣớc đó bằng việc xử lý yếu tố di truyền
trong gen (Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long )….Đây chính là những thành tựu
trong lĩnh vực Bảo Vệ Thực Vật nói chung và của Công nghệ Sinh học nói riêng .
Chính vì tính chất quan trọng của ngành Bảo Vệ Thực Vật (cũng nhƣ Công
Nghệ Sinh Hoc) trong Nông Nghiệp và đời sống, nên chúng tôi đã thực hiện đề tài
“Sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền của các dòng nấm
Metarrhizium anisopliae và Beauveria basiana ký sinh trên côn trùng gây hại”. Từ
việc xác định chính xác trình tự của nucleotide trên gen phát sinh độc tố của nấm ký
sinh trên côn trùng gây hại cho hoa màu, ta có thể chủ động hơn trong quá trình tác
động lên gen gây độc, nhằm diệt nấm đạt hiệu quả cao nhất, giảm thiệt hại do côn
trùng phá hoại, nâng cao năng suất cây trồng, tạo sản phẩm sạch, an toàn và thân
thiện với môi trƣờng.
1.2. Mục đích và yêu cầu đề tài
1.2.1. Mục đích

Làm cơ sở khoa học cho việc xác định đa dạng di truyền và xác định gen gây
độc nhằm tạo ra đƣợc thuốc trừ sâu sinh học có hoạt tính ổn định và hiệu quả đối với
từng loại cây trồng, đáp ứng nhu cầu trong công tác bảo vệ thực vật hiện nay.


2

1.2.2. Mục tiêu
Bằng kỹ thuật RFLP và đọc trình tự cho phép xác định gen Pr1 và vùng gen
ITS1 - 5.8S - ITS2 sau đó tìm sự khác biệt trong trình tự nucleotide của đoạn gen Pr1
giữa các dòng nấm Metarrhizium anisopliae, và trình tự nucleotide của vùng gen
ITS1- 5.8S -ITS2 giữa các dòng nấm Beauveria bassiana.
1.2.3. Yêu cầu nghiên cứu
Phục hồi các dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana từ
nhiều cây trồng khác nhau.
Phát hiện gen gây độc Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae và vùng ITS1 –
5.8S – ITS2 của nấm Beauveria bassiana bằng phƣơng pháp PCR.
Sử dụng kỹ thuật RFLP thực hiện phản ứng enzyme cắt giới hạn để phát hiện
sự đa hình trong phạm vi vùng gen độc Pr1 của các dòng nấm Metarrhizium
anisopliae và ITS1 – 5.8S – ITS2 của các dòng nấm Beauveria bassiana.
Xác định trình tự nucleotide của vùng gen gây độc Pr1 và ITS1 – 5.8S – ITS2
trên hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria basisiana.
1.3. Đối tƣợng nghiên cứu
Một số loài thuộc hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana
vuille thu thập ở các tỉnh thành khác nhau nhƣ: Long An, Trà Vinh, Tây Ninh, Tiền
Giang, Bến Tre, Quận 2 thành phố Hồ Chí Minh, Quận 9 thành phố Hồ Chí Minh gây
hại cho côn trùng trên các đối tƣợng cây trồng khác nhau.

3

Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Vai trò của biện pháp phòng trừ sinh học trong bảo vệ thực vật hiện nay
Dƣới áp lực tạo ra nguồn sản phẩm nông nghiệp với sản lƣợng cao, chất lƣợng
tốt, giảm giá thành và giảm ảnh hƣởng đến môi trƣờng, chúng ta phải tăng cƣờng sử
dụng biện pháp sinh học một cách có hệ thống.
Quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) trên cây trồng nông lâm nghiệp theo định
hƣớng tăng cƣờng sử dụng các tác nhân sinh học và chế phẩm có nguồn gốc thảo mộc
là một hƣớng nghiên cứu ứng dụng mới mang lại hiệu quả kinh tế cao, góp phần xây
dựng một nền nông nghiệp bền vững, bảo vệ môi trƣờng và cân bằng sinh thái.
Có nhiều cách để sử dụng biện pháp sinh học, bao gồm:
Sử dụng ký sinh thiên địch chuyên tính, thƣờng là ký sinh.
Sử dụng ký sinh thiên địch không chuyên tính, thƣờng là các loài ăn thịt sâu
hại.
Biện pháp dòng hoá đực làm cho sâu hại không thể sinh sản đƣợc.
Sử dụng vi sinh vật có ích.
Biện pháp dẫn dụ giới tính để phòng trừ sâu hại.
Biện pháp sinh học trong IPM giúp cho việc loại bỏ một số nhƣợc điểm của các
biện pháp hoá học thƣờng dùng trƣớc đây.
Ƣu điểm của biện pháp vi sinh vật gồm:
Ngăn chặn sự phát triển tính kháng trong quần thể sâu bệnh và cỏ dại. Giảm bớt
hoặc giảm hoàn toàn sử dụng thuốc hoá học, giữ đƣợc quần thể sâu hại phát
triển ở mức thấp nhất, tránh bộc phát thành dịch.

