XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY NẮP ẤM (Nepenthes mirabilis Druce) in vitro

 
 

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG
CÂY NẮP ẤM (Nepenthes mirabilis Druce) in vitro

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: HUỲNH PHƯỚC

Niên khóa

: 2009 – 2013

Tháng 06/2013
i 
 


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG
CÂY NẮP ẤM (Nepenthes mirabilis Druce) in vitro

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. TÔN TRANG ÁNH

HUỲNH PHƯỚC

KS. TÔ THỊ NHÃ TRẦM

Tháng 06/2013
ii 

 


LỜI CÁM ƠN
Xin chân thành cám ơn
Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ
môn Công nghệ sinh học, thầy cô trong bộ môn công nghệ sinh học, cùng tất cả quý
thầy cô truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian học và làm đề tài.
Cô Tôn Trang Ánh và cô Tô Thị Nhã Trầm đã giúp đỡ cũng như đã chỉ dẫn em
trong khi thực hiện đề tài tốt nghiệp.
Các bạn của lớp DH09SH, bạn Nguyễn Thị Nhật Lệ, Lê Thị Ngân Hà, Nguyễn

Hoàn Nguyên, cùng các bạn làm đề tài ở bộ môn đã giúp đỡ mình trong thời gian qua.
Con xin thành kính ghi ơn cha mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn
tạo mọi điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập.
Tp Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2013
Huỳnh Phước

iii 
 


TÓM TẮT
Cây nắp ấm (Nepenthes mirabilis Druce) là một trong các loài cây ăn thịt phổ
biến ở Việt Nam. Cây có gân lá kéo dài thành tua cuốn, phần cuối tua hình thành ấm
nhiều màu sắc, có chức năng chính là bắt côn trùng. Cây có giá trị về kinh tế và y học.
Việc vi nhân giống cây nắp ấm nếu thành công sẽ mang lại lợi nhuận cao.
Nghiên cứu thực hiện dựa trên việc xác định môi trường phù hợp cho hạt nảy
mầm, nồng độ khoáng đa lượng của môi trường MS phù hợp với cây nắp ấm, ảnh
hưởng của BA và NAA đến sự tạo chồi ở cây, nồng độ than hoạt tính phù hợp cho
cây phát triển và ảnh hưởng của 2,4-D, BA lên sự tạo sẹo.
Kết quả cho thấy hạt nảy mầm thuận lợi trên môi trường 1/2MS bổ sung 60g
đường với tỉ lệ nảy mầm đạt 72,3 %. Môi trường 1/2MS là thích hợp nhất cho sự
phát triển của cây nắp ấm, chiều dài thân đạt 0,76 cm. Cụm chồi được phát sinh
trên môi trường 1/2MS + 1,5 mg/l BA + 0,1 – 0,5 mg/l NAA sau 60 ngày nuôi cấy
với số chồi là 3,73 và 4. Than hoạt tính với nồng độ 1mg/l + 1/2MS cho ấm to, đẹp
với 4,3 ấm, trong khi đó môi trường 1/2MS + 1,5 mg/l BA + 0,3 - 0,5 g/l than hoạt
tính thích hợp với sự phát sinh chồi đạt 4,3 – 3,5 chồi. Sẹo hình thành từ lá ở môi
trường 1/2MS + 0,3 mg/l 2,4-D + 1,5 – 2,0 mg/l BA với tỉ lệ là 67% và 80%.

iv 
 

SUMMARY
The thesis: In vitro mutiplication of Nepenthes mirabilis Druce
The Pitcher Plant (Nepenthes mirabilis) is the very popular carnivoruos plants
in Vietnam. The tip of tendril, which is created from its midribs, will develop into
many colourful pitcher. The primer aim of pitcher is catching insect. Picher plant has a
high economic value and be used for medication. If the micropropagation of
nepenthes is success, it will make a more benefit in economy.
The study is about selection of medium, that’s accord for seeds germination.
Influence of different strengths of MS to nepenthes’s generation, effect of NAA, BA
and 2,4-D in multiplication shoot and callus induction.
The in vitro seed germination show that a haft-stregth Murashige and Skoog
(1962) media formulation with high sucrose level enhanced seed germination
compared to other media (72.3 %). The 1/2MS medium dive the highest results for the
nepenthes’s development, which average height is 0.76 cm. Following 60 days of
culture, the 1/2MS medium supplemented with BA 1.5 mg/l + NAA 0.1 – 0.5 mg/l
give the highest multiple shoots (3.73; 4 shoot). The development of shoots from
nodes in medium 1/2MS + BA 1.5 mg/l + activated carbon 0.3 – 0.5 g/l is highest (4.3
– 3.5 shoot). The high average number of pitchter (4.3 pitcher) form the plant which
cultured in 1/2MS medium contained with activated carbon 1 g/l. Callus was
efficiently induced when leaf segments were cultured on 1/2MS medium
supplemented with 2.4-D 0.3 mg/l and BA1.5 – 2.0 mg/l after 2 months.
Key words: MS, nepenthes mirabilis, multiplication shoot, callus, pitcher plant.

