Phân lập nấm men Saccharomyces cerevisiae, khảo sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng phân lập được

 

BỘ GIÁO
O DỤC VÀ
À ĐÀO TẠO
O
TRƯỜ
ỜNG ĐẠI HỌC
H
NÔN
NG LÂM TH
HÀNH PH
HỐ HỒ CH
HÍ MINH
BỘ
Ộ MÔN CÔ
ÔNG NGH
HỆ SINH HỌC
H

KHÓA
K
A LUẬ
ẬN TỐ
ỐT NG
GHIỆ
ỆP
PHÂN LẬ
ẬP NẤM MEN Saaccharom
myces cereevisiae, KHẢO
K

SÁ
ÁT
KH
HẢ NĂNG ỨC CH
HẾ SẢN
N SINH AFLATO
A
XIN
CỦA CÁC
C
CHỦ
ỦNG PH
HÂN LẬP
P ĐƯỢC

Ngàn
nh học

: CÔ
ÔNG NGHỆ
Ệ SINH HỌ
ỌC

Sinh
h viên thực hiện : DƯ
ƯƠNG NGÔ
Ô THỊ BÍC
CH TRÂM
M
Niên

n khóa

: 20009 - 2013

T
Tháng
06/20013
 
 


BỘ GIÁO
O DỤC VÀ
À ĐÀO TẠO
O
ỜNG ĐẠI HỌC
H
NÔN
NG LÂM TH
HÀNH PH
HỐ HỒ CH
HÍ MINH
TRƯỜ
BỘ
Ộ MÔN CÔ
ÔNG NGH
HỆ SINH HỌC
H

KHÓA

K
A LUẬ
ẬN TỐ
ỐT NG
GHIỆ
ỆP
PHÂN LẬ
ẬP NẤM MEN Saaccharom
myces cereevisiae, KHẢO
K
SÁ
ÁT
KH
HẢ NĂNG ỨC CH
HẾ SẢN
N SINH AFLATO
A
XIN
CỦA CÁC
C
CHỦ
ỦNG PH
HÂN LẬP
P ĐƯỢC

Hướn
ng dẫn kho
oa học

Siinh viên thự

ực hiện

PGS.T
TS. NGUYỄN NGỌC HẢI

DƯ
ƯƠNG NG
GÔ THỊ BÍC
CH TRÂM

T
Tháng
06/20013
 
 


 

LỜI CẢM ƠN
Mãi khắc ghi công ơn sinh thành, nuôi nấng, dạy dỗ của ba má và những người thân
trong gia đình. Cảm ơn ba má đã luôn động viên và là chỗ dựa tinh thần cho con mỗi khi
gặp khó khăn.
Chân thành cảm ơn
Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, cùng quý thầy cô đã dạy bảo và truyền
đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tại trường.
Thầy Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực
hiện đề tài.
Thầy Trương Đình Bảo, cô Nguyễn Ngọc Thanh Xuân đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo
điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt khóa luận.

Cảm ơn chị Ánh, chị Trang, chị Thư, chị Thu, chị Vi, anh Hùng, Đức cùng thực tập
tại phòng thí nghiệm.
Cuối cùng, em xin cảm ơn những người bạn đã giúp đỡ, an ủi và chia sẻ cùng em
những khi gặp khó khăn.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2013
Dương Ngô Thị Bích Trâm

i

 


 

TÓM TẮT
Độc tố aflatoxin là một loại độc tố nguy hiểm nhất, thường nhiễm trên nông sản, gây
độc cho người và gia súc, như gây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan, gây quái thai,
đột biến... thậm chí ở liều lượng cao có thể dẫn đến tử vong. Việc làm ức chế sự sản sinh
của nấm mốc và độc tố aflatoxin được coi là điều cần thiết nhằm làm hạn chế sự nhiễm
aflatoxin trong nông sản, cũng như giảm thiểu tổn thất về kinh tế. Hiện nay có nhiều
phương pháp nhằm làm giảm và phân hủy aflatoxin, trong đó có phương pháp sinh vật
học, do đó đề tài “Phân lập nấm men Saccharomyces cerevisiae, khảo sát khả năng ức chế
sản sinh aflatoxin của các chủng phân lập được” được thực hiện, từ tháng 01 năm 2013
đến tháng 06 năm 2013 tại Phòng Thí nghiệm Vi sinh khoa Chăn nuôi - Thú y trường Đại
học Nông Lâm Tp.HCM. Những kết luận rút ra từ đề tài:
Có sự hiện diện của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong men, phân heo, phân
gà từ các nông hộ.
Đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng Saccharomyces
cerevisiae: Sau 7 ngày nuôi cấy chung Aspergillus flavus và S. cerevisiae trên môi trường
thạch nước cốt dừa, qua quan sát bên ngoài và quan sát dưới đèn UV, nhận thấy một số

chủng có khả năng ức chế sinh trưởng và sản sinh aflatoxin của nấm mốc A. flavus. Chọn
ra được 3 chủng nấm men có khả năng ức chế độc tố mạnh, đó là chủng số 76, chủng số
96 và chủng số 153.
Khảo sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng nấm men Saccharomyces
cerevisiae trong môi trường bắp: sau 5 ngày nuôi cấy bào tử nấm mốc và tế bào nấm men,
ghi nhận được sự thay đổi hàm lượng độc tố aflatoxin trên môi trường bắp so với mẫu đối
chứng dương chỉ có bào tử nấm mốc Aspergillus flavus và mẫu đối chứng âm không chứa
bào tử nấm mốc và nấm men.

ii

 


 

SUMMARY
Aflatoxin is a dangerous toxin, often infective on agricultural, poison to humans and
animals, such as acute effects, liver damage, teratogenicity, mutation ... even at high doses
can be fatal. It inhibits the production of mold and aflatoxin is considered essential in
order to limit aflatoxin contamination in agricultural products, as well as minimize the
economic loss. There are many methods to reduce aflatoxin and decomposition, including
biological methods, sothe thesis: "Isolation of Saccharomyces cerevisiae, survey their
ability in inhibition of aflatoxin production by Aspergillus flavus on maize" was made
from 01/2013 to 06/2013 in Microbiology and Infections Diseases Department of Freulty
of Animal Sciences and Veterinary, Nong Lam University, Ho Chi Minh city. Over the
duration of the thesis, we have the following conclusions:
Isolation of Saccharomyces cerevisiae from various sources.
After 7 days of culture common Aspergillus flavus and Saccharomyces cerevisiae on
coconut agar, by observers outside and observed under UV light, found that some strains

have the ability to inhibit growth and aflatoxin production of molds A. flavus. Pick 3 yeast
strains are capable of strongly inhibiting toxins, which are some 76 species, 96 species
and 153 species.
After 5 days of culture mold spores and yeast cells in corn environment, noting the
change in the concentration of aflatoxin in environment compared with the positive
control sample only Aspergillus flavus mold spores and negative control sample did not
contain mold spores and yeast.
Keywords: Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus flavus, aflatoxin, inhibition.