Bảo vệ đƣợc côn trùng có ích và các vi sinh vật có ích khác, hạn chế sâu bệnh
thứ cấp trở thành sâu bệnh chính.
Bảo vệ đƣợc sức khỏe con ngƣời và tránh ô nhiễm môi trƣờng. (Trần Văn Mão,
2004).
2.2. Giới thiệu về nấm ký sinh trên côn trùng
Cũng nhƣ vi khuẩn, nhiều nấm liên quan với côn trùng nhƣ sinh vật cộng sinh
hoặc hoại sinh, nhƣng có nhiều loài nấm thực sự là ký sinh, gây hiện tƣợng bệnh lý và
dẫn đến sự chết của côn trùng. Theo Steinhaus (1949) (trích dẫn Nguyễn Lân Dũng,
4

1981) nấm ký sinh côn trùng trong tự nhiên có thể gây chết thƣờng xuyên với tỷ lệ cao
cho nhiều loài côn trùng gây hại và là những tác nhân điều hoà quần thể vi sinh vật
trong tự nhiên rất hiệu quả. Côn trùng chết do nấm rất dễ nhận biết bằng mắt thƣờng,
vì các sợi nấm mọc qua vỏ cơ thể và bao phủ toàn bộ bề mặt ngoài của cơ thể côn
trùng. Cơ thể côn trùng chết do nấm không bị tan rã, mà thƣờng giữ nguyên hình dạng
ban đầu, toàn bộ bên trong cơ thể chứa đầy sợi nấm (Nguyễn Lân Dũng, 1981).Nấm
gây bệnh cho côn trùng thuộc nhiều nhóm nấm khác nhau: từ nhóm nấm nguyên thủy
sống dƣới nƣớc đến nhóm nấm bậc cao sống trên cạn. Nấm gây bệnh cho côn trùng có
mặt ở trong cả 4 lớp nấm: nấm bậc thấp Phycomycetes, nấm túi Ascomycetes, nấm
đảm Basidiomycetes và nấm bất toàn Deurteromycetes.
- Lớp nấm bậc thấp Phycomycetes: trong lớp nấm này, các loài ký sinh trên côn
trùng tập trung ở ba bộ: Chytridiales, Blastocladiales và Entomophthorales. Đặc biệt
có những họ nấm gồm tất cả các loài đều là ký sinh trên côn trùng nhƣ
Entomophthoraceae và Coelomomycetaceae.
- Lớp nấm túi Ascomycetes: trong lớp nấm túi có bộ Laboubiniades là những
nấm ngoại ký sinh côn trùng có chuyên tính cao, còn các loài nấm túi khác đều là nội
ký sinh của côn trùng. Những giống nấm quan trọng gây bệnh cho côn trùng là:
Cordyceps, Aschersonia (bộ Hypocreales).
- Lớp nấm đảm Basidiomycetes: trong lớp nấm đảm chỉ ở hai giống có các loài
gây bệnh trên côn trùng, đó là giống Septobasidium và Uredinella.

- Lớp côn trùng đều thuộc bộ Moniliades. Những giống Beauveria, Spicana,
Metarrhizium, Cephalosporium và Sorosporella chứa các loài nấm khi xâm nhiễm vào côn
trùng đã tạo thành độc tố và gây chết vật chủ trong khoảng thời gian nhất định.
2.2.1. Giới thiệu về nấm Metarrhizium anisopliae.
Metschinikov đã phát hiện nấm này đầu tiên vào năm 1878 trên bọ hung
hại lúa mì,Chúng gây bệnh cho côn trùng sống trong đất. Bào tử của nấm sau 24 giờ
tiếp xúc với bề mặt cơ thể côn trùng thì bắt đầu mọc mầm và xâm nhập vào bên trong
các bộ phận nội quan. Sau khi vật chủ chết, sợi nấm mọc ra ngoài cơ thể côn trùng tạo
thành lớp nấm màu trắng hơi hồng nhạt. Trên đó tạo thành các khuẩn lạc màu xanh
xám. Quá trình phát triển của bệnh trong cơ thể côn trùng là 4 – 6 ngày tùy thuộc vào
loài và tuổi vật chủ cũng nhƣ nguồn bệnh ban đầu. Vào giai đoạn cuối cùng của quá
trình phát triển bệnh lý thì côn trùng chết
5