v 
 


MỤC LỤC

Trang
Lời cảm ơn ........................................................................................................................ i
Tóm tắt .............................................................................................................................ii
Mục lục ........................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt .............................................................................................. vi
Danh sách các bảng .......................................................................................................vii
Danh sách các hình ...................................................................................................... viii
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1
1.2 Yêu cầu ...................................................................................................................... 2
1.3 Nội dung nghiên cứu ................................................................................................. 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
2.1. Tổng quan về loài nắp ấm ........................................................................................ 3
2.1.1 Lịch sử phát hiện cây nắp ấm ................................................................................. 3
2.1.2. Cấu tạo cây nắp ấm................................................................................................ 3
2.1.2.1 Thân cây nắp ấm .................................................................................................. 3
2.1.2.2 Lá cây nắp ấm ...................................................................................................... 3
2.1.2.3. Hoa cây nắp ấm .................................................................................................. 5
2.1.3 Phân loại cây nắp ấm .............................................................................................. 6
2.1.4Đặc điểm phân loại học cây nắp ấm ....................................................................... 6
2.1.5 Mô tả cây nắp ấm ................................................................................................... 8
2.1.6 Giá trị của cây nắp ấm ............................................................................................ 8
2.1.7 Nhân giống truyền thống cây nắp ấm ..................................................................... 8
2.2. Nhân giống in vitro ................................................................................................. 10
2.2.1 Khái niệm nhân giống in vitro .............................................................................. 10
2.2.2 Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng ................................................... 10
2.3 Tình hình nghiên cứu về vi nhân giống cây nắp ấm ............................................... 11
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................... 13
3.1. Thời gian và địa điểm ............................................................................................. 13
3.2 Vật liệu .................................................................................................................... 13

vi 
 


3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 13
3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng thời gian khử trùng ............................................................. 13
3.3.2 Khảo sát môi trường MS, WPM, KC và nồng độ đường ..................................... 15
3.3.3 Khảo sát hàm lượng khoáng đa lượng của môi trường MS ................................. 16
3.3.4 Khảo sát sự phát sinh cụm chồi ............................................................................ 16
3.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường 1/2MS ........................................................ 17
3.3.6 Khảo sát sự tạo sẹo của lá nắp ấm ........................................................................ 18
3.4 Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................................... 18
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 19
4.1 Thời gian khử trùng HgCl2 0,1%............................................................................. 19
4.2 Môi trường MS, WPM, KC và nồng độ đường ảnh hưởng..................................... 23
4.3 Hàm lượng khoáng đa lượng của môi trường MS................................................... 26
4.4Sự phát sinh chồi từ mẫu thân trên môi trường 1/2MS ............................................ 29
4.5 Ảnh hưởng của môi trường 1/2MS có bổ sung than hoạt tính ................................ 31
4.6 Sự tạo sẹo của mẫu lá nắp ấm trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D và BA ........ 36
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 39
5.1 Kết luận.................................................................................................................... 39
5.2 Đề nghị .................................................................................................................... 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 40

vii 
 


DANH SÁCH CÁC CHữ VIếT TắT
2,4-D

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

BA

6-Benzyl-adenin

CITES

Convention on International Trade in Endangered Species of Wild
Fauna and Flora

GA3

Gibberellin

IAA

Indole-3-acetic acid

IBA

Indole-3-butiric acid

KC

KnudsonC

1/2KC

Môi trường KC có thành phần khoáng đa lượng giảm 1/2

3/4KC

Môi trường KC có thành phần khoáng đa lượng giảm 3/4

MS

Murashige và Skoog, 1962

1/2MS

Môi trường MS có thành phần khoáng đa lượng giảm 1/2

1/4MS

Môi trường MS có thành phần khoáng đa lượng giảm 1/4

1/8MS

Môi trường MS có thành phần khoáng đa lượng giảm 1/8

NAA

α-Naphthalene acetic acid

WPM

Wood Plant Medium

8 

 
 


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến mẫu lá nắp ấm ................. 14
Bảng 3.2 Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến mẫu thân nắp ấm ............. 14
Bảng 3.3 Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến mẫu cuống lá nắp ấm ...... 14
Bảng 3.4 Ảnh hưởng môi trường và đường đến việc nảy mầm hạt .............................. 15
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng đa lượng MS lên cây nắp ấm in vitro ... 16
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của BA, NAA đến sự sinh cụm chồi .......................................... 17
Bảng 3.7 Ảnh hưởng của BA và than đến phát triển của mẫu thân .............................. 17
Bảng 3.8 Ảnh hưởng của 2,4-D và BA đến sự tạo sẹo của mẫu lá nắp ấm in vitro ..... 18
Bảng 4.1 Thời gian khử trùng HgCl2 0,1% ảnh hưởng đến mẫu lá nắp ấm ................. 19
Bảng 4.2 Thời gian khử trùng HgCl2 0,1% ảnh hưởng đến mẫu thân .......................... 21
Bảng 4.3 Thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến mẫu cuống lá ..................................... 22
Bảng 4.4 Môi trường và đường ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt ........................... 24
Bảng 4.5 Nồng độ khoáng đa lượng MS ảnh hưởng đến cây nắp ấm .......................... 27
Bảng 4.6 Ảnh hưởng của BA và NAA đến sự phát sinh chồi ...................................... 29
Bảng 4.7 Ảnh hưởng của BA và NAA đến sự phát sinh chồi ...................................... 29
Bảng 4.8 Ảnh hưởng của than đến sự phát triển của mẫu nắp ấm................................ 31
Bảng 4.9 Ảnh hưởng của than đến sự phát triển của mẫu khi bổ sung 1,5 mg/l BA.... 34
Bảng 4.10 Ảnh hưởng của 2,4–D và BA đến sự tạo sẹo của mẫu lá nắp ấm ............... 36
Bảng4.11 Màu sắc và hình dạng mô sẹo....................................................................... 36

9 

 
 