iii

 


 

MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ............................................................................................................................ i
Tóm tắt ................................................................................................................................. ii
Summary ............................................................................................................................. iii
Mục lục ............................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................................. vi
Danh sách các bảng ........................................................................................................... vii
Danh sách các hình ........................................................................................................... viii
Chương 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................................... 1
1.2. Yêu cầu của đề tài......................................................................................................... 2
1.3. Nội dung thực hiện ....................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................... 3

2.1. Sơ lược về nấm men ..................................................................................................... 3
2.1.1. Đặc điểm chung của nấm men................................................................................... 3
2.1.2. Đặc điểm sinh lý và sinh hóa của nấm men .............................................................. 3
2.1.3. Tổng quan về Saccharomyces cerevisiae .................................................................. 4
2.1.4. Cơ chế kháng aflatoxin .............................................................................................. 5
2.1.5. Vai trò của nấm men.................................................................................................. 5
2.2. Sơ lược về aflatoxin...................................................................................................... 5
2.2.1. Cấu trúc và tính chất của aflatoxin ............................................................................ 6
2.2.2. Cơ chế gây độc của aflatoxin .................................................................................... 8
2.2.3. Tác hại của aflatoxin ................................................................................................. 9
2.2.4. Các phương pháp phân tích độc tố aflatoxin ........................................................... 12
2.2.5. Các quy định và tiêu chuẩn ..................................................................................... 13
2.3. Các nghiên cứu về khả năng ức chế độc tố aflatoxin của nấm men S. cerevisiae ..... 14
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 15
3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .............................................................................. 15
iv

 


 

3.2. Vật liệu và thiết bị ...................................................................................................... 15
3.2.1. Đối tượng khảo sát................................................................................................... 15
3.2.2. Thiết bị dụng cụ thí nghiệm..................................................................................... 15
3.2.3. Môi trường nuôi cấy ................................................................................................ 15
3.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 16
3.3.1. Phương pháp phân lập nấm men Saccharomyces cerevisiae .................................. 16
3.3.2. Phương pháp phát hiện nấm men S. cerevisiae bằng phản ứng PCR...................... 16
3.3.3. Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của Aspergillus flavus ........................................ 18

3.3.4. Đánh giá khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của Saccharomyces cerevisiae ........ 20
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................... 23
4.1. Phân lập nấm men Saccharomyces cerevisiae ........................................................... 23
4.1.1. Quan sát hình thái khuẩn lạc nghi ngờ là Saccharomyces cerevisiae ..................... 23
4.1.2. Đặc điểm hình thái của nấm men quan sát dưới KHV điện tử................................ 23
4.2. Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của Aspergillus flavus ........................................... 24
4.2.1. Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của Aspergillus flavus ........................................ 24
4.2.2. Đánh giá khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng S. cerevisiae ............. 25
4.3. Phản ứng khuếch đại trình tự PCR ............................................................................. 27
4.4. Đánh giá khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của Saccharomyces cerevisiae ........... 28
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................................. 31
5.1. Kết luận....................................................................................................................... 31
5.2. Đề nghị ....................................................................................................................... 31
Tài liệu tham khảo ............................................................................................................. 32 

v

 


 

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ctv

:

cộng tác viên

DNA

:

Deoxyribonucleic acid

EtBr

:

Ethidium Bromide

HPLC

:

High Pressure Liquid Chromatography

KHV

:

Kính hiển vi

LAB

:

Lactic acid bacteria

ppb

:

part per billion

PCR

:

Polymerase Chain Reaction

PDA

:

Potato dextrose Agar

RNA

:

Ribonucleic acid

SA

:

Sabouraud Agar

UV

:

Ultra Violet

vi

 


 

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Tính chất hóa - lý chủ yếu của các aflatoxin ........................................................ 8
Bảng 3.1 Thành phần tham gia phản ứng khuếch đại ....................................................... 17
Bảng 3.2 Trình tự và kích thước mồi xuôi - mồi ngược .................................................... 17
Bảng 3.3 Chu trình nhiệt .................................................................................................... 17
Bảng 4.1Hàm lượng aflatoxin sau khi phân tích HPLC ................................................... 29

vii

 


 

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Hình thái nấm men S. cerevisiae dưới KHV điện tử. .......................................... 4

Hình 2.2Công thức hóa học của aflatoxin B1, B2, G1, G2, M1, M2 ................................. 7
Hình 3.1 Cách cấy nấm men và nấm mốc ........................................................................ 19
Hình 3.2Nuôi cấy bào tử nấm mốc và tế bào nấm men trên môi trường bắp ................... 21
Hình 4.1 Khuẩn lạc nghi ngờ S. cerevisiae trên môi trường SA. ..................................... 23
Hình 4.2 Hình thái nấm men S. cerevisiae dưới KHV điện tử ......................................... 24
Hình 4.3 Khuẩn lạc Aspergillus flavus dưới ánh đèn UV ................................................ 25
Hình 4.4 Sự ức chế của khuẩn lạc nấm men đối với khuẩn lạc nấm mốc ........................ 25
Hình 4.5 Vòng sáng aflatoxin bị mờ và khuyết ................................................................ 26
Hình 4.6 Kết quả điện di mẫu DNA nấm men S. cerevisiae ............................................ 27
Hình 4.7 Kết quả thử khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng nấm men ......... 28

viii

 


 