- Nấm Metarrhizium anisopliae có 2 dạng: M. anisopliae var. major có bào tử
dài với kích thƣớc bào tử túi 10,0 – 14,0 (18,0) m và M. anisopliae var. anisopliae
có bào tử ngắn với kích thƣớc bào tử túi là 3,5 – 9.0(thƣờng 5,0 – 8,0) m. Nấm xanh
(nấm Metarrhizium anisopliae) sinh ra các độc tố destruxin A và B (Bùi Xuân Đồng,
Nguyễn Huy Văn, 2000).
- Nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên 200 loài côn trùng thuộc các bộ:
Orthoptera (11 loài), Dermaptera (1 loài), Hemiptera (21 loài), Lepidoptera (27 loài),
Diptera (4 loài), Hymenoptera (6 loài) và Coloptera (134 loài). Nấm xanh có thể nuôi
cấy trên môi trƣờng thức ăn nhân tạo.
- Metarrhizium anisopliae là chủng gây bệnh mạnh nhất cho côn trùng thuộc bộ
Coleoptera. Hơn 204 loài côn trùng thuộc họ Elaleridae và Curculionidae bị nhiễm
bệnh bởi Metarrhizium anisopliae (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng
Giang, 1997). Ngoài ra Metarrhizium anisopliae còn gây bệnh trên ấu trùng muỗi
Aedes aegypti, Anopheles stephensi và Clex pipiens thuộc Diptera, côn trùng hại lúa
Scotinophara coarctata thuộc họ Heminoptera, châu chấu Schistocera gragaria thuộc
họ Testigolidae, loài mối Nasutitermes exitiosus thuộc họ Termitidae. Nấm này phân

bố rộng trong tự nhiên.
- M. anisopliae với bào tử dạng trụ và khuẩn lạc xanh đen hoặc đôi khi màu
tối hoặc hồng vỏ quế. Khuẩn lạc mọc chậm, trên môi trƣờng PGA sau 10 ngày
nuôi cấy ở 20
o
C có đƣờng kính 2 cm.
Đã có nhiều nghiên cứu về sự phân bố của chúng: Nepal, New Zealand, New
Caledonia, Bahamas, Mỹ, Canada, Bắc Ireland, Italia, Turkey, Liên Xô (cũ). Ở những
nơi không có côn trùng cũng phân lập đƣợc Metarrhizium anisopliae: nang của
Nematod (Heterodenas chachatii và Globodera rostochensis), các hạt ngoài đồng và
trong đất trồng ở Canada, đất trồng chuối ở Honduras, đất trồng dâu ở Braril, đất trồng
cỏ ở New Zealand. Ngay ở những nơi có thời tiết khắc nghiệt của nƣớc Đức, ở đất
rừng sau khi đốt cháy, trong chất thải hữu cơ (chuẩn bị ô nhiễm), trầm tích cửa sông,
đất đầm lầy trồng cây đƣớc, tổ của một số loài chim và rễ của dâu tây cũng đều phân
lập đƣợc Metarrhizium anisopliae.
* Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm Metarrhizium anisopliae:
Không thể sinh trƣởng tốt trên nền cơ chất không có chitin.
6

Sống đƣợc ở nhiệt độ thấp (8
o
C), biên độ của độ ẩm rộng, ở nơi tích lũy nhiều
CO
2
và O
2
chúng có thể sống sót tới 445 ngày. Khi hoại sinh trong đất, bào tử
dính bị ức chế nảy mầm bởi khu hệ nấm đất, trong đó có chủng Aeromonas (thí
nghiệm in vitro).
Ở dƣới 10