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cấu trúc của ấm (Clarke, 1997) ....................................................................... 4
Hình 2.2 Tiêu bản loài N.mirabilis (François Mey, 2007) ............................................. 7
Hình 2.3 Các bước giâm cành cây nắp ấm (Pietropaolo và ctv, 1986) .......................... 9
Hình 3.1 Cành nắp ấm lấy từ vườn ươm ...................................................................... 13
Hình 3.2 Quả và hạt nắp ấm ......................................................................................... 15
Hình 4.1 Tình trạng mẫu lá sau khi khử trùng .............................................................. 20
Hình 4.2 Tình trạng mẫu thân sau khi khử trùng .......................................................... 21
Hình 4.3 Tình trạng mẫu cuống lá sau khi khử trùng ................................................... 22
Hình 4.4 Quá trình phát triển hạt nắp ấm trên môi trường nghiệm thức ...................... 24
Hình 4.5 Cây nắp ấm phát triển trên các môi trường nghiệm thức .............................. 27
Hình 4.6 Ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tạo chồi ở cây nắp ấm ........................... 33
Hình 4.7 Ảnh hưởng của than hoạt tính theo các nồng độ ........................................... 34
Hình 4.8 Sự ảnh hưởng của than hoạt tính kết hợp với BA.......................................... 37
Hình 4.9 Ảnh hưởng của BA, 2,4 – D đến sự phát sinh sẹo ở lá cây nắp ấm. ............. 38

10 

 
 


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Cây nắp ấm (Nepenthes sp.) là một trong các loại cây ăn thịt được biết nhiều ở

Việt Nam. Nổi bật với gân lá kéo dài tạo thành cấu trúc dạng bình nhiều màu sắc, có
chức năng chính để bắt các loại sinh vật cung cấp chất dinh dưỡng cho cây. Nắp ấm
có khoảng 90 tới 130 loài chính và các loài lai tự nhiên cũng như nhân tạo. Cây
thường yêu cầu độ ẩm cao, thích nghi với môi trường nghèo dinh dưỡng. Cây mọc
leo, cao1 – 2 m, thân rất dai, lá hình bầu dục, dài khoảng 10 cm, có cuống dài, ôm
vào thân, phía trên lá tạo thành một cuống hình dây, uốn cong, dài. Ở Việt Nam, cây
phân bố chủ yếu ở các vùng miền Trung và Nam bộ (Pietropaolo và ctv, 1986; Phạm
Hoàng Hộ, 1999; Đỗ Tất Lợi, 2003; Huỳnh Ngọc Tựng, 2009; McPherson, 2009).
Cây nắp ấm có nhiều ứng dụng trong y học, kinh tế. Về phương diện làm thuốc,
nắp ấm có vị ngọt, nhạt, tính mát. Nắp ấm chữa vàng da do viêm gan, đau do loét dạ
dày, tá tràng, sỏi niệu quản, huyết áp cao, ho do cảm mạo, ho gà. Về mặt kinh tế, cây
nắp ấm với các dạng bình nhiều màu sắc đẹp rất được ưa chuộng để làm cảnh và tiểu
cảnh như hoa lan. Những năm gần đây, thị trường cây nắp ấm đã phát triển mạnh và đi
vào ổn định. Bên cạnh đó, giá thành của một cây nắp ấm lại cao so với các loại cây
kiểng khác và khả năng sống của cây tăng dần theo kinh nghiệm của người mua. Từ
đó, ta có thể thấy rằng đây một nhánh thị trường tiềm năng to lớn cần được khai thác,
nếu thành công sẽ đem lại lợi nhuận cao cho người trồng lẫn người kinh doanh.
Phương thức sinh sản hữu tính thông thường của cây nắp ấm gặp nhiều khó
khăn. Việc thụ phấn cần cả cây đực, cây cái và phải đảm bảo ra hoa cùng lúc. Một số
hạt giống có thể nảy mầm trong vòng vài ngày, trong khi những loại khác có thể phải
mất nhiều tháng có khi là vài năm. Khả năng nảy mầm bị mất hoặc hạn chế sau vài
tuần hoặc vài tháng lưu trữ phụ thuộc loài. Hạt giống nắp ấm khá nhỏ thường bị xâm
nhiễm bởi các bào tử nấm trong tự nhiên, dễ bị côn trùng lấy làm thức ăn.
Thực tế, người ta thường sử dụng phương pháp giâm cành để tạo cá thể mới.
Đây cũng là phương pháp sinh sản cơ bản của các loài nắp ấm trong tự nhiên để duy trì
số lượng. Tuy nhiên, phương pháp giâm cành lại cho ra số lượng cá thể con ít, tốn
11 

 
 

nhiều công sức, diện tích, thời gian, phụ thuộc quá nhiều vào điều kiện môi trường, và
quan trọng nhất là cần kinh nghiệm của cá nhân phải cao.Vì vậy khi đưa vào sản xuất
sẽ không đạt được hiệu quả. Trong những năm trở lại đây phương pháp nhân giống in
vitro được sử dụng rộng rãi do các ưu điểm như hệ số nhân giống cao, tiết kiệm thời
gian, diện tích, tạo được các cây con có chất lượng tốt. Một số loài nắp ấm đã được
nhân giống bằng phương pháp này và đạt được khá nhiều kết quả. Tuy nhiên, các công
trình nghiên cứu còn chưa được bao quát và tối ưu, hệ số nhân chồi còn thấp.
Với thực trạng trên, cây nắp ấm là một loài cây có giá trị kinh tế cao, có thể nói
là rất cao, mà các phương pháp truyền thống không phù hợp vào sản xuất và mang lại
lợi nhuận. Vì vậy đề tài “Xây dựng quy trình nhân giống cây nắp ấm (Nepenthes
mirabilis Druce) in vitro” cần được thực hiện, để khảo sát môi trường thích hợp cho
việc nhân giống cây nắp ấm cho hệ số nhân giống cao nhất, phù hợp việc sản xuất nhất
mang lại hiệu quả kinh tế cao và đáp ứng kịp thời số lượng cây con giống.
1.2 Yêu cầu
Xác định được môi trường và nồng độ đường thích hợp cho sự nảy mầm của hạt
cây nắp ấm in vitro.
Xác định được hàm lượng khoáng đa lượng của MS, tỉ lệ than hoạt tính phù hợp
cho sự sinh trưởng của câynắp ấm in vitro.
Xác định được nồng độ thích hợp của các chất kích thích sinh trưởng trên môi
trường 1/2MS cho sự phát sinh cụm chồi, mô sẹo cây nắp ấm in vitro.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Đề tài được thực hiện đầu tiên bằng việc xác định thời gian xử lý HgCl20,1% phù
hợp để khử trùng các loại mẫu loài cây nắp ấm(mẫu lá, cuống lá và đốt thân non). Bên cạnh
đó là khử trùng hạt cây nắp ấm và nuôi trên các môi trường khác nhau với các nồng độ
đường khác nhau để xác định môi trường phù hợp nhất cho sự nảy mầm. Sau khi nuôi
khoảng 2 tháng, mẫu lá, thân không có cảm ứng, lấy các mẫu cây sinh trưởng từ hạt cấy
chuyền sang môi trường MS có hàm lượng khoáng thay đổi để khảo sát hình thái sinh trưởng
của cây. Cây được 30 ngày, chuyển qua môi trường 1/2MS bổ sung nồng độ BA và NAA

