TÁCH DÒNG, TẠO PLASMID MANG GEN EPSPS ỨNG DỤNG CHO PHÁT HIỆN ĐẬU NÀNH (Glycine max L.) CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ GLYPHOSATE

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TÁCH DÒNG, TẠO PLASMID MANG GEN EPSPS ỨNG DỤNG
CHO PHÁT HIỆN ĐẬU NÀNH (Glycine max L.) CHUYỂN GEN
KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ GLYPHOSATE

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: ĐINH THÀNH PHƯỚC

Niên khóa

: 2009-2013

Tháng 6/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TÁCH DÒNG, TẠO PLASMID MANG GEN EPSPS ỨNG DỤNG
CHO PHÁT HIỆN ĐẬU NÀNH (Glycine max L.) CHUYỂN GEN
KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ GLYPHOSATE

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. HUỲNH VĂN BIẾT

ĐINH THÀNH PHƯỚC

Tháng 6/2013


LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn đến Ban Giám Hiệu TrườngĐại Học Nông Lâm Thành
Phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập tại
trường.
Quý Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng quýThầy Cô đã trực tiếp
giảng dạy trong suốt bốn năm qua.
TS. Huỳnh Văn Biết người đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và giúp
đỡ tận tình cho tôi hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này. Thầy đã truyền đạt những
kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học cũng như kinh nghiệm thực tiễn, luôn
động viên và khuyến khích sáng tạo trong nghiên cứu, giúp tôi hiểu rõ hơn những nền
tảng lý luận đã được học trên giảng đường và chỉ cho tôi phong cách độc lập trong
nghiên cứu khoa học.
PGS.TS. Lê Đình Đôn và quýThầy Cô, Anh Chị Em trong Viện Nghiên cứu
Công nghệ Sinh học và Môi trường đã tận tình giúp đỡ, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện tốt
nhất về trang thiết bị, hóa chất và kỹ thuật trong quá trình thực hiện khóa luận này.

Cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên giúp đỡ tạo điều kiện tốt nhất cho tôi
trong suốt quá trình học tập.
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2013
Đinh Thành Phước

i


TÓM TẮT
Hiện nay, phát triển cây trồng công nghệ sinh học là xu thế chung của thế giới,
trong đó đậu nành chuyển gen cũng không là ngoại lệ. Vì vẫn còn có những tranh cãi
về lợi ích và nguy cơ của cây trồng công nghệ sinh học trên toàn cầu nên việc tăng
cường kiểm soát và kiểm tra cây trồng công nghệ sinh học là cấp thiết. Trước thực
trạng trên nghiên cứu “Tách dòng, tạo plasmid mang gen EPSPS ứng dụng cho phát
hiện đậu nành (Glycine max L.) chuyển gen kháng thuốc diệt cỏGlyphosate” được thực
hiện nhằm bước đầu tạo ra mẫu chuẩn và đường chuẩn cho việc định lượng và phát
hiện cây trồng có chuyển gen EPSPSkháng thuốc diệt cỏ.
Nghiên cứu tập trung vào việc tạo dòng gen EPSPS bằng E. coli, sau đó thu nhận
sản phẩm tạo dòng, tinh sạch và tiến hành xây dựng đường chuẩn cho phản ứng định
lượng, phát hiện gen EPSPSđược chuyển trên đậu nành bằng Realtime PCR.
Nghiên cứu đã đạt được các kết quả sau: tạo được E. coli khả nạp có khả năng
nhận plasmid; tạo dòng gen EPSPSthành công; xây dựng được đường chuẩn cho định
lượng chuyểngen EPSPS kháng thuốc diệt cỏ trên đậu nành bằng phương pháp Realtime PCR có phương trình:
y = -3,0533x + 54,4187
Đường chuẩn xây dựng được có độ tin cậycao,với chỉ số tương quan R2 =
0,9992.Kết quả thử nghiệm bằng kỹ thuật Real time PCR với đường chuẩn xác lập
được phát hiện mẫu DNA đậu nành số 1và số 2 có mang gen EPSPS.Số lượng gen
chuyển tương ứng tên mẫu DNA đậu nành số 1 là211,34 x 106 copies và mẫu DNA
đậu nành số 2 là 1,21 x 109copies.

ii


SUMMARY
Nowadays, the development of biotech crops has become one of the most general
trends in biotech all over

the

world, transgenic soybean is not an exception.