o
C và trên 35
o
C thì sự hình thành bào tử không thể xảy ra.
Nhiệt độ tốt nhất cho sự nảy mầm bào tử là 25 – 30
o
C và chết ở 49
o
C trong 10
phút.
Nhiệt độ tốt nhất cho sự sinh trƣởng là 25
o
C và pH 3,3 – 8,5.
Metarrhizium anisopliae có khả năng phân giải tinh bột, cellulose và kitin
(lông và da côn trùng). (Trần Văn Mão, 2004).
2.2.2 Giới thiệu về nấm Beauveria bassiana vuille
- Nấm Beauveria bassiana cũng nhƣ Metarrhizium anisopliae là nấm thiên
địch ký sinh trên côn trùng gây hại, bào tử nấm thƣờng có kích thƣớc thƣờng dài hơn
3µmdạng bào tử túi.Nấm Beauveria bassiana thuộc lớp: Deuteromycetes, họ
Moniliacea, bộ Moniliales, Giống: Beauveria. Giống Beauveria thƣờng đƣợc chia
thành 3 loài: Beauveria bassiana, Beauveria brongniarti, Beauveria alba, trong đó 2
loài đầu là tác nhân gây bệnh côn trùng (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng
Giang, 1997)là nấm trắng thƣờng gây bệnh cho:rầy nâu, sâu cuốn lá, sâu dục thân,bọ
xích hại lúa, bọ xích đen,….Nó hủy hoại các mô mềm và dịch cơ thể ký chủ, chúng
phát triển bên ngoài rồi mọc đầy trên cơ thể ký chủ, hút hết dƣỡng chất cho đến khi
ký chủ chết, khi ký chủ chết nó hình thành bào tử và phát tán bào tử trong không khí
nhờ nƣớc và gió.Tuy nhiên để phát tán nó đòi hỏi cần phải có ẩm độ kéo dài để bào tử
có thể lan đi nhờ gió và nƣớc.
- Bào tử trần hình cầu (đƣờng kính 1 - 4 m) đến hình trứng (1,5-5,5 x 1,3 m).
Sợi nấm có chiều ngang khoảng 3 - 5 m phát triển dày đặt trên môi trƣờng, mang

nhiều cuống sinh bào tử và bào tử. Mặt khuẩn lạc nấm dạng phấn trắng, Nấm khi mọc
trên côn trùng thƣờng có màu trắng hoặc vàng nhạt, đôi khi hơi sẫm, bề mặt trơn và có
nhiều bột, hiếm khi tập hợp thành bó sợi( Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị
Hƣơng Giang, 1997).
Nhiệt độ tối ƣu cho nấm phát triển là khỏang trên dƣới 25
0
C tốt nhất từ 25
0
C-
30
0
C trong trƣờng PDA (Potato-Dextrose-Agar), trong khỏang 3-6 ngày nuôi cấy
7

nấm phát trịển mạnh lúc này nấm có màu vàng nhạt hoặc màu trắng, đƣờng viền đôi
khi có màu kem hoặc hơi đỏ. Bào tử thƣờng có hình cầu, hình trứng, có khi chiều dài
lên tới 20 m với 1 m chiều rộng. Có khỏang 9 lòai Beauveria bassiana đƣợc phân
lập, sử dụng trong nghiên cứu trong kỹ thuật rRNA Sequencing.
Theo Veliska (1967), giá trị pH môi trƣờng từ 3 - 9 không ảnh hƣởng tới sự
phát triển tạo sinh khối của nấm Beauveria bassiana và theo Goral(1970) nấm
Beauveria bassiana thuộc vi sinh vật có khả năng điều chỉnh pH môi trƣờng, pH
thuận lợi cho sự phát triển là 5,7 - 6,0. Ngoài ra, có nhiều nghiên cứu cho rằng khả
năng phát triển tốt nhất của nấm Beauveria bassiana là 6,2 - 6,4 (trích dẫn bởi
Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997).
Nấm Beauveria bassiana phân bố rộng khắp. Giống nhƣ hầu hết các loại nấm
diệt sâu khác, khi rơi vào một nơi nào đó, chúng đều có khả năng trở thành
thành viên trong sinh quần nơi đó và tự sinh sôi nảy nở tăng lên. Vì là vật ký sinh
chuyên hóa rộng nên nấm này có khả năng tồn tại khi thiếu vật chủ chính. Khả năng
nhiễm thành công của nấm với côn trùng là khá lớn vì chúng có nhiều cách xâm nhiễm
khác nhau: qua lớp cutin, qua đƣờng tiêu hóa, qua đƣờng hô hấp và

qua lỗ của thân. Ngoài ra, nấm Beauveria bassiana còn có khả năng tồn tại trong
điều kiện môi trƣờng không thuận lợi dƣới dạng giả hạch nấm (các sợi nấm dinh
dƣỡng kết lại thành một thể rắn chắc).Có thể sử dụng rộng rãi nấm Beauveria
bassiana trong thực tiễn nông nghiệp vì: chúng có thể phát triển trên môi trƣờng dinh
dƣỡng, có thể đƣợc chế tạo ở dạng chế phẩm sinh học, và tiêu diệt một lƣợng không
nhiều các côn trùng có ích (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang,
1997).
Chất diệt côn trùng của nấm Beauveria bassiana là chất chúng tiết ra khi bào
tử nảy mầm. Tên thông thƣờng của độc tố là beauverixin, công thức hóa học
C
45
H
57
O
9
N
3
- ciclo (N - metyl - L - phenylalanin - D - - hydroxyizovalery)
3
. Đó là
một loại depxipeptit vòng có điểm sôi 93 - 94
o
C (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu
Thị Hƣơng Giang, 1997).
Vì tính chất quan trọng của nấm trong vai trò điều khiển cân bằng sinh học
trong tự nhiên nói chung và trong bảo vệ thực vật nói riêng nên hiện nay nhiều
nghiên cứu trên thế giới về nấm đƣợc áp dụng, một số kỹ thụât đƣợc áp dụng trong
8