Chương 1MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong số 10.000 loại nấm mốc khác nhau được biết đến thì có khoảng 50 loại là có
hại đối với gia súc, gia cầm và con người. Các loại nấm này sản sinh ra các độc tố được
gọi chung là mycotoxin. Trong các loại độc tố thuộc nhóm mycotoxin thì nguy hiểm nhất
là độc tố aflatoxin do 2 loại nấm mốc điển hình Aspergillus flavus và Aspergillus
parasiticus sản sinh ra. Trong đó, aflatoxin B1 là độc tố thường gặp và độc nhất.
Sự nguy hiểm của aflatoxin B1 là ở chỗ nó có khả năng gây hại chỉ với liều lượng
rất nhỏ, 1 kg thức ăn chỉ cần nhiễm 2 miligam (với lượng chỉ đủ dính trên đầu 1 móng
tay) cũng đã đủ làm hỏng gan. Độc chất này không bị phân hủy khi đun nấu ở nhiệt độ
thông thường, do vậy nó tồn tại trong thực phẩm mà không cần sự có mặt của nấm mốc
tương ứng, đồng thời nó cũng rất bền với các men tiêu hóa. Bên cạnh đó, việc chuyển hóa

aflatoxin trong cơ thể bị nhiễm độc cũng khá nhanh. Chỉ sau 48 giờ, phát hiện thấy 85%
lượng aflatoxin được chuyển hóa trong sữa và bài tiết trong nước tiểu của động vật được
cho ăn một liều duy nhất 0,50 mg/kg aflatoxin (Lê Ngọc Tú, 2006).
Aflatoxin gây ra nhiều tác hại cho vật nuôi và con người, làm giảm năng suất vật
nuôi, cũng như ảnh hưởng lớn đến sức khỏe con người. Trên vật nuôi, aflatoxin gây ra
một loạt triệu chứng cấp tính và mãn tính. Động vật nhiễm aflatoxin thường có biểu hiện
hoại tử nhu mô gan, chảy máu ở gan, viêm cầu thận cấp và dẫn đến chết. Động vật cũng
có những biểu hiện của triệu chứng mãn tính như ăn kém ngon, chậm lớn, gan tụ máu,
chảy máu và hoại tử nhu mô. Trên người, aflatoxin gây ngộ độc gián tiếp qua lương thực,
thực phẩm bị nhiễm độc. Theo nghiên cứu của Đại học Cornell (Hoa Kỳ), dù với hàm
lượng cực thấp nhưng aflatoxin đã gây nên những ảnh hưởng bất lợi cho con người qua
một thời gian dài tích tụ từ thực phẩm rồi dẫn đến ung thư gan. Nhiễm aflatoxin cấp tính
thường có các biểu hiện chủ yếu là suy chức năng gan cấp, xơ gan và hoại tử nhu mô gan.
Hiện nay đã có nhiều phương pháp nhằm làm giảm và phân hủy aflatoxin như
phương pháp vật lý, phương pháp hóa học, phương pháp sinh vật học… Muñozvà ctv
1

 


 

(2010) đã nghiên cứu khả năng ức chế sản sinh độc tố của nấm mốc Aspergillus nomius
và nhận thấySaccharomyces cerevisiae có thể ức chế sản sinh độc tố của nấm mốc này.
Vì thế,đề tài: “Phân lập nấm men Saccharomyces cerevisiae, khảo sát khả năng ức
chế sản sinh aflatoxin của các chủng phân lập được” được thực hiện.
1.2. Yêu cầu của đề tài
Phân lập các chủng nấm men Saccharomyces cerevisiaevàđánh giá khả năng ức chế
sản sinh aflatoxin của các chủng phân lập được trên môi trường bắp.
1.3. Nội dung thực hiện

Đề tài gồm các nội dung sau:


Phân lập Saccharomyces cerevisiae từ các nguồn mẫu: men bánh thu mua từ các

chợ, siêu thị, phân heo, phân gà thu từ các nông hộ


Thực hiện phản ứng PCR nhằm phát hiện S. cerevisiae



Xác định các gốc S. cerevisiae có khả năng ức chế sản sinh độc tố aflatoxin từ các

chủng phân lập được


Đánh giá khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của S. cerevisiae trên môi trường bắp.

2

 


 

Chương 2TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về nấm men
2.1.1. Đặc điểm chung của nấm men
Nấm men là loại vi sinh vật có cấu tạo đơn bào, không di động và sinh sản chủ yếu

bằng phương pháp nảy chồi. Trong tự nhiên, nấm men tồn tại rất nhiều trong trái cây, nhất
là khi trái cây bị hư hỏng. Nấm men có thể được phân lập từ môi trường sống như đất đai.
Ở Việt Nam đã tìm thấy nấm men trong sữa, sữa đặc, đậu phộng, gạo, bắp, đường kính,
mứt, kẹo, nước dừa, chè búp, thuốc lá (Nguyễn Phùng Tiến và Bùi Minh Đức, 2007).
Tế bào nấm men có nhiều hình dạng khác nhau: hình cầu, hình ovan hoặc elip, hình
quả chanh, hình trụ, hình chùy hoặc đôi khi còn kéo dài ra thành sợi. Nấm men có thể
thay đổi hình dáng và kích thước trong các giai đoạn phát triển và điều kiện môi trường
xung quanh.Nấm men là vi sinh vật có kích thước tương đối lớn. Đường kính khoảng
1m, chiều dài 8 - 12 m.
2.1.2. Đặc điểm sinh lý và sinh hóa của nấm men
Quá trình sống của nấm men gồm các quá trình dinh dưỡng, quá trình sinh trưởng
với những đặc điểm di truyền để bảo tồn nòi và những quá trình sinh hóa trao đổi chất
trong tế bào nhằm phục vụ cho sinh trưởng và tạo sinh khối.
Dinh dưỡng nấm men được chia làm hai nguồn: dinh dưỡng nội bào và dinh dưỡng
ngoại bào. Chất dinh dưỡng ngoại bào được thấm qua màng vào tế bào từ các chất ở môi
trường nuôi cấy bên ngoài. Khi tế bào ở trạng thái nghèo hoặc cạn chất dinh dưỡng thì
những chất dự trữ nội bào (lipit, tregaloza, glycogen…) sẽ được sử dụng, gọi là dinh
dưỡng nội bào.
Là vi sinh vật hiếu khí tùy nghi, do đó nấm men hô hấp như một cơ thể hiếu khí bậc
cao. Khi môi trường hết oxy phân tử chúng chuyển sang hô hấp kỵ khí. Quá trình này
được gọi là quá trình lên men.
Nấm men có hai hình thức sinh sản: sinh sản hữu tính (bằng bào tử) và sinh sản vô
tính (bằng nảy chồi hoặc phân cắt tế bào). Nấm men sinh sản vô tính bằng nảy chồi hoặc

