THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT PHÔI HEO IN VITRO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT PHÔI HEO IN VITRO

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: TRƯƠNG SỬ NGỌC HẰNG

Niên khóa

: 2005 – 2009

Tháng 8/ 2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
  

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT PHÔI HEO IN VITRO

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. CHUNG ANH DŨNG

TRƯƠNG SỬ NGỌC HẰNG

ThS. LÊ CÔNG THIỆN

Tháng 8/ 2009


LỜI CẢM ƠN
Thế là bốn năm đại học sắp qua đi.Những buổi thức suốt đêm thực hiện khóa luận
tuy có vất vả và gặp không ít khó khăn nhưng cũng đã để lại những kỉ niệm khó quên.
Khóa luận tốt nghiệp của tôi sẽ khó có thể hoàn thành nếu như không nhận được sự giúp
đỡ, động viên từ nhiều phía. Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc, tôi xin gởi lời cảm
ơn đến:
Tiến sĩ Chung Anh Dũng (Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam),
người luôn miệt mài vì khoa học, đã cung cấp những kiến thức quý báu cũng như đã tận
tình chỉ bảo, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa luận.
Thạc sĩ Lê Công Thiện (Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam) người
đã luôn theo sát chỉ dạy và tận tình giải đáp những thắc mắc của tôi trong suốt quá trình
thực hiện khóa luận.
Chị Phạm Quỳnh Lan, chị Hoàng Ngọc Minh người đã hướng dẫn, giúp đỡ và
động viên tôi rất nhiều ngay từ những ngày đầu cho đến khi hoàn thành khóa luận.
Toàn thể thầy cô thuộc bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tận tình chỉ dạy và truyền
đạt tri thức khoa học trong suốt bốn năm tôi học ở trường.
Tập thể các bạn lớp DH05SH, đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt bốn năm
học.Và trên hết là lòng biết ơn sâu sắc đến Ông Bà, Cô Chú và Cha Mẹ, những người đã

sinh thành, nuôi dạy và luôn dành cho con những gì tốt đẹp nhất.
Sự yêu thương và chăm sóc của mọi người đã và đang là động lực, là chỗ dựa vững chắc
cho con trong suốt cuộc đời này.
TP.Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 07 năm 2009
Trương Sử Ngọc Hằng

iii


TÓM TẮT
Trong bài báo cáo này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm để
sản xuất tạo ra phôi heo. Kỹ thuật này trải qua 3 giai đoạn: giai đoạn nuôi trứng trưởng
thành, giai đoạn thụ tinh và giai đoạn nuôi phôi.
Buồng trứng được thu từ lò mổ và được bảo quản trong nước muối 0,9% Nacl , và
mang về phòng thí nghiệm trong vòng 30 phút trong điều kiện được giữ ấm. Tại phòng thí
nghiệm, các nang trứng có kích thước từ 3 - 5 mm được chọc hút bằng bơm tiêm 5 ml có
gắn đầu 18G và các trứng có tế bào cumulus bao quanh thì được thu nhận.Các tế bào
trứng thì được đem nuôi trưởng thành trong 36 giờ. Môi trường nuôi trứng trưởng thành
mà chúng tôi sử dụng ở đây là môi trường TCM-199. Tỷ lệ trứng chín trung bình đạt
74,04%. Bằng phương pháp swim-up, trứng sau khi trưởng thành được chuyển vào giọt
môi trường thụ tinh có phủ dầu khoàng và ủ với nồng độ tinh trùng là 2 – 3 x106 tế
bào/ml. Sau 6 giờ thụ tinh, trứng sẽ được rửa trong môi trường nuôi phôi và 20 - 30 trứng
được chuyển vào giọt môi trường nuôi phôi có thể tích là 100 µl có phủ dầu khoáng
(trong điều kiện 38,50C và 5% CO2). Chúng tôi sử dụng môi trường Cr1aa + 5% FBS để
nuôi phôi. Tỷ lệ thụ tinh trung bình đạt 33,24%.
Sau 48 giờ làm IVF, tỷ lệ trung bình phôi 2 tế bào (25,34%), phôi 4 tế bào (31,37
%), 8 tế bào (25,8%), hớn 8 tế bào (17,49). Sau 6 ngày làm IVF, tỷ lệ trung bình phôi hơn
8 tế bào (8,62%), phôi dâu (10,46%), phôi nang sớm (0,92%).
Từ những kết quả trên cho thấy, hệ thống IVF của chúng tôi đã tiến hành là khá tốt. Bước
đầu thành công khi tạo được phôi heo đến giai đoạn phôi nang.