nhận diện nấm Beauveria bassiana vuille những nghiên cứu gần đây là :sử dụng

Isozymes (St Legent et al ., 1992;Poprawski et al .,1998), rRNA Sequences
(Rakotonirainy et al .,1991), phân tích RFLP (Kosir,Macpherson và
Khatchatourians.,1991 ; Maurer et al .,1997). Trong đó vịêc áp dụng kỹ thuật RFLP
kết hợp với PCR cho kết quả khả quan hơn cả .
2.3. Hiệu quả phòng trừ sâu hại bằng chế phẩm nấm
Nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana đƣợc nghiên cứu sản xuất để
trừ một số sâu hại quan trọng trong nông nghiệp. Hiệu quả của chế phẩm đã thử đối
với rầy nâu, sâu đo đay, châu chấu xanh, châu chấu ở điều kiện trong phòng thí
nghịêm và ở nhà lƣới. Chế phẩm có tác dụng giảm tỷ lệ rầy nâu 55,2 – 58,8%, rầy
lƣng trắng 64 – 92%, rầy xanh 75 – 96% và sâu đo xanh hại đay 43,9 – 64,2%. Hiệu
lực diệt các loài rầy hại lúa trên đồng ruộng của nấm Beauveria bassiana biến động
từ 33 – 75% tùy theo vụ và năm khác nhau. Hiệu lực của nấm kéo dài 3- 4 tuần sau
khi phun nấm, vì vậy chỉ cần phun nấm một lần trong một vụ là đủ để quản lý các loài
rầy hại lúa trong vụ.
Dùng nấm B. bassiana vuille để quản lý các loài rầy hại lúa đã làm tăng năng
suất từ đối chứng (tùy theo từng vụ và từng năm). Nấm B. bassiana không gây ảnh
hƣởng gì cho lúa và cũng không gây hại đối với các thiên địch sâu, gầy hại lúa (Trần
Văn Mão, 2004).
Nấm M. anisopliae có khả năng gây bệnh làm chết 84,6% châu chấu
Nomadacris succincta sau 10 ngày xử lý và nấm M. flavoviride gây chết 100% châu
chấu thí nghiệm sau 7 ngày. Chế phẩm nấm diệt châu chấu đƣợc tiến hành ở Bà Rịa –
Vũng Tàu, Đồng Nai cho kết quả tƣơng đối tốt nhƣng không đều (Trần Văn Mão,
2004). Nghiên cứu gần đây của Hệ Thống Nghiên Cứu Nông Nghiệp Hội Đồng Khoa
Học Công nghệ Việt Nam cho kết quả nhƣ sau:nấm Beauveria bassiana ký sinh trên
sâu róm hại thông có khả năng trừ sâu là đến 93.6%. Còn tác dụng khi sử dụng kết
hợp hai lọai nấm Beauveria bassiana và Metarrhizium anisopliae trong vịêc trừ hại
cho bọ dừa đạt hiệu quả từ 56%-97% (www.vnast .gov.vn/index .asp……)
Ở Bolivia, các nhà nghiên cứu thuộc công ty PROBIOMA đã sản xuất thành
công nhiều chế phẩm sinh học từ nhiều loài nấm thiên dịch khác, trong đó có hai loài
nấm phổ biến là Beauveria bassiana và Metarrhizium anisopliae và chế phẩm trên