thay đổi để khảo sát sự phát sinh cụm chồi. Do có sự tiết phenol từ mẫu, sau 2 tháng tiếp tục
cấy chuyền mẫu sang môi trường có nồng độ than hoạt tính thay đổi, để khảo sát sự tác động
12 

 
 


của than lên cây cũng như ngăn chặn việc tiết phenol từ mẫu. Bên cạnh đó, cấy chuyền lá
của cây sang môi trường bổ sung 2,4-D và BA thay đổi để theo dõi sự hình thành sẹo.

13 

 
 


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về loài nắp ấm
Nắp ấm(Nepenthes mirabilis) là loài cây ăn thịt được biết đến rất phổ biến.
Cũng như các loài cây ăn thịt khác, nắp ấm có chiếc bẫy để bắt côn trùng được gọi là
ấm (Temple, 1993). Hiện nay có khoảng 120 loài nắp ấm, phân bố chủ yếu ở miền
Nam Trung Quốc, Indonesia, Malaysia và Philippines,kéo dài về phía Tây tới
Madagascar và Seychelles, Ấn Độ và Sri Lanka về phía Nam tới Australia và New
Caledonia (McPherson, 2009). Nhiều loài nắp ấm được coi là loài bị đe dọa hay nguy
cấp và được liệt kê trong phụ lục 1 và 2 của CITES (1992).
2.1.1 Lịch sử phát hiện cây nắp ấm
Năm 1658, Etienne de Flacourt tại Madagascar đã công bố miêu tả một loài nắp
ấm trong công trình chuyên đề của ông Histoire de la Grande Isle de Madagascar. Cái
tên “Nepenthes” được sử dụng vào năm 1689 bởi J.P.Breney. Năm 1790, Joao de

Loureiro miêu tả cây nắp ấm ở Việt Nam. Vào năm 1874, J.D.Hooker đã công bố về
sự tiêu hoá của nắp ấm.
2.1.2. Cấu tạo cây nắp ấm
2.1.2.1 Thân cây nắp ấm
Nắp ấm là loại cây sống lâu năm với thân cây rất dai, có đường kính khoảng 5 cm
(Pietropaolo và ctv, 1986). Độ dày của thân rất khác biệt ở mỗi loài, từ vài mm ở loài
N.gracilis tới khoảng 3 cm ở loài N.bicalcarata. Thân cây có thể cao tới hơn 20 m,
nhưng thường thì cây trưởng thành cao từ 2 – 5 m (Clarke, 1997). Thân cây thường bám
vào các bụi cây, thân cây khác hoặc bò trên mặt đất (Pietropaolo và ctv, 1986).
2.1.2.2 Lá cây nắp ấm
Lá của nắp ấm rất đa dạng về hình dạng, màu sắc, kết cấu và kích cỡ. Kích
thước có thể từ 5 cm cho tới 1m (Clarke, 1997). Lá cây thường dài và dai, một số loài
lá có thể dài tới 6m. Các phiến lá thường có màu xanh đến màu vàng xanh với các gân
lá kéo dài ra khỏi giới hạn của lá trở thành các dây nho. Các dây nho này sẽ phát triển
trở thành ấm ở môi trường thích hợp (Pietropaolo và ctv, 1986). Ấm của cây được giữ
14 

 
 


bởi cấu trúc dây nho cho tới phiến lá. Đó là chiếc bình tự nhiên được cây sử dụng để
bắt các loài sinh vật như côn trùng. Ví dụ như loài sinh vật chủ yếu hoặc được hiểu là
con mồi được tìm thấy trong ấm của loài N. gracilis là kiến (Beaver, 1979). Màu sắc
của ấm rất đa dạng từ xanh đến xanh đốm tím hoặc đốm đỏ (Pietropaolo và ctv, 1986).

Hình2.1 Cấu trúc của ấm (Clarke, 1997).
Nắp ấm thường chia thành hai dạng ấm, tuy hình dạng của các loại ấm rất đa
dạng về loài, nhưng thường các ấm nằm gần mặt đất có hình trụ với hai cánh chạy
song song nhau từ đầu tới chân ấm (Pietropaolo và ctv, 1986). Thường các cây còn

nhỏ sản xuất ra loại ấm ngắn, mập lùn được gọi là ấm thấp và cánh hai bên được
cho là để dụ các loài côn trùng bò vào trong ấm. Khi thân cây leo cao, nó sản xuất
ra một loại ấm dài hơn và có hình trụ được gọi là ấm cao (Clarke, 1997). Các ấm ở
trên cao thường có dạng hình ống, nhỏ dần về phía tua cuốn. Thường các tua cuốn
này uốn cong lại trở thành một dạng cấu trúc nâng đỡ ấm, đưa ấm lên cao hơn. Các
tua cuốn ở ấm thấp thường không uốn cong (Pietropaolo và ctv, 1986). Mặc dù ấm
của các loài nắp ấm thường giống nhau về cấu trúc, nhưng chúng rất khác nhau về
kích cỡ, hình dạng, màu sắc. Chính sự khác nhau đó là nhân tố cơ bản để phân biệt
các loại nắp ấm khác nhau (Clarke, 1997). Không phải toàn bộ các loại ấm đều
dùng để bắt côn trùng (Joel, 1988). Gần đây đã phát hiện ra rằng một số loài
Nepenthes với các loại ấm đặc biệt lớn bắt được chuột chù Tupaia montana (Chin
và ctv, 2010), phân giải thành các chất dinh dưỡng dùng để cung cấp cho
15 