iv


SUMMARY
In this report, we used in vitro fertilization technique to create porcine embryo.
This technique has three periods: IVM (in vitro maturation), IVF (in vitro fertilization),
IVC (in vitro culture).
Ovaries of porcine were collected at a slaughterhouse, kept in 0,9 % NaCl solution
and transferred to the laboratory within 30 minutes under a warm condition. In the lab,
follicles within 3 - 5 mm in diameter were aspirated by a 5 ml syringe with an 18 - gauge
needle and the oocytes-cumulus complexes were collected. It were grown up within 36
hours. We used TCM-199 medium for growing up the oocytes. The maturation rate of
averange was 74,04 %.
With swim-up method, after culture for maturation,the oocytes were transferred to drop of
the fertilization medium covered with mineral oil and incubated sperm at concentration of
2 – 3 x 106 cells/ml.
Six hours after fertilization, the oocytes were washed with embryo culture and
then each of 20 - 30 oocytes were transferred to 100µl droplet of the culture medium
under the oil (in condition 38,50C and 5%CO2).We used Cr1aa medium supplemented
with 5% FBS for embryo culture. The fertilization rate of averange was 33,24%.
48 hours after IVF, the average rate of two-cell embryos (25,34%), four-cell embryos
(31,37%), eight – cell embryos (25,8%), more than eight - cell embryos (17,49%). Six
days after IVF, the average rate of eight - cell more than embryos (8,62%), morula
(10,46%), earlyblastocyst (0,92%).
These result above show that our IVF system are carried out well Which is the first
succesful period when making embryo porcine to earlyblastocyst.

v

MỤC LỤC

Lời cảm ơn ................................................................................................... iii
Tóm tắt ......................................................................................................... iv
Summary ...................................................................................................... v
Mục lục ........................................................................................................ vi
Danh sách từ viết tắt ..................................................................................... xi
Danh sách các bảng ...................................................................................... xii
Danh sách các hình ....................................................................................... xiii
Chương 1 Mở Đầu ........................................................................................1
1.1.Đặt vấn đề............................................................................................... 1
1.2. Yêu cầu của đề tài.................................................................................. 2
1.3.Nội dung thực hiện.................................................................................. 2
Chương 2 Tổng Quan Tài Liệu .....................................................................3
2.1. Giới thiệu chung .................................................................................... 3
2.1.1. Khái niệm ........................................................................................... 3
2.1.2. Lịch sử tạo phôi heo in vitro................................................................ 3
2.1.3. Các nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài ............................................ 4
2.1.3.1. Trên thế giới..................................................................................... 4
2.1.3.2. Tại Việt Nam ................................................................................... 4
2.2. Cơ sở khoa học của kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm ......................... 5
2.2.1.Hệ sinh dục động vật hữu nhũ .............................................................. 5
2.2.1.1. Hệ sinh dục cái................................................................................. 5
2.2.1.2. Hệ sinh dục đực ............................................................................... 6
2.3.Qúa trình sinh giao tử.............................................................................. 7
2.3.1.Qúa trình sinh noãn.............................................................................. 7

vi

2.3.1.1. Sự hình thành và phát triển của nang noãn ....................................... 8
2.3.1.2. Nội tiết của nang tăng trưởng ........................................................... 8
2.3.1.3. Sự hình thành và phát triển của noãn................................................ 9
2.3.1.4. Sự trưởng thành của noãn................................................................. 9
2.3.1.5. Sự phóng noãn ................................................................................. 10
2.3.1.6. Đặc điểm của giao tử cái- trứng........................................................ 11
2.3.2. Qúa trình sinh tinh .............................................................................. 11
2.3.2.1. Các giai đoạn của quá trình sinh tinh................................................ 11
2.3.2.2. Sự trưởng thành của tinh trùng trước thụ tinh ................................... 12
2.3.2.3. Đặc điểm của giao tử đực-tinh trùng ................................................ 12
2.4. Sự thụ tinh và phát triển của phôi........................................................... 13
2.4.1. Sự thụ tinh .......................................................................................... 13
2.4.2. Tinh trùng gắn vào lớp màng trong suốt của trứng .............................. 14
2.4.2.1. Tinh trùng xuyên qua lớp cumulus ................................................... 14
2.4.2.2. Tinh trùng gắn vào lớp màng trong suốt của trứng ........................... 14
2.4.2.3. Tinh trùng thực hiện phản ứng cực đầu ............................................ 15
2.4.2.4. Tinh trùng xâm nhập vào màng trong suốt của trứng........................ 15
2.4.2.5. Tinh trùng tiếp xúc với màng bào tương........................................... 16
2.4.2.6. Sự hình thành tiền nhân.................................................................... 16
2.4.3. Sự phát triển của phôi ......................................................................... 17
2.4.3.1. Sự phân chia tế bào .......................................................................... 17
2.4.3.2. Sự biểu hiện gene và tổng hợp protein ở phôi................................... 18
2.5. Kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm trên heo .......................................... 19
2.5.1. Thu nhận giao tử cái............................................................................ 19
2.5.2. Thu nhận trứng từ buồng trứng ........................................................... 19
2.5.3. Phương pháp lựa chọn tế bào trứng cho IVM ...................................... 20
2.6. Các thành phần môi trường nuôi chín trứng in vitro ............................... 21
2.6.1. Thành phần chín.................................................................................. 21
2.6.1.1. Nước................................................................................................ 21