thị trƣờng là: ProbioBass, ProbioMet
9


iPROBIOMET
CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ NẤM METARRHIZIUM
ANISOPLIAE DIỆT CÔN TRÙNG GÂY HẠI

PROBIOBASS
CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ NẤM BEAUVERIA
BASSIANA VUILLE DIỆT CÔN TRÙNG GÂY HẠI


Hình 2.1 Chế phẩm sinh học từ nấm Beauveria và Metarrhizium
(Nguồn : www.probioma.org.bo)
2.4. Sơ lƣợc về phƣơng thức xâm nhiễm của nấm ký sinh trên côn trùng
- Hầu hết những loài nấm gây bệnh cho côn trùng đều xâm nhập vào cơ thể vật
chủ qua lớp vỏ cơ thể. Bào tử nấm bám vào bề mặt cơ thể vật chủ, trong điều kiện đủ
độ ẩm bào tử mọc mầm và xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp vỏ
chitin nhờ áp lực cơ giới hoặc hoạt động men của nấm. Nấm tiết ra loại men làm mềm
lớp vỏ chiti mầm, qua lỗ thủng dó bào tử xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng và
tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử mọc. Do khả năng xâm nhập vào bên trong cơ
thể côn trùng qua lớp vỏ cơ thể nên nấm có thể ký sinh đƣợc côn trùng chích hút và cả
những pha phát triểncủa côn trùng nhƣ trứng, nhộng mà các vi sinh vật khác không ký
sinh đƣợc.
- Nấm cũng có thể xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng qua đƣờng miệng.Từ
miệng, bào tử đi tới ruột và qua thành ruột xâm nhiễm vào các bào nội quan để gây
bệnh. Xâm nhiễm kiểu này chủ yếu là bào tử của các loài nấm sống ở nƣớc. Dƣới tác
động của độc tố do bào tử nấm tiết ra có thể dẫn tới hiện tƣợng ngừng nhu động ruột
của vật chủ. Bào tử nấm còn có thể xâm nhập qua lỗ thở hoặc cơ quan sinh dục để vào

bên trong cơ thể côn trùng nhƣng rất ít.
Sự phát triển của nấm tới khi côn trùng chết
Sau khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng thì chúng bắt đầu sinh sôi nảy nở bên
10

trong cơ thể côn trùng và côn trùng chết trong khoảng 3 tuần.
Sự sinh trƣởng và phát triển của nấm sau khi côn trùng vật chủ chết
- Sau khi côn trùng chết, nấm tiếp tục phát triển hình thành lớp bào tử bao phủ
toàn bộ bề mặt ngoài của vật chủ. Lớp bào tử này ban đầu có màu trắng sau chuyển
qua màu xanh lục.
- Các nấm gây bệnh cho côn trùng chỉ sinh trƣởng phát triển để hoàn thành một
chu kỳ sống của chúng: từ mọc mầm bào tử đến hình thành bào tử mới. Nấmgây bệnh
côn trùng có tính chuyên tính hẹp, chỉ ký sinh một vật chủ hoặc một giai đoạn nhất
định của vật chủ. Nhiều trƣờng hợp chúng là ký sinh có tính chuyên hóa thức ăn rộng,
có thể ký sinh nhiều loài côn trùng thuộc các giống, họ, bộ khác nhau.
- Để có thể gây đƣợc những dịch bệnh nấm lớn cho sâu hại, các đặc điểm của
nấm đóng một vai trò quan trọng là: độc tính của nấm, khả năng di chuyển bào tử
trong những điều kiện không thuận lợi và khả năng phát tán trong thiên nhiên. Đặc
điểm đặc biệt đối với các nấm họ Entomophthoraceae đó là hoạt động bắn bào tử xa
một khoảng cách gấp hàng nghìn lần kích thƣớc của nó. Điều đó tạo khả năng phát tán
rộng lớn hơn trong quần thể côn trùng. Sự phát tán có hiệu quả cao hay không ở mức
độ nhất định cũng phụ thuộc vào độ nhất định cũng phụ thuộc vào.
2.5. Hoạt tính sinh học
- Các nấm diệt sâu cũng đƣợc chú ý nhiều nhƣ một sinh vật sản sinh các enzyme,
toxin và các chất hoạt tính sinh học khác. Theo nhiều tài liệu của nhiều tác giả cho biết
các nấm Muscardine(ví dụ: nấm Muscardine trắng: Beauveria bassiana ,nấm
Muscardine xanh: Metarrhizium anosopliae )có khả năng tổng hợp một lƣợng lớn
enzyme, trong đó có ý nghĩa lớn nhất có khả năng gây bệnh cho côn trùng có chứa.
chitinase,Proteinase,lipase và amylase.
2.6. Một số nghiên cứu trong nƣớc và ngoài nƣớc về nấm Metarrhizium anisopliae

và nấm Beauveria bassiana vuille cũng nhƣ một số nấm ký sinh côn trùng
khác trong ứng dụng để phòng trừ sâu hại
2.6.1. Nghiên cứu trong nƣớc
- Lần đầu tiên tại Bến Tre, Phạm Thị Thuỳ (2000) đã sử dụng nấm Metarrhizium
để trừ bọ dừa, kết quả ban đầu cho thấy nấm Metarrhizium sau khi đã thử nghiệm
trong phòng, trong nhà lƣới và ngoài đồng có hiệu quả đối với bọ dừa ở Bến Tre. Hiện
tại ở Việt Nam đã thu thập và lƣu giữ một số chủng nấm Beauveria và Metarrhizium,
11