Becausethere still have been debates about benefits and risks of biotech crops,
enhancement of the control and inspection of biotech crops are imperative. In order to
obtain a standard sample and calibration curve for quantitative analysis and detection
of transgenic Glyphosate - resistant soybean. The thesis named “Cloning, construction
of a reference plasmid containing EPSPS gene from GM soybean (Glycine max L.)”
was conducted.
The researchfocused on cloningEPSPSgeneinE. coli, then the clone product was
collected and purified. The standard sample from DNA plasmids with EPSPS gene and
calibration curve was established

for quantitative analysis and detection of GM

soybean by Real time PCR.
In this study,competent cells were made successfully; plasmids whith EPSPS
gene was cloned in E. coli. The calibration curve with high reliability was
established.the equation of calibration curve was y = -3.0533x + 54.4187, the
reliability indexR2 = 0.999. According the calibration curve, soybean DNA sample 1
and sample 2 were found obtainingEPSPS transgeneswith 211.34 x 106 copies and
1.21 x 109copies

Keyword: gene cloning, herbicide resistance, Real time PCR, GMO, EPSPS.

iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ........................................................................................................................ i
Tóm tắt .............................................................................................................................ii
Summary ........................................................................................................................ iii
Mục lục ........................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt .............................................................................................. vi
Danh sách các bảng .......................................................................................................vii
Danh sách các hình ...................................................................................................... viii
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................1
1.1

Đặt vấn đề .............................................................................................................1

1.2

Yêu cầu của đề tài .................................................................................................2

1.3

Nội dung thực hiện ...............................................................................................2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
2.1

Sơ lược về đậu nành (Glycine max L.) .................................................................3

2.2

Sơ lược về cây trồng biến đổi gen ........................................................................3

2.2.1 Định nghĩa sinh vật biến đổi gen (GMOs- Genetically Modified Organisms) ....3
2.2.2 Cấu trúc cơ bản của gen chuyển vào thực vật ......................................................4
2.2.3 Ứng dụng và nguy cơ của thực vật chuyển gen ...................................................7
2.2.4 Tổng quan tình hình cây trồng và sản phẩm từ cây trồng biến đổi gen ...............8
2.3

Phương pháp phát hiện, định lượng GMOs và sản phẩm từ GMOs ..................14

2.3.1 Nguyên tắc kỹ thuật Real time PCR ...................................................................14
2.3.2 Vật liệu của kỹ thuật Real time PCR ..................................................................15
2.3.3 Ứng dụng Real time PCR trong định lượng GMOs và sản phẩm GMOs .........15
2.3.4 Mức độ chuyên biệt trong phát hiện và định lượng GMOs................................18
2.4

Tạo dòng gen ......................................................................................................20

2.4.1 Khái quát về vector chuyển gen .........................................................................21
2.4.2 Vector tạo dòng plasmid .....................................................................................21
2.4.3 Khái quát về gen được tạo dòng .........................................................................23
2.4.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp .....................................................................................24
2.4.5 Chọn lọc tế bào vi khuẩn đã được biến nạp .......................................................24
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................................ 25
3.1

Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................................25
iv


3.2

Vật liệu nghiên cứu.............................................................................................25

3.2.1 Mẫu thí nghiệm dùng cho nghiên cứu ................................................................25
3.2.2 Dụng cụ - thiết bị dùng trong nghiên cứu...........................................................26
3.2.3 Hóa chất dùng trong nghiên cứu.........................................................................26

v