vii


2.6.1.2. Nguồn năng lượng............................................................................ 21
2.6.1.3. Nguồn protein .................................................................................. 21
2.6.1.4. Muối ................................................................................................ 21
2.6.1.5. Hệ đệm............................................................................................. 22
2.6.1.6. Kháng sinh ....................................................................................... 22
2.6.1.7. Dầu khoáng...................................................................................... 22
2.6.2. Các thành phần bổ sung ...................................................................... 22
2.6.2.1. Hormone .......................................................................................... 22
2.6.2.2. Dịch nang trứng ............................................................................... 23
2.7. Thu nhận giao tử đực ............................................................................. 23
2.7.1. Cơ sở của quá trình thu nhận tinh trùng............................................... 23
2.7.2. Mục đích của quá trình thu nhận tinh trùng ......................................... 24
2.7.3. Các phương pháp thu nhận tinh trùng.................................................. 24
2.7.3.1. Phương pháp swim-up...................................................................... 24
2.7.3.2. Phương pháp Gradient percoll.......................................................... 25
2.8. Hệ thống nuôi phôi in vitro .................................................................... 26
2.8.1. Điều kiện ............................................................................................ 26
2.8.1.1. Nhiệt độ ........................................................................................... 26
2.8.1.2. Độ pH .............................................................................................. 26
2.8.1.3. Hệ đệm............................................................................................. 26
2.8.1.4. Thời gian thụ tinh............................................................................. 26
2.8.1.5. Khả năng duy trì sự thụ tinh của tinh trùng....................................... 27
2.8.1.6. Mật độ tinh trùng ............................................................................. 27
2.8.1.7. Loại tinh trùng ra khỏi môi trường thụ tinh ...................................... 27
2.8.1.8. Hiện tượng đa tinh trùng .................................................................. 27
2.8.1.9. Đánh giá sự thụ tinh ......................................................................... 27

2.8.2. Hệ thống nuôi phôi.............................................................................. 28
2.9. Ứng dụng thực tiễn ................................................................................ 28
2.9.1. Ở động vật .......................................................................................... 28

viii


2.9.1.1. Nhân giống vật nuôi ......................................................................... 28
2.9.1.2. Nguồn nguyên liệu cơ bản cho y học................................................ 29
2.9.2. Nông nghiệp ....................................................................................... 29
2.9.3. Khai thác tế bào gốc............................................................................ 29
Chương 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................ 30
3.1. Vật liệu .................................................................................................. 30
3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ....................................................... 30
3.1.2. Nguồn mẫu ......................................................................................... 30
3.2. Thiết bị, hóa chất và dụng cụ ................................................................. 30
3.2.1. Dụng cụ thí nghiệm............................................................................. 30
3.2.2. Thiết bị thí nghiệm.............................................................................. 31
3.2.3. Hóa chất sử dụng thí nghiệm............................................................... 32
3.3. Phương pháp nghiên cứu........................................................................ 32
3.3.1. Thu buồng trứng heo tại lò mổ ............................................................ 32
3.3.2. Chọc hút buồng trứng tại phòng thí nghiệm ........................................ 33
3.3.3. Giai đoạn nuôi trứng trưởng thành ...................................................... 33
3.3.4. Thụ tinh trong vi giọt .......................................................................... 34
3.3.4.1. Chuẩn bị tinh trùng .......................................................................... 34
3.3.4.2. Phương pháp xác định tế bào nang noãn đạt giai đoạn MII............... 35
3.3.4.3.Thu nhận trứng sau khi nuôi.............................................................. 35
3.3.4.4. Thụ tinh ........................................................................................... 36
3.3.4.5. Kiểm tra sự thụ tinh sau 6 giờ........................................................... 36
3.3.4.6. Đánh giá kết quả thụ tinh sau 48 giờ ................................................ 36

3..3.5.Phương pháp thu dịch nang trứng........................................................ 37
3.3.6. Phương pháp xử lí số liệu.................................................................... 37
Chương 4 Kết quả và thảo luận ..................................................................... 38
4.1. Tỷ lệ IVM.............................................................................................. 38
4.2. Tỷ lệ IVF ............................................................................................... 40
4.3. Tỷ lệ phôi sau 2 ngày ............................................................................ 41

ix


4.4. Tỷ lệ phôi sau 6 ngày ............................................................................ 43
4.5. Nhận xét chung về kết quả đạt được....................................................... 44
Chương 5 Kết luận và đề nghị....................................................................... 45
5.1. Kết luận ................................................................................................. 45
5.2. Đề nghị .................................................................................................. 45
Tài liệu tham khảo ........................................................................................ 47
Phụ lục

x


DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT
BAS - Bovine Adult Serum: huyết thanh bò trưởng thành.
BSA - Bovine Serum Albumin: Albumin huyết thanh bò.
DPBS - Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline: môi trường thu trứng.
FBS - Fetal Bovine Serum: huyết thanh thai bò.
CS - Calf Serum: huyết thanh bê.
FSH - Follicle Stimulating Hormone: hormone kích thích nang trứng.
GV - Germinal Vesicle: noãn ở giai đoạn túi mầm.
GVBD - Germinal Vesicle Break Down: noãn ở giai đoạn tan biến túi mầm.