gồm 18 nguồn Beauveria và 10 nguồn Metarrhizium. Chúng đƣợc phân lập từ các
loại côn trùng khác nhau, gồm sâu đo xanh, châu chấu hại cam, sâu khoang hại lạc,
rầy nâu hại lúa, sâu đục thân ngô, sâu xanh hại bông, sâu cắn gié, bọ xít đen, bọ xít
dài (Nguyễn Văn Tuất, 2000).
- Theo Tạ Kim Chỉnh và ctv (2001), đã chọn đƣợc môi trƣờng nhân giống cho
các chủng Metarrhizium anisopliae là môi trƣờng Saubouraund có bổ sung vỏ trấu.Bùi
Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn (2000) đã thử nghiệm chế phẩm B.75 từ Beauveria
bassiana dạng bột để phòng trừ sâu róm hại cây thông và cho biết sâu chết 80% sau
một năm xử lý.
- Nguyễn Thị Lộc và ctv (2004) đã thử nghiệm, sản xuất và ứng dụng chế
phẩm nấm ký sinh để phòng trừ sâu hại lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Ngoài ra, ở
nƣớc ta cũng tiến hành nghiên cứu nấm gây bệnh trên các loài sâu hại đậu nành. Theo
Tống Kim Thuần, Vũ Quang Côn (2001), các vi nấm có khả năng gây bệnh sâu hại
trên đậu tƣơng chủ yếu là các loài sau: Beauveria bassiana, Metarrhizium anisopliae
và Normurea rileyi. Chúng gây bệnh hầu hết các loài sâu hại thuộc bộ cánh vảy –
Lepidoptera, Entomophthora sp gặp ở bộ cánh nửa cứng - Hemiptera
- Theo Phạm Thị Thùy và cộng sự (1991 - 1995), nguồn nấm Beauveria ở nƣớc
ta khá phong phú. Chế phẩm nấm Beauveria bassiana đƣợc sản xuất bằng phƣơng
pháp lên men xốp, sinh khối nấm đạt 5 x 10
8
bào tử/gam, thời gian thu hoạch nấm tốt

nhất theo phƣơng pháp này là 10 ngày, chế phẩm đƣợc làm khô ở nhiệt độ 45
o
C trong
8 giờ và có thể đƣợc bảo quản trong thời gian 6 tháng. Khi thử nghiệm phƣơng pháp
lên men chìm có sục khí trong nồi lên men 5 lít chứa môi trƣờng có pepton, cao nấm
men và muối khoáng thì sau 48 giờ ở 30 phút bào tử nấm Beauveria đạt 8,5 x 10
9
bào
tử/gam. Hiệu quả sử dụng tốt nhất của chế phẩm nấm là trên rầy nâu hại lúa, sâu đo
xanh hại đậu, châu chấu sống lƣng vàng với nồng độ sử dụng là 5 - 6 x 10
8
bào tử/ml.
Hiệu lực của thuốc nấm phụ thuộc chủ yếu vào nhiệt độ và độ ẩm.
- Theo Viện sinh học nhiệt đới, Thành phố Hồ Chí Minh, các nòi nấm có hiệu lực
diệt sâu cao có thể mất dần tính độc trong quá trình nuôi cấy. Sử dụng phƣơng pháp
tách tế bào đơn từ sâu nhiễm đã chọn đƣợc các chủng nấm diệt sâu có độc tính cao. Từ
các mẫu sâu chết ngoài đồng ruộng đã phân lập đƣợc 9 chủng nấm Beauveria bassiana
từ sâu xanh da láng, châu chấu và bọ hà khoai lang Đà Lạt, Hóc Môn và Indonesia.
Thử nghiệm trong phòng thí nghiệm cho thấy 9 chủng đều có hiệu lực diệt trùng ấu
12

trùng tằm, ấu trùng bọ hà, bọ hà trƣởng thành và sâu xanh da láng nhƣng ở các mức độ
khác nhau. Thử nghiệm kết hợp nấm Beauveria bassiana với pheromon trên ruộng
khoai lang ở Thủ Đức Thị Hƣơng Giang, 1997).
- Nguyễn Xuân Niệm (2003) khi nghiên cứu hiệu lực trừ sâu hại của chế
bassiana và Entomopthorales) của Công ty Hợp danh Sinh Thành trong phòng trừ bọ
cánh cứng hại dừa tại Kiên Giang đã kết luận rằng Bemetent có hiệu lực phòng trừ
cả thành trùng và ấu trùng của bọ cánh cứng hại dừa.
2.6.2. Nghiên cứu ngoài nƣớc
- Trên thế giới, việc sử dụng nấm trong đấu tranh chống sâu hại có lịch sử khá