 
 


cây(Adlassnig và ctv, 2011). Loài N.meririlliana ở Philippines sản xuất ra loại ấm
lớn nhất cao tới 50 cm và có đường kính 25 cm. Chim nhỏ, chuột và một số loài thú
nhỏ cũng bị bắt vào ấm (Pietropaolo và ctv, 1986).
Ấm thường được chia làm bốn phần chính: nắp, môi, phần trên ấm, phần dưới
ấm. Trên cùng của ấm là nắp, nắp rất đa dạng từ hình dáng đến màu sắc, phụ thuộc vào
loài (Clarke, 1997). Nắp gắn với ấm vào phía sau lưng của ấm, nó gắn vào phía trên
của ấm, được coi như nón của ấm có tác dụng để hạn chế lượng nước mưa rơi vào
ấm,phần nối giữa ấm và nắp gọi móc.Phần miệng của ấm được bao phủ bởi một cấu
trúc dày được gọi là môi (Pietropaolo và ctv, 1986). Chức năng chính của môi là ngăn
cản con mồi thoát khỏi ấm. Ngoài ra, nó còn có công dụng là tác nhân thu hút con mồi
vào ấm do có màu sắc sặc sỡ (Clarke, 1997). Thân ấm thường được chia làm hai phần:
vùng sáp và vùng tiêu hoá. Vùng sáp hay còn gọi là vùng trên được phủ một lớp sáp

mỏng trên bề mặt, hạn chế sự trốn thoát của côn trùng, tăng khả năng côn trùng rớt
xuống dịch phía dưới. Phần tiêu hoá ở phía dưới được bao phủ gồm các tuyến tiết ra
các loại acid và enzyme để phân huỷ con mồi. Mẫu của enzyme gồm ribonuclease,
lipase, esterase, acid phosphatase và protease (Slack, 1979). Pavlovic và ctv (2007) đã
công bố về sinh lý của phiến lá và ấm. Chất lỏng trong ấm thường có tính acid và có
chứa các enzyme thực vật (Peroutka và ctv, 2008; Adlassnig và ctv, 2011). Mật là sản
phẩm phụ của ấmđể thu hút côn trùng,nó được sản xuất từ các tuyến trên môi và nắp.
Nghiên cứu gần đây cho thấy rằng môi của bình rất ướt và côn trùng có thể trượt khi
đậu trên nó để ăn mật, rơi vào các bình bên dưới, nơi chúng chết và được tiêu hóa, chỉ
khi môi bị khô là côn trùng có thể đi trên đó dễ dàng, nhưng họ vẫn có thể bị mắc kẹt
khi chúng bò trên mặt trong của ấm được phủ sáp (Bohn và Federle, 2004). Điều thú vị
là kiến Camponotus schmitzi sống cộng sinh với Nepenthes bicalcarata, và có thể bò
trên cả môi ướt (Kitching, 2000).
2.1.2.3 Hoa cây nắp ấm
Nắp ấm gồm có cây đực và cái, để tạo hạt cần có hoa đực và hoa cái cùng lúc.
Cả hoa đực và hoa cái đều rất sặc sỡ. Chúng khá nhỏ, không có cành hoa, có bốn đài
hoa, nhị và nhuỵ nằm ngay giữa và nhìn rất giống nhau. Có thể phân biệt hoa cái

16 

 
 


bằng cách xem xét noãn phồng to lên ngay trên các lá đài. Hoa được sinh ra theo
chùm hoặc bụi (Pietropaolo và ctv, 1986).

2.1.3 Phân loại cây nắp ấm
Trong khi đa số cái loài nắp ấm mọc ở vùng nhiệt đới, một số loài khác thì phát
triển ở vùng đất cao hơn, nơi mà nhiệt độ thấp hơn. Dựa vào mục đích phát triển, nắp

ấm được chia làm hai loại: loài mọc ở vùng cao, mọc ở vùng đất cao hơn 1000 m, nơi
nhiệt độ trung bình từ 10 - 21 oC; loài mọc ở vùng thấp, dưới 1000m, nhiệt độ trung
bình khoảng từ 21 - 35 oC (Temple, 1993).
Loài ấm vùng thấp: N. ampullaria, N. gracilis, N. mirabilis…
Loài ấm vùng cao: N. alta, N.lamii, N.maxima…
2.1.4Đặc điểm phân loại học cây nắp ấm(Nepenthes mirabilis (Lour.) Druce)
Tên gọi: Trư lủng thảo, trư tử lung (Trung Quốc), nắp ấm (miền Trung và Nam
Việt Nam), cây bắt ruồi (Đỗ Tất Lợi, 2003).
Phân loại thực vật học (Hoàng Thị Sản, 2006)
Giới

Plantae

Thực vật

Ngành

Angiospermae

Hạt kín

Lớp

Eudicotyledoneae

Hai lá mầm

Bộ

Caryophyllales

Cẩm chướng

Họ

Nepenthaceae

Nắp ấm

Chi

Nepenthes

Nắp ấm

Loài

Nepenthes mirabilis

Các loài phụ:
Nepenthes mirabilis var. anamensis (Weiner, 1985)
Nepenthes mirabilis var. biflora (J.H.Adam và Wilcock, 1992)
Nepenthes mirabilis var. echinostoma(Burbidge, 1988)
Nepenthes mirabilis var. globosa (Catal, 2010)
Nepenthes mirabilis var. simensis (Westphal, 1991)
Nepenthes mirabilis var. smilesii(Weiner, 1985)
17 