HAS - Human Serum Albumin: Albumin huyết thanh người.
IVC - InVitro Culture: quá trình nuôi phôi.
IVF - InVitro Fertilization: thụ tinh trong ống nghiệm.
IVM - InVitro Maturation: quá trình nuôi chín trứng.
LH - Luteinizing Hormone: hormone gây rụng trứng.
MZT - Material to Zygote Transition: sự chuyển tiếp thông tin từ mẹ sang hợp tử.
TCM - Tissuse culture medium: môi trường nuôi cấy tế bào.
ZP - Zona Pellucida: màng bao quanh tế bào trứng.

xi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 IVF lần đầu tiên trên các đối tượng khác nhau............................... 4
Bảng 3.1 Dụng cụ thí nghiệm ....................................................................... 31
Bảng 3.2 Thiết bị thí nghiệm ........................................................................ 31
Bảng 3.3 Tên và nguồn gốc của hóa chất...................................................... 32
Bảng.4.1 Tỷ lệ IVM ..................................................................................... 39
Bảng 4.2 Tỷ lệ IVF....................................................................................... 40
Bảng 4.3 Kết quả thu nhận phôi sau 2 ngày IVF........................................... 41
Bảng 4.4 Kết quả thu nhận phôi sau 6 ngày IVF........................................... 43

xii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Quy trình cơ bản của thụ tinh trong ống nghiệm ............................ 3
Hình 2.2 Cấu tạo hệ sinh dục cái .................................................................. 6
Hinh 2.3 Cấu tạo bộ máy sinh dục đực của heo ............................................ 7
Hình 2.4 Buồng trứng cắt dọc ...................................................................... 7

Hình 2.5 Sự phát triển của nang noãn........................................................... 8
Hình 2.6 Nang noãn trưởng thành ................................................................ 10
Hình 2.7 Cấu tạo của tinh trùng.................................................................... 13
Hình 2.8 Sự thụ tinh ..................................................................................... 14
Hình 2.9 Phản ứng acrosome........................................................................ 15
Hình 2.10 Các giai đoạn của quá trình thụ tinh............................................. 17
Hình 2.11 Sự phân chia phôi ........................................................................ 17
Hình 2.12 Tế bào trứng loại A...................................................................... 20
Hình 2.13 Phương pháp Swim-up ................................................................ 25
Hình 3.1 Mẫu tinh trùng............................................................................... 30
Hình 3.2 Tinh trùng...................................................................................... 30
Hình 3.3 Tế bào trứng heo trước khi trưởng thành........................................ 34
Hình 3.4 Tế bào trứng heo sau 36 giờ........................................................... 36
Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ trứng chín trong từng lô thí nghiệm .................................. 38
Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ thụ tinh trong từng lô thí nghiệm ...................................... 40
Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ số phôi các loại tạo thành ở ngày thứ 2 ............................. 42
Biểu đồ 4.4 Tỷ lệ số phôi các loại tạo thành ở ngày thứ 6 ............................. 43

xiii


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nước ta xuất phát điểm là một nước nông nghiệp, do đó chăn nuôi sẽ chiếm một vị
trí khá quan trọng trong nền kinh tế nước nhà. Nhưng nếu như chăn nuôi theo các phương
pháp truyền thống thì hiệu quả kinh tế sẽ không cao, hao phí thời gian, của cải...
Công nghệ sinh học ra đời là chìa khóa mới ứng dụng vào trong chăn nuôi, nhằm
tăng hiệu quả sinh sản và cải thiện di truyền ở các giống vật nuôi. Và việc tạo ra nguồn
phôi dồi dào từ các tế bào sinh dục động vật hữu nhũ (trứng và tinh trùng) cũng là một

nhu cầu thực tế nhằm phục vụ cho chăn nuôi và các nghiên cứu thuộc lĩnh vực sinh học
phát triển.
Thành tựu của kỹ thuật IVF là tạo được phôi bên ngoài cơ thể mẹ thông qua sự kết
hợp giữa tinh trùng và trứng trong điều kiện in vitro hay còn gọi là kỹ thuật thụ tinh trong
ống nghiệm. Hiện nay, kỹ thuật này đã được ứng dụng rộng rãi khắp thế giới và đã đạt
được một số thành công trên nhiều đối tượng như chuột, khỉ, cừu, bò ... và ngay cả trên
người.
Với kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm người ta có thể tạo ra được nguồn phôi dồi
dào nhằm gia tăng nhanh số lượng cá thể, tạo động vật chuyển gene, khai thác nguồn tế
bào mầm... Các khả năng này giúp cho công tác chọn giống mới nhanh và hiệu quả hơn.
Hiện nay, ở Việt Nam lĩnh vực này vẫn còn nhiều mới mẻ, điều kiện tiếp cận và khả năng
đầu tư cho các nghiên cứu vẫn còn nhiều hạn chế.
Đối tượng nghiên cứu là heo được giết thịt tại lò mổ. Mục đích của đề tài là ứng
dụng kỹ thuật IVF để sản xuất ra phôi heo.Vấn đề nghiên cứu sản xuất ra phôi heo tuy
không mang ý nghĩa về mặt kinh tế nhưng một khi đã thành công thì sẽ được ứng dụng
nhiều trên các động vật khác đồng thời mong muốn từ thí nghiệm này là khả năng ứng
dụng các quy trình thao tác, kỹ thuật nuôi cấy trong điều kiện in vitro.

1


1.2. Yêu cầu của đề tài
Tạo phôi heo bằng tế bào trứng được thu từ buồng trứng tại lò mổ VISSAN và tế
bào tinh tươi thu nhận từ trung tâm huấn luyện chăn nuôi Bình Thắng.
1.3. Nội dung của đề tài
Thử nghiệm sản xuất phôi heo tại phòng thí nghiệm mô – phôi động vật thuộc
Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam.