lâu đời, Meschnikoff (1884) là ngƣời đầu tiên trình bày vấn đề sử dụng nấm trong đấu
tranh sinh học với sâu hại (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang,
1997).
Theo Juntin L.Hatting, Richard A. Humber, Tadeusz J. Poprawski và Ray M.
Miller (1999), các nghiên cứu về nấm gây bệnh rầy mềm ở Nam Phi đƣợc định hƣớng
từ năm1995-1998, và cho biết trong 8 lòai nấm đƣợc tìm thấy đều lan truyền và giết
chết rầy mềm, gồm có 6 lòai thuộc Entomophthorale Pandora neoaphidis,
Connidiobolus thromdoides, C.corcnatus, Entomophthora planhoniana và Neozygites
fresenii) và hai lòai thuộc Hyphomycetes (Beauveria bassiana, verticillium lecanii) .
Theo A.M. Kammp và M. J. Bidochka (1994), tiến hành đánh giá sự sản xuất
bào tử của 3 loại nấm gây bệnh côn trùng Metarrhizium anisopliae, Beauveria
bassiana và Verticillium lecanii đƣợc đánh giá ở các độ sâu khác nhau (2mm , 3mm,
4mm tƣơng ứng với 10ml, 15ml, 20ml) và các loại môi trƣờng khác nhau (SDA,
MEA, NA, CMA, YPDA, PDA) và cho biết sự sản xuất bào tử sau 14 ngày của nấm
Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana tốt nhất trong môi trƣờng PDA ở độ
sâu 2mm, trong khi Verticillium lecanii sản xuất bào tử tốt nhất trên môi trƣờng
YPDA và độ sâu của môi trƣờng thì không đáng kể. Theo Nguyễn Ngọc Tú và
Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang (1997), thì Codaira Y. (1961) đã tách đƣợc hai độc tố
ở nấm Metarrhizium anisopliae là destruxin A, liều gây chết với tầm là 0,28kg/g trọng
lƣợng cơ thể và destruxin B, liều gây chết là 0,34kg/g trọng lƣợng cơ thể
13

.
Hình 2.2 Nấm Beauveria bassiana
ký sinh trên ong
(nguồn: wescaco.ars.usda.gov)
Glare và Inwood (1998) đã so sánh di truyền các giống Beauveria phân lập
từ New Zealand bằng hai phƣơng pháp RAPD và RFLP. Kết quả phân tích RAPD sử
dụng 10 primer khác nhau đã chia các giống phân lập đƣợc thành 4 nhóm có kiểu di
truyền khác nhau: nhóm nhân không đồng nhất B. bassiana/B. brongniartii, nhóm B.

bassiana, nhóm B. brongniartii và một nhóm gồm các giống Beauveria khác. Sử dụng
enzyme cắt giới hạn vùng ITS của rDNA nhân cho thấy có sự khác biệt về di truyền
giữa giống B. bassiana và nhóm nhân không đồng nhất B. bassiana/B. brongniartii.
2.7. Phƣơng pháp phát hiện gen Pr1 và vùng ITS1 -5.8S – ITS2:
Có nhiều phƣơng pháp khác nhau (nhƣ ELISA, allozyme electrophoresis hoặc
RFLPs) có những ƣu và khuyết điểm khác nhau, chỉ phân biệt giữa mỗi loài hoặc đòi
hỏi số lƣợng lớn của DNA tinh khiết (Hegedus và ctv, 1993). Sự phân lập DNA thì tốn
nhiều thời gian và giới hạn số lƣợng mẫu có thể phân tích đƣợc trong thời gian thích
hợp. RAPD – PCR thì cũng đƣợc sử dụng để mô tả đặc điểm những giống
Metarrhizium anisopliae. Tuy nhiên, RAPD – PCR rất dễ bị nhiễm tạp và thƣờng
không ổn định, chỉ có thể thực hiện một cách chắc chắn trên DNA từ nuôi cấy ở ký
chủ.
Sử dụng phƣơng pháp mà cho phép sự khám phá về những đặc điểm của
những giống Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana lây nhiễm trên côn
trùng. Đó là phƣơng pháp kết hợp kỹ thuật PCR và phân tích RFLP (RFLP – PCR),
dựa trên sự khuếch đại của phần gen mã hóa chủ yếu là protease subtilisin Pr1 (St
Leger và ctv, 1992) đƣợc tiết ra bởi nấm Metarrhizium anisopliae và vùng ITS1- 5.8S
– ITS2 đƣợc tiết ra bởi nấm Beauveria bassiana và men cắt giới hạn các sản phẩm
PCR hai vùng này