 
 

Hình 2.2 Tiêu bản loài N.mirabilis (François Mey, 2007).
18 

 
 


2.1.5 Mô tả cây nắp ấm
Nắp ấm là một cây chủ yếu mọc hoang dại ở các tỉnh miền Trung và Nam Bộ,
còn thấy ở chân núi đá vôi các tỉnh nói trên. Tại miền Bắc chỉ mới gặp ở Vĩnh Linh,
cây mọc leo, cao 1 – 2 m, thân rất dai, lá có cuống dài, một nửa ôm vào thân, phần lá
hình bầu dục, dài khoảng 10 cm; phía đầu lá tạo thành một cuống hình dây, uốn cong,
dài chừng 15 cm, với đầu biến thành cái bình, trông như cái hoa nhưng không phải hoa
nên có tên bình nước. Bình hình trụ, hơi phồng ở gốc, mặt bình có nắp đậy, mặt trên
nắp trơn, mặt dưới có nhiều phiến phân phối đều, trong bình tiết ra một chất nhầy, khi
nào có côn trùng vào trong bình, thì lập tức nắp đậy chặt lại, chất nhầy trong bình tiêu
huỷ sâu bọ. Cụm hoa là một chùm thưa gồm hoa đực hoặc hoa cái. Lá dài hình bầu
dục, mặt trong có nhiều phiến nhỏ, cột nhị dài bằng các lá đài, 16 – 20 bao phấn cong,
xếp thành hai dãy. Bầu hình trứng, phủ lông trắng, vòi ngắn, đầu nhị chia làm 4 thuỳ,
quả nặng, hạt mảnh và dài. Mùa hoa thường gặp vào tháng giêng. Người ta thu hái
toàn cây, quanh năm, rửa sạch, chặt thành từng đoạn 2 – 3 cm, phơi nắng cho khô
dùng dần (Phạm Hoàng Hộ, 1999; Đỗ Tất Lợi, 2003; Huỳnh Ngọc Tựng, 2009).
Loại cây này có rễ dạng chùm và mỏng. Lá mỏng có lông, phiến lá thuôn dài
hình ngọn giáo. Ấm thấp phình to ở phần thân, nhất là ở phần hông của ấm, nắp có
hình tròn hoặc ovan. Ấm cao hình trụ, có một số nơi bị phình lên. Hoa đực và hoa cái
sinh sản đơn độc trên các cành mỏng. Các phần non thì thường có lông nhỏ bao phủ,
cây trưởng thành thì nhẵn với mép lá có rìa lông bao quanh (Mey, 2010).
2.1.6 Giá trị của cây nắp ấm

Trồng làm cảnh:Ở nước ta thị hiếu về hoa cảnh của các loài cây bắt mồi nói
chung và nắp ấm nói riêng còn rất mới mẽ, tiềm năng rất lớn nhưng chưa được khai
thác đúng mức, nhất là các loài có sẵn trong nước (Nguyễn Thị Thư, 2005). Thị
trường nấp ấm hiện nay đã khá ổn định, với số lượng người sưu tầm cây tăng mạnh
trong những năm gần đây. Giá thành của cây cũng khá cao do việc chăm sóc khó
khăn đồng thời do số lượng người bán khá ít.
Sử dụng làm dược liệu: Nắp ấm có vị ngọt, nhạt, tính mát, có tác dụng thanh
nhiệt, lợi thấp, hoá đờm, giảm đau. Nắp ấm còn có tác dụng trị vàng da do viêm gan,
đau do loét dạ dày, tá tràng, sỏi niệu quản, huyết áp cao, ho do cảm mạo, ho gà, còn
19 

 
 


dùng trong điều trị các chứng phù thủng toàn thân (Lê Quí Ngưu và Trần Thị Như
Đức,1993). Rễ của cây nắp ấm trị huyết áp, trị bệnh vàng da (Phạm Hoàng Hộ,
1999). Dịch của ấm chưa mở được sử dụng như thuốc nhuận trường, viêm họng, trị
bỏng, viêm mắt và các bệnh về da (Pietropaolo và ctv, 1986).
2.1.7Nhân giống truyền thống cây nắp ấm
Gồm có nhân giống hữu tính (gieo hạt) và nhân giống vô tính (giâm cành).
Sau khi thụ phấn, hạt phát triển thành dạng dài và mảnh. Hạt được gieo bằng
cách rải trên mặt đất, phải bảo đảm độ ẩm và nhiệt độ phù hợp (Pietropaolo và ctv,
1986). Hạt có thể được gieo trên xơ dừa và đá nhỏ sạch giữ ở 26oC. Tưới phun sương
và không được để môi trường khô, sự nảy mầm diễn ra từ hai đến sáu tuần. Hạt dễ bị
hư và cần phải bảo vệ tránh ánh sáng mặt trời trực tiếp (Temple, 1993). Tuy nhiên
phương pháp nhân giống bằng hạt gặp nhiều khó khăn do đòi hỏi cây đực và cây cái
phải ra hoa cùng lúc, hạt khá nhỏ, sinh trưởng chậm, dễ bị côn trùng lấy làm thức ăn
(Lavarack, 1981; Lee, 2008).