2

Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.Giới thiệu chung
2.1.1. Khái niệm
Thụ tinh là quá trình kết hợp tế bào tinh trùng với tế bào trứng để tạo ra một tế bào
mới gọi là " hợp tử ", hợp tử sẽ phát triển thành cơ thể mới. Quá trình kết hợp này thường
xảy ra trong cơ thể mẹ và tại 1/3 phía trên của ống dẫn trứng.
Thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro Fertilization - IVF) là quá trình kết hợp giữa
tinh trùng với trứng để tạo ra hợp tử, được thực hiện bên ngoài cơ thể mẹ, tại phòng thí
nghiệm (trong hộp lồng, hộp petri). Tuy xảy ra ngoài cơ thể, nhưng các điều kiện cho quá
trình IVF như môi trường, nhiệt độ, độ ẩm, độ nhớt .v.v... cùng các chỉ tiêu sinh học khác
phải giống như trong cơ thể mẹ.

Hình 2.1 Quy trình cơ bản của thụ tinh trong ống nghiệm ().
2.1.2. Lịch sử tạo phôi heo in vitro
Heo là động vật được quan tâm đặc biệt vì trong buồng trứng của chúng có chứa số
lượng lớn (hơn 200.000) các nang trứng sơ cấp (primordial follicles).

3


Trong những năm đầu thập kỷ 1980, người ta đã thu được các phôi in vivo từ các con heo
ở “động vật cho” và các phôi trên có thể phát triển từ giai đoạn 4 tế bào đến giai đoạn
phôi nang (blastocyst).
Sau đó, những hiểu biết về đặc điểm phát triển của trứng heo đã giúp hình thành
các loại môi trường nuôi trứng chín trong điều kiện in vitro.
Năm 1986, Chan và cộng sự đã thành công trong việc tạo phôi heo in vitro. Sau đó,
phôi được nuôi từ giai đoạn 2 tế bào đến giai đoạn blastocyst đạt được thành công.
2.1.3. Các nghiên cứu trong và ngoài nước thuộc lĩnh vực của đề tài

2.1.3.1. Trên thế giới
IVF được tiến hành lần đầu tiên trên thỏ bởi Dauzier và cộng sự năm 1954.
Đến ngày 25 tháng 7 năm 1978, Louise Brown - em bé thụ tinh trong ống nghiệm đầu tiên
ra đời. Kỹ thuật này cũng được Brackett ứng dụng và phát triển vào chăn nuôi bò sữa từ
năm 1981. Từ đó, IVF được nghiên cứu và áp dụng rộng rãi ở các nước chăn nuôi phát
triển (Mỹ, Pháp, Anh, Nhật, Đức...) tới nay con số đã lên tới hơn 40 loài.
Bảng 2.1 Các đối tượng đầu tiên được nghiên cứu thành công IVF
Tên tác giả nghiên cứu

Đối tượng được nghiên cứu

Chang (1959)

Thỏ

Whittingham (1968)

Chuột

Toyoda và Chang (1974)

Chuột rattus

Steptoe và Edwards (1978)

Người

Bracket và cộng sự (1982)

Bò cái

Hannada (1985)

Dê, cừu

Chan và cộng sự (1986)

Heo

2.1.3.2. Tại Việt Nam
Năm 1978, tại Trung Tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia đã có một
bộ phận bắt đầu ngiên cứu về phôi thỏ. Năm 1980, cũng bộ phận này nghiên cứ trên bò.
Tháng 9/1989, tại viện chăn nuôi quốc gia, Bộ Môn Cấy Truyền Phôi được thành lập,
gồm những nghiên cứu viên được đào tạo và thực tập tại nước ngoài. Năm 1986, con bê

4


đầu tiên ở nước ta cũng được ra đời từ công nghệ này. Năm 1994, bò sinh đôi, trong đó
một bê do trứng rụng tự nhiên trong chu kỳ động dục và một bê do cấy truyền phôi. Đây
là trường hợp bê sinh ra đầu tiên ở nước ta do cán bộ viện chăn nuôi quốc gia thực hiện
cấy truyền phôi.
Ngày 3/3/2002, cặp bê cái sinh đôi (cắt thành hai phôi) đã ra đời. Đây là thành
công đầu tiên ở Việt Nam và là kết quả của công nghệ cloning đơn giản.
Cùng năm 2002, thành công trong việc tạo phôi lợn bằng kỹ thuật thụ tinh trong
ống nghiệm tại trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM. Những kết quả này đã tạo
cơ sở khoa học cho sự phát triển ứng dụng công nghệ phôi sau này.
2.2. Cơ sở khoa học của kĩ thuật thụ tinh trong ống nghiệm
2.2.1. Hệ sinh dục động vật hữu nhũ
2.2.1.1. Hệ sinh dục cái