3

 


 

phân đôi tế bào, nhưng giữa quá trình này có thể sinh sản hữu tính xen kẽ hoặc ngược lại,
nấm men đang sinh sản hữu tính có thể trở lại sinh sản vô tính.
2.1.3. Tổng quan về Saccharomyces cerevisiae
Giới:

Fungi

Ngành:

Ascomycota

Phân ngành: Saccharomycotina
Lớp:

Saccharomycetes

Bộ:

Saccharomycetales

Họ:

Saccharomycetaceae

Chi:

Saccharomyces

Loài:

Saccharomyces cerevisia

Hình 2.1Hình thái nấm men S.
cerevisiae dưới KHV quang
học()

(Meyen ex E.C. Hansen, 1938)

Meyen mô tả vào năm 1938, tế bào S. cerevisiae có dạng hình trứng, bầu dục…,
kích thước trung bình 3-6 x 5-12 µm, sinh sản bằng hình thức nảy chồi không theo qui
luật, có thể xuất hiện từng cái một, từng đôi hoặc một chuỗi.
Khuẩn lạc nấm men S. cerevisiae có màu trắng nhạt, rìa tròn, lồi lên, bề mặt sáng lấp
lánh, đường kính 1-2 mm vào ngày thứ ba.
Nấm men S. cerevisiae phát triển tối ưu ở 33 - 35oC trong môi trường chứa 10 - 30%
glucose. Nhiệt độ tối thiểu là 4oC trong 10% glucose và 13oC trong 50% glucose, nhiệt độ
tối đa là 38 - 39oC.
Nấm men S.cerevisiae có khả năng lên men đường glucose, galactose, maltose,
saccharose, rafinose và dextrin đơn giản, không lên men lactose, mannitol, cellobise,
xylose, không đồng hóa nitrate, không phân giải tinh bột. Loài nấm men này có đặc điểm
lên men đường từ tinh bột do chúng có thể lên men được những dextrin đơn giản (Lương
Đức Phẩm, 2009).

4

 


 

2.1.4. Cơ chế kháng aflatoxin
S. cerevisiae làm giảm đáng kể sự nảy mầm của bào tử nấm A. flavus, làm ức chế sự
phát triển của nấm mốc và làm giảm trọng lượng sợi nấm. Điều này có thể là do sự hiện
diện của các hợp chất thơm như axit hữu cơ, este, rượu, lactones và tecpen… được sản
xuất bởi S. cerevisiaecó thể làm giảm quá trình lên men (Janssens và ctv, 1992; trích dẫn
bởi Al-Masri và ctv, 2011). Mặt khác,một nghiên cứu của Kusumaningtyas và ctv vào
năm 2006 đã chỉ ra rằng, khả năng làm giảm aflatoxin của S. cerevisiae có thể do
mannanoligosaccharide trong vách tế bào hoặc sự hình thành các liên kết hydro và các
tương tác Van der Waals giữa aflatoxin B1 và β-D-glucans. Mannanoligosaccharide có
thể liên kết chặt chẽ tới 88% aflatoxin.
2.1.5. Vai trò của nấm men
Nhờ đặc tính không sinh ra các chất độc gây hại trong quá trình trao đổi chất nên
nấm men được ứng dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm như sản xuất rượu, bia, nước
giải khát có cồn, sản xuất men bánh mì, gây hương nước chấm, chế biến các thực phẩm
sữa lên men cho người và làm thức ăn cho gia súc.
Người ta còn sử dụng nấm men để sản xuất protein đơn bào, sản xuất vitamin,
enzyme… và đặc biệt loài Saccharomyces cerevisiae đang được sử dụng như một công cụ
đắc lực để mang các DNA tái tổ hợp phục vụ cho việc sản xuất các sản phẩm thế hệ mới
của ngành công nghệ sinh học hiện đại.
Tuy nhiên, một số nấm men dại có hại cho sản xuất, làm nhiễm các quá trình công
nghệ và gây hư hỏng sản phẩm.
2.2. Sơ lược về aflatoxin
Aflatoxin là hợp chất trao đổi thứ cấp, được tổng hợp từ các chủng nấm mốc chủ
yếu thuộc loài Aspergillus, tập trung chủ yếu vào 3 chủng Aspergillus flavus, A.
parasiticus và A. nomius. Người ta đã xác định được rằng, sự tổng hợp các aflatoxin là sự
tác động qua lại của genotip của chủng nấm mốc và điều kiện môi trường ngoài.
Aflatoxin là một loại độc tố nấm mốc được phát hiện đầu tiên vào năm 1960, khi
gây bệnh trên gà Thổ Nhĩ Kỳ. Trận dịch xảy ra làm chết hơn 10.000 gà con 3-6 tuần tuổi
ở miền Đông Nam nước Anh do thức ăn có chứa khô dầu lạc bị nấm mốc, với các triệu
5

 


 

chứng như biếng ăn, xả cánh, xù lông và chết sau 1 tuần, được đặt tên là bệnh X của gà.
Tiếp theo đó, hàng loạt các vật nuôi khác cũng được phát hiện là có thể bị nhiễm aflatoxin
gồm heo, gà, khỉ, chó, trâu bò, ngựa... Kết quả của các nghiên cứu chỉ ra rằng động vật
được nuôi ở chế độ suy hoặc kém dinh dưỡng có khả năng nhiễm độc nhiều hơn động vật
khỏe. Ngoài ra, các công trình điều tra dịch tễ học ở các vùng khác nhau trên thế giới phát
hiện, dân ở các vùng trong khẩu phần thức ăn hàng ngày có lạc có tỉ lệ dân số bị ung thư
gan nhiều hơn các vùng khác. Ngoài lạc, aflatoxin còn được tìm thấy trên nhiều loại
lương thực, thực phẩm khác như gạo, bột, mì, ngô, đậu tương, hạt có dầu và sữa... Theo
Agag và ctv (2004), aflatoxin lây nhiễm cho người và động vật qua hai con đường chính:
(1) ăn uống trực tiếp aflatoxin (chủ yếu là B1) trong các loại thực phẩm có nguồn gốc
thực vật như ngô, các loại hạt và các sản phẩm của nó bị nhiễm aflatoxin; (2) ăn uống
aflatoxin có trong sữa và các sản phẩm của sữa, mô của động vật, trứng của gia cầm có
tiêu thụ thức ăn bị ô nhiễm.
Việc nhiễm aflatoxin không chỉ gây nhiễm độc chuỗi thực phẩm và những hậu quả
nghiêm trọng trong sức khỏe người tiêu dùng, mà còn gây ra những tổn thất lớn về kinh tế
và thương mại.
2.2.1. Cấu trúc và tính chất của aflatoxin
Năm 1962, Sargeant là người có công xác định các độc tố này, đó là một dạng dẫn
xuất của difuranocoumarin. Aflatoxin bao gồm 18 dạng hợp chất đa vòng bifuran như B1,
B2, G1, G2, GM1, G2, G2a, M1, M2, M2a, GM2, P1, Q1, R0, RB1, RB2, AFL, FLH,
AFLM và các dẫn xuất methoxy, ethoxy và acethoxy. Phân tử aflatoxin gồm một gốc
coumarin, 2 nhân furano và 1 vòng lacton (trích dẫn bởi Bùi Xuân Đồng, 2004).
Bốn loại aflatoxin chính thường gặp nhất là B1, B2, G1, G2. Các aflatoxin này có
độc tính cao nhất, đồng thời cũng là các aflatoxin được tạo thành với số lượng nhiều nhất,