Hình2.3 Các bước giâm cành cây nắp ấm (Pietropaolo và ctv, 1986).
Phương pháp thông dụng nhất để nhân giống nắp ấm là giâm cành. Phương
pháp này không những tạo ra nhiều cây con mà còn giải quyết vấn đề về cây có
thân quá già và leo quá cao trên giàn, lúc này cây cho ít bình và nhỏ dần (Nguyễn
20 

 
 


Thị Thư, 2005). Yêu cầu cành giâm là cây nắp ấm đang khỏe mạnh, thân phải chắc.
Điều kiện môi trường là nhiệt độ không quá 34oC, độ ẩm càng cao càng tốt trên
90%, ánh sáng 2500 – 3000 lux. Chọn cành giâm khỏe mạnh, cắt bớt 1/2 tất cả các
lá, cắt từng đoạn từ 3 - 5 lá, sau đó giâm xuống giá thể, cắt các đốt nghiêng 45 độ,
sau đó trùm bọc nilon trong suốt để cây ở môi trường thích hợp, sau 1,5 - 2 tháng
cây ra rễ tốt, 4 - 6 tháng cây to khỏe mới, tỉ lệ thành công phụ thuộc rất nhiều vào
môi trường (Châu Kiến Đạt, 2010).
Tuy nhiên phương pháp này còn có nhiều hạn chế: không ổn định về mặt duy
truyền, hệ số nhân giống thấp, tốn nhiều thơi gian và công sức, chiếm diện tích, khả
năng sống sót kém do phụ thuộc vào môi trường. Vì thế phương pháp vi nhân giống
có lẽ là một lựa chọn lý tưởng nhằm giải quyết các vấn đề khó khăn liên quan đến
nhân giống truyền thống.
2.2. Nhân giống in vitro
2.2.1 Khái niệm nhân giống in vitro
Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức
nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều
kiện vô trùng. Môi trường có các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng,
vitamin, các hormone tăng trưởng và đường (Dương Công kiên, 2002).
Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như: lá,
thân, hoa hoặc rễ. Phương pháp này có nhiều ưu điểm. Nhân giống in vitro tiết kiệm

thời gian, nhân giống các loài mà phương pháp nhân giống tự nhiên không cho phép
hay không thuận lợi. Sự tăng trưởng của cây in vitro thường mạnh hơn cây bình
thường, tạo được cây sạch bệnh, dễ dàng chọn lọc cá thể, giảm chi phí và diện tích, sản
xuất quanh năm, tạo ra các dòng đột biến, tạo ngân hàng gene (Pierik, 1975;
Anonymous, 1980; Assche, 1983; Gebhard và ctv, 1983; Kunneman, 1984).
2.2.2 Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy mô
Auxin là nhóm chất kích thích sinh trưởng thực vật được sử dụng rất thường
xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần
dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền

21 

 
 


phù tế bào và điều hoà sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được sử dụng phối hợp
với các cytokinin (Nguyễn Đức Lượng, 2002).
Cytokinin là một trong nhóm chất kích thích sinh trưởng thực vật. Cytokinin ít
có ảnh hưởng trên một thực vật nguyên vẹn và nó có hiệu quả trong việc kích thích sự
sinh tổng hợp protein. Khi phối hợp cùng với auxin thì cytokinin sẽ kích thích sự phân
chia tế bào và điều khiển sự phát sinh hình thái. Khi được bổ sung vào môi trường
nuôi cấy chồi thì những hợp chất này sẽ phá vỡ trạng thái hưu miên của chồi ngọn và
kích thích sự hoạt động của các chồi bên. Về phương diện này thì cytokinin có tác
động ngược lại với auxin nội sinh (Nguyễn Đức Lượng, 2002).
2.3Tình hình nghiên cứu về vi nhân giống cây nắp ấm trong và ngoài nước
Đã có một số nghiên cứu trong và ngoài nước về việc ứng dụng kĩ thuật
nuôi cấy tế bào thực vật trong việc nhân giống cây nắp ấm và đạt được một số
thành công nhất định.
Vào năm 2005, Nguyễn Thị Thư đã thực việc nuôi cấy trên đối tượng là

đốt thân loàiN.mirabilis. Kết quả đạt được là tìm ra môi trường phù hợp để tăng
trưởng chồi từ đốt thân là 1/2MS + BA 3 mg/l + NAA 2mg/l và môi trường tối
ưu cho việc phát sinh cụm chồi từ đốt thân là 1/2MS + BA 5mg/l.
Ngoài ra, theo Nguyễn Bảo Toàn và Lê Hồng Giang (2011) thực hiện trên
đối tượng là đốt thân loài N.mirabilis. Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng, môi
trường WPM phù hợp hơn môi trường MS trong sự cảm ứng mầm bên phát triển
và môi trường WPM bổ sung 0,05 mg/l NAA + 8 mg/l BA cho tỷ lệ tạo cụm chồi
cao nhất 81,3%.
Năm 2000, Sani và ctv đã thực hiện nghiên cứu trên hạt của loài
N.ampullaria. Từ đó đã chỉ ra rằng môi trường thích hợp nhất cho hạt nảy mầm là
1/2MS với nồng độ đường lên tới 60%, môi trường 1/2MS + 1 mg/l IBA phù hợp
nhất cho việc phát triển của thân rễ, bên đó môi trường 1/2MS + 2 mg/l 2, 4 – D
thích hợp cho sự phát sinh sẹo từ thân, và cuối cùng môi trường 1/2MS + 2,5 mg/l
BAP cho tỉ lệ phát sinh cụm chồi cao.
Năm 2005, Rasco Jr và Maquilan đã thực hiện nghiên cứu trong việc cảm
ứng hạt loài N.truncata nảy mầm. Một số kết luận được rút ra, môi trường
22 

 
 


1/4KC và 3/4KC phù hợp nhất cho việc nảy mầm và phát triển của cây, tỉ lệ
sống và nảy mầm của hạt tỉ lệ nghịch với nồng độ khoáng đa lượng của môi
trường MS.
Vào năm 2007, Khompat và ctv đã công bố nghiên cứu trên loài
N.mirabilis. Môi trường rắn MS + 3 mg/l BA cho tỉ lệ nảy mầm tốt, môi trường
lỏng cho tỉ lệ nảy mầm nhanh hơn môi trường rắn chỉ sau 6 tuần nuôi cấy. Môi
trường MS bổ sung 5 mg/l BA thích hợp cho sự phát sinh cụm chồi. Môi trường
1/2MS phù hợp cho sự phát triển của cây.