Hệ sinh dục cái của một số động vật tuy có khác nhau ở một số chi tiết nhưng chủ
yếu gồm các cấu trúc cơ bản sau:
Buồng trứng: có dạng cặp hình oval nằm hai bên tử cung, dự trữ các nang trứng,
gồm hai phần: phần vỏ chứa các tế bào trứng đã phát triển và phần tủy có nhiều mạch
máu và bạch huyết, một số tế bào phụ trợ.
Vòi tử cung (hay ống dẫn trứng): nơi dẫn trứng và diễn ra sự thụ tinh.
Tử cung: cơ quan để hợp tử làm tổ và phát triển.
Âm đạo: cơ quan giao hợp.
Âm hộ: cơ quan sinh dục nằm ngoài cơ thể nối liền với âm đạo.
Và một số cơ quan phụ (thứ cấp) khác.
Buồng trứng động vật hữu nhũ là cơ quan dự trữ các tế bào mầm sinh dục và noãn
bào được hình thành trong giai đoạn phôi thai. Chức năng đặc biệt của buồng trứng là sử
dụng lần lượt các nang trứng dự trữ này đến khi cạn kiệt và điều tiết hormone. Buồng
trứng đảm bảo cho các noãn lớn lên đều đặn rồi rụng trứng, đồng thời nó chuẩn bị cho tử
cung tiếp nhận những trứng đã được thụ tinh.
Số lượng nang trứng dự trữ trong buồng trứng ở các loài có sự khác nhau và thoái
triển dần trong quá trình lớn lên của cá thể, càng lớn tuổi thì số nang trứng có hiệu quả

5


càng ít. Ở bò, có hơn 100.000 nang trứng lúc mới sinh, sau 9 năm giảm còn 2.500 nang
trứng. Ở heo, có hơn 200.000 nang trứng sơ cấp ở buồng trứng. Ở người, khi sơ sinh có
khoảng 30.000 – 300.000 nang trứng nguyên thủy, khi trưởng thành còn 400 - 500 nang.

Hình 2.2 Hệ sinh dục cái ().
2.2.1.2. Hệ sinh dục đực
Gồm các cấu trúc cơ bản sau:
Tinh hoàn: có cấu trúc dạng cặp được bọc trong một túi (bìu). Bên trong tinh hoàn
có nhiều ngăn, trong mỗi ngăn đều là tổ chức mô biệt hóa và sản sinh tinh trùng.

Mào tinh: nối với tinh hoàn, đây là các đường dẫn của tinh trùng.
Ống dẫn tinh: nối với mào tinh.
Túi tinh: nơi chứa tinh trùng và tiết dịch trộn với tinh trùng tạo tinh dịch.
Tuyến tiền liệt: sản xuất dịch, được tiết vào túi tinh.
Niệu đạo : nằm trong dương vật, tinh trùng phóng ra ngoài qua niệu đạo.
Dương vật: xuất tinh và bài xuất nước nước tiểu.
Ngay trước thời điểm phóng tinh, tinh trùng di chuyển từ mào tinh và ống dẫn tinh,
ống phóng tinh và niệu đạo để ra ngoài. Trên đường đi, tinh trùng được hòa với dịch tiết
từ các tuyến phụ để tạo thành tinh dịch.

6


Hình 2.3 Hệ sinh dục đực (www.octc.kctcs.edu).
2.3. Quá trình sinh giao tử
2.3.1. Qúa trình sinh noãn
Một noãn bào trưởng thành và sẵn sàng cho sự thụ tinh khi nó được phóng thích từ
một nang noãn trưởng thành của buồng trứng. Sự trưởng thành của noãn có liên hệ mật
thiết với sự trưởng thành của các nang noãn.

Hình 2.4 Buồng trứng được cắt dọc ().
2.3.1.1. Sự hình thành và phát triển nang noãn
Hình thành nang trứng là quá trình diễn biến nối tiếp các giai đoạn phát triển khác
nhau của nang trứng từ khi ra khỏi nơi dự trữ, phát triển thành tế bào trứng. Qúa trình

7


diễn ra như sau: từ những nang trứng nguyên thủy (primordial follicle) trở thành nang quá
độ là giai đoạn chuyển tiếp cho sự hình thành nang trứng sơ cấp (preantral follicle) đến

nang thứ cấp (antral follicle).
Sự tăng trưởng và thành thục của nang trứng trong buồng trứng thể hiện hàng loạt
sự biến đổi ở mức phân tử các thành phần khác nhau của nang như noãn bào, lớp tế bào
hạt và lớp tế bào vỏ. Các hiện tượng này được chi phối bởi những nhân tố khác nhau bên
trong buồng trứng, bên trong nang và những tính hiệu hormone.

Hình 2.5 Sự phát triển của nang noãn ().
2.3.1.2. Nội tiết của nang tăng trưởng
Sự tăng trưởng, thành thục, rụng trứng và hoàng thể hóa của nang trưởng thành
phụ thuộc vào các yếu tố: sự điều tiết thích hợp, hàm lượng đủ và tỉ lệ phù hợp của
Follicle Stimulating Hormone (FSH) và Luteinizing Hormone (LH) trong huyết thanh.
Trong đó FSH giữ vai trò chủ đạo cho việc khởi đầu sự hình thành xoang nang, kích thích
quá trình phân bào nguyên nhiễm các tế bào hạt (có sự hỗ trợ của Estradial) và quá trình
hình thành dịch nang. LH kích thích các tế bào vỏ và thụ quan LH hiện diện từ lúc bắt đầu
hình thành tế bào vỏ.