cả trong các cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm cũng như môi trường lên men.
Aflatoxin B1chứa một vòng lacton trong công thức phân tử, có màu huỳnh quang
xanh da trời (blue), aflatoxin G1chứa hai vòng lacton trong công thức phân tử, có màu
huỳnh quang xanh lá cây (green). Hai aflatoxin B2, G2 có công thức hóa học hoàn toàn
giống aflatoxin B1, G1, chỉ khác là nối đôi trong vòng hidrofuran đã bị khử.
6

 


 

Aflatoxin B1, B2 trong sữa bò được chuyển hóa và gọi là aflatoxin M1 và aflatoxin
M2. Aflatoxin M1 có huỳnh quang xanh tím, là hydroxy- 4 aflatoxin B1, aflatoxin M2 có
Rf thấp hơn và có huỳnh quang tím, là hydroxy- 4 aflatoxin B2.
Các chủng A. flavus thường sản xuất chỉ có hai aflatoxin B1 và B2, trong khi đó
chủng A. parasiticus có thể sản xuất tất cả các độc tố aflatoxin. Aflatoxin M1 là chất
chuyển hóa của aflatoxin B1 trên người và động vật (trong sữa mẹ có thể phơi nhiễm tới
mức ng). Aflatoxin M2 là chất chuyển hóa của aflatoxin B2 trong sữa của bò được cho ăn
thức ăn nhiễm aflatoxin.
Trong bốn loại aflatoxin thì aflatoxin B1 thường được tìm thấy ở nồng độ cao nhất,
tiếp theo là G1, trong khi đó B2 và G2 tồn tại ở nồng độ thấp hơn.

Hình 2.2Công thức hóa học của aflatoxin B1, B2, G1, G2, M1, M2

2.2.1.1. Tính chất vật lý của aflatoxin
Aflatoxin có dạng tinh thể màu vàng, khối lượng phân tử thấp, ít tan trong nước, tan
trong các dung môi phân cực nhẹ như chloroform, methanol, aceton, acetonitril… và
7

 


 

không tan trong các dung môi hòa tan chất béo như n-hexan, ether ethylic, ether dầu hỏa...
Tính tan của aflatoxin trong nước dao động từ 10 - 20 mg/l.
Các aflatoxin rất bền với nhiệt. Chúng thường ít hoặc không bị phá hủy khi đun nấu
thông thường. Tuy nhiên, khi có độ ẩm và ở nhiệt độ cao vẫn có thể tiêu hủy aflatoxin
trong một khoảng thời gian nhất định. Aflatoxin dễ bị phá hủy bởi tia tử ngoại, đun trong
nồi áp suất hoặc khi xử lý bằng các chất oxy hóa.
Các aflatoxin phát quang mạnh dưới ánh sáng cực tím sóng dài. Điều này cho phép
phát hiện các hợp chất này ở nồng độ cực kỳ thấp (khoảng 0,5 ng hay thấp hơn trên một
vết ở sắc kí bản mỏng).
2.2.1.2. Tính chất hóa học của aflatoxin
Trong phân tử aflatoxin có vòng lacton nên dễ bị thủy phân khi có mặt của các base
mạnh. Tuy nhiên, khi acid hóa thì các aflatoxin lại được tái tạo.Đặc tính này là quan trọng
trong quá trình chế biến thực phẩm, vì quá trình xử lý kiềm giúp làm giảm hàm lượng
aflatoxin của các sản phẩm, mặc dù sự có mặt của protein, pH và thời gian xử lý có thể
làm thay đổi kết quả. Tuy nhiên, nếu chỉ xử lý kiềm nhẹ thì việc acid hóa sẽ làm phản ứng
xảy ra theo hướng ngược lại.
Nhiều tác nhân oxy hóa như hypochlorite natri, thuốc tím, chlorine, hydrogen
peroxide, ozone và peborat natri phản ứng với aflatoxin và thay đổi các phân tử aflatoxin,
một số phản ứng làm mất huỳnh quang.
2.2.2. Cơ chế gây độc của aflatoxin
Aflatoxin B1 là phân tử ái lực mạnh với thành ruột, có trọng lượng phân tử thấp nên
dễ dàng hấp thu hoàn toàn sau khi ăn. Khi đến ruột non, aflatoxin B1 sẽ nhanh chóng
được hấp thu vào tĩnh mạch và ruột non, tá tràng.
Từ ống tiêu hóa, theo tĩnh mạch cửa, aflatoxin tập trung vào gan nhiều nhất (chiếm
khoảng 17% lượng aflatoxin của cơ thể), tiếp theo là ở thận, cơ, mô mỡ, tụy, lách và 80%

bị bài tiết ra ngoài trong khoảng một tuần và đáng chú ý là nó bài tiết qua tuyến sữa, gây
bệnh cho thai nhi đang bú sữa mẹ. Chu kì bán rã trong huyết tương là 36,5 phút, lượng
phân phối là 14% trọng lượng cơ thể, giải phóng khỏi cơ thể là 1,25 L/kg/h. Aflatoxin chủ
yếu bài tiết trong vòng 48 giờ (Hendrickse, 1991; trích dẫn từ Verma, 2004).
8

 


 