Theo Fong (2008), môi trường WPM + 0,5 mg/l IBA phù hợp nhất cho sự
phát sinh rễ ở loài N.gracilis.
Năm 2009, Kumaria và Tandon đã thực hiện nghiên cứu và thấy rằng môi
trường 1/2MS là phù hợp nhất cho sự nảy mầm và môi trường 1/2MS + 0,5 mg/l
NAA là phù hợp nhất cho sự phát sinh ấm ở loài N.khasiana tại Ấn độ.
Dinarti và ctv (2010) đã tiếp tục thực hiện việc nghiên cứu sự nảy mầm
của loài N.mirabilis. Và đạt được các kết quảmôi trường 1/4KC và 1/2MS có bổ
sung TDZ, IAA, GA3 phù hợp cho sự nảy mầm của hạt, giúp tăng phần trăm số
hạt nảy mầm cũng như giảm số ngày nảy mầm. Môi trường 1/2MS và 1/4 KC
chứa 0 – 1 mg/l BAP phù hợp cho sự phát triển của chồi và lá.
Đến năm 2011, Sukamto và ctv thực hiện các nghiên cứu trên loài
N.albomarginata đã kết luận rằng, môi trường 1/2MS + 1 mg/l BA + 0,5 mg/l
NAA là phù hợp nhất cho sự phát triển của cây, 1/2MS + 1,5 mg/l NAA thích
hợp cho việc phát sinh chồi nách, và cuối cùng 1/2MS + 1 mg/l BA + 2mg/l
NAA cho sự cảm ứng sẹo tốt.
Trong cùng năm 2011-2012, Jala đã kết luận nuôi cấy loài N.mirabilis
dưới ánh sáng đỏ phù hợp với việc thúc đẩy sự nảy mầm của hạt, trong khi ánh
sáng vàng tốt nhất cho sự tăng trưởng của cây. Môi trường 1/2MS + 2 mg/l BA
phù hợp cho sự phát triển của cây và có sự hình thành cấu trúc sẹo sau 20 tuần
nuôi cấy.

23 

 
 


Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm
Các thí nghiệm được tiến hành từ tháng 12/2012 đến tháng 06/2013 tại phòng

nuôi cấy mô, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố
Hồ Chí Minh.
3.2 Vật liệu
Vật liệu thí nghiệm là cành cắt cây nắp ấm dài 30 – 50 cm, hạt từ 2 đến 3 tuần
tuổi mua ở vườn ươm, mẫu cấy ban đầu gồm lá, đoạn thân, hạt.
Môi trường nuôi cấy là môi trường MS, WPM, KC.
Điều kiện nuôi cấy là thời gian chiếu sáng: 16 h/ngày; nhiệt độ: 25 ± 20C; độ
ẩm: 50 - 60%; cường độ chiếu sáng: 2000 - 3000 lux.
3.3.Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến khả năng sống
của mẫu cây nắp ấm

Hình 3.1 Cành nắp ấm lấy từ vườn ươm
Các bước tiến hành: Lá cây cắt thành nhiều mảnh nhỏ dài 6 cm, cuống lá từng
đoạn dài 6 cm, thân cây cắt từng đoạn ngay chồi ngủ khoảng 5cm, sau đó dùng cồn 700
rửa sạch theo 1 chiều từ trên xuống để tránh tổn thương mẫu. Chuyển mẫu sang bình
tam giác vô trùng và đưa vào tủ cấy. Thực hiện thao tác khử trùng mẫu cấy trong điều
24 

 
 


kiện vô trùng. Mẫu cấy được lắc qua cồn 700 trong 30 giây - 1 phút, sau đó được khử
trùng với vitamin C trong 15 phút; kháng sinh (nồng độ 1 g/l) trong 30 phút;
HgCl20,1% bổ sung vào 3 giọt Tween 20 lắc trong các khoảng thời gian khác nhau và
được bố trí trên từng nghiệm thức. Sau khi khử trùng xong loại bỏ những phần hư hại,
mẫu được cắt thành từng đoạn dài từ 1 - 1,5 cm đối với mẫu thân chồi, đối với mẫu lá
cắt mẫu thành từng mảnh 1x1 cm, cuống lá cắt từng lát mỏng dày 0,5 – 1 cm sau đó
được cấy vào môi trường MS.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành với mẫu lá, thân, cuống lá cây
nắp ấm.Mẫu lá, cuống lá được đặt tiếp xúc trực tiếp với môi trường nuôi cấy, thân cây
cấy trên môi trường MS. Gồm có 4 nghiệm thức, mẫu lá mỗi nghiệm thức 5 chai, mẫu
thân mỗi nghiệm thức 4 chai, mẫu cuống lá mỗi nghiệm thức 4 chai, thực hiện lặp lại 3
lần, thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên.
Bảng 3.1Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến mẫu lá nắp ấm
Nghiệm thức
A1

Môi trường
MS

Thời gian khử trùng (phút)
2

Mẫu/chai
5

Tổng mẫu
75

A2

MS

3

5

75

A3

MS

4

5

75

A4

MS

5

5

75

Bảng 3.2Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến của mẫu thân
Nghiệm thức
B1

Môi trường
MS

Thời gian khử trùng(phút)
4

Mẫu/chai
1

Tổng mẫu
12

B2

MS

5

1

12

B3

MS

6

1

12

B4

MS

7

1

12

Bảng 3.3Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến của mẫu cuống lá
Nghiệm thức
C1

Môi trường
MS

Thời gian khử trùng(phút)
2

Mẫu/chai
5

Tổng mẫu
60

C2

MS

3

5

60

C3

MS

4

5

60

C4

MS

5

5

60

25