2.3.1.3. Sự hình thành và phát triển của noãn
Sự phát triển của noãn gồm 4 giai đoạn:
 Sự di chuyển của tế bào mầm vào cơ quan sinh dục.

8


 Sự gia tăng số lượng tế bào mầm bằng nguyên phân.
 Sự giảm chất liệu di truyền bằng giảm phân.
 Sự trưởng thành về cấu trúc và chức năng của noãn.
Trong quá trình giảm phân của noãn có 2 giai đoạn noãn ở trạng thái ngừng tăng trưởng
(block):
Block thứ nhất khi noãn bước vào giai đoạn tiền kỳ (prophase) của giảm phân, cho
ra noãn sơ cấp ở giai đoạn túi mầm (germinal vesicle - GV). Các noãn sẽ vượt qua giai

đoạn này khi có sự xuất hiện của đỉnh LH (Luteinizing Hormone) tức khi cá thể đến tuổi
trưởng thành sinh dục.
Block thứ hai ở giai đoạn trung kỳ (metaphase) của giảm phân II, cho ra noãn thứ
cấp. Noãn chỉ vượt qua được giai đoạn Metaphase II khi có sự thụ tinh của tinh trùng.
2.3.1.4. Sự trưởng thành của noãn
Trước giai đoạn phóng noãn, các noãn sơ cấp sẽ tiến hành quá trình trưởng thành
của nhân và của tế bào chất. Sự trưởng thành của nhân được hiểu là quá trình biến đổi
nhân của trứng trong suốt quá trình giảm phân tạo ra bộ nhiễm sắc thể đơn bội từ bộ
nhiễm sắc thể lưỡng bội.
Ngay sau quá trình giảm phân, noãn GV sẽ đi qua các giai đoạn tan biến túi mầm
(germinal vesicle break down - GVBD); metaphase I (MI); và metaphase II (MII), sau
cùng là sự phóng noãn.Thời gian noãn trưởng thành qua các giai đoạn này sẽ khác nhau
tùy loài. Ở người noãn GV trải qua giai đoạn GVBD 15 giờ, metaphase I (MI) 20 giờ,
metaphase II (MII) 35 giờ sau đỉnh LH, sự phóng noãn xảy ra khoảng 38 giờ sau đỉnh LH.
Ở bò, từ giai đoạn GV đến giai đoạn MII mất khoảng 19 giờ. Ở heo, thời gian này mất
khoảng 38 giờ. Chính sự khác nhau cơ bản về thời gian trưởng thành của noãn là cơ sở
cho việc giải thích tại sao để nuôi trưởng thành các tế bào trứng in vitro cần khoảng 18 20 giờ ở bò và 38 - 44 giờ ở heo.
Sự trưởng thành của tế bào chất được miêu tả như là một quá trình biến đổi tế bào
chất của trứng cần thiết cho quá trình thụ tinh và hoàn tất cho sự phát triển của phôi.
Điểm mấu chốt cho sự trưởng thành tế bào chất là sự sản xuất và hiện diện của các nhân

9


tố đặc biệt, sự định vị lại các bào quan trong tế bào chất và sự biến đổi sau dịch mã của
các mRNA đã tích lũy lại trong suốt quá trình sinh trứng.
Như vậy, sự trưởng thành về nhân và tế bào chất là tiêu chuẩn cho sự trưởng thành
của trứng trong điều kiện in vivo. Đây cũng là cơ sở thu nhận các trứng trưởng thành
trong điều kiện in vitro.

Hình 2.6 Nang noãn trưởng thành ().
2.3.1.5. Sự phóng noãn
Sự phóng noãn xảy ra vào cuối kỳ tăng trưởng. Ở giai đoạn này nang trứng trội có
khả năng đáp ứng với sự tăng lên mạnh và đột ngột của các kích dục tố bằng sự thay đổi
hoàn toàn cấu trúc của nó, dẫn đến hiện tượng rách nang và giải phóng noãn bào. Đồng
thời, trong noãn bào xày ra những thay đổi đáng kể tạo ra một noãn bào trưởng thành
hoàn toàn sẵn sàng cho sự thụ tinh:
 Noãn tách rời khỏi màng trong, tạo ra khoảng trống quanh noãn hoàng.
 Trong nhân của noãn, các nhiễm sắc thể kết thúc giảm phân I, thể cực thứ
nhất được phóng thích vào khoảng trống quah noãn hoàng.
 Giảm phân II khởi động rồi ngừng lại ở trung kỳ II.
Giảm phân II chỉ tiếp tục sau khi thụ tinh cùng với sự phóng thích thể cực thứ hai.
Noãn không thụ tinh sẽ bị thoái hóa. Mỗi trứng rụng được bao quanh màng trong suốt và