Bảng 2.1Tính chất hóa – lý chủ yếu của các aflatoxin
Trọng
Aflatoxin

Công thức

lượng
phân tử

Điểm nóng
chảy (oC)

Độ quay cực

Màu huỳnh

quang học

quang ở UV

trong CHCl3

365 nm

B1

C17H12O6

312

– 269

- 558

Xanh lam

B2

C17H14O6

314

286 – 289

- 429

Xanh lam

G1

C17H12O7

328

244 – 246

- 550

Xanh lục

G2

C17H14O7

330

237 – 240

- 473

Xanh lục

M1

C17H12O7

328

299

- 280

Xanh lam tím

M2

C17H14O7

330

293

Xanh tím

( />
Aflatoxin có khả năng liên kết với DNA trong nhân tế bào. Sự liên kết này làm ức
chế enzyme polymerase, dẫn đến sự tổng hợp RNA bị hạn chế và ức chế polymerase tRNA (Dương Thanh Liêm và ctv, 2010).
Tác động lên sự tổng hợp acid nucleic: vòng α-, β-lacton không bão hòa trong phân
tử flatoxin gây ức chế tổng hợp DNA nhân tế bào, do đó nó làm rối loạn tăng trưởng bình
thường của tế bào (Nexterin và Vixarinova, 1971; trích dẫn Dương Thanh Liêm và ctv,
2010). Ngoài ra, chính những vòng lacton này có hoạt tính gây ung thư.
Tác động lên sự tổng hợp protein: tác động lên polysom làm ngăn sự kéo dài của
chuỗi polypeptide hoặc kết thúc quá trình sao chép, dẫn đến giảm RNA ribosome và RNA
thông tin (Clifford và ctv, 1967; trích dẫn Hồ Văn Út Hậu, 2010).
2.2.3. Tác hại của aflatoxin
Aflatoxin là chất độc nguy hiểm đối với các loài gia súc, gia cầm và con người. Sự
nhiễm độc aflatoxin được thể hiện qua hàng loạt các triệu chứng cấp tính hoặc mãn tính.
Sự nhiễm độc mãn tính aflatoxin có tính di truyền theo ba kiểu: gây ung thư, quái thai và
gây đột biến. Tuy nhiên, mức độ độc hoàn toàn khác nhau, phụ thuộc vào giống loài, lứa

9

 


 

tuổi, giới tính,đường xâm nhập, trạng thái sức khỏe của cơ thể, tình trạng dinh dưỡng,
mức và tần suất tiếp xúc.
2.2.3.1. Ảnh hưởng của aflatoxin đối với thực vật
Aflatoxin xâm hại màng và chất gắn nội bào, làm biến mất ribosome, gia tăng các
thể lưới và túi golgi, lưới nội chất cuốn lại, hình thành các thể tiểu bào, làm biến dạng các
hạt và bản mỏng bên trong lục lạp.
Tác dụng sinh lý học của aflatoxin lên thực vật bậc cao: ức chế sinh trưởng, ức chế
sự tổng hợp chất diệp lục... Nếu như aflatoxin B1 ức chế sự sao chép DNA thể ty lạp thì
nó lại hầu như không làm biến đổi sự tổng hợp các protein trong mô thực vật bậc cao; nó
không có tác dụng lên hoạt tính của peroxidaza.
2.2.3.2. Ảnh hưởng của aflatoxin đối với động vật
Trong những điều kiện phù hợp, độc tố aflatoxin được sinh ra nhưng không đủ
lượng để gây ngộ độc nặng. Nó làm giảm khả năng hấp thụ dinh dưỡng, vật nuôi chậm
tăng trưởng, còi cọc, làm tiêu tốn thức ăn, giảm khả năng miễn dịch, làm vật nuôi dễ mắc
bệnh. Độc tố còn gây hư hại tế bào gan, thận, gây ung thư làm tăng tỉ lệ chết ở thú non,
suy giảm năng suất, sản lượng trứng.Trên các động vật thí nghiệm, nhiễm độc aflatoxin
gây một loạt các triệu chứng cấp và mãn tính. Nhiễm độc cấp thường biểu hiện bằng cái
chết của các động vật thí nghiệm, với các triệu chứng thường gặp như nhu mô gan, chảy
máu gan, viêm cầu thận cấp. Nhiễm độc mạn tính thường biểu hiện bằng ăn kém ngon,
chậm lớn, gan tụ máu, chảy máu và hoại tử nhu mô. Loại mạn tính tác động tới yếu tố di
truyền tương ứng với 3 kiểu gây ung thư, gây quái thai và gây đột biến.
Theo Osweiler (2005), hàm lượng rất thấp của aflatoxin có trong thức ăn, đôi khi ít
hơn 1ppm, cũng có thể ảnh hưởng đến hệ thống miễn dịch, làm chảy máu và tổn thương

gan. Nếu độc tố ở liều cao hơn có thể gây chán ăn, lờ đờ, sốt xuất huyết, tiêu chảy và chết.
Tính nhạy cảm của động vật thay đổi theo loài và lứa tuổi. Nhìn chung, động vật còn non
(trước cai sữa) thường bị ảnh hưởng nhiều hơn động vật trưởng thành. Cá hồi, vịt, gà tây
và lợn trước cai sữa là những loài nhạy cảm cao với độc tố aflatoxin, trong khi đó, gia
súc, bò và cừu là những loài có khả năng kháng mạnh.

10

 


 

Aflatoxin thường không ảnh hưởng đến khả năng sinh sản hoặc không gây hư thai.
Tuy nhiên, động vật sơ sinh cũng có khả năng bị nhiễm do độc tố aflatoxin M1 được
chuyển hóa từaflatoxin B1 có trong sữa của thú mẹ.
2.2.3.3. Ảnh hưởng của aflatoxin đối với con người
Con người tiếp xúc với độc tố nấm mốc qua những nguồn khác nhau, có thể là sử
dụng thực phẩm có nguồn gốc thực vật bị nhiễm độc tố hoặc các chất chuyển hóa của
chúng (hiện diện trong sản phẩm động vật như sữa, thịt, trứng, cơ quan nội tạng) hay tiếp
xúc với không khí, bụi có chứa độc tố. Một hàm lượng nhỏ aflatoxin khi được con người
tiêu thụ sẽ nhanh chóng hấp thụ trong đường tiêu hóa thông qua một quá trình thụ động
mà chưa tìm ra được cơ chế, sau đó nhanh chóng xuất hiện như là chất chuyển trong máu
sau 15 phút và trong sữa 12 giờ sau khi ăn (Yiannikouris và Jouany, 2002; Moschini và
ctv, 2006; trích dẫn bởi Lizarraga-Paulin và ctv, 2011).
Ngộ độc aflatoxin trên người thường được chia thành hai dạng: cấp tính và mãn tính.
Ngộ độc aflatoxin được xem là cấp tính khi hàm lượng aflatoxin được tiêu thụ ở
mức cao. Triệu chứng lâm sàng của ngộ độc cấp tính bao gồm nôn mửa, co giật và hôn
mê, hạ đường huyết, thoái hóa mỡ ở gan và thận, phù não, với tỉ lệ tử vong khoảng 25%.
Ngộ độc mãn tính thường xảy ra hơn, đó là khi tiêu thụ một lượng ít hoặc vừa phải

aflatoxin. Có nhiều nghiên cứu trước đó đã báo cáo rằng độc tố aflatoxin và các dẫn xuất
của nó trong nước tiểu, máu và máu cuống rốn của con người có thể xâm nhập vào thai
nhi (Denning và ctv, 1990; trích dẫn bởi Lizarraga-Paulin và ctv, 2011).
Gan là cơ quan đích của nhiễm độc aflatoxin. Giai đoạn đầu, gan thoái hóa mỡ.
Trong tổ chức tế bào nhiễm nhiều hạt mỡ, tạo màu sắc vàng nhạt, mật sưng. Sau đó gan
sưng to lên, mật căng phồng và bắt đầu nổi các mụt nhỏ trên bề mặt gan, làm cho nó gồ
ghề, đôi khi có những nốt hoại tử màu trắng. Cuối cùng gan trở nên bở, dễ bể do nhiễm
khuẩn (Dương Thanh Liêm và ctv, 2002). Khi nhiễm độc thể mãn tính, thường xuất hiện
các tế bào gan khổng lồ, nhân tế bào đột biến, phát triển dạng sợi trong nội ống và tăng
sinh mô ống mật. Do tế bào gan bị hư hại nên có sự gia tăng các enzyme SGOT, SGPT,
sản sinh nhiều prothrobin làm giảm thời gian đông máu. Hàm lượng albumin, globulin,
cholesterol, ure trong máu cũng bị giảm (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).
11

 


 

2.2.4. Các phương pháp phân tích độc tố aflatoxin
Có nhiều phương pháp vật lý, hóa học, sinh học để phát hiện aflatoxin trong thực
phẩm.Tuy nhiên, do hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm rất thấp, nên để xác định chính
xác hàm lượng độc tố aflatoxin cần phải chọn phương pháp phù hợp.
Các phương pháp vật lý - hóa học chủ yếu dựa trên tính chất phát huỳnh quang ở
bước sóng tử ngoại của aflatoxin. Sắc ký là một trong những lĩnh vực quan trọng và hiện
đại nhất của hóa học. Aflatoxin có thể được phát hiện và định lượng bằng phương pháp
sắc ký trên giấy với các hệ dung môi butanol - nước - acetic (20:1:19) hay chloroform methanol (95:5) và sắc ký bản mỏng trên alumin, bột kieselguhl, bột cellulose với hệ dung
môi chloroform - methanol (99:1 hay 93:7) hoặc chloroform - aceton (90:10 hay 85:15).
Cũng có thể định lượng aflatoxin bằng sắc ký trên cột nhôm oxyd, cột silicagel với
các dung dịch rửa là cloroform và hỗn hợp 5% methanol-cloroform. Hiện nay, phương

pháp phổ biến nhất cho phát hiện và định lượng aflatoxin với độ nhạy cao là sử dụng sắc
ký lỏng hiệu năng cao (High Pressure Liquid Chromatography -HPLC) với dung môi tách
là acetonitril.
Bên cạnh đó, các phương pháp thử nghiệm sinh học cũng có khả năng phát hiện
aflatoxin, bao gồm việc thử nghiệm trên vịt con một ngày tuổi, trên phôi gà, trên ấu trùng
giáp xác, các loài thân mềm hoặc trên vi sinh vật để phát hiện độc tính của aflatoxin.
Trong số các đối tượng được áp dụng thì việc thử nghiệm trên vịt con một ngày tuổi được
dùng nhiều nhất, vì vịt là một loài đặc biệt mẫn cảm với độc tố aflatoxin, do đó có thể
phát hiện bằng phương pháp sinh học những lượng aflatoxin rất nhỏ. Tuy nhiên, cách thử
này cũng có một vài hạn chế: phải tổ chức nuôi vịt và con vật có thể nôn liều thuốc độc
vừa được cho uống.
Để hạn chế và kiểm soát aflatoxin trong công nghệ sau thu hoạch, nhiều biện pháp
hạn chế hoặc giảm bớt hàm lượng aflatoxin cho nông sản bảo quản được áp dụng như xử
lý nhiệt với muối amoni, monomethylamin, natri hydroxyt, natri hypoclorit, H2O2.... Bên
cạnh đó, các biện pháp kiểm soát sinh học aflatoxin cũng rất hứa hẹn, bao gồm từ việc tạo
giống cây trồng, vật nuôi kháng nấm, sử dụng thuốc bảo vệ thực vật và kháng nấm trên
đồng ruộng, và sau cùng là các biện pháp công nghệ gen nhằm vô hoạt gen sinh độc tố ở
12

 


 

nấm mốc. Theo cách tiếp cận mới này, có thể phát triển việc sử dụng các chế phẩm enzym
methyl transferase để phân giải tiền aflatoxin B1, tạo các giống nấm mốc cạnh tranh với
nấm mốc sinh aflatoxin B1 bằng cách loại bỏ gen sinh độc tố của các chủng gốc và đưa
chúng trở lại ổ sinh thái cạnh tranh với các chủng nấm hoang dại sinh độc tố, tạo vật nuôi,
cây trồng với công nghệ tái tổ hợp DNA có gắn gen kháng nấm.
2.2.5. Các quy định và tiêu chuẩn