10


các tế bào quanh noãn. Các tế bào quanh noãn sẽ tiếp tục biệt hóa thành tế bào tiết steroid
để duy trì sự mang thai nếu trứng được thụ tinh.
2.3.1.6. Đặc điểm của giao tử cái - trứng
Mỗi trứng được chứa trong một nang noãn. Nang noãn được cấu tạo từ các tế bào
hạt (granuloa cell), chúng có vai trò quan trọng trong sự trưởng thành và biệt hóa của
trứng. Các tế bào hạt quanh trứng, kết hợp một cách chuyên biệt với trứng.Trong phức
hợp này có những khe nối (gap junction) cho phép chúng trao đổi chất. Các khe nối vẫn
được duy trì ngay cả khi tế bào hạt và trứng bị ngăn cách bị ngăn cách hoàn toàn với nhau
bởi lớp màng zona. Theo Bdleid và Wassarman (1980), Greve và Wassarman (1985), đây
là một lớp màng ngoại bào bao quanh trứng, nó được tổng hợp và bị thủy phân trong quá
trình phát triển của trứng.
Các trứng này sẽ được lùa vào vòi Fallope nhờ hoạt động của các long mao trên bề
mặt biểu mô của ống dẫn trứng. Trong một chu kỳ rụng trứng tự nhiên có từ 8-12 trứng

rụng. Tuy nhiên, điều này còn tùy thuộc vào từng chủng và quá trình này không diễn ra
liên tục mà theo từng khoảng thời gian kéo dài từ 2 - 3 giờ. Sau khi rụng trứng, nang
trứng và các tế bào hạt còn lại trong buồng trứng biệt hóa thành thể vàng để tiết ra
progesterol nhằm duy trì sự mang thai. Trong trường hợp không mang thai, thể vàng tồn
tại một thời gian ngắn, khối tế bào thoái hóa dần rồi tiêu biến.
2.3.2. Quá trình sinh tinh
2.3.2.1. Các giai đoạn của quá trình sinh tinh
Sự sinh tinh xảy ra gần như suốt đời sống của cá thể đực. Mỗi quá trình sinh tinh
gồm có 4 giai đoạn:
 Sinh sản: tinh nguyên bào ở màng đáy tiến hành phân chia nguyên nhiễm
nhiều đợt, tạo ra các dạng tinh nguyên bào A và B.Tinh nguyên bào B là
tiền thân của các tinh bào.
 Sinh trưởng: là giai đoạn của những tinh bào sơ cấp. chúng tăng về kích
thước và trong nhân tế bào hình thành từng đôi nhiễm sắc thể.

11


 Phát triển: có 2 kỳ phân chia liên tiếp, tinh bào sơ cấp phân chia thành tinh
bào thứ cấp, từ đó phân chia lần 2 thành 2 tinh tử. Như vậy, 1 tinh nguyên
bào phân chia thành 4 tinh tử.
 Thành thục: tinh tử trải qua giai đoạn tạo hình tinh trùng và trở thành tinh
trùng là thể có chức năng để gặp và kết hợp được với trứng.
2.3.2.2. Sự trưởng thành của tinh trùng trước thụ tinh
Tinh trùng có khả năng thụ tinh phải trải qua quá trình “ kiện toàn năng lực thụ
tinh” hay “ sự hoạt hóa tinh trùng”, bởi vì sau khi phóng tinh, tinh trùng có khả năng di
động nhưng chưa có khả năng thụ tinh. Sự kiện toàn năng lực thụ tinh được thực hiện khi
tinh trùng di chuyển trong đường sinh dục cái, thông qua các giai đoạn biến đổi sau:
Phản ứng khả năng hóa: xảy ra trong đường sinh dục cái (ống dẫn trứng, tử cung),
làm thay đổi chất bên trong và trên bề mặt tế bào. Do đó, làm màng tế bào mất ổn định,

loại bỏ các chất dịch bám trên tinh trùng và có thể thực hiện phản ứng cực đầu (thể đỉnh).
Phản ứng tăng động: là kết quả của phản ứng khả năng hóa làm tinh trùng thay đổi
kiểu di động từ dạng chuyển động thẳng tiến sang dạng chuyển động tự do.
Phản ứng cực đầu: đây là phản ứng kích thích gia tăng nồng độ Ca2+, ngoại bào
liên quan đến việc tái tổ chức lại lớp màng ở phần đầu tinh trùng. Sau phản ứng này, các
enzyme thủy giải từ đầu tinh trùng, được giải phóng, đồng thời để lộ ra các vị trí gắn với
màng trong suốt giúp tinh trùng xâm nhập vào trứng.
2.3.2.3. Đặc điểm của giao tử đực-tinh trùng
Tinh trùng được hình thành từ ống sinh tinh trong tinh hoàn. Đây là loại tế bào
thích ứng với chức năng vận chuyển và mang bộ gene đơn bội. Mặc dù tinh trùng có hình
dạng khác nhau tùy từng loài nhưng chúng đều có cấu trúc cơ bản gồm ba phần: đầu, cổ
(phần giữa), đuôi.
Phần đầu: có dạng hình quả lê dẹp, có 2 phần chính:nhân và thể đỉnh. Nhân chứa
nhiễm sắc thể ở dạng kết đặc cao độ, không có RNA, chiếm tới 65% thể tích phần đầu.
Phần trước của nhân được bọc bằng thể đỉnh tạo dạng túi, trong túi này có chứa các
enzyme thủy phân (hyaluronidase) liên quan đến quá trình xâm nhập của tinh trùng vào
màng trứng. Thể đỉnh được hình thành từ thể Golgi. Trong túi thể đỉnh chứa các enzyme

12