Từ 1973, theo quy định của Cộng đồng chung Châu Âu và Mỹ, hàm lượng aflatoxin
B1 cho phép trong các sản phẩm nông sản được kiểm soát ở mức 0,05 - 0,01 mg/kg cho
các sản phẩm trung gian. Năm 1988, quy định trên mở rộng cho nguyên liệu của ngành
công nghiệp chế biến và bảo quản thực phẩm, hàm lượng aflatoxin B1 không được vượt
quá ngưỡng 0,2 mg/kg. Quy định áp dụng cho các sản phẩm thực phẩm ở mức rất thấp: từ
0,01µg/kg (cho sữa trẻ em) đến 0,2 µg/kg (cho phomat). Trong khi đó, quy định về
ngưỡng của aflatoxin B1 ở các nước châu Á và châu Phi nhìn chung ở mức 5 - 20 µg/kg
quy định cho đa số các nông sản.
Ở Việt Nam, theo Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia do Cục Chăn nuôi biên soạn năm
2009, quy định hàm lượng tối đa độc tố nấm mốc aflatoxin B1 trong thức ăn cho bê (dưới
6 tháng tuổi) là 50 µg/kg, cho bò thịt (trên 6 tháng tuổi) là 100 µg/kg; đối với lợn con từ 1
- 28 ngày tuổi là 10 µg/kg, nhóm lợn còn lại là 50 µg/kg; đối với gà con từ 1 - 28 ngày
tuổi là 10 µg/kg, nhóm gà còn lại là 30 µg/kg. Bên cạnh đó, hàm lượng tổng số các
aflatoxin B1 + B2 + G1 + G2 theo quy định chỉ được cho phép trong khoảng 200 - 500
µg/kg đối với bò, trong khoảng 30 – 100 µg/kg đối với lợn và trong khoảng 30 - 50 µg/kg
đối với gà. Cũng theo Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia về các chỉ tiêu vệ sinh an toàn và mức
giới hạn tối đa trong một số nguyên liệu thức ăn chăn nuôi ban hành năm 2011 quy định,
hàm lượng tổng số aflatoxin trong ngô không lớn hơn 200 µg/kg, trong thóc, tấm không
lớn hơn 50 µg/kg, trong cám gạo các loại không lớn hơn 50 µg/kg, trong lúa mì và sản
phẩm lúa mì không lớn hơn 100 µg/kg.
Đối với các loại thực phẩm, Bộ Y tế cũng công báo thông tư về việc ban hành các
Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia đối với giới hạn ô nhiễm hóa học trong thực phẩm năm
2011. Quy chuẩn này nêu rõ, giới hạn ô nhiễm aflatoxin trong các loại thực phẩm như ngũ
13

 


 

cốc và sản phẩm chế biến từ ngũ cốc là 2 µg/kg; ngô và gạo là 5 µg/kg; các loại gia vị như
ớt, hạt tiêu là 5 µg/kg. Không quy định đối với sữa và các sản phẩm từ sữa.(Hàm lượng
trên ứng với aflatixon B1)
2.3. Các nghiên cứu về khả năng ức chế độc tố aflatoxin của nấm men
Saccharomyces cerevisiae
Kusumaningtyas và ctv (2006) đã nghiên cứu làm giảm aflatoxin B1 trong thức ăn
cho gà bằng cách sử dụng Saccharomyces cerevisiae, Rhizopus oligosporus và sự kết hợp
của hai thành phần trên. Kết quả cho thấy, hai tác nhân trên có khả năng làm giảm hàm
lượng độc tố trong thức ăn cho gà, đặc biệt giảm đáng kể nhất kể từ ngày thứ 5 trở đi.
Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng, mỗi tác nhân khi sử dụng riêng lẻ sẽ cho kết quả tốt hơn
là kết hợp hai tác nhân với nhau.
Kết quả nghiên cứu của Matur vàctv (2010) cho thấy rằng bổ sungchiết xuất S.
cerevisiae vào thức ăn cho gà với tỉ lệ 1g/kg làm giảm tác động độc hại của aflatoxin đến
hoạt động của men lipase và chymotrypsin của tuyến tụy gà mái.
Pizzolittovà ctv (2011) đã lập mô hình nghiên cứutrong ống nghiệm về khả năng
kháng aflatoxin B1 của vi khuẩn Lactic (LAB) và S. cerevisiaeđể xem tác nhân nào có
khả năng ức chế hiệu quả hơn. Kết quả nghiên cứu cho thấy, chủng nấm men S. cerevisiae
CECT 1891 là tác nhân cho hiệu quả cao nhất trong việc ức chế độc tố aflatoxin B1, và
nói chung, nấm men có khả năng ức chế độc tố cao hơn so với LAB.

14

 


 

Chương 3VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ 01/2013 - 06/2013, tại:

- Phòng Thí nghiệm Vi sinh, Bộ môn Vi sinh - Truyền nhiễm, khoa Chăn nuôi - Thú y,
trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM.
- Phòng chẩn đoán xét nghiệm thú y Hàn - Việt.
- Phân tích hàm lượng aflatoxin tại trạm chẩn đoán, xét nghiệm và điều trị Chi cục Thú y
Tp. HCM.
3.2. Vật liệu và thiết bị
3.2.1. Đối tượng khảo sát
Chủng Aspergillus flavus sinhaflatoxin do Phòng Thí nghiệm Vi sinh cung cấp.
Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae phân lập từ các mẫu: men mua từ chợ,
siêu thị, phân heo, phân gà thu từ các nông hộ (chi tiết xem phụ lục 4).
3.2.2. Thiết bị dụng cụ thí nghiệm
Thiết bị: kính hiển vi, nồi hấp tiệt trùng autoclave, tủ lạnh, tủ sấy, cân tiểu li, máy
vortex, đèn cực tím, lò vi sóng, máy li tâm…
Dụng cụ: ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, bình tam giác, đũa khuấy thủy
tinh, lame, lamelle, giá đỡ ống nghiệm, ống đong…
Các dụng cụ thủy tinh dùng trong phòng thí nghiệm được sấy tiệt trùng ở 170oC/90
phút. Các dụng cụ nhựa được hấp tiệt trùng bằng autoclave ở 121oC/15 phút.
3.2.3. Môi trường nuôi cấy
Môi trường Sabouraud: phân lập và giữ giống nấm men.
Môi trường PDA: môi trường giữ giống nấm.
Môi trường thạch nước cốt dừa: kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của Aspergillus
flavusvà thử tính đối kháng.
Môi trường bắp: đánh giá khả năng ức chế sản sinh aflatoxin.
Thành phần các môi trường được trình bày ở phần phụ lục 1.

15